JPH11246301A - 臓器保存溶液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来より使用されているＨＥＳが添加された
臓器保存溶液と同等もしくはそれ以上の臓器保存溶液を
提供すること。 【解決手段】 ヒアルロン酸及び／又はその生理学的に
許容される塩を含有してなる移植向けの臓器保存溶液を
構成とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、臓器保存溶液に関
し、特にヒアルロン酸及び／又はその生理学的に許容さ
れる塩（以下、総称してヒアルロン酸類という）を含有
してなる移植向けの臓器保存溶液に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】今日、
臓器移植は、難治性末期臓器障害に対する最終的な治療
法として臨床に応用されている。肝臓移植の場合、その
５年生存率は約７０％に達し、この高い成績は、手術法
の改良、臓器保存溶液・免疫抑制剤の開発、臓器供給シ
ステムの構築の発展に支えられている。臓器保存溶液
は、Euro-collins Solution(ＥＣＳ）を初めとして数多
く研究されてきた。現在では、例えば眼球保存溶液とし
てはＥＰ−１１液等が、また、肝臓、腎臓、膵臓、及び
肺臓等では最も優れた臓器保存溶液といわれるUniversi
ty of Wisconsin Solution（ＵＷＳ）が広く用いられて
いる。ＵＷＳの臓器保存時間は、臨床的には腎臓では平
均２４時間、肝臓・膵臓では平均１７時間、心臓では平
均４時間の成績が得られている（JH Southard,臓器保存
研究会, 広島, 1993）。この保存時間をさらに長くする
ことが可能になれば、遠隔地からの臓器の調達が可
能、待機的な移植手術が可能になる、など臓器移植の
全体的なシステムに大きく貢献でき、移植成績の向上に
寄与する大きな可能性を有している。

【０００３】臓器保存溶液は、該溶液によるフラッシン
グ・アウト（flush-out)時の細胞・組織の膨張、及び臓
器保存時の低温化による細胞の膨潤・組織の水腫などを
防止するために高分子電解質が配合される。これまで例
えば、血清アルブミン、デキストラン、ポリビニルピロ
リドン、フィコール（Ficoll）、及びポリエチレングリ
コールなど数多くの検討が行われてきた。最も優れた臓
器保存溶液といわれるＵＷＳ中には臓器保存溶液の高分
子電解質としてヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）が用い
られている。ＨＥＳとは水酸基がヒドロキシエチル基に
置換されたグルコースのα-1,4及びα-1,6結合した高分
子多糖で、ＵＷＳ中では形態維持物質としての役割を担
っている。しかし、ＨＥＳは元来生体外成分であるため
に生体適合性、毒性を含む安全性を保証することは難し
かった。

【０００４】一方、ヒアルロン酸は、哺乳動物の結合組
織に多量に存在する極めて高い粘ちょう性及び保湿性を
有する直鎖状の高分子ムコ多糖であり、本質的に抗原性
が無く生体適合性が高いため、変形性膝関節症の治療薬
や眼科手術補助剤等に用いられている。

【０００５】本発明者らは、上記高分子電解質として現
在、主に用いられているＨＥＳに代替でき、かつそれら
の使用に付随する欠点を改良できる各種高分子物質につ
いて鋭意研究を行った結果、ヒアルロン酸類を使用する
と、意外にも臓器保存中の細胞の生存率が維持され、上
記課題が解決できることを見い出し本発明を完成するに
至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、
（１）ヒアルロン酸類を含有してなる移植向けの臓器保
存溶液、（２）ヒアルロン酸類の平均分子量が１０万以
上である（１）記載の溶液、（３）ヒアルロン酸類の濃
度が０．０５〜１．０重量％である（２）記載の溶液で
ある。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明におけるヒアルロン酸は、鶏冠、硝子体、へその
緒などからの抽出物又はある種のバクテリア、例えばス
トレプトコッカス属のヒアルロン酸産生菌の培養物から
得られ、その由来等の起源を問わず本発明において利用
することができる。しかしながら、ヒアルロン酸産生菌
の培養物から得られるヒアルロン酸は、高分子のものが
高い純度で得られることから好ましい。また、ヒアルロ
ン酸は遊離の酸でもその生理学的に許容される塩であっ
ても良い。生理学的に許容される塩としては、本発明の
臓器保存溶液に添加される他の成分との適合性を有する
ナトリウム塩又はカリウム塩の形にあるものが特に好ま
しい。

【０００８】本発明で使用するヒアルロン酸類は、平均
分子量が１０万以上であるものが好ましく使用できる。
ヒアルロン酸類のような高分子物質の場合、その分子量
分布が単分散でなく多分散性であるため一律に分子量を
規定することは困難であるが、平均分子量は好ましくは
１０万〜２５０万の範囲内である。平均分子量が１０万
未満であるとグルコースの様に低分子のために臓器の細
胞に取り込まれるので細胞及び組織の膨潤が生じる懸念
がある。また、平均分子量２５０万以上であると臓器保
存溶液の粘度が増加してべとつき、臓器取り扱い時の操
作性が低下する。

【０００９】ヒアルロン酸類の濃度は、０．０５〜１．
０重量％であることが好ましい。ヒアルロン酸類の濃度
が、０．０５重量％以下であると細胞の保護効果が低く
なる。また、１．０重量％を超えると粘度が増加してべ
とつき操作性が低下する。

【００１０】本発明の臓器保存溶液は、必要に応じて浸
透圧、ｐＨ等を調整する他の成分が加えられる。用いら
れる他の成分としては、通常、陽イオンとしてナトリウ
ムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマ
グネシウムイオン等が挙げられ、また陰イオンとして塩
素イオン、リン酸イオン、硫酸イオン、及びクエン酸イ
オンが挙げらる。そして、さらにラフィノースを含める
ことができる。

【００１１】上記したような各成分を適当な濃度で処方
して、そのｐＨを６．５〜７．８に、浸透圧を２４０〜
３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に調整すると、本発明の臓
器保存溶液が提供できる。尚、各成分は、リン酸カリウ
ム、硫酸マグネシウムとして添加されるのが好ましい。

【００１２】本発明の臓器保存溶液の製造方法として
は、例えば、まず、ラクトビオン酸、リン酸カリウム、
硫酸マグネシウム、アデノシン、グルタチオン、ヒアル
ロン酸ナトリウム、ラフィノース、及びアロプリノール
を加え、室温で注射用水に溶解せしめ、ｐＨを水酸化ナ
トリウムで調整後、最後に濾過滅菌する。かくして得ら
れる臓器保存溶液は、通常ｐＨが６．５〜７．８、浸透
圧が２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇである。

【００１３】

【実施例】以下、ヒアルロン酸類を含有してなる移植向
けの臓器保存用溶液の具体的な例を実施例により本発明
を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。下記の臓器保存溶液〜を用い
た。ここで臓器保存溶液〜は、下記の処方により製
造した。また、臓器保存溶液は、市販のものを用い
た。

【００１４】臓器保存溶液 ２リットルのフラスコにラクトビオン酸を１００ミリモ
ル、リン酸カリウムを２５ミリモル、硫酸マグネシウム
を５ミリモル、アデノシンを５ミリモル、グルタチオン
を３ミリモル、ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量６
０万）を３ｇ、ラフィノースを６９．４５ミリモルを秤
取り、室温で適量の注射用水に溶解した。次に、１ミリ
モルのアロプリノールを少量の１Ｎの水酸化ナトリウム
に溶解した後、これに加えた。この溶液を１Ｎの水酸化
ナトリウムでｐＨ７．４に調整し、全量を１リットルと
した。尚、この時のヒアルロン酸ナトリウムの濃度は、
０．３重量％であった。これを濾過滅菌し、２００ｍｌ
容のバイアル瓶に無菌的に分注、充填した。これの浸透
圧は３１８ｍＯｓｍ／ｋｇ、粘度は４．５ｍＰａ・ｓで
あった。

【００１５】臓器保存溶液 ２リットルのフラスコにラクトビオン酸を１００ミリモ
ル、リン酸カリウムを２５ミリモル、硫酸マグネシウム
を５ミリモル、アデノシンを５ミリモル、グルタチオン
を３ミリモル、ヒアルロン酸ナトリウム（平均分子量２
０万）を２ｇ、ラフィノースを５６．５９ミリモルを秤
取り、室温で適量の注射用水に溶解した。次に、１ミリ
モルのアロプリノールを少量の１Ｎの水酸化ナトリウム
に溶解した後、これに加えた。この溶液を１Ｎの水酸化
ナトリウムでｐＨ７．４に調整し、全量を１リットルと
した。尚、この時のヒアルロン酸ナトリウムの濃度は、
０．２重量％であった。これを濾過滅菌し、２００ｍｌ
容のバイアル瓶に無菌的に分注、充填した。これの浸透
圧は３１８ｍＯｓｍ／ｋｇ、粘度は３．８ｍＰａ・ｓで
あった。

【００１６】臓器保存溶液 ２リットルのフラスコにラクトビオン酸を１００ミリモ
ル、リン酸カリウムを２５ミリモル、硫酸マグネシウム
を５ミリモル、アデノシンを５ミリモル、グルタチオン
を３ミリモル、ＨＥＳ７００００（杏林製薬製）を８０
ｇ、ラフィノースを１７．６３ミリモルを秤取り、室温
で適量の注射用水に溶解した。次に、１ミリモルのアロ
プリノールを少量の１Ｎの水酸化ナトリウムに溶解した
後、これに加えた。この溶液を１Ｎの水酸化ナトリウム
でｐＨ７．４に調整し、全量を１リットルとした。これ
を濾過滅菌し、２００ｍｌ容のバイアル瓶に無菌的に分
注、充填した。これの浸透圧は３１６ｍＯｓｍ／ｋｇ、
粘度は３．２ｍＰａ・ｓであった。

【００１７】 臓器保存溶液 臓器保存溶液 ：ビアスパン（日本アルコン社製、ＵＷＳ） これの浸透圧は３２１ｍＯｓｍ／ｋｇ、 粘度は３．８ｍＰａ・ｓ

【００１８】実施例１ ラット遊離肝細胞の調整 常法に従い、ウイスター（Wistar）ラットをペントバル
ビタール腹腔内注射により麻酔し、肝臓にコラゲナーゼ
潅流を約１５分行った後、肝臓を摘出し、分散させてラ
ット遊離肝細胞溶液を得た。

【００１９】トリパンブルー排除試験（TB test)による
保存溶液の評価法 トリパンブルーで細胞を染色し、顕微鏡にて総細胞数と
死細胞数を計測し、生存率と細胞密度を算出する。細胞
の生存率（％）が高いほど、臓器保存溶液の性能は高い
ことを示す。尚、細胞の生存率（％）及び細胞密度（ce
lls ／ml）は、次式により算出される。 細胞の生存率（％）＝（総細胞数−死細胞数）／総細胞
数×１００ 細胞密度（cells ／ml）＝（総細胞数−死細胞数）／
０．１×１０００×希釈倍率

【００２０】チオバルビツール酸試験(TBAtest) による
保存溶液の評価法 ラット遊離肝細胞溶液を適宜に希釈し、この希釈液に１
０％トリクロル酢酸１ｍｌ、０．７％チオバルビツール
酸２ｍｌを各々加えて混和し、１００℃で２０分間加熱
後、室温で１０００×Ｇで２５分間遠心し、上清の吸光
度を５３０ｎｍで測定する。ＴＢＡ値（abs ／cells)が
高いことは脂質の過酸化が進行していることを示し、臓
器保存に良くないことを示す。尚、ＴＢＡ値（abs ／ce
lls)は、次式により算出される。 ＴＢＡ（abs ／cells)＝吸光度／細胞密度

【００２１】ラット遊離肝細胞を用いた保存溶液の評価 実験Ｎｏ．１−１〜Ｎｏ．１−４のようにラット遊離肝
細胞溶液１ｍｌに対し、上記の臓器保存溶液〜を別
々に２ｍｌ加え、４℃で４８時間遮光保存した。保存
後、これら臓器保存溶液の上記の TB test及びTBA test
を行った。ラット遊離肝細胞の生存率（％）は TB test
より、また、ＴＢＡ値（abs ／cells)値はTBA testより
求めた。結果を表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１より、ラット遊離肝細胞の生存率、及
びＴＢＡ値ともに実験Ｎｏ．１−１及びＮｏ．１−２
は、実験Ｎｏ．１−３のＨＥＳ添加及び実験Ｎｏ．１−
４のＵＷＳ（日本アルコン社製）と同等以上の値が得ら
れたことから、ヒアルロン酸の添加は、臓器保存溶液と
して効果が高いことが示された。また、臓器保存溶液
のヒアルロン酸の平均分子量６０万、及び臓器保存溶液
のヒアルロン酸の平均分子量２０万の方が、臓器保存
溶液のＨＥＳ添加よりも高い生存率と低いＴＢＡ値が
得られた。

【００２４】参考例１ ２リットルのフラスコを４本用意し、これらにラクトビ
オン酸を１００ミリモル、リン酸カリウムを２５ミリモ
ル、硫酸マグネシウムを５ミリモル、アデノシンを５ミ
リモル、グルタチオンを３ミリモルを各々秤取り、室温
で適量の注射用水に溶解した。次に、１ミリモルのアロ
プリノールを少量の１Ｎの水酸化ナトリウムに溶解し
た。そして、２リットルのフラスコ４本に各々、ラフィ
ノース無添加（実験Ｎｏ．２−１）、３７．５６ミリモ
ル添加（実験Ｎｏ．２−２）、８３．４０ミリモル添加
（実験Ｎｏ．２−３）、１６２．１２ミリモル添加（実
験Ｎｏ．２−４）を行った。これらの溶液を１Ｎの水酸
化ナトリウムでｐＨ７．４に調整し、全量を１リットル
とした。これら各々を濾過滅菌し、２００ｍｌ容のバイ
アル瓶に無菌的に分注、充填した。そして、これら及び
臓器保存溶液の浸透圧を測定した。浸透圧は、実験Ｎ
ｏ．２−１〜Ｎｏ．２−４で各々２３９、２８０、３２
５、及び４０７ｍＯｓｍ／ｋｇであり、実験Ｎｏ．２−
５の臓器保存溶液の浸透圧は３１８ｍＯｓｍ／ｋｇで
あった。

【００２５】ラット遊離肝細胞を用いた保存溶液の評価 ラット遊離肝細胞溶液１ｍｌに対し、上記４種類のラフ
ィノース濃度により浸透圧の異なる臓器保存溶液２ｍｌ
を加え、４℃で４８時間遮光保存した。保存後、これら
４種類の臓器保存溶液の上記の TB test及びTBA testを
行った。ラット遊離肝細胞の生存率（％）は TB testよ
り、また、ＴＢＡ値（abs ／cells)値はTBA testより求
めた。結果を表２に示す。

【００２６】

【表２】

【００２７】表２より、ラット遊離肝細胞の生存率及び
ＴＢＡ値とも浸透圧２３９〜４０７ｍＯｓｍ／ｋｇで効
果があり、特に２３９〜３２５ｍＯｓｍ／ｋｇで効果が
高かった。

【００２８】

【発明の効果】以上のように、本発明の臓器保存溶液
は、ヒアルロン酸類を該臓器保存溶液に含有させること
により達成され、従来より使用されているＨＥＳが添加
された臓器保存溶液と同等もしくはそれ以上の臓器保存
の効果を奏する。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒアルロン酸及び／又はその生理学的に
   許容される塩を含有してなる移植向けの臓器保存溶液。
2. 【請求項２】 ヒアルロン酸及び／又はその生理学的に
   許容される塩の平均分子量が１０万以上である請求項１
   記載の溶液。
3. 【請求項３】 ヒアルロン酸及び／又はその生理学的に
   許容される塩の濃度が０．０５〜１．０重量％である請
   求項２記載の溶液。