JPH11505405A - 大腸菌型細菌または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の酵素的検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 細菌がメンブランフィルター上で濃縮されることを特徴とする、大腸菌型細菌、または大腸菌（E.coli）を検出するための、２工程の酵素的方法。好ましくは鉱物、タンパク質加水分解物、及び糖、好ましくはマルトース、またはポリアルコール、好ましくはマンニトール、マーカー酵素の誘導剤、特にはβ-ガラクトシダーゼ若しくはβ-グルクロニダーゼ、競合細菌の増殖阻害剤が含まれる栄養素を含んだ増殖培地上に、前記のフィルターを置く。プレインキュベーシションの後に、蛍光性または化学発光性酵素基質とメンブラン透過化剤を含むアッセイ培地に、該フィルターを置く。メンブランフィルター及びアッセイ培地をインキュベーションして、光励起の誘導後に酵素基質を開裂させて該メンブランフィルター上に、蛍光性、若しくは化学発光性のミクロコロニーを産製させる。

Description

【発明の詳細な説明】 大腸菌型細菌または大腸菌(E.coli)の酵素的検出方法 本発明は、液体または液体化試料（例えば、飲料水または娯楽用の水）中の 大腸菌型細菌（coliform bacteria）、特に総大腸菌型細菌（total coliform ba cteria）、便大腸菌型細菌（faeca coliform bacteria）または大腸菌(E.coli) の酵素的検出方法に関し、 ａ）メンブランフィルター上の細菌を濃縮する工程； ｂ）メンブランフィルターとその上に濃縮された細菌を、細菌の増殖を支持す る栄養物質およびその増殖と代謝の過程でマーカー酵素を誘導するための誘導物 質を含有する増殖培地上に載せる工程； ｃ）メンブランフィルターとその上に濃縮された細菌をプレインキュベートし て、メンブランフィルターの上でこれらの細菌のミクロコロニーを形成させ、該 マーカー酵素を産生させる工程；そして ｄ）発光を用いてミクロコロニーを肉眼で見えるようにする工程、 を具備した、上記方法に関する。 大腸菌型細菌は、水や食物の衛生上の指標である。水中の総大腸菌型細菌（ ＴＣ）は、土壌または有機植物性物質に由来する。便（耐熱性）大腸菌型細菌（ ＦＣ）および特に大腸菌(E.coli)(E.coli)は、ヒトや動物の腸内に棲息し、便に よる汚染の指標である。 メンブランフィルターにより大腸菌型細菌や大腸菌(E.coli)を検出するため の古典的な方法は、確認試験と組合せたラクトース発酵に基づき、完了するのに ４８〜９６時間が必要である。従来から、操作に必要な時間が２４時間以内であ れば、その操作は迅速であると考えられている。しかし、緊急事態（例えば、水 の供給が途絶えた後、または配水設備の工事後）時に飲料水の分析に使用するに は、２４時間法でも充分迅速とは言えない。このような場合には、通常の８時間 交代勤務および好ましくは最大７時間の勤務の間に、水１００ ml 当たり少なく とも１つの大腸菌型細菌を検出して、水が飲用に適することを証明し、従って飲 用に適さないということを住民に不要に警告することは避けるべきである。 大腸菌型細菌、特にＴＣおよび大腸菌(E.coli)の検出のための従来の迅速（ ２４時間）メンブランフィルター法は、細菌が増殖および代謝の過程で産生する ２つの特異的なマーカー酵素（すなわち、それぞれβ−ガラクトシダーゼとβ− グルクロニダーゼ）の活性を細菌コロニー中で証明することに基づいている。こ れらの酵素の存在は、メンブランフィルター上の細菌が、増殖培地に加えられた 発色性基質（例えば、β−ガラクトシダーゼについては、５−ブロモ−４−クロ ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）、そしてβ− グルクロニダーゼについては、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β− Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ））を切断する能力により証明される。発色性 基質自身は着色しておらず、メンブランフィルター上の着色コロニーの検出は、 酵素の存在、従って細菌の存在を示す。例えば、Mafafi and Kneifel，Zentralb l．Hyg．189: 225-234(1989)、Brenner ら、Appl．Environ．Microbiol．59: 35 34-3544（1993）および Frampton and Restaino，J．Appl．Bacteriol．74: 223 -233(1993)を参照。 同様に、増殖培地に加えられた蛍光性基質（例えば、４−メチルウンベリフ ェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−ｇａｌ）または４−メチルウンベ リフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ））は、それぞれ細菌のβ−ガラク トシダーゼとβ−グルクロニダーゼにより切断されて、蛍光性化合物である４− メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を産生する。蛍光性基質自身は蛍光を発せ ず、従ってメンブランフィルター上の蛍光性コロニーの検出は、酵素の存在従っ て細菌の存在を示す。現在β−ガラクトシダーゼの基質としてＭＵ−ｇａｌを用 いてメンブランフィルター上のＴＣを検出するための最も迅速な蛍光法は、完了 するのに１６〜２４時間を必要とする（Brenner、前述）。大腸菌(E.coli)につ いて、β−グルクロニダーゼの基質としてＭＵＧを用いて得られる最小検出時間 は、７．５時間である（Sarhan and Foster，J．Appl．Bacteriol．70: 394-400 (1991)）。Ｂerg らの米国特許と科学文献は、β−ガラクトシダーゼの基質とし てＭＵ−ｇａｌを含有する寒天増殖培地とインキュベーション温度４１．５℃を 用いて、６時間で、メンブランフィルター上の便（耐熱性）大腸菌型細菌を検出 する方法を開示している（Berg ら、米国特許第５，２９２，６４４号、およびA ppl．Environ．Microbiol．54: 2118-2122(1988)）。しかし、３５〜３７℃で増 殖し、耐熱性大腸菌型細菌より低いβ−ガラクトシダーゼ活性を有する総大腸菌 型細菌の検出時間は、８時間を超える。大腸菌(E.coli)は、この方法で特異的に 検出することはできない。 従って本発明の目的は、液体または液体化試料中の大腸菌型細菌細菌、特に ＦＣのみならずＴＣおよび大腸菌(E.coli)を、短時間（例えば、ＴＣについては ７時間以内の検出時間）で検出することを可能にするメンブランろ過法を提供す る。 この目的のために、本発明の方法は、 − プレインキュベーション工程後に増殖培地からメンブランフィルターを取 り出し： − メンブランフィルター上のミクロコロニーをメンブラン透過化剤（permea bilizer）で処理して、これをマーカー酵素の化学発光性基質または蛍光性基質 と接触させ； − ミクロコロニーをインキュベートして該基質を切断させて、化学発光性化 合物または蛍光性化合物を産生させ；そして − ミクロコロニーにより産生された化学発光性化合物または蛍光性化合物か らの発光を開始させる、ことを具備した酵素測定法により、ミクロコロニーを肉 眼で見えるようにすることを特徴とする。 細菌を増殖させマーカー酵素を誘導することを目的とするいわゆるプレイン キュベーション工程から酵素測定工程を分離する２工程法の使用は、メンブラン 透過化剤を加えて、基質と誘導物質の間の酵素に対する競合を避けることを可能 にする。測定法にメンブラン透過化剤を含める根拠は、細菌による基質の迅速な 摂取を促進することである。特に大腸菌型細菌や大腸菌(E.coli)の外膜と細胞質 膜の両方を破壊するメンブラン透過化剤（例えば、ポリミキシンＢもしくはコリ スチン、またはこれらの１つとリゾチウムとの混合物）が使用される。公知の１ 工程法（例えば Berg らによる米国特許第５，２９２，６４４号に開示の方法） では、そのようなメンブラン透過化剤は殺菌作用があるため使用できず、従って 増殖培地に加えられていない。 ２工程法は、本発明者によりすでに開示されている：すなわち、Nelis ら、 水質技術会議議事録（Proceedings of the Water Quality Technology Conferen ce）（AWAA）、マイアミ、フロリダ州、1993年11月７〜11日、1663〜1673頁。し かし、この公知の方法では、フィルターに濃縮された細菌は、液体増殖培地に移 され、フィルター自身は除去されるため、培地中にミクロコロニーは形成されな い。その代わり、細菌の均一な混合物が得られ、そこからの全体的な発光を、発 光測定装置または蛍光測定装置を用いて測定する。しかし現在では、このような 液体検出法では、β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼを有する大 腸菌型細菌でない細菌がしばしば妨害することがわかっている。このような非大 腸菌型細菌細菌の増殖は阻害することができるが、これらが試料中に多量に存在 する時は、これらの非大腸菌型細菌細菌中に存在するマーカー酵素の量が測定に 影響する。本発明の方法では、非大腸菌型細菌細菌が大腸菌型細菌より多量に存 在しても、ミクロコロニーの形成が阻止されているため、このような影響は排除 される。 本発明の具体的な態様において、一般に使用されているセルロースエステル フィルターより疎水性の高いメンブランフィルターが使用され、特にポリビニリ デンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製のメンブランフィルターが使用される。 このような疎水性のメンブランフィルターを使用すると、細菌のミクロコロ ニーによる発光が強化されることがわかった。 本発明の好適な態様において、誘導物質は、β−ガラクトシダーゼについて はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドそしてβ−グルクロニダーゼ についてはイソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロニドとｐ−ニトロフェニル−β −Ｄ−グルクロニドよりなる群から選択される。 これらの誘導物質は、従来の培地で使用される誘導物質より効率が高いこと が見いだされた。 本発明のさらに好適な態様において、増殖培地として、鉱物栄養物質、タン パク質加水分解物（特に、トリプトン）、および糖（好ましくはマルトース）、 またはポリアルコール（好ましくはマンニトール）を含有する増殖培地が使用さ れる。 プレインキュベーション工程においてそのような増殖培地の使用は、一方で は、ストレスを加えられた大腸菌型細菌／大腸菌(E.coli)の効率的な増殖促進、 良好な回収を、そして他方では弱い消光作用を組合せている。 本発明のさらに好適な態様において、前述のＭＵ−ｇａｌやＭＵＧとは異な る蛍光性基質、特に４−トリフルオロメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラク トピラノシド（ＴＦＭＵ−ｇａｌ）または４−トリフルオロメチルウンベリフェ リル−β−Ｄ−グルクロニド（ＴＦＭＵＧ）が使用されるが、化学発光性基質が 好適である。これまでのところ後者はメンブランフィルター上に増殖した細菌コ ロニーの検出に応用されているが、現在使用されている基質より感度が高い。 本発明はまた、本発明の方法で使用される増殖培地に関し、この培地は、鉱 物栄養物質、タンパク質加水分解物（特に、トリプトン）、大腸菌型細菌の増殖 と代謝の過程でマーカー酵素を誘導する誘導物質（特に、β−ガラクトシダーゼ またはβ−グルクロニダーゼ）、および糖（好ましくはマルトース）、またはポ リアルコール（好ましくはマンニトール）を含有することを特徴とする。 本発明をより詳細に説明する前に、まずこの説明で使用されるいくつかの具 体的な用語の意味を以下に記載する。 総大腸菌型細菌（ＴＣ）という用語は、エシェリヒア（Escherichia）、エ ンテロバクター（Enterobacter）、クレブシェラ（Klebsiella）またはシトロバ クター（Citrobacter）属の４つの属のいずれかに属し、酵素β−ガラクトシダ ーゼを有するものを意味する。 便大腸菌型細菌（ＦＣ）という用語は、大腸菌型細菌の群に属し、ヒトや動 物の小腸に住み着いている（耐熱性）細菌を意味する。これらの便大腸菌型細菌 は、便による汚染の指標であり、酵素β−ガラクトシダーゼも有し、特に大腸菌 (E.coli)(E.coli)種はさらに酵素β−グルクロニダーゼも有する。便大腸菌型細 菌の検出は、これらを、総大腸菌型細菌の検出に使用される温度（約３５〜３７ ℃）より高い温度（４１．５〜４４℃）でインキュベートすることにより行われ る。 プレインキュベーションという用語は、１つまたはそれ以上の細菌（これは ろ過した試料に由来する）で被覆された膜を、増殖培地上に置いて、一定時間あ る温度に保持して細菌を増殖させてマーカー酵素を誘導する、本発明の方法の１ つの工程を意味する。 メンブラン透過化剤という用語は、細菌の外膜および細胞質膜の両方を破壊 して化学物質の摂取を促進させることを可能にする任意の化合物を意味する。 酵素測定という用語は、本発明の方法の増殖工程とは別個の工程であって、 細菌中に存在するマーカー酵素（特に、β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルク ロニダーゼ）により基質を切断し、次に切断産物を光化学的または化学的励起し て放出される光を用いて測定する工程を意味する。 発光という用語は、蛍光または化学発光を意味する。 蛍光という用語は、光化学的励起（すなわち、より波長の短い光）後に、分 子がある波長の光を放出する物理化学的過程を意味する。 化学発光という用語は、「促進剤」と呼ぶ調製剤で化学的に励起した後に、 分子が光を放出する物理化学的過程を意味する。 蛍光性基質という用語は、それ自身は非蛍光性であるが、親化合物から解離 され光化学的に励起された時、光を放出する構造部分（すなわち、いわゆる蛍光 性化合物）を有する化合物を意味する。 化学発光性基質という用語は、それ自身は非発光性であるが、親化合物から 解離され光化学的に励起された時、光を放出する構造部分（すなわち、いわゆる 発光性化合物）を有する化合物を意味する。 分析される試料は、液体または液化されたものであり、１００ ml 中少なく とも１つのＴＣ、１つのＦＣまたは１つの大腸菌(E.coli)を含有することが疑わ れるものである。本発明の方法が応用される典型的な試料には、飲料水、水泳用 の水、または食品もしくは薬品の液体抽出物がある。 本発明の方法の具体的な態様の第１の工程は、例えばフィルター、特に口径 ０．２２μＭ〜０．４５μＭで直径が例えば４７ mm の細菌メンブランフィルタ ー上の１００ ml の液体または液体化試料中に存在する細菌を濃縮することより なる、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）（デュラポア（Durapore）（登 録商標）、ミリポア（Millipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ州 から入手できる）は、細菌のミクロコロニーの最終的な蛍光または化学発光を増 強することがわかっているため、メンブランフィルターは、この物質が好ましい 。他の有用な物質には、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ナイ ロンまたはセルロースエステル、特に硝酸セルロースがある。 第２の工程は、不活性マトリックスとして寒天または吸湿性セルロースパッ ドを含有する５５ mm のシャーレ中の固形、半固形または液体増殖培地上に、細 菌を含有するメンブランフィルターを置くことである。この培地は、特にタンパ ク質加水分解物、好ましくはトリプトン（例えば、０．５％）、酵母エキス（例 えば、０．３％）、モノアンモニウムホスフェート（例えば、０．２％）、硫酸 マグネシウム（例えば、０．００５％）、リン酸水素二カリウム（例えば、０． １％）、および糖、好ましくはマルトース（例えば、０．５％）またはポリアル コール、好ましくはマンニトール（例えば、０．５％）を含有する。この培地は 以後、改良発光培地（Improved Luminescence Medium）（ＩＬＭ）と呼ぶ。ＩＬ Ｍから酵母エキスを除くことにより、より改良された培地が得られ、メンブラン フィルター上でより強い発光を有するコロニーが得られる。ＩＬＭ増殖培地はさ らに、ドデシル硫酸ナトリウム（例えば、０．０１％）、胆汁酸塩（例えば、０ ．０１％）、および抗生物質セフスロジン（cefsulodin）（例えば、０．００１ ％）を、競合する非標的細菌のインヒビターとして含有する。これはさらに、該 マーカー酵素の１つを誘導する化合物を含有する。例えば、β−ガラクトシダー ゼの誘導物質としてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（例えば、 ０．００１％）またはメリビオース（例えば、０．０１％）、そしてβ−グルク ロニダーゼを誘導するためのｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（例え ば、０．０５％）、イソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロニド（例えば、０．０ ０１％）、またはメチル−β−Ｄ−グルクロニド（例えば、０．００５％）であ る。本発明の方法で使用されるＩＬＭ、および特に酵母エキスを含有しないＩＬ Ｍは、一定時間後、ＴＣや大腸菌(E.coli)のための種々の他の選択培地（ｍ End o 寒天ＬＥＳ、マコンキー（MacConkey）寒天、ｍＴＥＣ寒天、ｍＦＣ寒天、Ｅ Ｃ寒天、ラウリルトリプトース寒天（Lauryl Tryptose agar）、トリプトンバイ ル寒天（Tryptone Bile agar）、ｍＴ７寒天、ラウリル硫酸塩寒天 （Lauryl Sulphate agar）、Sarhan and foster（前記で引用）が記載したＭＵ Ｇ−７培地、および Berg らの米国特許（前記で引用）で開示された培地よりも 強い蛍光および化学発光性ミクロコロニーを提供する。 第３の工程は、いわゆるプレインキュベーションであり、メンブランフィル ターと増殖培地を適当な温度（例えば、総大腸菌型細菌については３５〜３７℃ 、または便大腸菌型細菌そして特に大腸菌(E.coli)については４１．５〜４４℃ ）で、好ましくは水浴中で、適当な時間インキュベートして、細菌を増殖させ、 蛍光または化学発光により検出可能な充分なマーカー酵素を産生させることより なる。必要なプレインキュベーション時間は、蛍光または化学発光性基質が使用 されているかに応じて、通常４〜６．５時間である。 第４の工程は、増殖培地からメンブランフィルターを取り出し、これを培地 を含浸させた吸湿性セルロースパッドに載せて、マーカー酵素を測定することよ りなる。この測定培地は、特に２つのマーカー酵素のいずれかに対する蛍光性基 質、好ましくはＴＦＭＵ−ｇａｌ（λ exc ３９４、λ em ４８９ nm）（β−ガ ラクトシダーゼ）またはＴＦＭＵＧ（λ exc ３９４、λ em ４８９ nm）（β− グルクロニダーゼ）を含有する。また共通の蛍光性基質ＭＵ−ｇａｌ（β−ガラ クトシダーゼ）またはＭＵＧ（β−グルクロニダーゼ）を使用することもできる が、感度は低い。後者の２つの化合物の欠点は、最適の蛍光を得るために、メン ブランフィルターに水酸化ナトリウムを噴霧する必要があることである。β−ガ ラクトシダーゼの基質として考慮すべきＭＵ−ｇａｌの他の類似体（３−アセチ ル−７−（β−ガラクトピラノシルオキシ）クマリン（λ exc ４２０、λ em ４５９ nm）、３−（２−ベンズオキサゾリル）−７−（β−ガラクトピラノシ ルオキシ）クマリンおよび１−（β−ガラクトピラノシルオキシ）−ピレン−３ ，６，８−トリス−（ジメチル−スルホンアミド）（ｐＨ９でλ exc.４９５、 λ em.５５０ nm）（Kollerら、Appl．Fluoresc．Technol．1: 15-16(1989)を参 照）を含む）は、励起波長および蛍光波長が長波長側にシフトしており、モル吸 光係数が上昇しているため、原則としてＭＵ−ｇａｌ自身より感度および特異性 が高い。非ウンベリフェリル蛍光性ガラクトピラノシドおよびグルクロニド（例 えば、フルオレセンジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはフルオレセン−ジ −β− Ｄ−グルクロニドおよびその誘導体、例えばＣ１２−フルオレセン−ジ−β−Ｄ −ガラクトピラノシドもしくはＣ１２−フルオレセン−ジ−β−Ｄ−グルクロニ ド（イマジーングリーン（ImaGene Green）、モレキュラープローブズ（Molecul ar Probes）、ユージン（Eugene）、オレゴン州）、またはレゾルフィン−β− Ｄ−ガラクトピラノシドもしくはレゾルフィン−β−Ｄ−グルクロニド（イマジ ーンレッド（ImaGene Red）、モレキュラープローブズ（Molecular Probes）） も原理的に使用可能である。より高い本質的感度は、化学発光性ＡＭＰＧＤ（３ −（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−トリシクロ−［３ ．３．１．１３．７］デカン］−４−イル）フェニル）−β−Ｄ−ガラクトピラ ノシド）、またはその誘導体、特にクロロ誘導体（例えば、トロピックス社（Tr opix，Inc.）、ベッドフォード、マサチューセッツ州、から入手できるガラクト ン（Galacton）（登録商標）（ＡＭＰＧＤのモノ−クロロ誘導体）、ガラクトン −プラス（Galacton-Plus）（登録商標）（ＡＭＰＧＤのジ−クロロ誘導体）（ β−ガラクトシダーゼ）、およびグルクロン（Glucuron）（登録商標）（３−（ ４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）−ト リシクロ［３．３．１．１．３．７］デカン］−４−イル）フェニル）−β−Ｄ −グルクロニド）、またはその誘導体（β−グルクロニダーゼ）（トロピックス 社（Tropix，Inc.））に関連しており、一般に化学発光の方が蛍光より１オーダ ー感度が高い。ＡＭＰＧＤとグルクロン（Glucuron）（登録商標）は、遺伝子受 容体測定法において基質として使用されている。例えば、Jain ら、Anal．Bioch em．199: 119-124（1991）および Bronsteinら、Anal Biochem．219: 169-181（ 1994）を参照。さらに、この測定培地は、メンブラン透過化剤、好ましくはポリ ミキシンＢ硫酸またはコリスチンメタン−スルホネート、またはこれらの１つと リゾチームとの混合物、およびｐＨを７．３に調整するための緩衝化物質を含有 する。メンブランフィルターとともに吸湿性パッドを、適当な温度、好ましくは ４４℃でホットエアインキュベーター中で充分な時間、通常１５〜６０分間イン キュベートして、基質を細菌に摂取させ、これをマーカー酵素に上り切断させる 。 第５の工程は、使用される基質が蛍光性であるかまたは化学発光性であるに 依存する。蛍光性基質では、第５の工程は、プレインキュベーションの間にメン ブランフィルターの上に形成された細菌ミクロコロニーに、４−メチルウンベリ フェロン、ウンベリフェロン類似体または一般に蛍光切断産物の励起波長に近い 波長の光を照射して、ミクロコロニーに蛍光を出させる。蛍光性ミクロコロニー は、上記波長の光（例えば、３６６ nm）を放出する紫外線ランプを用いるか、 または装置（例えば、画像処理するコンピューターに接続したＣＣＤカメラ）を 用いて検出し計数する。化学発光性基質を使用する場合は、メンブランフィルタ ーに促進剤を噴霧して、フィルター上のミクロコロニーを化学発光性にする。こ の工程の前に、適当な温度（例えば、６０℃）でホットエアインキュベーター中 で例えば１０分間フィルターを乾燥させる。促進剤は、２つの成分からなり、１ つは例えば、フルオレセンナトリウム、およびエメラルド（Emerald）（登録商 標）、エメラルド II（Emerald II）（登録商標）、サファイア（Sapphire）（ 登録商標）、サファイア II（Sapphire II）（登録商標）、ニトロ−ブロック（ Nitro-Block）（登録商標）またはルビー（Ruby）（登録商標）としてトロピッ クス社（Tropix，Inc.）から市販されている蛍光色素と一緒のまたは一緒ではな い陽イオン性ポリマーである。第２の成分は、水酸化ナトリウムのようなアルカ リ化剤である。本発明において、後者は希薄溶液（例えば、０．５Ｍの有機塩基 、好ましくはピペリジン）で置換することができ、これにより感度が増強される ことが見いだされた。この新しい促進剤は、「改変発光増幅物質溶液」（改変Ｌ ＡＭ−溶液）と呼ぶ。あるいは、２つの成分を混合する代わりに、ガラクト−ラ イト（Galacto-Light）（登録商標）またはガス−ライト（GUS-Light）（登録商 標）（トロピックス社（Tropix，Inc.））のような市販の混合物を使用してもよ い。後に証明するように、驚くべきことに我々は、ＰＶＤＦメンブランフィルタ ー上で、第１の成分を除いた促進剤（すなわち、０．５Ｍピペリジンのみ）を用 いて、同等の感度が得られることを見いだした。この促進剤は、さらに「代替促 進剤」と呼ぶ。化学発光専用のＥＣＬカメラ中で好感度ポラロイド（登録商標） フイルムであるＸ線フィルムにメンブランフィルターを例えば６０分間露光させ るか、または装置（例えば、画像処理するコンピューターに接続したＣＣＤカメ ラ）を用いて、発光性ミクロコロニーを検出することができる。 本発明のさらなる詳細は、以下の６つの実施例から明らかであろう。しかし 、この説明は本発明を限定するものではない。この説明では、以下の図を参照し ている。 図１は、メンブランフィルター上で増殖させたＴＣと大腸菌(E.coli)の蛍光 ミクロコロニーの出現の写真である。 図２は、メンブランフィルター上のＴＣの７時間の蛍光法で得られた数と、 ＴＣ検出用の標準寒天培地上で得られたものとの相関を示すグラフである。 図３は、メンブランフィルター上の大腸菌(E.coli)の７時間の蛍光法で得ら れた数と、大腸菌(E.coli)検出用の標準寒天培地上で得られたものとの相関を示 すグラフである。 図４は、メンブランフィルター上で増殖したＴＣと大腸菌(E.coli)の化学発 光性ミクロコロニーを示すＸ線フィルムの写真である。 図５は、メンブランフィルター上のＴＣの６．５時間の化学発光法で得られ た数と、ＴＣ検出用の標準寒天培地上で得られたものとの相関を示すグラフであ る。 図６は、メンブランフィルター上の大腸菌(E.coli)の６．５時間の化学発光 法で得られた数と、大腸菌(E.coli)検出用の標準寒天培地上で得られたものとの 相関を示すグラフである。 図７は、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブランフィルター上 のＴＣのミクロコロニーの強度の増加と、混合セルロースエステル製のメンブラ ンフィルター上の強度との比較を示すＸ線フィルムの写真である。 図８は、改変ＬＡＭ−溶液で噴霧した時と比較して、ＰＶＤＦフィルターに ピペリジン（代替促進剤）のみを含有する促進剤を噴霧した時の、ＴＣについて 得られた匹敵する感度を示すＸ線フィルムの写真である。 図９は、β−ガラクトシダーゼ活性の化学発光測定に基づく、メンブランフ ィルター上の大腸菌(E.coli)の数に関して、ＴＣおよび／または大腸菌(E.coli) の検出用の他の（市販の）選択培地に対してＩＬＭが優れていることを示す写真 である。 図１０は、β−グルクロニダーゼ活性の化学発光測定に基づく、メンブラン フィルター上の大腸菌(E.coli)の数に関して、ＴＣおよび／または大腸菌(E.col i)の検出用の他の選択培地に対してＩＬＭが優れていることを示す写真である。 図１１は、プレインキュベーションについて、完全ＩＬＭに対して、酵母エ キスのないＩＬＭを用いて得られた改良化学発光応答を示す写真である。 実施例１ この実施例は、β−ガラクトシダーゼとβ−グルクロニダーゼについて、蛍 光性基質の使用に関連して、メンブランフィルター上のそれぞれＴＣと大腸菌(E .coli)の検出と計測を証明する。 材料： メンブランフィルター：ＰＶＤＦ（デュラポア（Durapore）（登録商標）、ミ リポア（Millipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）よりなる、口径 ０．４５μＭを有する４７ mm のメンブランフィルター。 増殖／誘導培地：０．５％マルトース、０．５％トリプトン、０．２％モノア ンモニウムホスフェート、０．５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウ ム、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．３％酵母エキス、０．０１％胆汁 酸塩、０．００１％セフスロジン、０．１％リン酸二カリウム、および１％寒天 を含有するＩＬＭ（ｐＨ７．３）。この培地はさらに、ＴＣ中でβ−ガラクトシ ダーゼを誘導するための０．００１％のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシド、または大腸菌(E.coli)中でβ−グルクロニダーゼを誘導するための０ ．０５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを含有する。 緩衝化測定混合物：４−トリフルオロメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラ クトピラノシド（ＴＦＭＵ−ｇａｌ）（β−ガラクトシダーゼの基質）または４ −トリフルオロメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＴＦＭＵＧ） （β−グルクロニダーゼの基質）のいずれが、およびポリミキシンＢ硫酸（シグ マ（Sigma）、７７３０ IU/ml）を含有する０．１モル/Ｌリン酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ７．３）。測定混合物はまた、１ｍＭの塩化マグネシウムを含有する。 方法： ＴＣまたは大腸菌(E.coli)を含有する水試料１００ ml をメンブランフィルタ ーでろ過した。フィルターを増殖／誘導培地（ＩＬＭ）上に無菌的に置き、水浴 中で３７℃（ＴＣ用）または４１．５℃（大腸菌(E.coli)用）でインキュベート した。６．５時間インキュベート後、メンブランフィルターを、１．８ ml の緩 衝化測定混合物を含浸させた吸湿性セルロースパッドを含有する第２のシャーレ に移し、４４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベート後、蛍光 性ミクロコロニーを、長波長紫外線ランプで計測した（蛍光波長３６６ nm）。 結果： 図１は、６．５時間のインキュベーションと３０分間の酵素測定後のＴＣ（ 左）と大腸菌(E.coli)（右）の蛍光性ミクロコロニーの出現の例である。図２は 、蛍光を基準に計測したＴＣのミクロコロニーの数を、ＴＣについて通常の選択 寒天培地（すなわち、ｍＥｎｄｏ寒天ＬＥＳ）で得られたものと比較している。 図３は、蛍光を基準に計測した大腸菌(E.coli)のミクロコロニーの数を、大腸菌 (E.coli)について通常の選択寒天培地（すなわち、ｍＦＣ寒天）で得られたもの と比較している。プロットした線は、理想的な相関曲線を示し、データにフィッ トさせたものではない。蛍光計測と従来培地の計測の相関係数は、大腸菌(E.col i)の検出については０．８４４であり、ＴＣ（ｎ＝１３）の検出については０． ６９７であった。 結論： この方法は、蛍光を基準にして全部で７時間以内にＴＣと大腸菌(E.coli)の ミクロコロニーを数えることができる。標準方法との一致は満足できるものであ った。 実施例２ この実施例は、β−ガラクトシダーゼとβ−グルクロニダーゼの化学発光性 基質を使用して、メンブランフィルター上のそれぞれＴＣと大腸菌(E.coli)の検 出と計測を示す。 材料： メンブランフィルター：実施例１に記載のもの。 増殖／誘導培地：実施例１に記載のＩＬＭ。 緩衝化測定混合物：ガラクトン−プラス（Galacton-Plus）（登録商標）、９ μモル／Ｌ（β−ガラクトシダーゼの基質）、またはグルクロン（Glucuron）（ 登録商標）、２５μモル／Ｌ（β−グルクロニダーゼの基質）（いずれの基質も トロピックス社（Tropix，Inc.）より）、およびポリミキシンＢ硫酸（シグマ（ Sigma）、７７３０ IU/ml）を含有する０．１モル/Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ ｐＨ７．３）。測定混合物はまた、１ｍＭの塩化マグネシウムを含有する。 改変発光増幅物質溶液（改変ＬＡＭ−溶液）：エメラルド II（Emerald II） （登録商標）（トロピックス社（Tropix，Inc.））、０．５モル／Ｌピペリジン 溶液中１．６μg/ml。 方法： ＴＣまたは大腸菌(E.coli)を含有する水試料１００ ml をメンブランフィルタ ーでろ過した。フィルターを増殖／誘導培地（ＩＬＭ）上に無菌的に置き、水浴 中で３７℃（ＴＣ用）または４１．５℃（大腸菌(E.coli)用）でインキュベート した。６時間インキュベート後、メンブランフィルターを、１．８ ml の緩衝化 測定混合物を含浸させた吸湿性セルロースパッドを含有する第２のシャーレに移 し、４４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベート後、膜に改変 ＬＡＭ−溶液を噴霧し、蛍光性ミクロコロニーを、Ｘ線フィルムで肉眼で見える ようにした。このためにメンブランフィルターを、ポリエチレンフィルムで包ん だアグファクリックス（Agfa Curix）ＲＰ１ Ｘ線フィルムに１時間接触させた 。現像後、発光性ミクロコロニーは、透明のバックグランドに対して黒い点とし て現れ、これを計測した。 結果： 図４は、６時間のインキュベーションと３０分間の酵素測定後のＴＣ（左） と大腸菌(E.coli)（右）のＸ線フイルム上のミクロコロニーの出現の例である。 図５は、化学発光を基準に計測したＴＣのミクロコロニーの数を、ＴＣについて 通常の選択寒天培地（すなわち、ｍＥｎｄｏ寒天ＬＥＳ）で計測して得られたも のと比較している。図６は、化学発光を基準に計測した大腸菌(E.coli)のミクロ コロニーの数を、大腸菌(E.coli)について通常の選択寒天培地（すなわち、ｍＦ Ｃ寒天）で計測して得られたものと比較している。プロットした線は、理想的な 相関曲線を示し、データにフィットさせたものではない。従来培地と比較した化 学発光直接計測法の相関係数は、大腸菌(E.coli)の検出については０．８３６で あり、ＴＣ（ｎ＝１３）の検出については０．６５０であった。 結論： この方法は、特に装置（例えば、Ｘ線フィルムの代わりに、画像処理するコ ンピューターに接続したＣＣＤカメラ）を用いた時、全部で６．５時間以内に化 学発光を基準にしてＴＣと大腸菌(E.coli)のミクロコロニーの検出と計測ができ る。標準方法との一致は満足できるものであった。 実施例３ この実施例は、化学発光に基づき、メンブランフィルター上のＴＣの計測に ついて、混合セルロースエステル製の従来のフィルターに対して、ポリビニリデ ンジフルオリド（ＰＶＤＦ）フィルターが優れていることを証明するものである 。 材料： メンブランフィルター： − 口径０．４５μＭを有する、ＰＶＤＦ（デュラポア（Durapore）（登録商 標）、ミリポア（Millipore）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）よりな る４７ｍＭのメンブランフィルター。 − 口径０．４５μＭを有する、混合セルロースエステルよりなる４７ｍＭの メンブランフィルター（ミリポア（Millipore））。 増殖／誘導培地：０．５％マルトース、０．５％トリプトン、０．２％モノア ンモニウムホスフェート、０．５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグネシウ ム、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．３％酵母エキス、０．０１％胆汁 酸塩、０．００１％セフスロジン、０．１％リン酸二カリウム、および１％寒天 を含有するＩＬＭ（ｐＨ７．３）。この培地はさらに、ＴＣ中でβ−ガラクトシ ダーゼを誘導するための０．００１％のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシドを含有する。 緩衝化測定混合物：ガラクトン−プラス（Galacton-Plus）（登録商標）、９ μモル／Ｌ（β−ガラクトシダーゼの基質）（トロピックス社（Tropix，Inc.） ）、９μモル／ＬおよびポリミキシンＢ硫酸（シグマ（Sigma）、７７３０ IU/m l）を含有する０．１モル/Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）。測定混合 物はまた、１ｍＭの塩化マグネシウムを含有する。 改変発光増幅物質溶液（改変ＬＡＭ−溶液）：実施例２に記載のもの。 方法： ＴＣを含有する水試料１００ ml をメンブランフィルターでろ過した。フィル ターを増殖／誘導培地（ＩＬＭ）上に無菌的に置き、水浴中で３７℃でインキュ ベートした。６時間インキュベート後、メンブランフィルターを、１．８ ml の 緩衝化測定混合物を含浸させた吸湿性セルロースパッドを含有する第２のシャー レに移し、４４℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベート後、膜 に改変ＬＡＭ−溶液を噴霧し、化学発光性ミクロコロニーを、実施例２に記載の ようにＸ線フィルムで肉眼で見えるようにした。 結果： 図７は、混合セルロースエステル製のメンブランフィルター上で得られた強 度に対する、ＰＶＤＦメンブランフィルター上のミクロコロニーの強度の上昇を 示す写真である。 結論： ＰＶＤＦ製のメンブランフィルターは、混合セルロースエステル製のフィル ターより強い大腸菌型細菌の化学発光性ミクロコロニーを与え、細菌の検出性の 向上を示している。 実施例４ この実施例は、疎水性メンブランフィルター、特にＰＶＤＦ（デュラポア（ Durapore）（登録商標）を用いて試料中に存在する細菌を濃縮すると、化学発光 に基づき、メンブランフィルター上の総大腸菌型細菌は、陽イオン性ポリマーや 蛍光色素を添加することなく可視化できることを証明する。 材料： メンブランフィルター：実施例１に記載のもの。 増殖／誘導培地：実施例３に記載のＩＬＭ。 緩衝化測定混合物：実施例３に記載のもの。 改変発光増幅物質溶液（改変ＬＡＭ−溶液）：実施例２に記載のもの。 陽イオン性ポリマーや蛍光色素のない促進剤：０．５Ｍピペリジン水溶液（「 代替促進剤」と呼ぶ）。 方法： インキュベーション後、膜を改変ＬＡＭ−溶液または代替促進剤で噴霧した以 外は、実施例３に記載の通りである。次に化学発光性ミクロコロニーを、実施例 ２に記載のようにＸ線フィルムを用いて計測した。 結果： 図８は、ピペリジンと発光増幅物質（左）を含有する促進剤で噴霧した時と 比較して、ピペリジン（代替促進剤、右）のみを含有する促進剤をＰＶＤＦフィ ルターに噴霧した時に得られたものと匹敵する感度を示す。 結論： ＰＶＤＦフィルターが形成する疎水性環境は、酵素切断産物を保護し、これ は保護性陽イオン性ポリマーの使用を不要とし、ピペリジンのみよりなる促進剤 の使用を可能にする。 実施例５ この実施例は、β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼのいずれ かの化学発光検出に基づき、メンブランフィルター上の大腸菌(E.coli)の計測に 関連して、ＴＣおよび／または大腸菌(E.coli)の検出用の従来の選択培地に対し て、ＩＬＭが優れていることを証明するものである。 材料： メンブランフィルター：実施例１に記載のもの。 細菌株：天然の井戸水から単離された大腸菌(E.coli)、n°２。約１００ CFU/ １００ ml の濃度得るための、グルコースを含まないトリプティックソイブロー ス（tryptic soy broth）中の一晩培養物の適当な希釈物。 増殖／誘導培地： − ０．５％マルトース、０．５％トリプトン、０．２％ モノアンモニウムホスフェート、０．５％塩化ナトリウム、０．０５％硫酸マグ ネシウム、０．０１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．３％酵母エキス、０．０１ ％胆汁酸塩、０．００１％セフスロジン、０．１％リン酸二カリウム、および１ ％寒天を含有するＩＬＭ（ｐＨ７．３）。この培地はさらに、β−ガラクトシダ ーゼを誘導するための０．０１％のイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノ シド、またはβ−グルクロニダーゼを誘導するための０．００５％のｐ−ニトロ フェニル−β−Ｄ−グルクロニドを含有する。 − ラウリルトリプトース寒天：１％寒天を加えたラウリルトリプトースブロ ス（ディフコ（Difco）、デトロイト、ミシガン州）を、そのまま（β−ガラク トシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド を補足（β−グルクロニダーゼ）。 − ＥＣ寒天：１％寒天を加えたＥＣ−ブロス（ディフコ（Difco））を、そ のまま（β−ガラクトシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β −Ｄ−グルクロニドを補足（β−グルクロニダーゼ）。 − ｍＴ７寒天（ディフコ（Difco））、そのまま（β−ガラクトシダーゼ） 、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを補足（β− グルクロニダーゼ）。 − ｍＴＥＣ寒天（ディフコ（Difco））、そのまま（β−ガラクトシダーゼ ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを補足（β −グルクロニダーゼ）。 − ｍＦＣ寒天（ディフコ（Difco））、そのまま（β−ガラクトシダーゼ） 、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを補足（β− グルクロニダーゼ）。 − マコンキー（MacConkey）寒天（ディフコ（Difco））、そのまま（β−ガ ラクトシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロ ニドを補足（β−グルクロニダーゼ）。 − ｍＥｎｄｏ寒天ＬＥＳ（ディフコ（Difco））、そのまま（β−ガラクト シダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを 補足（β−グルクロニダーゼ）。 − ラウリル硫酸寒天；１％寒天を加えたラウリル硫酸ブロス（オキソイド社 （Oxoid，Ltd.）、バシングストーク（Basingstoke）、英国）を、そのまま（β −ガラクトシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グル クロニドを補足（β−グルクロニダーゼ）。 − トリプトンバイル寒天；２％トリプトン、０．１６％胆汁酸塩および１％ 寒天を含有し、ここにさらに０．０１％イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシド（β−ガラクトシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル− β−Ｄ−グルクロニド（β−グルクロニダーゼ）を加えた。 − ＭＵＧ−７寒天：Sarhan and Foster（前記で引用）により記載された培 地、但しＭＵＧは省略し、０．０１％イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ ノシド（β−ガラクトシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β −Ｄ−グルクロニド（β−グルクロニダーゼ）を加えた。 − Berg ら、米国特許（前記で引用）で開示された培地、但しＭＵＧ−ｇａ ｌは省略し、そのまま（β−ガラクトシダーゼ）、または０．００５％ｐ−ニト ロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド（β−グルクロニダーゼ）を補足した。 緩衝化測定混合物：実施例２に記載のもの。 改変発光増幅物質−溶液（改変ＬＡＭ−溶液）：０．５モル／Ｌのピペリジン 水溶液中１．６μg/mlのサファイア（Sapphire II）（トロピックス社（Tropix, Inc.））。 方法： 実施例２に記載の通り。但し、ＩＬＭ以外に多種の他の増殖／誘導培 地を使用した。 結果： 図９は、β−ガラクトシダーゼ活性の化学発光測定に基づく、メンブランフ ィルター上の大腸菌(E.coli)の数に関連して、ＴＣおよび／または大腸菌(E.col i)の検出用の他の（市販の）選択培地（Ｂ〜Ｌ）に対してＩＬＭ（Ａ）が優れて いることを示す写真である。ここで、Ｂ＝Sarhan and Foster（前記で引用）に 記載されたＭＵＧ−７培地、Ｃ＝トリプトンバイル寒天、Ｄ＝Berg ら、米国特 許（前記で引用）で開示された培地、Ｅ＝ラウリルトリプトン寒天、Ｆ＝ＥＣ寒 天、 Ｇ＝ｍＴ７寒天、Ｈ＝ｍＴＥＣ寒天、Ｉ＝マコンキー（MacConkey）寒天、Ｊ＝ ｍＦＣ寒天、Ｋ＝ｍＥｎｄｏ寒天ＬＥＳ、およびＬ＝ラウリル硫酸寒天。 図１０は、β−グルクロニダーゼ活性の化学発光測定に基づく、メンブラン フィルター上の大腸菌(E.coli)の数に関連して、ＴＣおよび／または大腸菌(E.c oli)の検出用の他の（市販の）選択培地（Ｂ〜Ｌ）に対してＩＬＭ（Ａ）が優れ ていることを示す写真である。ここで、Ｂ＝Sarhan and Foster（前記で引用） に記載されたＭＵＧ−７培地、Ｃ＝トリプトンバイル寒天、Ｄ＝Berg ら、米国 特許（前記で引用）で開示された培地、Ｅ＝ラウリルトリプトン寒天、Ｆ＝ＥＣ 寒天、Ｇ＝ｍＴ７寒天、Ｈ＝ｍＴＥＣ寒天、Ｉ＝マコンキー（MacConkey）寒天 、Ｊ＝ｍＦＣ寒天、Ｋ＝ｍＥｎｄｏ寒天ＬＥＳ、およびＬ＝ラウリル硫酸寒天で あり、すべての培地は０．００５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニド を補足した。 結論： β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼ活性に基づくミクロコロ ニーの検出にとって、本発明の方法の最適の性能のために、ＩＬＭの使用は重要 な特徴である。 実施例６ 材料： 細菌株：実施例５に記載のもの。 メンブランフィルター：実施例１に記載のもの。 酵母エキスを有する増殖／誘導培地：β−グルクロニダーゼを誘導するために ０．０５％ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを含有する、実施例１に 記載のＩＬＭ。 酵母エキスを含まない増殖／誘導培地：実施例１に記載のＩＬＭであるが、酵 母エキスは含まず、β−グルクロニダーゼを誘導するために０．０５％ｐ−ニト ロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドを含有する。 緩衝化測定混合物：グルクロン（Glucuron）（登録商標）（トロピックス社（ Tropix，Inc.））、２５μモル／ＬとポリミキシンＢ硫酸（（シグマ （Sigma）、７７３０ IU/ml）を含有する０．１モル/Ｌリン酸ナトリウム緩衝液 （ｐＨ７．３）。測定混合物はまた、１ｍＭの塩化マグネシウムを含有する。 改変発光増幅物質溶液（改変ＬＡＭ−溶液）：実施例５に記載のもの。 方法： 大腸菌(E.coli)をデカントし、実施例２に記載のように、グルクロン（Gluc uron）を基質として用いて（但し、改良発光培地（ＩＬＭ）から酵母エキスを除 いて）、化学発光に基づきメンブランフィルター上で計測した。 結果： 図１１は、プレインキュベーションについて、完全ＩＬＭ（左）に対して、 酵母エキスのないＩＬＭ（右）を用いて得られた大腸菌(E.coli)についての化学 発光応答の増強を示す。 結論： 酵母エキスのないＩＬＭは、酵母エキスを含む完全ＩＬＭに比較して、メン ブランフィルター上の発光性コロニーの強度を改良する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，Ｂ Ｒ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＩ，ＧＢ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＫ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ａ）メンブランフィルター上の細菌を濃縮する工程； ｂ）メンブランフィルターとその上に濃縮された細菌を、細菌の増殖を支持す る栄養物質およびその増殖と代謝の過程でマーカー酵素を誘導するための誘導物 質を含有する増殖培地上にのせる工程； ｃ）メンブランフィルターとその上に濃縮された細菌をプレインキュベートし て、メンブランフィルターの上でこれらの細菌のミクロコロニーを形成させ、マ ーカー酵素を産生させる工程；そして ｄ）発光を用いてミクロコロニーを肉眼で見えるようにする工程、 を具備した、液体または液体化試料中の大腸菌型細菌、特に総大腸菌型細菌、 便大腸菌型細菌または大腸菌（E.coli）の酵素的検出方法方法であって、 − 該プレインキュベーション工程（ｃ）後に増殖培地からメンブランフィル ターを取り出し； − メンブランフィルター上のミクロコロニーをメンブラン透過化剤（permea bilizer）で処理して、これを該マーカー酵素の化学発光性基質または蛍光性基 質と接触させ； − ミクロコロニーをインキュベートして該基質を切断させて、化学発光性化 合物または蛍光性化合物を産生させ；そして − ミクロコロニーにより産生された化学発光性化合物または蛍光性化合物か らの発光を開始させる、 ことを具備した酵素測定法により、ミクロコロニーを肉眼で見えるようにする ことを特徴とする、上記方法。 ２．前記のプレインキュベーション工程（ｃ）後に、メンブランフィルターを メンブラン透過化剤（permeabilizer）と前記の基質とを含有する測定培地上に のせることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．一般に使用されるセルロースエステルフィルターよりも疎水性であるメン ブランフィルターを使用し、特にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の メンブランフィルターを使用することを特徴とする、請求項１、または２に記載 の方法。 ４．便大腸菌型細菌または総大腸菌型細菌検出のために、β−ガラクトシダー ゼの誘導物質を使用し、大腸菌(E.coli)の検出のために、β−グルクロニダーゼ の誘導物質を使用することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載 の方法。 ５．前記の誘導物質が、β−ガラクトシダーゼに対してはイソプロピル−β− Ｄ−チオガラクトピラノシドまたはメリビオースからなる群、並びにβ−グルク ロニダーゼに対してはイソプロピル−β−Ｄ−チオグルクロニド、ｐ−ニトロフ ェニル−β−Ｄ−グルクロニド、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルクロニドお よびメチル−β−Ｄ−グルクロニドよりなる群、から選択されることを特徴とす る、請求項４に記載の方法。 ６．β−ガラクトシダーゼの誘導物質を使用し、蛍光性基質として蛍光性ガラ クトピラノシド、好ましくは、４−トリフルオロメチル−ウンベリフェリル−β −Ｄ−ガラクトピラノシド（ＴＦＭＵ−ｇａｌ）、または別のウンベリフェリル −β−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用することを特徴とする、請求項１乃至５の いずれが１項に記載の方法。 ７．β−グルクロニダーゼの誘導物質を使用し、蛍光性基質として蛍光性グル コニド、好ましくは、４−トリフルオロメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グル クロニド（ＴＦＭＵＧ）または別のウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドを 使用することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。 ８．β−ガラクトシダーゼの誘導物質を使用し、化学発光性基質として化学発 光性ガラクトピラノシド、特に、３−（４−メトキシスピロ（１，２−ジオキセ タン−３，２’−トリシクロ−（３．３．１．１^3.7）デカン）−４−イル）フ ェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（AMPGD）、またはその誘導体、特にクロ ロ誘導体）を使用することを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか１項に記載 の方法。 ９．β−グルクロニダーゼの誘導物質を使用し、化学発光性基質として化学発 光性グルクロニド、特に、３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン− ３，２’−（５’−クロロ）−トリシクロ−（３．３．１．１^3.7］デカン）− ４−イル）フェニル−β−Ｄ−グルクロニド（グルクロン（Glucuron）（登録商 標））、またはその誘導体を使用することを特徴とする、請求項１乃至５のいず れか１項に記載の方法。 １０．発色性基質の切断により産生される化学発光性化合物が、有機塩基、特 に、ピペリジンの希薄溶液を含有する促進剤溶液により化学的に開始されること を特徴とする、請求項８、または９に記載の方法。 １１．一般に使用されているセルロースエステルフィルターよりも疎水性であ るフィルターが使用され、特にポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製が使 用され、前記の促進剤溶液が主に有機塩基のみ、特にピペリジンの希薄溶液より なることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。 １２．メンブラン透過化剤としてポリミキシンＢおよび／またはコリスチンメ タンスルホネートを使用することを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか１ 項に記載の方法。 １３．前記の増殖培地として、鉱物栄養物質、タンパク質加水分解物、特にト リプトン）、および糖、好ましくはマルトース、またはポリアルコール、好まし くはマンニトールを含有する培地を使用することを特徴とする、請求項１乃至１ ２のいずれが１項に記載の方法。 １４．鉱物栄養物質、タンパク質加水分解物、特にトリプトン、大腸菌型細菌 の増殖と代謝の過程でマーカー酵素を誘導する誘導物質、特にβ−ガラクトシダ ーゼまたはβ−グルクロニダーゼ、および糖、好ましくはマルトース、またはポ リアルコール、好ましくはマンニトールを含有することを特徴とする、請求項１ 乃至１３のいずれか１項に記載の方法で使用するための増殖培地。 １５．前記の鉱物栄養物質が、モノアンモニウムホスフェート、リン酸水素二 カリウム、塩化ナトリウムおよび硫酸マグネシウムからなることを特徴とする、 請求項１４に記載の増殖培地。 １６．ドデシル硫酸ナトリウム、胆汁酸塩、およびセフスロジンのような大腸 菌型細菌のインヒビターを含有することを特徴とする、請求項１４、または１５ に記載の増殖培地。