JPH11504000A - 造血前駆細胞の増殖を促進するチオール類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、造血前駆細胞の増殖を刺激する方法に関する。特に、本発明は、invitroおよびin vivo で造血前駆細胞の増殖を刺激するためのチオール類とその関連化合物の使用に関する。さらに、本発明は、骨髄形成異常症や後天性免疫不全症候群を含むがこれらに限らない、骨髄不全状態および免疫不全状態を治療するための上記化合物の使用方法に関する。図面は骨髄コロニー形成アッセイを示す。

Description

【発明の詳細な説明】 造血前駆細胞の増殖を促進するチオール類 １．序論 本発明は、造血前駆細胞の増殖を刺激する方法に関する。特に、本発明は、in vitroおよびin vivo で造血前駆細胞の増殖を刺激するためのチオール類とその 関連化合物の使用に関する。さらに、本発明は、骨髄形成異常症や後天性免疫不 全症候群を含むがこれらに限らない、骨髄不全状態および免疫不全状態を治療す るための上記化合物の使用方法に関する。 ２．発明の背景 前悪性疾患、明らかな悪性疾患および免疫不全症を含めて、さまざまな疾病お よび障害はリンパ−造血系の機能不全に関係している。これらの症状の一部は、 分化するように誘導されると患者の機能不全症を克服しうる前駆細胞を用いて、 リンパ−造血系を再増殖（repopulate）させることにより軽減および／または治 癒されるだろう。それゆえ、造血を開始させかつ造血を調節できることが非常に 重要になってくる（McCuneら，1988，Science 241:1632）。 ヒトにおいて成功している治療形態は骨髄移植である。白血病の治療で骨髄移 植を使用することとは別に、骨髄移植は他の新生物の治療において頻繁に使用さ れるようになってきている（Epstein and Slease，1985，Surg．Ann．17:125） 。しかしながら、このタイプの治療は侵入的な手術を必要とするので（ドナーに とってもレシピエントにとっても）苦痛を伴うものであり、特に同種異系間の移 植の場合は、レシピエントに重症で致命的でさえある合併症および関連する移植 片対宿主病（GVHD）の結果を引き起こすことがある。したがって、GVHDの危険は 、致命的な疾病をかかえた患者に対して骨髄移植を行うのを制限している。造血 障害の別の治療法は、レシピエントの血液細胞の発生を刺激するために増殖因子 またはサイトカインを使用することである(Dexter，1987，J．Cell Sci．88:1;M oore，1991，Annu．Rev．Immunol．9:159)。 血液細胞の形成過程は、少数の自己再生幹細胞が系統特異的な前駆細胞を生み 出し、続いてその前駆細胞が増殖・分化して成熟循環血液細胞を生ずる過程であ るが、この過程は少なくとも一部は特定のホルモンによって調節されていること がわかっている。こうしたホルモンは集合的に造血増殖因子として知られている （Metcalf，1985，Science 229:16; Dexter，1987，J．Cell Sci．88:1; Golde and Gasson，1988，Scientific American，July:62; Tabbara and Robinson，19 91，Anti-Cancer Res．11:81; Ogawa，1989，Environ．Health Presp．80:199; Dexter，1989，Br．Med．Bull．45:337）。組換えＤＮＡ法の出現により、多数 のこうした分子がクローン化されて、組換え体の形で発現されている(Souza ら ，1986，Science 232:61; Gough ら，1984，Nature 309:763; Yokotaら，1984， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81:1070; Kawasakiら，1985，Science 230:291)。 これらの増殖因子はその構造、生物学、そして治療可能性でさえも研究されて いる。最もよく特性付けられた因子として、例えば、エリトロポエチン(EPO)、 幹細胞因子(SCF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、マクロフ ァージコロニー刺激因子(M-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、インターロ イキン類がある。これらの因子は血液細胞の発育過程の異なる時期で異なる細胞 型に作用する。医療におけるそれらの使用可能性には、輸血の必要性を少なくす ること、移植および細胞障害性のがん治療の後の骨髄の回復を速めること、免疫 抑制疾患を治療すること、損傷を治癒すること、免疫反応を活性化させることな どが含まれる（Golde and Gasson，1988，Scientific American，July:62）。造 血前駆細胞の増殖および分化を誘導することとは別に、こうしたサイトカインは 、成熟造血細胞の移動への影響（Weibart ら，1986，J．Immunol．137:3584）を 含めて、成熟血液細胞の多くの機能を活性化する(Stanley ら，1976，J．Exp．M ed．143:631; Schraderら，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:323; Moore ら，1980，J．Immunol．125:1302; Kurland ら，1979，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 76:2326; Handman and Burgess，1979，J．Immunol．122:1134; Vadasら ，1983，Blood 61:1232; Vadasら，1983，J．Immunol．130:795)こともわかって いる。 これらの増殖因子は種々の造血細胞系統に対して増殖および／または分化作用 を有することがわかっているが、多くの臨床疾患の背景においてそれらが有効で あることは証明されていない。例えば、骨髄形成異常症候群（myelodysplastic syndrome: ＭＤＳ）は、血液細胞の非効率的な生産、進行性の血球減少および急 性白血病に進行しやすい危険性により特徴づけられる造血幹細胞障害の別のグル ープを構成する（Listら，1990，J．Clin．Oncol．8:1424）。ＭＤＳ患者を組換 えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子と組換えヒト顆粒球コロニー刺激 因子で治療した臨床試験は、これらのサイトカインが治療した患者の顆粒球形成 を回復させるが、その効力は顆粒球／単球系統に限られ、ヘモグロビンおよび／ または血小板の数をほとんどまたは全く向上させないことを示した(Schusterら ，1990，Blood 76(Suppl.1):318a)。最近になって、この種の患者を組換えヒト エリトロポエチンで治療したところ、患者の25％未満でヘモグロビンの持続的向 上および／または輸血の必要性の減少が達成されたにすぎなかった(Besaら，199 0，76(Suppl.1):133a; Hellstromら，1990，76(Suppl.1):279a; Bowenら，1991 ，Br．J．Haematol．77:419)。したがって、ＭＤＳのような骨髄不全状態を治療 するための有効な薬剤の必要性が依然存在している。 さらに、サイトカインは製造するのが難しくかつ費用がかかる。こうした因子 はタンパク質であるので、その製造は直接的な化学合成になじみにくい。その上 、内因的発現レベルが低く、しかもヒト細胞の増殖速度が限られているため、こ れらのタンパク質の天然生産は非常に割高につく。組換え法による生産も莫大な 費用と技術的な障害を伴う。それゆえ、これらの以前に報告された分子はどれも 、in vivo 投与に適した、生物学的に活性で容易に合成できる造血前駆細胞の刺 激剤を提供しない。 ３．発明の概要 本発明は、造血前駆細胞を刺激する際のチオール類および関連化合物の使用に 関する。このようなチオール化合物は米国特許第3,892,824 号の教示にしたがっ て容易に合成できる。本発明は、一部には、造血前駆細胞の刺激におけるチオー ル化合物、アミフォスチン（amifostine）、の以前には知られていなかった効力 を本発明者らが見いだしたことに基づいている。造血前駆細胞は、これらの細胞 を培養して、in vitroにおいてチオール化合物でそれらを処理することにより刺 激され得る。あるいは、より多くの血液細胞を必要としている患者にチオール化 合物を直接投与することもできる。したがって、本発明は、ＭＤＳや免疫不全症 のような骨髄不全状態を含むがこれらに限らない造血前駆細胞の増殖を必要とす る症状を治療する方法を提供する。 ４．図面の説明 図１． 骨髄コロニー形成アッセイ。４人のＭＤＳ患者から単離した骨髄細胞 をアミフォスチンで処理し、洗浄し、メチルセルロース中にプレートした。対照 サンプルはこの化合物で処理しなかった。その後、CFU-GEMM、BFU-E およびCFU- GMコロニー形成について各サンプルをアッセイした。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、一部には、アミフォスチンがin vitroにおいて造血前駆細胞を刺激 するという本発明者らの知見に基づいている。これを基礎として、本発明は、造 血細胞の増殖を必要とするあらゆる症状の治療方法におけるチオール類およびポ リアミン類並びにそれらの機能性誘導体もしくは類似体の使用を包含する。 5.1. 化合物 本発明による造血前駆細胞の刺激は、最小限の毒性でもってヒトへの使用に適 しているチオール化合物による処理により達成される。特に、本発明は、式 RNH (C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂を有するアミノチオール類（ここでR は水素、アリール 、アシルまたは炭素原子数１〜７のアルキル基であり、各n は２〜６の数値であ る）、またはその水和物もしくは薬学的に許容される塩（例えば、ハロゲン塩お よび／またはアルカリ金属塩）に関する。この種の化合物およびその合成法は、 Piper & Johnstonへの米国特許第3,892,824 号に詳細に記載されており、この特 許をそのままここに参考として組み入れるものとする。かかる化合物として、ア ミフォスチン、グルタチオン、N-アセチルシステイン、チオ硫酸ナトリウムなど が挙げられるが、これらに限らない。それらは当業者には公知の方 法で製造することができ、例えば、F．Cortese,“Organic Syntheses”，Coll． bol．II，A.H．Blatt編，John Wiley and Sons，Inc.，New York，N.Y.，1943， pp．91-93; S．Akerfeldt，Acta Chem Scand.，1960，14: 1980; および J.R.Pi per ら，Chem．Ind．(London)，1966，p.2010 を参照のこと。 好適な化合物である S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイドロジェ ン ホスホロチオエート一水和物 H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂.H₂O(アミフォスチ ンまたはWR 2721)の製造もPiper & Johnstonへの米国特許第3,892,824 号に詳述 されている。この化合物の脱リン酸化形態がその遊離チオール活性代謝産物(WR1 065)である。さらに、室温で安定な三水和物形態も合成されている。 経口投与の場合、好適な化合物は WR 151327（化学的命名法：1-プロパンチオ ール-3-[[3-(メチルアミノ)プロピル]アミノ]-ジハイドロジェン ホスホチオレ ート）であり、この化合物は次の式： CH₃NH(CH₂)₃NH(CH₂)₃SPO₃H₂ で表される。WR 151327 は酸素−フリーラジカル掃去能を有するチオホスフェー ト還元剤であり（Grdinaら，1991，前掲）、細胞を殺すことなくまたはその増殖 を抑制することなく抗ＨＩＶ活性を発揮する。WR 151326 は脱リン酸化された遊 離のチオールである。これらの化合物はＨＩＶ活性を抑制することができるので 、抗ＨＩＶ効果と造血細胞の刺激効果の両方を達成するためにＨＩＶ患者を治療 するのに特に有用でありうる。 5.2. 化合物の使用 本発明の化合物は、循環血液細胞数の減少を示すあらゆる症状（個々には貧血 、白血球減少症、血小板減少症、または汎血球減少症および種々の形態の免疫不 全状態を含むが、これらに限らない）の治療のために患者に直接投与することが できる。また、本化合物は培養下の造血前駆細胞の数を増やすためにも使用され 、その後細胞は患者の静脈内に注入される。骨髄または末梢血幹細胞とチオール とのin vitroまたはex vivo インキュベーションの場合、好ましい用量範囲は0. 1 μM 〜5 mMである。本発明の方法は血液細胞数の減少を伴う症状（後天性およ び先天性の骨髄不全状態および免疫不全症候群、例えばファンコーニ貧血、先天 性 好中球減少症およびＭＤＳ、および細胞障害性のがん治療を含むがこれらに限ら ない）を治療するのに有効でありうる。 上記の第5.1 節に記載した化合物のin vivo 投与は、次の方法で行うことがで きる。最初に、骨髄不全患者のグループに、100 mg/m²、200 mg/m²、400 mg/m² または740 mg/m²の異なる量の化合物を静脈内注入して最大許容量を決定する。 その後、患者を予め決定された用量で１週間に３回、３週間治療する。14日の休 止期間後、細胞カウントおよびコロニー形成により血液学的応答を評価する。応 答した患者は、末梢細胞のカウント数が正常レベルにもどるまで治療を続ける。 5.3. 医薬製剤および投与経路 同定された化合物は、単独でまたは適当な担体もしくは賦形剤と混合した医薬 組成物の形で、ＭＤＳを含むがこれに限らない種々の疾病を治療または軽減する 用量でヒト患者に投与され得る。治療的に有効な量はさらに、治療前の状態と比 べて、血液細胞数を増加させるのに十分な化合物の量をさす。本発明化合物の製 剤化および投与の技術は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”，Mack Pu blishing Co.，Easton，PAの最新版に載っている。 5.3.1. 投与経路 適当な投与経路として、例えば、経口、直腸、経粘膜、経皮または腸投与；筋 肉内、皮下、髄内注射を含む非経口送達、並びに鞘内、直接心室内、静脈内、腹 腔内、鼻腔内または眼内注入がある。 また、化合物を全身的に投与するのではなく、例えば、化合物を骨髄に直接注 入することにより、しばしばデポ剤または持続放出製剤の形で、局所的に投与す ることもできる。 さらに、標的を定めたドラッグデリバリーシステムの形で、例えばリポソーム 内に保持させて、および／または細胞特異的抗体と結合させて、化合物を投与し てもよい。リポソームおよび細胞特異的抗体は骨髄細胞にターゲッティングされ 、骨髄細胞によって選択的に取り込まれるだろう。 5.3.2. 組成物／製剤 本発明の医薬組成物は、それ自体公知の方法で、例えば慣用の混合、溶解、造 粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、エントラッピング(entrapping)また は凍結乾燥の方法を用いて調製することができる。 こうして、本発明にしたがって用いられる医薬組成物は、医薬として使用可能 な製剤への活性化合物の加工処理を容易にする賦形剤や補助剤を含む生理学的に 許容される担体を１種以上用いて、慣用方法で製剤化することができる。適当な 製剤は所定の投与経路により決まる。 注射の場合は、本発明の化合物を適当な水溶液中に、例えばハンクス液、リン ゲル液、生理食塩水のような生理学的に適合しうる緩衝液中に製剤化する。経粘 膜または経皮投与の場合は、透過すべきバリアーに適した浸透剤を製剤化におい て用いる。このような浸透剤は当技術分野で一般的に知られている。 経口投与の場合は、活性化合物を当技術分野で公知の薬学的に許容される担体 と混合することで、化合物を容易に製剤化することができる。こうした担体は、 治療すべき患者による経口摂取のために、本発明の化合物を錠剤、丸剤、糖衣錠 、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などに製剤化することを 可能にする。経口用の医薬製剤を調製するには、固体の賦形剤と混合し、任意に 、得られた混合物を粉砕し、所望により適当な補助剤を添加した後で、顆粒の混 合物を加工して錠剤または糖衣錠のコアを得る。適当な賦形剤は特に充填剤であ り、例えばラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールを含む糖類； 例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデン プン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチ ルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、および／またはポリビ ニルピロリドン(PVP)のようなセルロース調製物である。所望により、架橋ポリ ビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン 酸ナトリウム）などの崩壊剤を添加してもよい。 糖衣錠のコアには適当なコーティングをほどこす。そのために濃厚な糖溶液が 用いられ、この溶液は任意にアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カ ーボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカ ー液、および適当な有機溶媒または混合溶媒を含んでいてもよい。同定のために 、または活性化合物の用量の異なる組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣 錠のコーティングに色素や顔料を添加してもよい。 経口的に用いられる医薬製剤には、ゼラチンで作られたプッシュ- フィット(p ush-fit)カプセルと、ゼラチンおよび可塑剤（例：グリセロール、ソルビトール ）から作られた軟質の密封カプセルがある。プッシュ- フィットカプセルは、ラ クトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクやステア リン酸マグネシウムなどの滑沢剤、場合により安定剤と混合した活性成分を含む ことができる。軟質カプセルの場合は、活性化合物を脂肪油、液状パラフィン、 液状ポリエチレングリコールといった適当な液体中に溶解させるか、または懸濁 させる。さらに、安定剤を加えてもよい。経口投与用の製剤はすべて、このよう な投与に適した投薬量とすべきである。 バッカル投与の場合には、組成物は慣用方法で製剤化される錠剤またはロゼン ジ剤の形をとることができる。 吸入による投与の場合、本発明にしたがって用いられる化合物は、適当なプロ ペラント（噴射剤）、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメ タン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用い て、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で便利に送入さ れる。加圧エアロゾルの場合には、計測した量を送入するためのバルブを備える ことにより投薬量単位を決定することができる。吸入器またはインサフレーター で用いるために、化合物と適当な粉末基剤（例えば、ラクトース、デンプン）と の粉末ミックスを含有する（例えば、ゼラチンの）カプセルおよびカートリッジ を作製することができる。 注入、例えばボーラス注射または連続注入による非経口投与のために化合物を 製剤化することができる。注入用の製剤は１回量の剤形で、例えばアンプルで提 示されても、防腐剤を添加した複数回量の容器で提示されてもよい。こうした組 成物は油性または水性ビヒクル中に調製した懸濁液、溶液またはエマルジョンの ような形をとることができ、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの添加 剤を含んでいてもよい。 非経口投与用の医薬製剤には水溶性の形の活性化合物の水溶液がある。さらに 、適当な油性の注入用懸濁液として活性化合物の懸濁液を調製することができる 。適当な親油性の溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油のような脂肪油、オレイン 酸エチルやトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームがあ る。水性の注入用懸濁液は懸濁液の粘度を高める物質、例えばナトリウムカルボ キシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランを含むことができる。 場合により、懸濁液は適当な安定剤を含んでいてもよく、また、高濃厚液の調製 を可能にするために化合物の溶解度を高める物質を含んでいてもよい。 また、使用前に適当なビヒクル（例えば、発熱物質フリーの滅菌水）を用いて 用時調製するために、活性成分を粉末の形で製剤化することもできる。 活性化合物はまた、例えばカカオ脂やグリセリドのような慣用の座剤用基剤を 含有する、座剤または保持浣腸剤などの直腸注入用組成物として製剤化すること もできる。 上述した製剤に加えて、化合物をデポ剤として製剤化してもよい。このような 長時間作用型製剤は植え込み（例えば皮下または筋肉内に）または筋肉内注射に より投与することができる。したがって、例えば、化合物は適当なポリマー物質 、疎水性物質（例えば、許容される油中に調製したエマルジョンとして）または イオン交換樹脂を用いて製剤化することができ、また、難溶性の誘導体として、 例えば難溶性の塩として製剤化してもよい。 本発明の疎水性化合物のための製剤上の担体は、ベンジルアルコール、非極性 の界面活性剤、水混和性の有機ポリマーおよび水性相を含む共溶剤系である。共 溶剤系はＶＰＤ共溶剤系でありうる。ＶＰＤは無水エタノール中に調製した3% w /vのベンジルアルコール、8% w/vの非極性界面活性剤ポリソルベート80、および 65% w/v のポリエチレングリコール300 の溶液である。ＶＰＤ共溶剤系（VPD:5W ）は5%デキストロース水溶液で１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶剤系 は疎水性化合物をよく溶解し、全身投与後のそれ自体の毒性が低い。もちろん、 その溶解性および低毒性の性質をそこなうことなく、共溶剤系の比率を大幅に変 化させることができる。さらに、共溶剤系の成分の正体を変化させてもよい。例 えば、ポリソルベート80の代わりに他の低毒性の非極性界面活性剤を使用しても よく、ポリエチレングリコールの画分サイズを変えてもよく、ポリエチレングリ コールを他の生物適合性のポリマー、例えばポリビニルピロリドンで置換しても よく、また、デキストロースの代わりに他の糖類または多糖類を用いてもよい。 あるいは、疎水性医薬化合物用の他のデリバリーシステムを使用することもで きる。リポソームとエマルジョンが疎水性薬剤用のデリバリービヒクルまたは担 体の公知例である。通常、毒性がより高いという犠牲を払うが、ジメチルスルホ キシドのようなある種の有機溶媒も使用し得る。さらに、治療薬を含有する固体 の疎水性ポリマーの半透性マトリックスのような持続放出システムを用いて化合 物を送達させてもよい。さまざまな持続放出性物質が確立されており、当業者に は公知である。持続放出カプセルは、その化学的性質に応じて、数週間から100 日以上にわたって化合物を放出させる。治療薬の化学的性質および生物学的安定 性に応じて、タンパク質安定化のための更なる戦略を採用してもよい。 医薬組成物はさらに適当な固体もしくはゲル相の担体または賦形剤を含んでい てもよい。このような担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸 カルシウム、種々の糖類、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリ エチレングリコールのようなポリマーが挙げられるが、これらに限らない。 造血前駆細胞を刺激する本発明化合物の多くは、薬学的に適合しうる対イオン との塩として提供される。薬学的に適合しうる塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、 酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むがこれらに限らない、多くの酸を用いて 生成させることができる。塩は対応する遊離塩基形態よりも水性または他のプロ トン性溶媒に溶解する傾向がある。 5.3.3. 有効投薬量 本発明で用いるのに適した医薬組成物には、その意図した目的を達成するのに 有効な量の活性成分を含有する組成物が含まれる。より詳細には、治療有効量と は、治療すべき被験者の症状の発生を防止するか、既存の症状を軽減するのに有 効な量のことである。有効量の決定は、特にここに示した詳細な開示に照らして 、当業者の能力の範囲内である。 本発明の方法で用いるどの化合物の場合も、最初は細胞培養アッセイから治療 有効量を概算することができる。例えば、細胞培養で測定されたEC50（50％増加 のための有効量）、すなわちBFU-E、CFU-GEMM、CFU-GMなどの形成によりアッセ イした骨髄前駆細胞複製の最大刺激の半分を達成する試験化合物の濃度、を含む 循環濃度範囲を達成するための動物モデルで用量を決定することができる。こう した情報はヒトでの有効量をより正確に決定するために使用される。 治療有効量とは、血液細胞数の増加または患者の生存の長期化に関係した症状 の緩和をもたらす化合物の量をさす。かかる化合物の毒性および治療効力は、例 えばLD50（母集団の50％致死量）およびED50（母集団の50％治療有効量）を決定 するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬物学的手法により決定 し得る。毒性効果と治療効果との用量比が治療係数であり、これはLD50とED50の 比として表される。治療係数の高い化合物が好適である。これらの細胞培養アッ セイおよび動物実験から得られたデータがヒトの投薬量範囲を決定する際に用い られる。かかる化合物の投薬量は、毒性をほとんどまたは全く示さないED50を含 む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用いる剤形および投与経路に応じて 、この範囲内で投薬量を変えることができる。正確な処方、投与経路および投薬 量は、患者の症状をかんがみて個々の医師により選択される。（例えば、Fingl ら，1975,“The Pharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1，p.1を参照 のこと。） 投薬量および投薬間隔は、前駆細胞の刺激効果を維持するのに十分な活性成分 の血漿レベルを与えるように個々に調製しうる。全身投与のための患者の常用量 は 100〜2000 mg/日の範囲である。患者の体表面積あたりで換算すると、常用量 は50〜910 mg/m²/日の範囲である。通常の平均血漿レベルは 0.1〜1000μM の範 囲に維持すべきである。 局所投与または選択的取込みの場合、薬物の有効局所濃度は血漿濃度と関連し ないかもしれない。 投与される組成物の量は、いうまでもなく、治療すべき被験者、被験者の体表 面積、疾病の重症度、投与方法および担当医師の判断により左右されるだろう。 5.3.4. 包装 組成物は、所望により、活性成分を含有する単位剤形を１個以上含むパックま たはディスペンサー器具で提示することができる。このパックは例えば金属ホイ ルまたはプラスチックホイル、例えばブリスターパックから成る。パックまたは ディスペンサー器具には投与のための説明書を添付してもよい。また、薬学的に 適合しうる担体を用いて本発明化合物を含有する組成物を調製し、適当な容器に 詰め、表示した症状の治療についてのラベルを貼ってもよい。ラベルに明記され る適当な症状としては免疫不全症の治療が含まれる。 ６．実施例： アミフォスチンは造血前駆細胞の刺激剤である これまでの研究では、数種のスルフヒドリル化合物が造血細胞に対してある程 度のin vitro刺激作用をもつことが報告されている（Helgestad ら，1986，Blut 52: 1-8; Ash ら，1981，Blood 58: 309-316; Toohey，1975，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 72：73-77;および Hankins and Krantz，1979，J．Biol．Chem．254 : 5701-5707）。しかし、これらの化合物がin vivo で増殖促進作用をもつこと は知られておらず、実際、いくつかの化合物はその毒性のためにin vivo 投与に 適していない。その上、これらの化合物はその抗酸化活性のために増殖因子含有 ならし培地中で内因性阻害剤を中和することにより機能することが示唆されてい る。対照的に、本明細書にはアミフォスチンは前駆細胞の増殖を刺激することが 示される。その細胞増殖促進活性はいくつかの組換えサイトカインの活性より大 きいことがわかった。また、グルタチオンと違って、アミフォスチンは高濃度で さえも骨髄前駆細胞に対して有毒でなかった。アミフォスチンはもともとは電離 線に対する細胞保護剤として開発されたものである。アミフォスチンは電離線、 アルキル化剤および白金類似体の細胞毒性から正常な組織を保護することがわか っていたが、本発明以前に細胞増殖促進剤として試験されたことはない。 6.1. 材料および方法 正常な個人またはＭＤＳ患者から骨髄吸引により骨髄検体を得た。ヘパリン化 骨髄サンプルからFicoll Hypaque密度勾配遠心により単核細胞画分を単離した。 ２×10⁶個の骨髄単核細胞をさまざまな濃度の WR 1065（アミフォスチンの遊離 のチオール活性代謝産物）またはアミフォスチン(WR 2721)とインキュベートし た。インキュベーションを15分間行い、その後細胞をペレット化し、10 ml の培 養培地で２回洗浄し、そしてコロニー形成のためにメチルセルロース中にプレー トした。比較のため、細胞をグルタチオン(GSH)、インターロイキン-1（IL-1） 、インターロイキン-3（IL-3）およびマスト細胞増殖因子(MGF)ともインキュベ ートした。 骨髄単核細胞からのCFU-GM、BFU-E およびCFU-GEMMコロニーの形成を、以前に 記載された方法（Pike and Robinson，1970，J．Cell．Physiol．76: 77-84）の 変法を用いて測定した。薬剤にさらした後、Iscove改良Dulbecco培地、0.8%メチ ルセルロース、30% ウシ胎児血清、エリトロポエチン、および5%フィトヘムアグ ルチニン刺激白血球ならし培地(PHA-LCM)またはウシ胎児血清中の単核細胞の１m l懸濁液を35mlペトリ皿に３通りずつプレートし、5% CO₂の湿潤雰囲気下に37℃ でインキュベートした。７日後に倒立顕微鏡を使って40個の細胞を含む顆粒球／ マクロファージコロニー（CFU-GM）およびクラスター（3〜40個の細胞）を評価 し、結果をプレートした２×10⁶個の細胞当たりの平均コロニー数として表した 。BFU-E およびCFU-GEMMは14日間のインキュベーション後に評価した。アミフォ スチンまたはWR 1065 の存在下または不在下での平均コロニー数を比較し、対照 に対するパーセントとして表した。 6.2. 結果 WR2721およびWR1065（3mg/ml）は正常骨髄においてCFU-GEMMおよびBFU-E の回 収を最高７倍まで増加させたものの、CFU-GMの低い刺激が観察された（範囲：1. 5 〜３倍）。それぞれのチオールの場合は 0.1〜1000μM の濃度で前駆細胞増殖 の用量依存的刺激が起こったが、GSH はより高い濃度では細胞毒性を示した。チ オールへの暴露を24時間まで引き延ばしても、前駆細胞の回収の更なる増加は得 られなかった。MGF 、IL-1およびIL-3(100U/ml)と比較して、低い生理学的濃度 のWR2721(10μM)またはWR1065(1.0 μM)とのプレインキュベーションはBFU-E お よびCFU-GEMMの最高３倍多い回収をもたらした。これらの知見は、WR2721お よびWR1065が造血前駆細胞の増殖の強力な刺激剤であり、試験した組換えサイト カインを効力の点で越えることを示している。 ４人のＭＤＳ患者由来の骨髄の処置より得られた結果を図１に示してある。骨 髄懸濁液を 100または 500μM のアミフォスチンにさらした後でプレートした。 骨髄前駆細胞の増殖の刺激は次のとおりであった。すなわち、CFU-GEMMコロニー の生成は４人の患者のうち２人において対照の約225%まで増加し、BFU-E コロニ ーの生成は４人の患者のうち３人において対照の 300〜650%まで増加し、CFU-GM は４人の患者のうち２人において対照の 150〜350%まで増加した。それゆえ、こ こに開示したチオール類は正常な骨髄と病んだ骨髄の両方において造血細胞の増 殖を刺激する。 本発明は、本発明の個々の側面の例示として提供される特定の実施態様により 、その範囲を制限されるものではない。実際、ここに示したものに加えて、種々 の本発明の改変が前述の記載および添付の図面から当業者には明らかになるだろ う。このような改変も本発明の特許請求の範囲に入るものである。 ここに引用した刊行物はすべてその全体を参考として組み入れるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，Ｌ Ｓ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 キャピッツィ，ロバート，エル. アメリカ合衆国 19041 ペンシルバニア 州 ヘイバーフォード，タンブリッジ サ ークル 100 (72)発明者 リスト，アラン，エフ. アメリカ合衆国 85718 アリゾナ州 タ クソン，キャミノ エスクエラ 4725 エ ヌ.

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．in vitroで造血前駆細胞を有効量のチオール化合物にさらすことを含んでな る造血前駆細胞の刺激方法。 ２．チオール化合物が式： RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂ （ここでR は水素、アリール、アシルまたは炭素原子数１〜７のアルキル基で あり、各n は２〜６の数値である）を有するアミノチオール、またはその水和物 、アルカリ金属塩および／またはハロゲン塩である、請求項１に記載の方法。 ３．アミノチオール化合物が S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイド ロジェン ホスホロチオエート一水和物 H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂.H₂Oである、 請求項２に記載の方法。 ４．アミノチオール化合物が S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイド ロジェン ホスホロチオエート三水和物である、請求項２に記載の方法。 ５．前記の化合物が脱リン酸化された遊離チオールまたはその代謝産物である、 請求項１、２、３または４に記載の方法。 ６．治療有効量のチオール化合物を個体に投与することを含んでなる造血前駆細 胞の刺激方法。 ７．チオール化合物が式： RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂ （ここでR は水素、アリール、アシルまたは炭素原子数１〜７のアルキル基で あり、各n は２〜６の数値である）を有するアミノチオール、またはその水和物 、アルカリ金属塩および／またはハロゲン塩である、請求項６に記載の方法。 ８．アミノチオール化合物が S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイド ロジェン ホスホロチオエート一水和物 H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂.H₂Oである、 請求項７に記載の方法。 ９．アミノチオール化合物が S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイド ロジェン ホスホロチオエート三水和物である、請求項７に記載の方法。 10．前記の化合物が脱リン酸化された遊離チオールまたはその代謝産物である、 請求項６、７、８または９に記載の方法。 11．治療有効量のチオール化合物を個体に投与することを含んでなる骨髄不全状 態の治療方法。 12．チオール化合物が式： RNH(C_nH_2n)NH(C_nH_2n)SPO₃H₂ （ここでR は水素、アリール、アシルまたは炭素原子数１〜７のアルキル基で あり、各n は２〜６の数値である）を有するアミノチオール、またはその水和物 、アルカリ金属塩および／またはハロゲン塩である、請求項11に記載の方法。 13．アミノチオール化合物が S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイド ロジェン ホスホロチオエート一水和物 H₂N(CH₂)₃NHCH₂CH₂SPO₃H₂.H₂Oである、 請求項12に記載の方法。 14．アミノチオール化合物が S-2-(3-アミノプロピルアミノ)エチル ジハイド ロジェン ホスホロチオエート三水和物である、請求項12に記載の方法。 15．前記の化合物が脱リン酸化された遊離チオールまたはその代謝産物である、 請求項11、12、13または14に記載の方法。 16．骨髄不全状態が骨髄形成異常症候群（myelodysplastic syndrome）である、 請求項11に記載の方法。