JPH11201969A - 簡易遊離ヘモグロビン測定方法および測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 液体試料中に存在する遊離ヘモグロビンを簡
便、迅速かつ正確に測定する方法および測定用キットを
提供する。 【解決手段】 遊離ヘモグロビン、ヘモグロビン−ハプ
トグロビン複合体および遊離ハプトグロビンを含む液体
試料を、直接、あるいは、血球分離膜を介して、抗ハプ
トグロビン抗体を含有させた吸水性担体の一端に接触さ
せることにより、液体試料中のヘモグロビン−ハプトグ
ロビン複合体および遊離ハプトグロビンを捕捉させ、つ
いで、捕捉されずに吸水性担体上を展開した遊離ヘモグ
ロビンと、着色粒子で標識して吸水性担体に含有させた
第一の抗ヘモグロビン抗体とを結合させ、続いて、吸水
性担体上を展開した着色結合物を、吸水性担体に固相化
した第二の抗ヘモグロビン抗体で捕捉させることにより
液体試料中の遊離ヘモグロビンを可視的に検出、測定す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遊離ヘモグロビン
測定方法および遊離ヘモグロビン測定用キットに関し、
詳しくは臨床検査分野等で用いられる、免疫学的手法に
より遊離ヘモグロビンを簡便、迅速に測定することがで
きる簡易遊離ヘモグロビン測定方法および測定用キット
に関する。

【０００２】

【従来の技術ならびに発明が解決しようとする課題】体
外循環、熱傷、腸管出血性大腸菌感染、不適合輸血、輸
血後溶血、溶血性疾患等では、大量の溶血を引き起こす
可能性があり、溶血性腎障害などの合併症を伴うことが
多い。通常、血漿または血清中のヘモグロビン（以下Ｈ
ｂと略す）はヘモグロビン−ハプトグロビン複合体（以
下Ｈｂ−Ｈｐと略す）および遊離Ｈｂ（以下Ｆ−Ｈｂと
略す）として存在しているが、この溶血性の腎障害を引
き起こす原因はＦ−Ｈｂであると言われている。

【０００３】さらに詳しく述べると、血中のＨｂ−Ｈｐ
は速やかに肝に摂取され、正常経路を経てビリルビンま
で代謝されるが、Ｆ−Ｈｂは腎糸球体を通過し尿中へ排
泄される。これが尿細管上皮細胞に取り込まれ溶血性腎
障害を引き起こす原因となる。従って、血中のＦ−Ｈｂ
をＨｐ結合型のＨｂと区別して測定したり、尿中のＦ−
Ｈｂを測定することは、臨床上重要な意義を持つ。

【０００４】Ｆ−Ｈｂの測定に際してはＨｂ−Ｈｐと分
別する必要があり、測定法としては、簡易分別定量法、
Ｆ−Ｈｂ吸着法（カラム法）等が知られている。簡易分
別定量法は、一元放射状免疫拡散法による血清中のハプ
トグロビン（以下Ｈｐと略す）の定量値とシアンメトヘ
モグロビン法によるＨｂの定量値からＨｂとＨｐとの結
合比に基づき、Ｆ−Ｈｂを算出するものである。しかし
簡易分別定量法には、Ｈｂ量とＨｐ量から間接的にＦ−
Ｈｂ量を求める方法であるため、ＨｂおよびＨｐの定量
限界以下のＦ−Ｈｂは測定できないという問題がある。

【０００５】Ｆ−Ｈｂ吸着法はＨｐを担体に固定した
後、この固定化ＨｐにＦ−Ｈｂを吸着させ、Ｈｂの色調
によりＨｐに結合したＨｂ量、すなわちＦ−Ｈｂ量を測
定するものである。さらに詳しく述べると、Ｈｐを活性
型セファロースに固定し、これを円筒状カラムに均一に
充填する。垂直に立てたカラムに被検血清０．１ｍｌを
注入し、３〜１０倍量の生理食塩水にて十分洗浄する。
測定は室温にて行う。Ｈｂの着色部分の長さを計測し、
前もって既知濃度のＦ−Ｈｂ溶液で作成した検量線より
Ｆ−Ｈｂ量を読み取る。（大城猛：臨床ハプトグロビ
ン、永井書店、１９８７）

【０００６】しかし、この方法はＨｐ固定化セファロー
スの均一性、検体の注入法、カラム径等により着色層の
長さが異なるため再現性、定量性に欠ける問題点があ
る。また、特開平５−３２２８８８に開示されているよ
うな、抗Ｈｂ−Ｈｐ抗体固相化高分子化合物カラムを遠
心管に挿入し血清を添加した後、遠心分離により血清中
のＦ−Ｈｂを分画定量する方法も報告されている。この
方法も、カラムによりＨｂ−Ｈｐの除去を行った後、Ｆ
−Ｈｂを定量するため測定の迅速性、簡便性に劣る。

【０００７】また酵素免疫測定法を原理とした、Ｈｐ固
相化プレートを用いたＦ−Ｈｂの定量方法や、抗Ｈｐ抗
体処理にて血清中のＨｂ−Ｈｐや遊離Ｈｐ（以下Ｆ−Ｈ
ｐと略する）を不活化した後、Ｆ−Ｈｂを測定する方法
などが特開平３−２７２６９８および特開平７−１０３
９７８に開示されている。これらは定量性、再現性に優
れているが、酵素免疫測定法を用いているため測定の迅
速性、簡便性に欠けるものである。

【０００８】測定の迅速性に関しては血中Ｆ−Ｈｂのよ
うな血清・血漿中の成分を測定する場合、採血した血液
を凝固させるため、数分から数十分間の放置後、遠心操
作さらには血球部分との分離といった煩雑な操作が必要
となるので、採血後かなりの時間を要する。さらにはこ
れらの操作のために血液の必要量が多くなり、患者の負
担も大きい問題点がある。また、これらの操作時におけ
る赤血球に対する物理的な刺激や、全血放置は溶血の原
因となりＦ−Ｈｂの正確なデータを得られない大きな原
因ともなる。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、長年にい
たって鋭意研究した結果、先に述べた酵素免疫測定法に
よる、抗Ｈｐ抗体処理により血中のＨｂ−ＨｐやＦ−Ｈ
ｐを不活化した後、Ｆ−Ｈｂを測定する方法を基本とし
て、より簡便化を図るために、近年、妊娠診断薬などの
市販キットに応用されているイムノクロマトグラフィー
法を原理とした血清、血漿および全血ならびに尿などの
液体試料中に存在するＦ−Ｈｂを正確、迅速かつ簡便に
測定する方法を見出し、簡易遊離ヘモグロビン測定方法
および測定用キットを完成するに至った。

【００１０】すなわち本発明はＦ−Ｈｂ、Ｈｂ−Ｈｐお
よびＦ−Ｈｐを含む液体試料を、直接、あるいは、血球
分離膜を介して、抗Ｈｐ抗体を含有させた吸水性担体の
一端に、接触させることにより、液体試料中のＨｂ−Ｈ
ｐおよびＦ−Ｈｐを捕捉させ、ついで、捕捉されずに吸
水性担体上を展開したＦ−Ｈｂと、着色粒子で標識して
吸水性担体に含有させた第一の抗Ｈｂ抗体とを結合さ
せ、続いて、吸水性担体上を展開した着色結合物を、吸
水性担体に固相化した第二の抗Ｈｂ抗体で捕捉させるこ
とにより液体試料中のＦ−Ｈｂを可視的に検出、測定す
ることを特徴とする簡易免疫学的測定方法を提供する。

【００１１】本発明はさらに、抗Ｈｐ抗体、着色粒子で
標識した第一抗Ｈｂ抗体および第二抗Ｈｂ抗体を含有す
る吸水性担体からなることを特徴とする簡易Ｆ−Ｈｂ測
定用キットを提供する。本発明において使用し得る抗Ｈ
ｐ抗体および抗Ｈｂ抗体には、異種の動物、例えばウサ
ギ、ヤギなどにＨｐ、Ｈｂを各々免疫して得られるポリ
クローナル抗体またはＨｐやＨｂを各々免疫したマウス
の脾細胞と骨髄腫細胞を細胞融合した後、融合細胞を培
養またはマウスに接種して得られるモノクローナル抗体
があげられる。これらの抗体は自家調製してもよいし、
日本バイオテスト（株）、和光純薬（株）、医学生物学
研究所、第一化学薬品（株）などから発売されているの
で容易に入手が可能である。

【００１２】本発明に使用し得る着色粒子は、コロイド
状金属粒子あるいはコロイド状非金属粒子、合成高分子
ラテックスなどがよく知られているが、安定した粒子
径、色調の多様性、イムノクロマトグラフィー展開後の
鮮明さを考慮すると合成高分子ラテックスが好ましい。
市販の合成高分子ラテックスは本クロマトグラフィーを
最適な条件で実施できるように設定されたものを選択で
き、ポリマーラボラトリーズ社、積水化学工業（株）、
ローヌプーラン社などから容易に入手することができ
る。粒子径は０．０５〜５μｍの範囲で市販されてお
り、標識する抗体によって、感度、精度の上で適宜選択
することが重要であるが、好ましくは、０．４〜１．０
μｍである。

【００１３】本発明に使用しうる吸水性担体は、毛細管
現象を有し、かつ液体試料中の溶質や合成高分子ラテッ
クス粒子で標識した抗体と検出しようとする物質との結
合物が、展開剤、例えば水や緩衝液などで速やかに拡散
・移動できるような担体であれば良く、ニトロセルロー
スシート、ガラス繊維ろ紙、ろ紙、不織布、ナイロンシ
ートなどが利用できる。ただし、イムノクロマトグラフ
ィーの主たる反応（Ｆ−Ｈｂと着色粒子で標識した第一
の抗Ｈｂ抗体との反応、着色結合物の展開および第二の
抗Ｈｂ抗体との反応）を行わせるための吸水性担体（以
下、イムノクロマトグラフィー用支持体）としてはニト
ロセルロースシートが最適である。ニトロセルロースシ
ートはシュライヒャー−シュエル社、ミリポア社、ゲル
マンサイエンス社等から発売されており容易に入手でき
る。また、近年イムノクロマトグラフィー専用シートと
して強度に優れたマイラーバッキングのニトロセルロー
スシートも各メーカーから市販されている。

【００１４】つぎに合成高分子ラテックス粒子による抗
体の標識法について説明する。標識法は通常行われてい
る方法であれば特に限定しないが、一般にはラテックス
粒子と抗Ｈｐ抗体または抗Ｈｂ抗体を室温で１時間以上
混和することで達成できる。本発明の場合は、抗Ｈｐ抗
体の標識には白色ラテックス粒子が望ましい。抗Ｈｂ抗
体の標識には判定が容易であるよう青色や赤色等の着色
ラテックス粒子を使用する。ラテックス粒子標識抗体は
遠心分離などの方法によって集め、通常使用されている
緩衝液、例えばリン酸緩衝液などで良く洗浄後、ブロッ
キング剤で未反応部分を遮断する。ブロッキング剤とし
ては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や乳タンパク等が良
く用いられる。

【００１５】つぎに標識抗体の装着方法について説明す
る。白色ラテックスで標識した抗ヒトＨｐ抗体は至適濃
度に希釈して不織布等の吸水性担体に含浸させ、風乾ま
たは凍結乾燥等により乾燥した後、イムノクロマトグラ
フィー用支持体へ装着してもよいし、直接、イムノクロ
マトグラフィー用支持体上に塗布し乾燥して装着しても
よい。着色ラテックスで標識した抗ヒトＨｂ抗体は至適
濃度に希釈して不織布等の吸水性担体に含浸させ、風乾
または凍結乾燥等により乾燥した後、イムノクロマトグ
ラフィー用支持体へ装着してもよいし、直接、イムノク
ロマトグラフィー用支持体上に塗布し乾燥して装着して
もよい。

【００１６】つぎに、抗Ｈｐ抗体処理によるＨｂ−Ｈｐ
・Ｆ−Ｈｐの捕捉、除去法について説明する。液体試料
中のＨｂ−Ｈｐ・Ｆ−Ｈｐは、Ｆ−Ｈｂが着色粒子で標
識した第一の抗Ｈｂ抗体に接触する前に除去されること
が望ましい。除去法としては、試験管内で液体試料と抗
Ｈｐ抗体を反応させてＨｂ−Ｈｐと抗Ｈｐ抗体、Ｆ−Ｈ
ｐと抗Ｈｐ抗体の免疫複合体を形成させ不活化する方法
や、液体試料を、抗Ｈｐ抗体を含有させた吸水性担体と
最初に接触させることによりＨｂ−Ｈｐ・Ｆ−Ｈｐを捕
捉させ除去する方法が挙げられるが、簡便性の点から後
者の方法が望ましい。したがって、抗Ｈｐ抗体を含有さ
せた吸水性担体は、前処理用部位として、イムノクロマ
トグラフィーの展開開始部位である液体試料滴下（浸
漬）部に設置するのが最適である。本発明において、前
処理用に吸水性担体に含有させる抗Ｈｐ抗体は、遊離の
抗体を用いてもよいが、後記実施例２に示すように、Ｈ
ｐ捕捉能を高めるため、白色ラテックスで標識すること
が望ましい。

【００１７】イムノクロマトグラフィーに関する測定用
キットについては、すでに数多くの発明が開示されてい
るので特に本発明で詳細に言及する必要はない。しかし
ながら、本発明の方法が確実かつ容易に実施できる例を
以下に示す。ニトロセルロースシート等のイムノクロマ
トグラフィー用支持体を、使用しやすさを考慮に入れて
任意の大きさの長方形（幅５〜１０ｍｍ、長さ２０〜１
００ｍｍが好適に用いられる）に裁断する。支持体の展
開方向の上流側には、前処理用部位（ラテックス標識抗
ヒトＨｐ抗体を含有した吸水性担体）、液体試料吸収部
位（イムノクロマトグラフィーを正確にまた迅速に展開
するための吸水性担体）、着色粒子標識抗体保持部位
（着色ラテックス標識抗ヒトＨｂ第一抗体を含有した吸
水性担体）を設ける。

【００１８】前処理用部位、液体試料吸収部位、着色粒
子標識抗体保持部位は、それぞれを別個の吸水性担体に
調製してもよい（図１）。あるいは同一吸水性担体上に
それぞれの部位を設けて一体型にしてもよい（図２）。
また、前処理用部位と液体試料吸収部位を同一吸水性担
体上に設けて、着色粒子標識抗体保持部位はイムノクロ
マトグラフィー用支持体上に設けてもよい（図３）。

【００１９】さらに血液をそのまま試料として測定でき
るように、試料滴下（浸漬）部に血球分離部位（血球分
離膜）を前処理用部位に重ねて設置しておき、採血した
血液を直接滴下（浸漬）した後、展開液を追加する方
法、あるいは展開液にて血液を希釈後、滴下（浸漬）す
る方法を用いれば血清・血漿分離操作をせずに測定が可
能である（図４〜６）。血球分離膜についてはすでに特
開平１−３０２１６１や特表昭６３−５０１５９４、Ｗ
Ｏ９６０３１９４等に記されており公知である。特に好
適なのはゲルマンサイエンス社のサイトセップ、ヘマセ
ップ、ヘマダイン等があげられ、適宜選択が可能であ
る。

【００２０】イムノクロマトグラフィー用支持体にはＨ
ｂ検出部位（抗ヒトＨｂ第二抗体を固定化したゾーン）
を設ける。さらにコントロール部位（第一抗体を調製す
るのに用いた動物のＩｇＧに対する抗体、例えばマウス
で免疫したものであれば抗マウスＩｇＧ抗体を固定化し
たゾーン）を同一支持体上のさらに下流部に設けておけ
ば、測定の終了および確認の方法となりうる。イムノク
ロマトグラフィー用支持体の下流側には過剰液体試料吸
収部位（イムノクロマトグラフィーを正確にまた迅速に
展開するための吸水性担体）を設ける。吸水性担体とし
てはろ紙が好適である。

【００２１】以上の前処理用部位、（血球分離部位）、
液体試料吸収部位、着色粒子標識抗体保持部位、イムノ
クロマトグラフィー用支持体、過剰液体試料吸収部位を
展開方向に並べ、全体を粘着テープで固定して測定用試
験紙とする。測定用試験紙はそのまま測定用キットとし
て用いてもよいし、試料滴下口と判定窓を設けたプラス
チックケースに入れ、測定用キットとして用いてもよ
い。以下に実施例をあげて本発明をより詳細に、具体的
に説明するが、本発明はこの実施例によって何ら限定さ
れるものではない。

【００２２】

【実施例】［実施例１］Ｆ−Ｈｂ測定用キットの作製 １）抗ヒトＨｂ第二抗体を固相化したイムノクロマトグ
ラフィー用支持体の作製ニトロセルロースシート（ＢＡ
Ｓ−８５、シュライヒャー−シュエル社製）を５ｍｍ×
３０ｍｍに切断し、その端より１０ｍｍの位置に抗ヒト
Ｈｂモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（日本バ
イオテスト社製）、２０ｍｍの位置に抗マウスＩｇＧ抗
体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（カッペル社製）を各々エアー
ブラシ（オリンポス社製）を用いて直線状に塗布し、抗
ヒトＨｂ抗体および抗マウスＩｇＧ抗体のラインを作製
した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（ディフ
コ社製）、０．１％ツィーン２０を含むリン酸生理食塩
水（ＰＢＳ）に３７℃、２時間浸漬しブロッキングを行
った後、充分乾燥しイムノクロマトグラフィー用支持体
を作製した。

【００２３】２）ラテックス粒子標識抗体の作製 ａ．着色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｂ第一抗体 赤色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０
％、粒子径４５０ｎｍ、ポリマーラボラトリーズ社製）
３００μｌにＰＢＳ １．２ｍｌを加え、１３，０００
ｒｐｍ、５分間遠心分離を行った。抗ヒトＨｂモノクロ
ナール抗体溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）（日本バイオテス
ト社製）１ｍｌを加え充分混和して、室温、１時間反応
を行った。未反応の抗ヒトＨｂモノクロナール抗体を除
去するため１３，０００ｒｐｍ、５分間遠心分離を行
い、沈渣をＰＢＳ １．５ｍｌで懸濁させ再度遠心分離
を行った。沈渣を、１％スキムミルク−０．０１％アジ
化ナトリウムを含むＰＢＳ １．５ｍｌに懸濁させ冷蔵
保存した。

【００２４】ｂ．白色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｐ抗
体 白色ラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ、１０
％、粒子径４５０ｎｍ、ポリマーラボラトリーズ社製）
と抗Ｈｐ抗体（医学生物学研究所製）を用いて上記と同
様な操作で標識した。 ｃ．着色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｂ第一抗体保持担
体 着色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｂ第一抗体をベンリー
ゼ不織布（旭化成社製）５ｍｍ×５ｍｍに１０μｌ含浸
させ風乾した。 ｄ．白色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｐ抗体保持担体 白色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｐ抗体をガラス繊維ろ
紙５ｍｍ×５ｍｍに２０μｌ含浸させた後、０．１％ス
キムミルクを含むＰＢＳにてブロッキング後、風乾させ
調製した。

【００２５】３）測定用キットの作製 抗ヒトＨｂ第二抗体を固相化したイムノクロマトグラフ
ィー用支持体の一方の端から２．５ｍｍの位置まで着色
ラテックス粒子標識抗ヒトＨｂ第一抗体保持担体を重ね
た。さらに着色ラテックス粒子標識抗ヒトＨｂ第一抗体
保持担体上に液体試料吸収用担体（ろ紙Ｎｏ．５２６
アドバンテック東洋製）５×１５ｍｍを端から５ｍｍの
位置まで重ねた。また、それを覆うように白色ラテック
ス粒子標識抗ヒトＨｐ抗体保持担体５×１０ｍｍを重ね
た。また、イムノクロマトグラフィー用支持体のもう一
方の端から５ｍｍの位置まで吸水性担体５ｍｍ×２０ｍ
ｍ（ろ紙Ｎｏ．５２６ アドバンテック東洋製）を重ね
た。最後に裏側に透明なテープを貼り全体を固定化し、
液体試料滴下口と判定窓を設けたプラスチックケースに
入れ測定用キットとした。全血測定用の場合には、白色
ラテックス粒子標識抗ヒトＨｐ抗体保持担体の上に、さ
らに血球分離膜を重ね、液体試料滴下口と判定窓を設け
たプラスチックケースに入れ測定用キットとした。

【００２６】［実施例２］抗Ｈｐ抗体と白色ラテックス
粒子標識抗Ｈｐ抗体を含有した吸水性担体のＨｐ捕捉能
力の比較 白色ラテックス標識抗Ｈｐ抗体を含有した吸水性担体の
Ｈｐ捕捉能力を抗Ｈｐ抗体を含有した吸水性担体と比較
するため、１キットあたり抗Ｈｐ抗体量０．１、１．
０、１０μｇとなるよう、抗Ｈｐ抗体液を直接イムノク
ロマトグラフィー用支持体に塗布した測定用キットおよ
び白色ラテックス標識抗Ｈｐ抗体液を含浸させたグラス
フィルターをイムノクロマトグラフィー用支持体に装着
した測定用キットを実施例１の方法に準じて作製した。
それぞれのキットに遊離Ｈｂを含まない血清Ｓ１（血清
中のＨｂの存在型式としてはＨｂ−Ｈｐのみ）を滴下
し、Ｈｐ捕捉能力を調べた。その結果、抗Ｈｐ抗体直接
塗布キットの場合、抗体濃度０．１、１．０μｇではＨ
ｂ−Ｈｐを捕捉しきれずＨｂ陽性であり、１０μｇで十
分量の抗Ｈｐ抗体が作用して血清中のＨｂ−Ｈｐを完全
に捕捉し陰性の結果であった。白色ラテックス標識抗Ｈ
ｐ抗体を含浸させキット化した場合には、抗体量０．１
μｇでもＨｂ−Ｈｐを完全に捕捉することができ、抗Ｈ
ｐ抗体を効率よく作用させることが可能であった（表
１）。

【００２７】

【表１】

【００２８】［実施例３］血清・血漿中のＦ−Ｈｂ測定
用キットの性能試験 １）標準液を用いた反応性試験 ヒトＨｂ（シグマ社製）を１、０．５、０．１ｍｇ／ｄ
ｌとなるように０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳにて溶解
し、標準液とした。測定用キットの液体試料滴下口に各
標準液を２００μｌ添加し展開させ、１０分後に目視判
定した。なお、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを展開した
場合には陰性の結果であった（表２）。

【００２９】

【表２】

【００３０】２）標準血清を用いた反応性試験 健常者ヒトプール血清にヒトＨｂ（シグマ社製）を１ｍ
ｇ／ｍｌとなるように加えＦ−Ｈｂ標準血清とした。Ｆ
−Ｈｂ陰性血清は健常者ヒトプール血清をそのまま用い
た。各々の血清を５０００倍となるようにＰＢＳにて希
釈し、測定用キットの液体試料滴下口に２００μｌ添加
し展開させ、１０分後に目視判定した。表３に結果を示
したが、Ｈｂ添加血清では陽性、健常者血清では陰性で
あった。

【００３１】

【表３】

【００３２】３）血清希釈倍率の検討 標準血清と健常者血清を標準品として０．１％ ＢＳＡ
−ＰＢＳにて希釈したものについて測定を行った。表４
に示すように健常者血清が陰性、標準血清が陽性を示す
倍率は５×１０³ 倍であった。

【００３３】

【表４】

【００３４】４）判定時間の検討 目視判定までの反応時間を５、１０、２０、３０、６０
分について検討したところ、表５に示すように、１０〜
２０分で良好な結果が得られた。測定時間の迅速化を考
慮に入れ判定時間は１０分とした。

【００３５】

【表５】

【００３６】５）感度の検討 標準ヒトＨｂを希釈した血清に添加し測定感度の検討を
行った。表６に示すように原血清濃度で０．１ｍｇ／ｄ
ｌまで判定可能であった。

【００３７】

【表６】

【００３８】６）再現性試験 健常者血清とＨｂ添加濃度の異なる標準血清２検体（Ｓ
１、Ｓ２）を用いて同時再現性試験（ｎ＝５）を行っ
た。健常者血清では全て陰性の結果、２つの標準血清で
は全て陽性の結果が得られた（表７）。

【００３９】

【表７】

【００４０】７）交差反応性 他動物のＨｂに対する反応性を確認したところ表８に示
すようにヤギ、ウシ、ブタのＨｂ（５ｍｇ／ｄｌ）に対
する交差反応性はみられなかった。

【００４１】

【表８】

【００４２】８）酵素免疫測定法との相関性 ヒト血清６２検体について、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）での血清中のＦ−Ｈｂ測定との相関性について検討
した。ＥＬＩＳＡでは２．２ｍｇ／ｄｌ以上を陽性とし
た。一致率は９４％、感度としては１００％、特異度は
９０％でほぼ良好な結果が得られた（表９）。

【００４３】

【表９】

【００４４】［実施例３］全血中のＦ−Ｈｂ測定用キッ
トの性能試験 １）血球分離膜の性能確認試験 採血した全血を直ちに、通常良く用いられている抗凝固
剤と混和させ、溶血を起こさないように生理食塩水やＰ
ＢＳにて５０００倍に希釈したものを試料とした。陽性
サンプルとしては採血後の全血を激しく振盪し物理的に
溶血させたものを用いた。表１０に血球分離膜有無での
比較結果を示した。血球分離膜を用いることにより、全
血でのＦ−Ｈｂの測定が可能であった。

【００４５】

【表１０】

【００４６】２）感度の検討 標準ヒトＨｂを５０００倍に希釈した非溶血の全血に添
加し測定感度の検討を行った。表１１に示すように原液
濃度で０．１ｍｇ／ｄｌまで判定可能であった。

【００４７】

【表１１】

【００４８】３）再現性試験 人血液５検体について各々、物理的溶血させたものと非
溶血血液を用意し５０００倍に希釈した後測定を行った
ところ、表１２に示すように非溶血ではすべて陰性の結
果、物理的溶血させたものでは全て陽性の結果が得られ
た。

【００４９】

【表１２】

【００５０】

【発明の効果】上記実施例から明らかなように、本発明
は、生体内溶血の指標となるＦ−Ｈｂを血清・血漿・尿
または採血直後の全血からでも迅速、簡便かつ正確に判
定できる免疫学的測定方法および測定用キットを提供す
る。溶血性腎障害の原因となる体外循環、熱傷、腸管出
血性大腸菌感染、輸血等での生体内溶血の確認には、迅
速性が要求される。したがって本発明は、溶血の確認の
遅れによって生ずる溶血性腎障害の回避および防止に役
立つものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の簡単な１態様を示したものであり、該
測定用キット上部図および断面図。（血清、血漿測定
用）

【図２】本発明の簡単な１態様を示したものであり、該
測定用キット上部図および断面図。（一体型血清、血漿
測定用１）

【図３】本発明の簡単な１態様を示したものであり、該
測定用キット上部図および断面図。（一体型血清、血漿
測定用２）

【図４】本発明の簡単な１態様を示したものであり、該
測定用キット上部図および断面図。（全血測定用）

【図５】本発明の簡単な１態様を示したものであり、該
測定用キット上部図および断面図。（一体型全血測定用
１）

【図６】本発明の簡単な１態様を示したものであり、該
測定用キット上部図および断面図。（一体型全血測定用
２）

【符号の説明】 ａ 前処理用部位（ラテックス標識抗ハプトグロビン
抗体保持吸水性担体） ｂ 液体試料吸収部位 ｃ 着色粒子標識抗体保持部位（ラテックス標識抗ヒ
トヘモグロビン第一抗体保持吸水性担体） ｄ ヘモグロビン検出部位（抗ヒトヘモグロビン第二
抗体固相化ゾーン） ｅ コントロール部位（抗マウスＩｇＧ抗体固相化ゾ
ーン） ｆ イムノクロマトグラフィー用支持体 ｇ 過剰液体試料吸収部位 ｈ 血球分離部位（血球分離膜）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 松山 恵理子 東京都中央区日本橋室町１−５−３ わか もと製薬株式会社内 (72)発明者 平田 晴久 東京都中央区日本橋室町１−５−３ わか もと製薬株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遊離ヘモグロビン、ヘモグロビン−ハプ
   トグロビン複合体および遊離ハプトグロビンを含む液体
   試料を、直接、あるいは、血球分離膜を介して、抗ハプ
   トグロビン抗体を含有させた吸水性担体の一端に接触さ
   せることにより、液体試料中のヘモグロビン−ハプトグ
   ロビン複合体および遊離ハプトグロビンを捕捉させ、つ
   いで、捕捉されずに吸水性担体上を展開した遊離ヘモグ
   ロビンと、着色粒子で標識して吸水性担体に含有させた
   第一の抗ヘモグロビン抗体とを結合させ、続いて、吸水
   性担体上を展開した着色結合物を、吸水性担体に固相化
   した第二の抗ヘモグロビン抗体で捕捉させることにより
   液体試料中の遊離ヘモグロビンを可視的に検出、測定す
   ることを特徴とする遊離ヘモグロビンの簡易免疫学的測
   定方法。
2. 【請求項２】 抗ハプトグロビン抗体に代えて白色粒子
   で標識された抗ハプトグロビン抗体を含有する請求項１
   記載の簡易免疫学的測定方法。
3. 【請求項３】 抗ハプトグロビン抗体、着色粒子で標識
   した第一抗ヘモグロビン抗体、および第二抗ヘモグロビ
   ン抗体を含有する吸水性担体からなることを特徴とする
   簡易遊離ヘモグロビン測定用キット。
4. 【請求項４】 抗ハプトグロビン抗体に代えて白色粒子
   で標識された抗体を含有する請求項３記載の簡易遊離ヘ
   モグロビン測定用キット。