JPH11501011A

JPH11501011A - 神経保護薬としての縮合ベンゾチアゾール類の利用

Info

Publication number: JPH11501011A
Application number: JP8525382A
Authority: JP
Inventors: ド・ブラバンデ，マルク・ジヨリス; ルサージユ，アンヌ・シモーヌ・ジヨセフイーヌ; レイセン，ジヨセフア・エドウアルダ・マリア・フランシスカ
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1995-02-23
Filing date: 1996-02-14
Publication date: 1999-01-26
Also published as: NZ302670A; US5955485A; WO1996025931A3; EP0814806A1; WO1996025931A2; KR19980701739A; AU4877696A; MX9706454A; AU702422B2; CA2212525A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、酸化的ストレスに伴う神経及び血管系の老化又は変性疾患に冒された人間の治療的又は予防的処置のための薬剤の製造のための、２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体の利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】神経保護薬としての縮合ベンゾチアゾール類の利用本発明は、酸化的ストレスに伴う神経及び血管系の老化又は変性疾患に冒された人間の治療的又は予防的処置のための薬剤の製造のための、２，３−ジヒドロ −イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体の利用に関する。２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体は、酵素モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）を阻害し、うつ病及びパーキンソン症候群の処置のための治療力を有する薬剤としてＵＳ−４，２６２，００４に開示されている。現在、実験により、そこに開示されているある種の２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体が試験管内及び生体内の両方において有力な酸化防止活性を有することが示されている。その酸化防止性を見ると、これらの誘導体は、酸化的ストレスに伴う神経及び血管系の変性疾患及び老化の処置において治療的有用性を有する。結局、本発明は酸化的ストレスに伴う神経及び血管系の老化又は変性疾患に冒された人間の治療的又は予防的処置のための薬剤の製造のための、２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体、製薬学的に許容され得る酸付加塩、立体化学的異性体、ならびに該誘導体、塩及び立体異性体の混合物の利用に関し、該誘導体は式（Ｉ）：［式中、Ｒ¹はＣ_l-10アルキル又はＣ_5-12シクロアルキルを示し、Ｒ²は水素又はＣ_1-10アルキルを示し；Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵はそれぞれ独立して水素又はＣ_1-4アルキルを示す］を有する。本発明はまた、酸化的ストレスに伴う神経及び血管系の老化又は変性疾患に冒された患者を、該老化及び変性疾患の経過及び／又は影響を改善する、停止させる、遅延させる又は緩和するのに有効な量の式（Ｉ）の２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体を該患者に投与することにより処置する方法にも関する。Ｃ_1-4アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル及びそれらの分枝異性体を定義する。Ｃ_1-10アルキルは炭素数が１〜１０の直鎖状もしくは分枝鎖状飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル及びそれらの分枝異性体を定義する。Ｃ_5-12 シクロアルキルは炭素数が５〜１２の単環状、ならびに可能なら２−及び３環状飽和炭化水素基、例えばシクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロノニル、シクロデシル、シクロウンデシル、シクロドデシル、ビシクロ［２．２．１］ヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル（ノルボルニル）、ビシクロ［２．２．２］オクチル、トリシクロ［３．３．１．１³,⁷］デシル（アダマンチル）などのシクロアルキル基を定義する。好ましいのは、Ｒ¹がＣ_4-10アルキル又はＣ_7-10シクロアルキルを示し；Ｒ²が水素を示す化合物である。Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵は水素を示すのが好ましく；Ｒ³及びＲ⁵はメチル、エチル、２−プロピル及び２−メチル−２−プロピルを示すこともできる。特に好ましいのはＲ¹が直鎖状Ｃ_6-10アルキル基、α−もしくはβ− 位において分枝しているＣ_4-10アルキル基、あるいは単環状Ｃ_7-10シクロアルキル基を示す化合物である。本発明の特定の化合物には：Ｎ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミン；及びＮ−ヘキシル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール− ７−アミンが含まれる。式（Ｉ）の化合物はＵＳ−４，２６２，００４に記載の方法に従って製造することができる。それらは塩基性を有するので、これらの化合物を適した酸で処理することにより製薬学的に許容され得るその酸付加塩の形態に転化することができる。適した酸は、例えば無機酸、例えばハロゲン化水素酸、例えば塩酸又は臭化水素酸；硫酸；硝酸；リン酸などの酸；あるいは有機酸、例えば酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サイクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、パモ酸などの酸を含む。上記で用いた付加塩という用語は式（Ｉ）の化合物及びその塩が形成することができる溶媒和物も含む。そのような溶媒和物は例えば水和物、アルコレートなどである。Ｎ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミンの好ましい酸付加塩は二塩酸塩である。製薬学的に許容され得ない塩は、式（Ｉ）の化合物、及びその化合物を含む組成物の製造において有用であり得る。酸化的ストレスは、組織内のオキシダントの作用、特に悪影響に関連する現象を言う。内因性の強いオキシダントは例えば超酸化物（Ｏ₂ ^-・）、過酸化水素（Ｈ₂Ｏ₂）、ヒドロキシラジカル（ＨＯ・）である。組織は中枢、末梢又は骨髄組織であることができ、特に血管系、神経系、腎臓、肝臓、心臓、すい臓、副甲状腺及び性腺に属することができる。組織細胞における酸化的ストレスはＤＮＡ損傷、タンパク質損傷及び脂質の過酸化に導き、後者は細胞膜の一体性及び機能の変化を生ずる。ラジカルから誘導される酸素による酸化的障害は現在一般に、神経変性障害の開始及び進行における重要段階であると考えられている。治療的処置は、神経及び血管系の該変性疾患の経過及び／又は影響の改善、停止、遅延又は緩和に有効な量でそのような誘導体を投与することを含む。予防的処置は、神経及び血管系の老化又は変性疾患の開始及び発生を予防又は遅らせるのに有効な量でそのような誘導体を投与することを含む。２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体の酸化防止活性を、ラジカルを掃去し、かくしてラジカル−誘導脂質過酸化及び細胞毒性を妨げるその能力により試験管内で示すことができる。神経細胞の培養物において、それらは既知の内因性酸化防止剤ビタミンＥ（α−トコフェロール）に代わることができる。式（Ｉ）の化合物の酸化防止活性は、培養物中のヒトの線維芽細胞を、培地におけるグルタチオン枯渇により誘導される細胞死に対してそれらが保護することでも理解される得る。式（Ｉ）の化合物の酸化防止活性はその親油性と比例していると思われる、すなわち酸化防止活性はＲ¹がより大きなアルキル又はシクロアルキル基を示すと共に増加する。酸化的ストレスに伴う且つ式（Ｉ）の化合物を用いる処理に感受性であると思われる神経及び血管系の疾患及び状態は、神経系の正常な及び病理学的変性である。特に該化合物は、例えば血栓塞栓発作、脳卒中、出血性発作、脳虚血、脳痙攣、脳老化、脳もしくは脊髄外傷、心停止、低血圧、心臓又は肺手術、重症の低血糖、無酸素症、低酸素症、周産期仮死における酸化的損傷又は障害に伴う中枢及び末梢神経系からのニューロン欠損の予防又は処置において；ならびに酸化的代謝過程が役割を果している神経変性疾患、例えばハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、老年痴呆、ピック病、コルサコフ病、オリーブ橋小脳萎縮、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ダウン症候群、グルタル酸血症、てんかん、痙攣状態、多発脳梗塞性痴呆、及びウィルス感染−誘導神経変性、特に神経−ＡＩＤＳ包含痴呆、認識困難症、進行性構語障害、運動失調、ＨＩＶ感染に伴うニューロパシー及びミオパシー、あるいは脳炎症を含むいずれかの疾患の緩和において治療的価値を有し得る。式（Ｉ）の化合物、特に好ましい化合物Ｎ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミン二塩酸塩はアルツハイマー病に冒された患者、ならびにＡＩＤＳ及び特に神経−ＡＩＤＳに冒された患者の処置に特別に有用であるこが期待される。アルツハイマー病は、記憶、言語、視覚−空間的技能（ｖｉｓｕｏ −ｓｐａｔｉａｌｓｋｉｌｌｓ）及び挙動の障害を特徴とする１種の進行性痴呆である。神経−ＡＩＤＳはＨＩＶ感染に伴う典型的状態であり、進行性脱髄を特徴とする中枢及び末梢神経系の感染として現れる。さらに、それらの酸化−防止性の観点から、式（Ｉ）の化合物は血管系の正常な、及び病理学的変性、例えばアテローム発生、アテロマトーシス（動脈の内皮の脂肪変性）、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、高血圧に伴う血管肥大、高リポタンバク質血症及び老化による正常な血管変性；性腺及び膵臓の血管症；副甲状腺反応性肥厚；慢性腎臓病；腫傷性疾患；ならびに炎症性疾患の予防又は処置においても用途を有し得る。本発明の薬剤として適した式（Ｉ）の化合物の製薬学的組成物は、当該技術分野において既知の１種又はそれ以上の賦形剤又は担体を含む。これらの１種又はそれ以上の賦形剤又は担体を適切に選ぶことにより、製薬学的組成物を経口的、直腸内、膣内、局所的、非経口的（筋肉内、皮下及び静脈内を含む）又は体内埋植投与に、あるいは吸入又は卵管通気法に適した形態に適応させられる。調剤は適宜、個別の投薬形態で与えるのが簡便である。そのような組成物の調製法は当該技術分野において周知であり、活性成分及び賦形剤を互いに緊密に混合することを特徴としている。すべての方法は活性化合物を液体担体又は微粉砕された固体担体、あるいは両方と一緒にし、次いで必要なら生成物を所望の製剤に成形する段階を含む。経口的投与のために、製薬学的組成物は固体投薬形態、例えば錠剤又はカプセルの形態をとることができ、それは結合剤（例えば予備ゼラチン化澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸カルシウム）；滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばポテト澱粉又はナトリウム澱粉グリコレート）；あるいは湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬学的に許容され得る賦形剤を用いて従来の方法により調製される。経口的投与のための液体製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁剤の形態をとることができ、あるいはそれらは使用前に水又は他の適したビヒクルを用いて構成するための乾燥生成物として与えられることができる。そのような液体製剤は、懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、メチルセルロース又は水素化食用脂肪）；乳化剤（例えばレシチン又はアラビアゴム）；非−水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油状エステル又はエチルアルコール）；ならびに防腐剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸）などの製薬学的に許容され得る添加剤を用いて従来の方法により調製されることができる。口中への局所的適用のために、製薬学的組成物は従来の方法で調製されるバッカル錠又は舌下錠、ドロップス、あるいはロゼンジの形態をとることができる。表皮への局所的投与のために、本発明の化合物はクリーム、ジェル、軟膏又はローションとして、あるいは経皮パッチとして調製されることができる。そのような組成物は、例えば水性又は油性基剤を用い、適した増粘剤、ゲル化剤、乳化剤、安定剤、分散剤、懸濁剤及び／又は着色剤を添加して調製されることができる。式（Ｉ）の化合物はデポ剤として調製されることもできる。そのような長期作用型調剤は、体内埋植（例えば皮下に、又は筋肉内に）により、あるいは筋肉内注射により投与されることができる。かくして例えば化合物を適したポリマー性もしくは疎水性材料（例えば許容され得る油中の乳液として）、又はイオン交換樹脂を用いて、あるいはわずかに可溶性の誘導体、例えばわずかに可溶性の塩として調製することができる。式（Ｉ）の化合物は、注射、簡便には静脈内、筋肉内又は皮下注射による、例えばボーラス注射又は継続的静脈内輸液による非経口的投与のために調製することができる。注射のための製剤は単位投薬形態で、例えばアンプルで、又は防腐剤が加えられた多投薬量容器で与えられることができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液又は乳剤の形態をとることができ、懸濁化剤、安定剤及び／又は分散剤などの調製剤を含有することができる。他の場合、活性成分は、例えば無菌の発熱物質−非含有水などの適したビヒクルで構成するための粉末の形態であることができる。式（Ｉ）の化合物は、例えば従来の座薬基剤、例えばココアバター又は他のグリセルドを含有する座薬又は保持性浣腸などの直腸用組成物として調製されることもできる。鼻内投与のために、式（Ｉ）の化合物を例えば液体スプレーとして、粉末として又はドロップの形態で用いることができる。吸入による投与のために、式（Ｉ）の化合物は簡便に、適したプロペラント、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適したガスを用い、加圧されたパック又はネブライザーからのエアゾールスプレー提供の形態で送達されることができる。加圧エアゾールの場合、計量された量を送達するバルブを設けることにより投薬単位を決定することができる。吸入器又はインサフレーターで用いるための、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを、本発明の化合物及び適した粉末基剤、例えばラクトース又は澱粉の粉末混合物を含有して調製することができる。上記の製薬学的組成物のいずれも従来の方法で、制御された放出形態を伴って与えることができる。式（Ｉ）の化合物の生物学的利用率を向上させるために、それらを適したシクロデキストリンと有利に調製することができる。適したシクロデキストリンは、シクロデキストリンの無水グルコース単位のヒドロキシ基の１つ又はそれ以上がＣ_1-6アルキル、特にメチル、エチル又はイソプロピル；ヒドロキシＣ_1-6アルキル、特にヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル又はヒドロキシブチル；カルボキシＣ_1-6アルキル、特にカルボキシメチル又はカルボキシエチル；Ｃ_1-6アルキルカルボニル、特にアセチル；Ｃ_1-6アルキルオキシカルボニルＣ_1-6アルキル又はカルボキシ−Ｃ_1-6アルキルオキシＣ_1-6アルキ、特にカルボキシメトキシプロピル又はカルボキシエトキシプロピル；Ｃ_1-6アルキルカルボニルオキシＣ_1-6アルキル、特に２−アセチルオキシプロピルで置換されたα−，β−，γ−シクロデキストリン、あるいはそのエーテル又は混合エーテルである。複合化剤及び／又は可溶化剤として特に注目されるのはβ−ＣＤ、２，６−ジメチル−β−ＣＤ、２−ヒドロキシエチル−β−ＣＤ、２−ヒドロキシエチル−γ−ＣＤ、２−ヒドロキシプロピル−γ−ＣＤ及び（２−カルボキシメトキシ）プロピル−β−ＣＤ、ならびに特に２−ヒドロキシプロピル−β−ＣＤ（２−ＨＰ−β−ＣＤ）である。本発明の組成物で用いるための最も好ましいシクロデキストリン誘導体は、０．３５〜０．５０（質量分析により決定）の範囲内の平均分子置換度（Ｍ．Ｓ．）を有し、１．５％未満の未置換β−シクロデキストリンを含有する２ −ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。ＮＭＲ又はＩＲにより決定されるＭ．Ｓ．値は０．５５〜０．７５の範囲であるのが好ましい。製薬学的組成物は式（Ｉ）の化合物及びシクロデキストリン又はシクロデキストリン誘導体のみから成ることができる。この固体形態は簡便に、水溶液の凍結乾燥により、又は別の場合、共−沈澱により調製されることができる。この製剤は特に水、食塩水又はシクロデキストリンの水溶液を用いた再構成のために、あるいはフルーツジュースなどの非−製薬学的液体、あるいは食物などの固体さえも用いる配合のために特に有用である。好ましくは本発明の製薬学的組成物は経口的投与に適している。組成物は分離された投薬単位で、特に単位投薬形態で有利に与えられることができる。簡便な単位投薬製剤は、活性成分を０．１〜１００ｍｇの量で含有する。処置における１日あたりの投薬量として必要な式（Ｉ）の化合物の量は、選ばれる特定の化合物のみでなく、投与の経路、処置されるべき状態の性質、ならびに患者の年令、体重及び状態と共に変化し、究極的に付き添う医師に一任される。しかし一般に適した投薬量は、１日に約０．５〜約２０ｍｇの範囲内であろう。予防に用いるために適した１日あたりの投薬量は一般に同じ範囲内であろう。簡便には所望の投薬量を１投薬で又は適した間隔で、例えば１日に２、３、４回又はそれ以上の細分投薬量で投与される分けられた投薬として与えることができる。Ｎ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミンの１日あたりの投薬量は１投薬で投与することができるが（ｏ．ｄ．）、２回の投薬で投与するのが好ましく、それは、そのような管理が２４時間に及ぶ有効な血漿レベルを与えるからである。反復して又は慢性的に投与すると、定常状態に達するまで血漿レベルが漸進的に上昇する。式（Ｉ）の化合物は、神経変性疾患の処置又は緩和に用いられる他の薬剤、例えばドーパミン作用性欠損などの神経伝達物質の欠損の代わりとなる薬剤、例えばレボドパ；しかし特にコリン作用性欠損の代わりとなる薬剤、例えばガランタミン、Ｅ２０２０、フィゾスチグミン又はタクリン；記憶増進薬、例えばサベルゾール；ＡＩＤＳの防除に用いられる薬剤、例えばヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばジドブジン（ＡＺＴ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ラミブジン（３ＴＣ）、スタブジン（２４Ｔ）；非−フクレオシド逆転写酵素阻害剤、例えばロビリド、ネビラピン（ピリジノン）、８−クロロＴＩＢＯ又はチビラピン（（−）−（Ｓ）−８−クロロ−４，５，６，７−テトラヒドロ−５−メチル−６−（３−メチル−２−ブテニル）イミダゾ［４，５，１−ｊｋ］［１，４］ベンゾジアゼピン−２（１Ｈ）−チオン−塩酸塩）、ＨＩＶ−プロテアーゼ阻害剤、例えばサキナビル、インジナビル、ネルフィナビル、リトナビルなどの抗レトロウィルス性化合物；酸化防止剤、例えばビタミンＣ、ビタミンＥ、プロブコールなどの薬剤と組み合わせて用いることもできる。かくして本発明は他の側面において、製薬学的に許容され得る担体、ならびに活性成分として：（ａ）有効量の本明細書で定義される式（Ｉ）の化合物を含む組成物を：（ｂ）有効量の前節で定義された他の治療的に活性な薬剤と一緒に含む組み合わせを提供する。組み合わせは別々に、すなわち上記のいずれかの経路を介して同時に、一緒に又は連続して投与されることができ、あるいは組み合わせが１つの製薬学的製剤の形態で存在することもできる。かくして酸化的ストレスに伴う神経又は血管系の老化又は変性疾患に冒された人間の治療又は予防的処置において同時に、別々に又は連続して用いるための組み合わせ製剤としての、（ａ）式（Ｉ）の化合物及び（ｂ）前記において定義された他の治療薬を含む製薬学的製品は、本発明の他の側面を成す。そのような製品は、式（Ｉ）の化合物の製薬学的組成物を含有する容器、及び第２の治療薬の製薬学的組成物を含む他の容器を含むキットを含むことができる。２つの活性成分の別々の組成物を有する製品は、各成分の適量及び投与のタイミングと順序を患者によって選ぶことができるという利点を有する。式（Ｉ）の化合物が第２の治療薬と組み合わされて用いられる場合、各化合物の投薬量は、化合物が単独で用いられる場合の投薬量から変化し得る。かくして式（Ｉ）の化合物が第２の治療薬と一緒に用いられる場合、各化合物の投薬量は化合物が単独で用いられる場合に用いられる投薬量と同じか又はより普通にはそれより低い。適した投薬量は当該技術分野における熟練者が容易に認識することができるであろう。実施例１：グルタチオン枯渇に対する試験管内保護ヒト線維芽細胞［株ＮＳ］をシスチン／メチオニン欠乏ＥＭＥＭ中で４８時間培養した。いずれの処置も受けない標準培養では、すべての細胞が壊死性となった。細胞死は、位相差顕微鏡により得点評価した。表１は、式（Ｉ）の化合物を用いて観察されたＥＣ₉₀値、すなわち式（Ｉ）の化合物を用いた処置の後４８時間、線維芽細胞の９０％以上が生き残る濃度をまとめている。実施例２胚海馬の初代培養物を本質的に以前に記載されている通りに調製した（Ｐａｕｗｅｌｓ，Ｐ，ＶａｎＡｓｃｈｏｕｗ，Ｈ．Ｐ．，Ｐｅｅｔｅｒｓ，Ｌ．，Ｍｏｅｒｅｍａｎｓ，Ｍ．，Ｌｅｙｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．１９９２．Ｃｈｒｏｎｉｃｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｉｔｈｓａｂｅｌｕｚｏｌｅｐｒｏｔｅｃｔｓｃｕｌｔｕｒｅｄｒａｔｂｒａｉｎｎｅｕｒｏｎｓｆｒｏｍｔｈｅｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｓｙｎａｐｓｅ，１２：２７１−２８０）。胚日（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｄａｙ）１７においてラットの海馬形成を切開し、ＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）中の０．０５％トリプシン、０．１ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩに分離した。熱−不活化ウマ血清（ＨＳ）を４％の濃度まで加え、細胞を遠心し、ＤＭＥＭで洗浄し、１０％のＨＳを含有するＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（３：１）に再懸濁させた。細胞をポリＬ−リシン（０．００１％）予備−コーティングマルチウェル−２４プレートで、４ｘ１０⁵細胞／cm²の密度で平板培養した。培養において１日目に、培地を化学的に限定された培地（０．２６％のウシ血清アルブミン、３０ｎＭのセレン酸ナトリウム、３ｎＭの３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニン、０．３５ μＭのレチノール、０．３μＭのレチノールアセテート、２．３μＭのＤＬ−ａ −トコフェロール、２．１μＭのＤＬ−α−トコフェロールアセテート、３．６ μＭのリノレン酸、３．６μＭのリノレイン酸、０．１２５％のヒトトランスフェリン、２０ｎＭのプロゲステロン、５７．５ｎＭのコルチコステロン、４９Ｕ／１のインスリン、０．４μＭのビオチン、１０ｕＭのＬ−カルニチン、８３μＭのＤ（＋）−ガラクトース、３．３μＭのグルタチオン、１０ｕＭのエタノールアミン、０．１ｍＭのプトレシンを含有するＤＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（３：１）；Ｒｏｍｉｊｎ，Ｈ．Ｊ．，ｖａｎＨｕｉｚｅｎ，Ｆ．，Ｗｏｌｔｅｒｓ，Ｐ．Ｓ．１９８４．Ｔｏｗａｒｄｓａｎｉｍｐｒｏｖｅｄｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ，ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉｕｍｆｏｒｌｏｎｇ−ｔｅｒｍｃｕｌｔｕｒｉｎｇｏｆｃｅｒｅｂｒａｌｃｏｒｔｅｘｔｉｓｓｕｅ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｂｅｈａｖ．Ｒｅｖ．，８：３０１−３３４）にＤＬ−α −トコフェロール（ＶｉｔＥ）及びＤＬ−α−トコフェロールアセテートを含んで（標準）、又は含まずに、試験化合物の存在下で、又は不在下で変えた。培地からｖｉｔＥが省略されると、試験管内で４日目に重大な細胞死が観察された。化合物の添加は培養物を救うことができた。培養物の生き残りを、細胞質ＬＤＨ活性を用いて測定した。ｖｉｔＥ−枯渇培養物における生き残り−救済のためのＥＣ₅₀は、ｖｉｔＥが補足された培地において生育される培養物の場合に見られる生き残りの５０％まで培養物の生き残りを復帰させるのに必要な化合物の濃度を指す。各化合物の７種類の濃度を３重に調べ、独立した実験の数を表で示し、平均ＥＣ₅₀−値±ＳＤを算出した（表２）。初代神経培養物は、試験管内における生き残りに関して培地中の酸化防止剤ｖｉｔＥの存在に依存する。培養物の生育にｖｉｔＥ枯渇培地が用いられると、生き残りは標準の±２０％に落ちる。酸化防止性を有する化合物はｖｉｔＥの欠乏を補足することができ、培地に加えられるとそのままでｖｉｔＥ欠乏培養物を救うことができる。初代神経培養物についてのｖｉｔＥ枯渇試験において、式（Ｉ）のいくつかの誘導体を１Ｏ-⁷Ｍ及び１０^-6Ｍで調べ、すべてｖｉｔＥ枯渇培養物をある程度救って生き残らせることができた（表２）。化合物７は最も有力な化合物であった：１０^-7Ｍにおいて、ＶｉｔＥ枯渇培地で生育された初代神経培養物の完全な救済が見られた。培養物が標準の５０％まで救われた化合物７の濃度（標準は４．４μＭのｖｉｔＥを含有する培地で生育される培養物）は２５±１２ｎＭであった（表２）。これらのデータに基づき、上記の試験における化合物７の酸化防止活性をｖｉｔＥの活性より約１００倍有力であると見積もった。実施例３ある種の細胞におけるシスチン吸収のグルタメートによる競合的阻害は、グルタチオン（ＧＳＨ）枯渇及び酸化的ストレスに導く。この酸化的ストレスのモデルは、神経膠Ｃ６神経膠腫細胞に関して（Ｋａｔｏｅｔａｌ．，１９９２．ＡｍｅｃｈｎｉｓｍｆｏｒｇｌｕｔａｍａｔｅｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎｔｈｅＣ６ｇｌｉｏｍａｃｅｌｌｓｉｎｖｏｌｖｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｃｙｓｔｉｎｅｕｐｔａｋｅｌｅａｄｉｎｇｔｏｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｄｅｐｌｅｔｉｏｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４８：９０３−９１４）、及び神経細胞系Ｎ１８ＲＥ１０５に関して（Ｍｕｒｐｈｙｅｔａｌ．，１９８９．Ｇｌｕｔａｍａｔｅｔｏｘｉｃｉｔｙｉｎａｎｅｕｒｏｎａｌｃｅｌｌｌｉｎｅｉｎｖｏｌｖｅｓｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｓｙｓｔｉｎｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｌｅａｄｉｎｇｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ．Ｎｅｕｒｏｎ２：１５４７−１５５８）記載されている。細胞培養：Ｃ６神経膠腫細胞（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＣＣＬ１０７）を２〜４ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸塩及び５〜１０％の熱−不活化ウシ胎児血清が補足されたＤＭＥＭ中で培養した。培養物は空気／５〜１０％ＣＯ₂、水飽和雰囲気中で３７℃ に保持された。グルタチオン枯渇及び酸化防止剤としての薬剤の評価：２４−ウェル培養プレートで３０，０００〜５０，０００細胞／ｃｍ²において（毒性及び過酸化物測定のため）、又は９６−ウェル培養プレートで１３６，０００細胞／ｃｍ²において（ＧＳＨ決定のため）平板培養された培養物を用いて実験を行った。８〜２４時間後、培養をＧＳＨ消耗化合物グルタメート（１０ｍＭ）の存在する、又は不在の培地に切り替えた。酸化的ストレスの阻害のための薬剤を調べるために、薬剤をグルタメートと一緒に加えた（溶媒の最終的濃度は０．０１％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、０．１％ＤＭＳＯであった）。細胞内ＧＳＨレベルを６〜８時間後に測定し、細胞内過酸化物を１４〜２０時間後に測定し、毒性及び保護をＢｅｒｇｍｅｙｅｒａｎｄＢｅｒｎｔ（ＵＶ−ａｓｓａｙｗｉｔｈｐｙｒｕｖａｔｅａｎｄＮＡＤＨ．Ｉｎ：ＭｅｔｈｏｄｓｏｆＥｎｚｙｍａｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．１９７４．Ｈ．Ｕ．Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ，ｅｄ．Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２ｎｄＥｄ．，ｐｐ５７４−５７９）の方法に従って乳酸塩デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイを用いて４８時間後に分析した。Ｃ６神経膠腫細胞培養物中のＧＳＨ含有量の決定：ＧＳＨレベルは本質的にＶａｎｄｅｐｕｔｔｅｅｔａｌ．（１９９４）に記載されている通りに、洗浄及び均質化法を修正して、微量法により分析した。ゲル（９６−ウェルプレートの）をＰＢＳで洗浄し、１．３％の５−スルホサリチル酸を含有する５０μｌの１０ｍＭＨＣｌ中で均質化し、ホモジネートを１２００ｘｇにおいて、４℃で１０分間遠心した。４０μｌの上澄み液を９６−ウェルプレートのウェルに移し、２００μｌの試薬（１４３ｍＭのリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４中の１ｍＭのＤＴＮＢ［５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）］及び０．３４ｍＭのＮＡＤＰＨ及び６．３ｍＭのＥＤＴＡ）を加えた。５分間、室温に平衡化した後、４０μｌのＧＳＨレダクターゼ（８．５ＩＵ／ｍｌの１４３ｍＭリン酸塩緩衝液、６．３ｍＭのＥＤＴＡｐＨ７．４）を加えることにより反応を開始させた。ＮＡＤＰＨ酸化をＭｕｌｔｉｓｋａｎＭＣＣ／３４０（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４１４ｎｍで５分間追跡し、１分当たりの吸光度の変化（ΔＡ）を算出した。ＧＳＨ含有量を、試験毎に０．２〜２ナノモルの市販のＧＳＨの範囲の標準曲線（濃度に対してΔＡ／分がプロットされている）から推定した。細胞内過酸化物の蛍光測定：細胞内過酸化物の生成を６−カルボキシ−２’，７ ’−ジクロロジヒドロフルオレセイン二酢酸塩、ジ（アセトキシメチルエステル）（Ｃ−ＤＣＤＨＦ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を用いて検出した。Ｃ−ＤＣＤＨＦをＤＭＳＯに１０ｍＭの濃度で溶解し、−７０℃で窒素下に保存した。培養物を１０ｍＭのグルタメートに１４〜２０時間暴露した後、細胞に１００μＭのフルオロフォアを３７℃で１時間負荷した。培地を吸引して除去し、ＰＢＳを細胞に加え、プレートをＣｙｔｏｆｌｕｏｒＩＩミクロプレートフルオレセンスリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み取った。励起及び発光波長は、４８５／５３０ｎｍフィルターペアを用いて選んだ。細胞タンパク質１μｇ当たりの相対的蛍光単位（ｒｆｕ）で表される蛍光強度を細胞内過酸化物の指数として用いた。結果：１０ｍＭのグルタメートでＣ６神経膠腫細胞培養物を６〜７時間処置すると、細胞内ＧＳＨレベル（表３）を標準ウェルのレベルより約３−倍低いレベルに減少させた（９１９ピコモルＧＳＨ／ウェルに対して２７７ピコモルＧＳＨ／ウェル）。ＧＳＨの減少は、毒性細胞内過酸化物の±３−倍の増加により示される通り（タンパク質１μｇ当たり６９ｒｆｕからタンパク質１μｇ当たり２０５ｒｆｕへの増加）、酸化的ストレスを生じた。１６〜４８時間後に約±７８％の細胞死が起こった。ＬＤＨ放出（細胞毒性の指数）はＮＭＤＡ拮抗薬ＭＫ８０１により妨げられなかったので（データは示されていない）、この毒性に興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）は含まれてなかった。我々の培養条件下で（表Ａ）、Ｃ６神経膠腫培養物における基底ＬＤＨ放出は合計ＬＤＨの１１±３％であり（平均±ＳＥＭ、ｎ＝７）、１０ｍＭのグルタメートで処置されてから４８時間後のＬＤＨ放出は、合計ＬＤＨの７８±７％であった。化合物７は１μＭにおいて、これらの培養物を細胞死から完全に保護した。この保護はＧＳＨレベルの復帰の故ではなく、ＧＳＨレベルは溶媒標準レベルの約３分の１のままであった。保護はグルタメート−誘導細胞内過酸化の阻害と平行しており、化合物７による保護がＧＳＨ−枯渇−誘導酸化的ストレスの妨害の結果であったことを示した。投薬量応答分析（表４）は、酸化的ストレス−誘導細胞毒性に対する保護に関する化合物７の高い効力（ＩＣ₅₀ ９ｎＭ）、及び酸化的ストレス−誘導細胞内酸化の阻害に対する高い効力を明らかにした。構造的に関連する化合物の評価（表５）は、それらが類似の活性を示すことを示した。結論：試験管内における証拠において、化合物７及びいくつかの密接に関連する化合物が細胞培養物において有力な酸化防止剤として作用することが明らかである；それらは毒性細胞内過酸化物の酸化的ストレス−誘導増加を阻害するので、細胞を酸化的ストレス−誘導細胞死から保護する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者レイセン，ジヨセフア・エドウアルダ・マリア・フランシスカベルギー・ビー−2360オウド−トウルンホウト・ヘルフストドレーフ４

Claims

【特許請求の範囲】１．酸化的ストレスに伴う神経及び血管系の老化又は変性疾患に冒されたヒトの治療的又は予防的処置のための薬剤の製造のための、式：［式中、Ｒ¹はＣ_1-10アルキル又はＣ_5-12シクロアルキルを示し、Ｒ2は水素又はＣ_1-10アルキルを示し；Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵はそれぞれ独立して水素又はＣ_1-4アルキルを示す］を有する２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール誘導体、製薬学的に許容され得る酸付加塩、立体化学的異性体、ならびに該誘導体、塩及び立体異性体の混合物の利用。２．処置されるべき疾患又は状態が、酸化的代謝過程が役割を果している神経変性疾患、例えば、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、老年痴呆、ピック病、コルサコフ病、オリーブ橋小脳萎縮、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、ダウン症候群、グルタル酸血症、てんかん、痙攣状態、多発脳梗塞性痴呆、及びウィルス感染−誘導神経変性、特に神経−ＡＩＤＳ包含痴呆、認識困難症、ＨＩＶ感染に伴うニューロパシー及びミオパシーに関連している請求の範囲第１項に記載の利用。３．Ｒ¹がＣ_4-10アルキル又はＣ_7-12シクロアルキルを示し；Ｒ²が水素を示す請求の範囲第１項に記載の利用。４．Ｒ³、Ｒ⁴及びＲ⁵が水素を示し、Ｒ³及びＲ⁵がメチル、エチル、２ −プロピル及び２−メチル−２−プロピルを示すこともできる請求の範囲第１項に記載の利用。５．Ｒ¹が直鎖状Ｃ_6-10アルキル基、α−もしくはβ−位で分枝しているＣ_4-10 アルキル基、又は単環状Ｃ_7-10シクロアルキル基を示す請求の範囲第１項の利用。６．式（Ｉ）の化合物がＮ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミン二塩酸塩である請求の範囲第１項に記載の利用。７．式（Ｉ）の化合物が経口的投与に適合させられた製薬学的組成物の製造に用いられる請求の範囲第５項に記載の利用。８．Ｎ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミン二塩酸塩の１日あたりの投薬量が０．１〜２０ｍｇの範囲である請求の範囲第６項に記載の利用。９．１日あたりの投薬量が１回の投与で与えられる請求の範囲第７項に記載の利用。１０．製薬学的に許容され得る担体、ならびに活性成分として：（ａ）有効量の請求の範囲第１項で定義された式（Ｉ）の化合物を：（ｂ）有効量の、神経伝達物質の欠損の代わりとなる薬剤、記憶増進薬、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非−ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶ−プロテアーゼ阻害剤又は他の酸化防止薬と一緒に含む製薬学的組成物。１１．式（Ｉ）の化合物がＮ−シクロヘプチル−２，３−ジヒドロ−イミダゾ［２，１−ｂ］ベンゾチアゾール−７−アミン二塩酸塩である請求の範囲第９項に記載の組成物。１２．経口的投与に適合させられた請求の範囲第１０項に記載の組成物。１３．式（Ｉ）の化合物、ならびに神経伝達物質の欠損の代わりとなる薬剤、記憶増進薬、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非−ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ＨＩＶ−プロテアーゼ阻害剤又は他の酸化防止薬から選ばれる他の治療薬を、酸化的ストレスに伴う神経又は血管系の老化又は変性疾患に冒されたヒトの治療的又は予防的処置において同時に、別々に又は連続して用いるための組み合わせ製剤として含む製品。