JPH11514101A

JPH11514101A - 組換えウサギ組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬

Info

Publication number: JPH11514101A
Application number: JP10546185A
Authority: JP
Inventors: ブルカト，チェリル; バール，シンシア; ブルゲラ，ポール; ルイズ，ジュアン; サンチェズ―マーティンズ，デメトリオ
Original assignee: インストルメンテーションラボラトリーエス．ピー．アー．
Priority date: 1997-04-23
Filing date: 1998-04-22
Publication date: 1999-11-30
Anticipated expiration: 2018-04-22
Also published as: DE69832628T2; DE69832628D1; CA2288058A1; EP1015890A1; WO1998048283A1; ATE311601T1; IL132529A0; ES2255157T3; JP3246749B2; EP1015890B1; US6100072A; AU7129598A

Abstract

(57)【要約】血漿サンプル中のプロトロンビン時間および/またはフィブリノーゲンレベルを決定するための、液体試薬および凍結乾燥された試薬が開示される。試薬は、好ましくは、組換えウサギ組織因子に基づく。固有の特性を有する組換えウサギ組織因子の精製された調製物、RT試薬を製造するための新規の方法もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウサギ組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬発明の分野本発明は、一般に、凝固系における欠乏症を決定するためのプロトロンビン時間試薬の分野に関し、より詳細には、組換えウサギ組織因子、および天然または合成の供給源いずれかに由来するリン脂質を用いてなされるプロトロンビン時間試験のための試薬に関する。本発明はまた、精製された組換えウサギ組織因子の調製物、および試薬を製造するための新規の方法を含む。発明の背景トロンボプラスチンとも呼ばれる組織因子は、膜結合糖タンパク質であり、これは血液凝固第VII因子および第VIIa因子と複合体を形成することによって機能する。組織因子の活性は、タンパク質と会合しているリン脂質の存在に依存する。Bach，Ronald R.、「Initiation of Coagulation by Tissue Factor」、CRC C ritical Reviews in Biochemistry 23(4): 339-368(1988)。第VII因子および第V IIa因子の組織因子との複合体化は、それらのタンパク質分解活性を非常に増強する。複合体は、凝固カスケードの固有の、そして共通の経路を含む一連の酵素を活性化し、最終的にトロンビンの形成を導き、トロンビンは、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒し血餅の形成を生じる。Nemerson，Yale、「Tiss ue Factor and Hemostasis」Blood 71: 1-8(1988)。診断試験（例えば、プロトロンビン時間（PT）試験）は、この一連のインビボでの酵素事象を、制御された条件下で利用して、患者の血液凝固系における欠乏症を診断し、そして抗凝固治療において患者をモニターする。PT試験において、凝固を誘導する試薬は、患者の血漿のサンプル中に添加される。全てのPT試薬は、凝固を誘導する成分として組織因子を含む。血餅形成が血漿サンプル中で起こるためにかかる時間は、プロトロンビン時間すなわちPT値である。ほとんどの市販のPT試薬は、天然の供給源（例えば、ウサギ脳、ウサギ脳/肺混合物、ヒト胎盤、またはウシ脳）から抽出された粗組織因子を含有する。粗抽出物は、天然の産物なので、しばしば製造単位ごとに均一性を欠く。例えば、ウサギ脳トロンボプラスチンは、季節的な可変性を示す。天然の抽出物での別の問題は、夾雑物の存在である。例えば、ヒト組織因子は、HIVまたは他のヒトウイルス疾患の供給源であり得、そして多くの天然のトロンボプラスチンはまた、PT値に有害な影響を与え得る他の外来性の凝固因子を含む。これらのいくつかの問題を克服する試みにおいて、組換え組織因子が、PT試薬を製造するために用いられてきた。例えば、組換えヒト組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬は、公開されたPCT出願WO93/07492に記載されている。しかし、ヒト組織因子は、ビタミンＫの非存在かまたはアンタゴニストによって誘導されるタンパク質（PIVKA）に感受性である。このことは、PT時間を変更し、そしてPT試験において不正確な結果を与えることが示されている（Kovacs M.J.ら、「Assessment of the validity of the INR system for patients with liver i mpairment」Thromb Haemost，(1994); 71:727-30、ならびにSpaethe，R.およびS hirley，I．「Comparison of a highly sensitive rabbit brain thromboplasti n，Dade Thromboplastin FS，with a human brain thromboplastin，Manchester Comparative Thromboplastin」in Thromboplastin Calibration and Oral Anti coagulant Control，A.M.H.P．van den Besselaar，H.R．GralnickおよびS.M．L ewis（編）Martinus Nijhoff Publishers(1984)、197-206頁)。PIVKAは、しばしば抗凝固治療を受けている患者、または肝臓疾患もしくはビタミンＫ欠乏症を引き起こす他の疾患を有する患者に存在する。したがって、ヒト組織因子に基づく PT試薬は、上昇したPIVKAレベルを有する患者由来の血漿サンプルとともに用いられた場合、不正確なPTを提供し得る。発明の要旨本発明は、組換え体ウサギ由来の組織因子を含有するプロトロンビン時間試薬、組換えウサギ組織因子の調製物、および組換え組織因子に基づく試薬の製造方法に関する。本発明はさらに、血漿サンプル中のPT値およびフィブリノーゲンレベルを、本発明の試薬を用いて決定する方法に関する。１つの局面において、本発明は、血漿サンプル中のプロトロンビン時間および /またはフィブリノーゲンレベルを決定するための試薬に関し、ここで、この試薬は、組換え組織因子タンパク質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびこれらの組合せからなる群より選択されるリン脂質、緩衝液系、ならびにカルシウムイオンを含む。試薬は、液体形態または凍結乾燥の状態であり得、そして必要に応じて、他の成分（安定剤、抗菌剤、殺生物剤などを含む）を含有し得る。別の局面において、本発明は、有益な特性を有する組換えウサギ組織因子の精製された調製物に関する。本発明の組換えウサギ組織因子は、Ｎ末端からＣ末端までを規定するアミノ酸配列：細胞外ドメイン、脂質結合ドメイン、細胞内ドメイン、および組換え組織因子を選択的に富化するためのアフィニティータグを含む。精製された調製物は、アフィニティータグを有さない組換えウサギ組織因子タンパク質に比較して、脂質結合ドメインを有する組換え組織因子タンパク質について富化される。別の局面において、本発明は、PTまたはフィブリノーゲンレベルを決定するための試薬を調製するための再脂質化（relipidation）法に関する。この方法は、 (a) リン脂質小胞を含有する溶液、懸濁液、または分散液（dispersion）を提供する工程；(b) 組織因子タンパク質を上記の溶液、懸濁液、または分散液と混合する工程；および(c) その混合物を、上記タンパク質のリン脂質小胞との会合を可能にする条件下で、十分な時間インキュベートする工程を包含する。この方法は、天然または組換え組織因子タンパク質とともに使用され得る。タンパク質は、好ましくは、組換え組織因子タンパク質である。現在好ましい実施態様において、タンパク質は、組換えウサギ組織因子タンパク質であり；より好ましくは、本明細書中に記載される精製された組換えウサギ組織因子調製物である。本発明は、本方法により製造される試薬をさらに含む。図面の簡単な説明図は、従来のウサギ組織因子に基づくプロトロンビン時間試薬を用いて決定されたフィブリノーゲンレベルに対する、組換えウサギ組織因子に基づく試薬を用いて決定されたフィブリノーゲンレベルの比較を示すグラフである。発明の詳細な説明規定のリン脂質および他の安定剤を有する組換え組織因子に基づく試薬が、開発されている。この試薬は、液体かまたは凍結乾燥された処方物のいずれかであり得、そして患者サンプル中のフィブリノーゲンレベル、凝固因子活性パーセント、プロトロンビン時間、PT活性パーセント、PT比、および国際規格化比(Inter national Normalized Ratio(INR))を、臨床的凝固装置を用いて、または手動の方法により決定するために有用である。この試薬は、最低でも、組換え組織因子タンパク質（「組織因子」はまた、ときどき本明細書中で「トロンボプラスチン」といわれる）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびこれらの組合せからなる群より選択されるリン脂質、緩衝液系、およびカルシウムイオンを含む。この試薬は、好ましくは、他の成分（例えば、安定剤、抗菌剤、および/または殺生物剤を含む）をさらに含む。現在好ましい実施態様において、組換え組織因子タンパク質は、組換えウサギ組織因子タンパク質であり、そしてリン脂質は、合成リン脂質である。組織因子タンパク質の脂質に対する比は、約0.05μgタンパク質/１mgのリン脂質〜約 30μgタンパク質/１mgのリン脂質であり得る。好ましい範囲は、約0.2〜約20μg タンパク質/１mgのリン脂質である。好ましい実施態様において、試薬は、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンの混合物を約5:95〜約95:5の比で含む。より好ましいホスファチジルセリン/ホスファチジルコリン比は、約15:85 〜約60:40である。現在の好ましい実施態様において、ホスファチジルセリン/ホスファチジルコリン比は、約20:80〜約30:70である。この試薬は、好ましくは、血漿サンプルの凝固に必要な量のカルシウムイオンを含有する。現在の好ましい実施態様において、カルシウムイオン濃度は、約１〜約20mMである。カルシウムイオンは、好ましくは、塩化カルシウム（CaCl₂）として添加されるが、他の水溶性カルシウム塩（例えば、グルコン酸カルシウム）が用いられ得る。本発明において、好ましい緩衝液は、Hepes緩衝液であるが、他の緩衝液（例えば、Trisまたはイミダゾール緩衝液）が用いられ得る。緩衝液の好ましい濃度は、血漿サンプルの最適な凝固に必要な量である。緩衝液濃度は、好ましくは、約25mM〜約100mMの範囲であり、最も好ましくは約50mMである。緩衝液は、好ましくは以下を含む：NaCl(約25〜150mM)、グリシン(約0.1〜10.0％)、ウシ血清アルブミン(約0.1〜1.0％)、デキストラン(約0.1〜10.0％)、ポリエチレングリコール(約0.1〜５％)、塩化カルシウム(約１〜20mM)、オマジンナトリウム（sodiu m omadine）のような抗菌剤(約0.03〜0.05％)、シプロフロキサシン(約0.05〜0. 1mg/mL)、および/またはプロピオン酸(約20〜200mM)、ならびに試薬のヘパリン感受性を調整するためのヘパリンアンタゴニスト（例えば、ポリブレン）(約1〜 50g/mL)。本発明の試薬処方における使用のための好ましい組換え組織因子は、組換えウサギ組織因子である。組換えウサギ組織因子は、周知のクローニング技術を用いて調製され得る。組換えウサギ組織因子のクローニングおよびスクリーニングは、AndrewsらによりGene，98: 265-269(1991)に記載された。ウサギ組織因子遺伝子を得るためのDNAを含むcDNAライブラリーは、Stratageneより市販されている。本発明の試薬における使用のために現在最も好ましい組換えウサギ組織因子は、脂質結合ドメインにおいて富化される組換えウサギ組織因子の精製された調製物であり、これは本明細書以下に記載される。本発明はさらに、組換えウサギ組織因子の新規の精製された調製物に関する。本発明の組換えウサギ組織因子は、アフィニティー技術による精製を容易にするような様式で操作されている。この操作設計を用いて、タンパク質の脂質結合配列（これは、生物学的活性に重要である）は、精製タンパク質においてインタクトである。この設計は、規定の合成リン脂質のブレンドのリポソーム（またはリン脂質ビヒクル）への組織因子タンパク質の再脂質化を容易にする。組換えウサギ組織因子の本発明の精製調製物は、Ｎ末端からＣ末端まで：細胞外ドメイン、脂質結合ドメイン、細胞内ドメイン、および脂質結合ドメインについての精製産物を選択的に富化するためのアフィニティータグ、を規定するアミノ酸配列を含む。得られる精製調製物は、アフィニティータグを欠く組換え組織因子タンパク質調製物に比較して、脂質結合ドメインを有する（すなわち、有意により大きいレベルの脂質結合ドメインを有する）組換え組織因子タンパク質について富化される。アフィニティータグは、組換え組織因子タンパク質を精製するために用いられる選択された固相に対し、親和性を有するアミノ酸配列である。アフィニティータグは、好ましくは、複数の連続的に連結したアミノ酸であり、最も好ましくはヒスチジンである。現在好ましい実施態様において、アフィニティータグは、ヒスチジンヘキサマー(His)₆である。組換えウサギ組織因子タンパク質の本発明の精製された調製物は、価値のある特徴を有し、これにより本発明のPT試薬における使用に特に良好に適するようになる。例えば、精製法を経るタンパク質の脂質結合領域の保護は、そのタンパク質がリン脂質と接触した場合に、得られる精製調製物（これは、脂質結合ドメインにおいて富化される）を再脂質化に対してより敏感にする。本発明のタンパク質調製物は、望ましくは約1.0のISI値を有するプロトロンビン時間試薬を製造するために用いられ得る。ウサギ組織因子タンパク質を利用する試薬は、PIVKAに対して、ヒトまたはウシの組織因子を含有する試薬ほど感受性ではない(Hemker ら、Kinetic aspects of the interaction of blood clotting enzymes．III．D emonstration of an inhibitor of prothrombin conversion in vitamin K defi ciency．Thromb Diath Haemorrh，(1968); 19: 346-63、およびDenson KWE，Thr omboPlastin-sensitivity，Precision and other Characteristics．Clin Lab H aematol．(1988); 18: 315-28)。本発明の組換えウサギ組織因子タンパク質は、当該分野で認識されている技術を用いてウサギ組織因子の遺伝子を有する転移ベクターで形質転換された酵母細胞から得られ得る。上述のように、ウサギ組織因子の配列は、公知である(Andre wsら、Gene（1991）98: 265-269)。酵母クローニング系は、市販されている(例えば、Invitrogenから)。本発明において、タンパク質を発現する形質転換酵母細胞は、破壊され、そしてそのタンパク質は、以下の方法によって精製される：複数の連続的に連結されたヒスチジン残基を含むヒスチジンテイルは、組換えウサギ組織因子タンパク質のＣ末端に共有結合的に連結される。ヒスチジンタンパク質複合体が金属キレートカラムに適用される場合、結合タンパク質のヒスチジン部分は、カラムに結合する(Hochuliら、Biotechnology、1321頁、1988年11 月)。金属キレートカラムは、キレート機能（例えば、EDTA）を有して誘導体化され、そしてそのキレート機能と複合体化された金属を有する樹脂を含む。この目的に好ましい金属としては、銅、亜鉛、コバルト、およびニッケルが挙げられる。ニッケルは、この目的のために現在最も好ましい。ヒスチジンタグ化タンパク質は、以下の現在好ましい手順に従って調製され得る。この手順において、６つのヒスチジン残基が、組換えウサギ組織因子タンパク質のＣ末端に付加される。しかし、得られるHis-タグ化タンパク質が、その生物学的活性を保持し、そして金属キレートカラム上で保持し得る場合には、他の His-タンパク質が調製され得る（例えば、任意の所望の数のヒスチジン残基が、組換えウサギ組織因子タンパク質のＣ末端に付加され得る）。所望ならば、His- タンパク質は、当該分野で公知の他のタンパク質精製技術を用いてさらに精製され得る。ウサギ組織因子遺伝子を含むDNAフラグメントは、cDNAライブラリーから当該分野で公知の方法により単離される。次いで、DNAフラグメントは、制限エンドヌクレアーゼで消化されて、ウサギ組織因子をコードするDNAを含む制限フラグメントを生成する。次いで、組織因子をコードする制限フラグメントは、プラスミドのポリリンカー部位にクローニングし、このプラスミドは、その挿入される DNAを酵母発現ベクターにおいて有用なプロモーターの制御下に配置することにより、挿入されるDNAの発現を可能にする。次いで、ウサギ組織因子をコードするプラスミドは、適切な酵母宿主株中へ形質転換され、そしてHis-ウサギ組織因子をコードするDNAを含む組換えクローンが単離される。ウサギ組織因子をコードするクローンは、細胞培養物の所望の光学密度に達するまでウサギ組織因子遺伝子の過剰発現を可能にしない条件下で増殖される。次いで、培養物は、His-ウサギ組織因子タンパク質を誘導され、そして細胞を収集するまで細胞を増殖させる。次いで、細胞は遠心分離され、そして所望ならば、ペレットは使用の準備が整うまで凍結され得る。ウサギ組織因子は、細胞ペレットから以下のように精製される。細胞ペレットは、解凍され（事前に凍結されている場合）、そして溶解緩衝液中に再懸濁される。細胞は、破壊され、そして細胞細片は、高速遠心分離によって除去される。上清は、予め平衡化した金属（例えば、ニッケル、コバルト、銅、亜鉛）キレートカラムに適用された後、使用の準備が整うように澄明化されそして中和される。ウサギ組織因子（RTF）は、260アミノ酸残基の糖タンパク質である。RTFによるFVIIへの結合およびRTFによるFVIIによる活性化に関する特定の詳細は公知ではないが、RTFとHTFとの間の公知の匹敵する比活性および配列ホモロジーに基づいて、HTF中の領域に類似のRTF中の領域が、同等に重要であり、そして等価な機能を果たすことを予想することは、科学的に合理的である。その機能は：結合：アミノ酸43〜80 アミノ酸127〜166 アミノ酸184〜207（２番目のCysループ）アミノ酸218〜239（膜貫通または脂質結合領域）（不可欠）アミノ酸155〜165、および184〜207（２番目のCysループ）は、結合および活性化機能の両方を共有し、そして糖タンパク質の細胞外ドメイン内の中央に位置する。組換え組織因子の分解は、タンパク質分解活性のために、タンパク質のインビトロ発現の間に起こり得る。これらの分解された副産物は、タンパク質のＮ末端かまたはＣ末端のいずれか由来のアミノ酸領域を欠失している傾向がある。組織因子の構造/機能の関係の現在の知識に基づいて、以下の分析は、アミノ酸の欠失している領域が、組織因子の機能的活性に対して有する効果を示す。Ａ．タンパク質のＮ末端側から分解が起こる場合、その効果は、結合領域を含む可能性が非常に高く、おそらくFVIIに対する結合親和性を低減する。この分解の結果、全体的な組織因子活性が弱まる。Ｂ．分解が、タンパク質のＣ末端側から起こる場合、結合特性をおそらく含まないが、FVIIの活性化に必須の膜貫通領域（アミノ酸218〜239）のいくつかまたは全部を含み、これらの分解産物をFVIIaに対してはなお反応性であるがFVII には非反応性にしている。その全体的な結果としては、FVII分子について同等に競合している産物とFVIIaに対して同等に反応性であるがFVIIに対する異なる反応性を有する産物との混合物である。その結果、完全な産物に対する分解された産物の比に依存して、FVII に対してよりもFVIIaに対してより高い感受性を得る。上記の両方の場合は、異なる状況に起因して、FVII/FVIIaの比の時間的変化を提示するサンプル中で異なって現れる：・（Ｂ）の場合からの組織因子が用いられて、それらのサンプルを異なる時間に試験する場合、それらの結果は異なる。・（Ａ）の場合からの組織因子が用いられて、それらのサンプルを異なる時間に試験する場合、それらの結果は、比の変化により影響を受けない。上記の問題を回避するために、６ヒスチジン((His)₆)のテイルをコードする配列が、組換えRTF配列の3'末端（タンパク質のＣ末端に等価）に結合された。この設計は、以下を達成する： (a) 属親和性クロマトグラフィーを用いることによって精製を容易にする；および (b) 端分解産物（Ｂの場合）の排除を最大にする。なぜなら、これらは、(His )₆テイルを欠失し、そしておそらく完全な産物で精製されないからである。精製のためのウサギ組織因子タンパク質の3'末端上の(His)₆テイルの結合は、この特定の問題の発生を最小にする。別の言い方をすれば、本発明の組換えウサギ組織因子タンパク質の精製調製物を得るために使用される精製方法は、精製された産物中の脂質結合ドメインの存在を保存し、結果として、第VII因子：第VII a因子の比の変化に理論的により感受性でないウサギ組織因子タンパク質を得る。一旦、組み換え組織因子タンパク質が得られれば、PT試薬は、タンパク質を「再脂質化」してタンパク質および結合するリン脂質の複合体を形成することによって形成され、これは、天然のTFリン脂質複合体を模倣する。本方法において用いられるリン脂質は、天然または合成であり得る。本発明はさらに、新規のそして独特の再脂質化法に関する。組換え組織因子タンパク質の精製プロトコルにおいて、組換えタンパク質は、界面活性剤溶液中に抽出される（実施例２を参照のこと）。先行技術の方法では、膜タンパク質は界面活性剤で可溶化されたリン脂質中に添加され、その結果、リン脂質-タンパク質-界面活性剤の等方性混合溶液を生じる。その後、界面活性剤は、透析、接線方向（tangential）濾過、希釈、または吸着のような方法によって除去されなければならない(Moller，J.V.ら、Prog．Protein-Lipid Interact.，(1986)，2: 1 47-196)。現在の技術水準において、膜貫通タンパク質のための再脂質化プロトコルは、界面活性剤除去のための複雑な手順を必要とする。本発明の再脂質化手順において、界面活性剤で可溶化された組換えタンパク質は、リン脂質ブレンド（これは、界面活性剤を含まない）と組み合わされる。予想外にも、本発明者らは、界面活性剤で可溶化した組織因子タンパク質とリン脂質を混合した後の界面活性剤の除去が、完全に活性なそして安定な組織因子調製物を得るために必要でないことを見出した。本発明の再脂質化法において、組換え組織因子を含有する溶液は、規定の合成リン脂質ブレンドと組み合わされる。合成リン脂質ブレンドは、好ましくは、1, 2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン（ホスファチジルコリン）および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-L-セリン]（ホスファチジルセリン）を、好ましいモル比で含み、所望のプロトロンビン時間を得る。この方法は、以下の工程：(a) リン脂質小胞または所望の合成リン脂質のリポソームを含有する水溶液、懸濁液、または分散液を提供する工程；(b) 界面活性剤-可溶化組織因子タンパク質を上記水溶液、懸濁液、または分散液と混合する工程；および (c) 工程(b)で生成された混合物を上記タンパク質が上記リン脂質小胞と会合することを可能にするのに十分な条件下、および十分な時間でインキュベートする工程、を包含する。この方法は、工程(c)の後に得られる溶液をカルシウムイオンを含む緩衝液と混合するさらなる工程をさらに包含し得る。得られる処方物は、単一のウイルス試薬であり得、これは液体または凍結乾燥されたもののいずれかであり得る。この処方ストラテジーは、この試薬の製品ごとの均一性を改善する。ヘパリンまたは他の抗凝固剤に対する感受性は、ポリブレンのようなヘパリンアンタゴニストの添加によって調整され得る。本発明の試薬は、プロトロンビン時間の測定、フィブリノーゲンレベルの決定、経口抗凝固治療における患者のモニタリング、および因子レベルの測定を含む多くの適用を有する。この試薬は、第II因子、第V因子、第VII因子、および第X 因子の活性を検出する固有の凝固経路を活性化する。全体の因子の活性化パーセントは、この経路内での臨床的徴候を示唆し得る。この試薬はまた、経口抗凝固剤（例えば、クマジン(coumadin)（ワルファリンとしても知られる）で治療中の患者の臨床的モニタリングのために用いられ得る。クマジンは、ビタミンＫアンタゴニストであり、投与された場合に、ビタミンＫ依存因子（第II因子、第VII因子、第IX因子、および第X因子）、プロテインＣ、ならびにプロテインＳのグルタミン残基をカルボキシル化する肝臓の能力を妨害し得る。第II因子、第VII因子、第IX因子、および第X因子の非カルボキシル化形態は、正確な翻訳後修飾を欠き、従ってより機能的ではなく、結果として血餅形成の延長化を生じる。これらのタンパク質産物は、代表的にPIVKA（ビタミンＫ不在またはアンタゴニストによって誘導されるタンパク質）と呼ばれる。HemkerおよびJie、第５章、「Pro teins induced by vitamin K absence(PIVKAs): effect of coumarins on circu lating clotting factors」，Oral Anticoagulants，L．PollerおよびJ．Hirsh( 編)、Arnold（1996）を参照のこと。本発明のウサギ組換え組織因子はまた、プロトロンビン時間（PT）の任意の改変を開発するために用いられ得る。本発明の試薬が使用され得るこのような改変されたPT試験の例は、以下を含む：１）プロトロンビン消費試験第V因子、第VII因子、第IX因子、もしくは第XI因子、または第XII因子の欠乏症の検出のための一般化したスクリーニング試験は、Palkuti HS.によって「Labor atory monitoring of anticoagulant therapy.」J．Med．Tech.，(1985)，2:81- 86に；およびOwen CA Jr.，Thompson JH Jr.によって「Soybean phosphatides i n prothrombin-consumption and thromboplastin-generation tests: their use in recognizing thrombasthenic hemophilia」Am．J．Clin．Pathol.，(1960); 33:197-208に記載される。Biggs R，Douglas AS．「The thromboplastin gener ation test」J．Clin．Pathol.，(1953)，6:23-29。２）プロトロンビンプロコンバーチン（proconvertin）試験経口抗凝固剤治療の第II因子、第VII因子、第IX因子、および第X因子に対する効果を反映するスクリーニング試験は、Owren PA，Aas Kによって「The control o f dicumarol therapy and the quantitative determination of prothrombin an d proconvertin」Scand．J．Clin．Lab．Invest.，3:201-208に;およびWare AG, Stragnell R．「An improved on-stage prothrombin method」Am．J．Clin．Pat hol.，(1952)，22:791-797に記載される。３）組織トロンボプラスチン阻害試験プロトロンビナーゼ複合体の構成を妨害するループス様インヒビターの能力を増強することによって、これらのインヒビターを検出するスクリーニング試験。参考文献：Brandt JT，Triplett DA．「The effect of phospholipid on the de tection of lupus anticoagulant by the dilute Russell viper vernom time」 Arch．Pathol．Lab．Med.，1989; 113:1376-1378。本発明の組換えウサギ組織因子ベースのPT試薬は、PIVKAに対するより低い感受性を有し、したがって、経口抗凝固治療中の患者および肝臓障害を有する患者をモニターするために有用である(Denson，K.W.E.ら「The Characterisation of Recombinant Rabbit Tissue Factor（rRTF）and the PIVKA Inhibitor」公開のために提出済)。ヒトトロンボプラスチンに基づく現在利用可能な試薬は、そのP IVKAに対する感受性のために、これらの患者への使用に好適でないかもしれない。従来の試薬と本発明の試薬との間の差異は、INR（国際規格化比）値に反映され得、そこで、ヒトトロンボプラスチンに基づく試薬は、ワルファリンコントロールおよび肝臓患者において偏差を示す(Kovacs，M.J.ら、「Assessment of the Validity of the INR System for Patients with Liver Impairment」Thromb． Haemost.，71: 727-730(1994))。本発明のウサギベースの組換えPT試薬の利点は、このようなINRの偏差の減少であり、これは、患者における経口抗凝固剤治療および肝臓障害の両方のモニタリングにおけるこの試薬の適用を可能にする。従って、INR系は、経口抗凝固剤治療中の患者由来の血漿、または患者の血漿中のP IVKAからの任意の妨害のない肝臓障害の任意の型を有する患者に関して使用し得る。 PT時間およびフィブリノーゲンレベルは、本発明の試薬を、現在利用可能な臨床的凝固分析機（例えば、Instrumentation Laboratory，Lexington，MAから入得る。代表的なプロトコルにおいて、100μlのPT試薬および50μlの血漿は、37℃の温度に温められる。次いで、試薬および血漿サンプルは、混合され、これは凝固反応を誘発する。血餅の形成は、検出器によって、例えば、サンプルの光学密度の変化、または粘度の変化によって検出される。血餅を形成するために必要とされる時間の量は、プロトロンビン時間である。このプロセスは、代表的には完全に自動化されるが、手動でも行われ得る。自動化プロセスでは、臨床医は、単に試薬および血漿サンプルを自動化凝固分析機にロードすればよく、その自動分析機は、加熱、混合、および検出の工程を行う。これらのプロトコルにおいて、フィブリノーゲンレベルは、以下の工程により決定され得る。外因性のカスケードの終点で生成されるトロンビン（第IIa因子）は、患者の血漿サンプル中のフィブリノーゲンをフィブリンに転換する。フィブリン分子は、自己凝集して血餅を形成する。吸光度または光散乱の変化は、サンプル中に存在するフィブリノーゲンの量に正比例し、そして適切なアルゴリズムを用いて決定され得る(図１を参照のこと)。本発明の試薬は、自動化および半自動化PTアッセイのためのほとんどの臨床的装置において、ならびに手動の方法において現在使用されているPT試薬の代わりに用いられ得る。現在市場で入手可能なプロトロンビン時間試薬の大部分は、粗ウサギ組織因子に基づき、そして本発明の試薬よりも大きな製品ごとの可変性を有する。本発明の試薬を使用して、経口抗凝固剤治療についての所望の感度（IS I≒1.0）が達成され得、その一方で、現在使用されている粗ウサギベースの試薬に類似する因子感受性を維持し得る。以下の実施例は、本発明の特定の実施態様の局面を例示することが意図され、いかなる様式においても限定的であることは意図されない。実施例実施例１組換えPT試薬処方−一般的プロトコル。以下のプロトコルは、組換えウサギ組織因子が、最適な組織因子対リポソーム比で規定のリポソーム組成物中に再脂質化される、PT試薬の調製物を記載する。再脂質化の後、タンパク質-リン脂質複合体を、カルシウム、ポリブレン(ヘパリンアンタゴニスト)、および安定剤を含有する処方緩衝液に添加する。処方物を、再脂質化タンパク質の添加による正常な制御のために、約10〜13秒のPT時間に達するまで調整する。リポソーム懸濁液の調製および組織因子再脂質化 0.5〜10mMの規定の組成物（ホスファチジルセリン/ホスファチジルコリン、15 :85〜30:70 M/M）の合成リン脂質ブレンドを親水性ポリビニリデンフルオライドフィルターを通して濾過する。実施例２に記載のように調製された0.1％非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中の組換えウサギ組織因子を含有するストックタンパク質調製物を、1:10〜1:1500で濾液中に希釈する。タンパク質のリン脂質に対する比は、所望のプロトロンビン時間を達成するように最適化し得る。組織因子タンパク質をリポソーム懸濁液とともに37℃で最低30分間インキュベートし、タンパク質のリポソーム小胞との会合を確実にする。インキュベーション工程の後、タンパク質/リン脂質を、所望の試薬特性を達成するような様式で処方する。タンパク質/リン脂質を、以下に記載のように、10〜80倍の希釈範囲で処方緩衝液に添加する。脂質処方物の調製処方緩衝液（好ましくは、50〜100mMのHepes）を、調製する。この緩衝液には、NaCl(150mM)、グリシン(１％)、ウシ血清アルブミン(0.3％)、ポリエチレングリコール(２％)、塩化カルシウム(10mM)、オマジンナトリウムのような抗菌剤(0 .05％)、シプロフロキサシン(0.05mg/mL)、および/またはプロピオン酸(20mM)、ならびに試薬のヘパリン感受性を調整するためのポリブレンのようなヘパリンアンタゴニスト（５μg/mL）が含まれる。この処方緩衝液（0.2μのフィルターで濾過される）に、タンパク質-リン脂質混合物を添加する。次いで、液体処方物を所定の時間、37℃でインキュベートする。所望のプロトロンビン時間（すなわち、通常のPT時間10〜13秒）に達するために、タンパク質-リン脂質混合物の量を、必要な場合、増加し得る。処方物中の賦形剤を調整することによって、処方物を、因子に対する所望の感受性、およびISI（ISI≒1.0）に達するように最適化し得る。表Ｉは、好ましい範囲を用いて上記の方法に従って調製された、３つの液体試薬処方物製品の製品ごとの再現性を示す。PTは、100μLの試薬（組換え体ウサギ PT試薬）を50μLの患者の血漿中に添加し、そして外因性の経路の活性化を開始することによって得られる。この結果、最終的に固体ゲルの形成を伴ってフィブ umentation Laboratory，Lexington，MA）を用いて、製造者により推奨されたプロトコルに従って決定した。得られた結果は、ISIおよびプロトロンビンの時間測定（これは、重要な臨床的考慮である）に関して、試薬の製品の一貫性を示す。凍結乾燥処方物の調製処方緩衝液（好ましくは、50〜100mMのHepes）を、調製する。この緩衝液には、NaCl(50mM)、グリシン(５％)、ウシ血清アルブミン(0.3％)、デキストラン(５％)、塩化カルシウム(10mM)、オマジンナトリウムのような抗菌剤(0.05％)、シプロフロキサシン(0.05mg/mL)、および試薬のヘパリン感受性を調整するためのポリブレンのようなヘパリンアンタゴニスト(５μg/mL)が含まれる。この処方緩衝液（0.2μのフィルターで濾過されている）に、タンパク質-リン脂質混合物を添加する。次いで、この処方物を所定の時間、37℃でインキュベートし、その後凍結乾燥する。所望のプロトロンビン時間（すなわち、通常のPT時間10〜13秒）に達するために、タンパク質-リン脂質混合物の量を、必要な場合、増加し得る。処方物中の賦形剤を調整することによって、処方物を、因子に対する所望の感受性、およびISI（ISI≒1.0）に達するように最適化し得る。表IIは、好ましい範囲を用いてこの方法に従って作製された、３つの凍結乾燥された試薬処方物製品の製品ごとの再現性を示す。凍結乾燥された試薬を水中で再構成し、そしてPT（プロトロンビン時間）を決定した。PTは、100μLの試薬（組換え体ウサギPT試薬）を50μLの患者の血漿中に添加し、そして外因性の経路の活性化を開始することによって得られる。この結果、最終的に固体ゲルの形成を伴ってフィブリノーゲンがフィブリンへ変換する。プロトロンビン時間を、均測定（これは、重要な臨床的考慮である）に関して、これらの製品の一貫性を示す。組換え体ウサギPT試薬をまた用いて、フィブリノーゲンレベルを測定し得、これは、PTの結果にさらなる診断的価値を提供する。表IIIは、自動化臨床凝固分線の結果の例を示す。PTおよびフィブリノーゲン値を、上記のように、100μLの試薬（組換え体ウサギPT試薬）を、50μLの血漿に添加し、そして外因性の経路の活性化を開始することによって得る。割り当てられたフィブリノーゲン値を有するキャリブレーターとしての血漿を希釈して、キャリブレーション曲線を得る。血漿サンプルのPTおよびフィブリノーゲン濃度を、血餅形成の間の吸光度または光散乱に連関させることによるトロンボキネティック（thrombokinetic）測定によって同時に決定し得る。図Ｉは、従来のウサギトロンボプラスチンに比較して、組換え体ウサギPT試薬を用いて決定される血漿サンプル由来のフィブリノーゲン値（mg/dL）を示す(相関＝0.998)。従来のトロンボプラスチンは、IL Test^TM PT-fib H5 Plus(P/N 84698-10)（Instrumentation Laboratory，Lexington，MA から入手可能）であった。実施例２組換えウサギ組織因子の酵母からの産生組換えウサギ組織因子（rRTF）を、以下の一般プロトコルに従って得られる組換えPichia pastoris細胞中で産生する：完全なRTF遺伝子を有するDNAのフラグメントを、Stratagene（カタログ番号93 6902）から購入した市販のλZapII中のRabbit Heart cDNAライブラリーから単離した。 (His)₆テイルをコードする配列を、RTF遺伝子の翻訳された配列の3'末端に添加し、そしてPichia pastoris移入ベクターpHIL-S1（Invitrogenから入手）と適合するように操作し、そしてそれに挿入してPHO1シグナル配列とインフェーズ(i n phase)に、そしてAOX1プロモーターの指向下になるようにする。このプラスミドに含まれる目的の他の配列は、以下のものである：レスキューマーカーとしてのHIS4オープンリーディングフレーム Ampicillin耐性遺伝子 AOX1遺伝子の5'および3'末端の隣接領域（組換えを容易にするため）野生型Pichia pastoris GS115細胞（Invitrogenから入手）を、RTF遺伝子を有する上記の組換えP pastoris移入ベクターで形質転換した。組換えの後、単離されたRTF産生クローンの１つを、活性RTFのより高い発現、および培養条件を最適化することによって改善された産生に基づいて選択した。 rRTFを含む組換え酵母細胞を破壊し、そしてタンパク質を非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中で抽出した。好ましい緩衝液は、50mM PIPES、500mM NaCl 、0.76％ Emulphogen(pH7.8)であるが、他の緩衝液および非イオン性界面活性剤（例えば、Triton X-100またはNP-40）が代替となり得る。得られる粗ホモジネートを澄明化し、この溶液をpH7に調整し、pHを調整した混合物を緩衝液で希釈し、その後高速遠心分離に供することによってクロマトグラフィーのために調製した。rRTFを、澄明化したホモジネートから金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって単離した。カラムからの溶出に続いて、rRTFをpH 4、24℃での沈降化によってさらに濃縮し、そして高速遠心分離によって澄明化した。最後に、タンパク質溶液を中性pH に調整した。rRTFを含有する最終溶液は、50mM Tris-Acetate、500mM NaCl、0.1 ％ Emulphogen(pH7.1)の好ましい緩衝液中の100〜500μgタンパク質で構成された。上記のような他の非イオン性界面活性剤を含有する他の緩衝液組成が用いられ得る。生成物を、使用するときまで-70℃で保存した。24℃でのインキュベーションを除き、製造の全ての工程を４℃で行った。等価物当業者は、本明細書中の特定の開示に対する多くの等価物を確認し得る。このような等価物は、以下の請求の範囲に包含されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ブルゲラ，ポールアメリカ合衆国マサチューセッツ 02173，レキシントン，ハートウェルアベニュー 101 (72)発明者ルイズ，ジュアンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02173，レキシントン，ハートウェルアベニュー 101 (72)発明者サンチェズ―マーティンズ，デメトリオアメリカ合衆国マサチューセッツ 02173，レキシントン，ハートウェルアベニュー 101

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の工程を包含する、血漿サンプル中のプロトロンビン時間またはフィブリノーゲンレベルを決定するための液体試薬または凍結乾燥された試薬の調製方法： (a) リン脂質小胞を含有する溶液、懸濁液、または分散液を提供する工程； (b) 組織因子タンパク質を該溶液、懸濁液、または分散液と混合する工程；および (c) 工程(b)において生成された混合物を、該タンパク質の該リン脂質小胞との会合を可能にする条件下で、十分な時間インキュベートし、血漿サンプル中で凝固を誘導し得る試薬を生成する工程。２．前記工程(b)の単離された組織因子タンパク質が、組換えウサギ組織因子タンパク質である、請求項１に記載の方法。３．前記工程(c)のタンパク質含有リン脂質小胞を含有する溶液を処方緩衝液と混合するさらなる工程を包含する、請求項１に記載の方法。４．前記工程(b)の単離された組織因子タンパク質が、組換えウサギ組織因子タンパク質である、請求項３に記載の方法。５．請求項１、請求項２、請求項３、または請求項４に記載の方法により生成された試薬。６．前記タンパク質含有リン脂質小胞が、リン脂質１mgあたり約0.05μg〜約30 μgの単離されたタンパク質含有組織因子を含有する、請求項５に記載の試薬。７．前記タンパク質含有リン脂質小胞が、リン脂質１mgあたり約0.2μg〜約20μ gの単離されたタンパク質含有組織因子を含有する、請求項６に記載の試薬。８．前記血漿サンプルの凝固に必要な量のカルシウムイオンをさらに含む、請求項５に記載の試薬。９．前記血漿サンプルの凝固に必要なイオン強度をさらに含む、請求項８に記載の試薬。１０．Hepes緩衝液をさらに含む、請求項９に記載の試薬。１１．組換えウサギ組織因子の精製された調製物であって、該調製物は：Ｎ末端からＣ末端へ (a) 細胞外ドメイン、 (b) 脂質結合ドメイン、 (c) 細胞内ドメイン、および (d) 該組換えウサギ組織因子を選択的に富化するのに使用するためのアフィニティータグ、を規定するアミノ酸配列を含む組換えウサギ組織因子を含み、ここで、該精製された調製物は、アフィニティータグのない組換えウサギ組織因子に比較して、脂質結合ドメインを有する組換えウサギ組織因子タンパク質について富化される、調製物。１２．前記アフィニティータグが、複数の連続的に連結したヒスチジンアミノ酸を含む、請求項１１に記載の精製された調製物。１３．前記結合ドメインが(His)₆配列を含む、請求項１２に記載の精製された調製物。１４．前記組換えウサギ組織因子が、第VII因子および第VIIa因子と反応する、請求項１１に記載の精製された調製物。１５．前記組換えウサギ組織因子が、約1.0のISI値を有するプロトロンビン時間試薬を生成するために用いられ得る、請求項１１に記載の精製された調製物。１６．前記組換えウサギ組織因子が、ヒトまたはウシの組織因子と比較して、血漿サンプル中のPIVKAに対してより感受性でない、請求項１１に記載の精製された調製物。１７．本質的に以下からなる、血漿サンプル中のプロトロンビン時間またはフィブリノーゲンレベルを決定するための液体試薬または凍結乾燥された試薬： (a) 組換えウサギ組織因子タンパク質； (b) ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびこれらの組合せからなる群より選択されるリン脂質；および (c) 緩衝液系。１８．脂質に対するタンパク質の比が、約0.05μgタンパク質/mgリン脂質〜約30 μgタンパク質/mgリン脂質である、請求項１７に記載の試薬。１９．前記脂質に対するタンパク質の比が、約0.2μgタンパク質/mgリン脂質〜約20μgタンパク質/mgリン脂質である、請求項１８に記載の試薬。２０．前記リン脂質が、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンの混合物を、約5:95〜約95:5の比で含有する、請求項１７に記載の試薬。２１．前記リン脂質が、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンの混合物を、約15:85〜約60:40の比で含有する、請求項１７に記載の試薬。２２．前記リン脂質が、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンの混合物を、約20:80〜約30:70の比で含有する、請求項１７に記載の試薬。２３．前記緩衝液系が、血漿サンプルの凝固のために十分な量のカルシウムイオンを含有する、請求項１７に記載の試薬。２４．前記緩衝液系が、血漿サンプルにおける凝固を補助するために十分なイオン強度を有する、請求項１７または請求項２３に記載の試薬。２５．前記緩衝液系がHepesを含有する、請求項１７または請求項２３に記載の試薬。２６．前記緩衝液系がHepesを含有する、請求項２４に記載の試薬。２７．請求項１７に記載の試薬であって、前記組織因子タンパク質が、以下：Ｎ末端からＣ末端へ、 (a) 細胞外ドメイン、 (b) 脂質結合ドメイン、 (c) 細胞内ドメイン、および (d) 該組換えウサギ組織因子を選択的に富化するのに使用するためのアフィニティータグ、を規定するアミノ酸配列、を含む組換えウサギ組織因子の精製された調製物を含み、ここで、該精製された調製物は、アフィニティータグのない組換えウサギ組織因子に比較して、脂質結合ドメインを有する組換えウサギ組織因子タンパク質について富化される、試薬。２８．血漿サンプル中のフィブリノーゲンの量を測定するための方法であって、請求項５、請求項１７、または請求項２７に記載の試薬を用いる工程を包含する、方法。