JPH1118788A - Ｇタンパク質共役受容体 ｈｏｆｎｈ３０ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 HOFNH30ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方法を
提供する。 【解決手段】 配列番号２のHOFNH30ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
０％同一であり、かつHOFNH30ポリペプチドの活性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。 【効果】 HOFNH30ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは感染症、疼痛、癌、、糖尿病、肥満症、拒食症、過
食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高
血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、
アレルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害のよ
うな症状の治療と、このような症状の診断に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドはＧタンパク質共役受容体ファミリー（以後HOFNH30
と記す）に関する。本発明はまた、このようなポリヌク
レオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または活性化
することに関する。

【０００２】

【従来の技術】医学的に重要な生物学的プロセスの多く
が、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与して
いるタンパク質および／または第二メッセンジャー（例
えば、ｃＡＭＰ）により媒介されることはよく知られて
いる (Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-354) 。ここ
では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む経路に
関与しているタンパク質つまりＰＰＧタンパク質と称さ
れる。こうしたタンパク質の例として、アドレナリン作
動薬やドーパミンの受容体(Kobilka, B.K.ら, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K.
ら, Science, 1987, 238:650-656; Bunzow, J.R.ら, Na
ture, 1988, 336:783-787)、Ｇタンパク質それ自体、エ
フェクタータンパク質（例：ホスホリパーゼＣ、アデニ
ルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ）、およびアクチ
ュエータータンパク質（例：プロテインキナーゼＡ、プ
ロテインキナーゼＣ）(Simon, M.I.ら, Science, 1991,
252:802-8) の受容体のようなＧＰＣ受容体を挙げるこ
とができる。

【０００３】例えば、シグナル伝達の一つのタイプで
は、ホルモンの結合の結果として細胞内で酵素アデニル
酸シクラーゼが活性化される。この酵素のホルモンによ
る活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、このＧ
ＴＰもホルモンの結合に影響を及ぼす。Ｇタンパク質は
ホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけてい
る。ホルモン受容体により活性化されると、Ｇタンパク
質は結合していたＧＤＰをＧＴＰと交換することが見い
だされた。その後、ＧＴＰ担持形態が活性化されたアデ
ニル酸シクラーゼと結合する。ＧＴＰがＧＤＰへ加水分
解されると（この加水分解はＧタンパク質自体により触
媒される）、Ｇタンパク質はその不活性な基底形態へと
戻る。こうして、Ｇタンパク質は二重の役割を果たして
おり、すなわち、受容体からのシグナルをエフェクター
に中継する中間体として、さらにシグナルの持続時間を
制御する時計として機能している。

【０００４】Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺
伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫通ドメ
インを有すると特性付けられた。これらのドメインは細
胞外または細胞質ループにより接続された膜貫通αヘリ
ックスに相当すると考えられる。Ｇタンパク質共役受容
体には、ホルモン、ウイルス、増殖因子、神経の受容体
などの多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。

【０００５】Ｇタンパク質共役受容体（７ＴＭ受容体と
しても知られる）は、少なくとも８つの異なる親水性ル
ープをつなぐ、約２０〜３０個のアミノ酸からなる７つ
の保存された疎水性領域を含むと特性付けられてきた。
Ｇタンパク質共役受容体のファミリーには、精神疾患お
よび神経疾患の治療に用いられる神経弛緩薬と結合する
ドーパミン受容体が含まれる。このファミリーに含まれ
るメンバーのその他の例としては、カルシトニン、アド
レナリン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムス
カリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、ト
ロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮
細胞分化遺伝子−１、ロドプシン、におい物質、サイト
メガロウイルスの受容体が挙げられるが、これらに限ら
ない。

【０００６】大部分のＧタンパク質共役受容体は、機能
性タンパク質の構造を安定化させると考えられるジスル
フィド結合を形成する保存されたシステイン残基を、最
初の２つの細胞外ループのそれぞれに１個もっている。
７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、
ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称される。ＴＭ３がシグ
ナル伝達に係わっている。

【０００７】システイン残基のリン酸化およびリピド化
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
Ｇタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を与える
ことができる。Ｇタンパク質共役受容体はその第三細胞
質ループおよび／またはカルボキシ末端にリン酸化部位
を含むことが多い。β−アドレナリン受容体のような数
種のＧタンパク質共役受容体においては、プロテインキ
ナーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼによる
リン酸化が受容体の脱感受性を媒介している。

【０００８】いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役
受容体のリガンド結合部位はＧタンパク質共役受容体の
数個の膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケット
(socket)を含み、このソケットがＧタンパク質共役受容
体の疎水性残基によりとり囲まれていると考えられてい
る。Ｇタンパク質共役受容体のそれぞれの膜貫通ヘリッ
クスの親水側は、内側に面して極性のリガンド結合部位
を形成していると仮定される。一部のＧタンパク質共役
受容体では、ＴＭ３がＴＭ３のアスパラギン酸残基のよ
うなリガンド結合部位をもつとしてリガンドの結合に関
与してきた。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン、
さらにＴＭ６やＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシ
ンもリガンドの結合に関与している。

【０００９】Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体
のＧタンパク質により、種々の細胞内酵素、イオンチャ
ンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合すること
ができる (Johnson ら, Endoc. Rev., 1989, 10:317-33
1 を参照のこと) 。個々のＧタンパク質のαサブユニッ
トが特定のエフェクターを優先的に刺激して細胞のさま
ざまな生物学的機能をモジュレートする。Ｇタンパク質
共役受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部のＧタ
ンパク質共役受容体のＧタンパク質共役を調節するため
の重要な作用機構として同定された。Ｇタンパク質共役
受容体は哺乳動物宿主のいろいろな部位で見いだされて
いる。

【００１０】ここ１５年の間に、細胞膜を７回貫通する
（7 transmembrane:７ＴＭ）受容体をターゲットとする
３５０種類ほどの治療薬が市場に導入され、成功を収め
てきた。このことは、こうした受容体に治療用ターゲッ
トとしての確立され実証された歴史があることを示して
いる。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、感染症（例
えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギ
ー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神
分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および
運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・
ラ・ツレット症候群を含む）を含むがこれらに限らな
い、機能障害または疾病を予防し、改善し、治療する上
で何らかの役割を果たす新たな受容体を同定して特性付
ける必要性が存在している。本発明は、このような受容
体を提供するものである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、HOFNH30ポリペプチドおよび組換え物質、並び
にその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はHO
FNH30ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
に関する。こうした使用には、とりわけ、感染症（例え
ば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギ
ー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神
分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および
運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・
ラ・ツレット症候群を含む）の治療が含まれる。他の態
様では、本発明は、本発明により提供される物質を用い
てアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法、並
びに同定された化合物を用いてHOFNH30の平衡異常と関
連した症状を治療することに関する。本発明のさらに他
の態様は、不適当なHOFNH30活性またはHOFNH30レベルと
関連した疾病を検出するための診断アッセイに関する。

【００１３】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「HOFNH30」とは、
特に、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドまたはそのアレル変異体を意味する。「受容体
活性」または「受容体の生物学的活性」とは、類似の活
性、向上した活性、または望ましくない副作用が低下し
たこれらの活性を含めて、HOFNH30の代謝的または生理
的機能を意味する。さらに、前記HOFNH30の抗原的およ
び免疫原的活性も含まれる。「HOFNH30遺伝子」とは、
配列番号１で表されるヌクレオチド配列を有するポリヌ
クレオチドまたはそのアレル変異体および／またはそれ
らの相補体を意味する。

【００１４】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【００１５】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲ
ＮＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。
「ポリヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修
飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性ま
たは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡま
たはＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、ト
リチル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基
がある。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が
行われてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自
然界に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵
素的または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスお
よび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を
包含する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオ
リゴヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチ
ドも包含する。

【００１６】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の遺伝子コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝
した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天
然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第２
版, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New
York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION
OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic Press, New
York, 1983中のWold, F., Posttranslational Protein
Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1
-12; Seifter ら, "Analysis for protein modificatio
nsand nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 1
82:626-646; および Rattan ら, "Protein Synthesis:
Posttranslational Modifications and Aging", Ann NY
Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこと。

【００１７】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、欠
くことのできない性質を保持しているポリヌクレオチド
またはポリペプチドのことである。典型的なポリヌクレ
オチドの変異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド
配列の点で相違する。この変異体のヌクレオチド配列の
変化は、基準ポリヌクレオチドによってコードされるポ
リペプチドのアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよ
い。ヌクレオチドの変化は、以下で述べるように、基準
配列によりコードされるポリペプチドにおいてアミノ酸
の置換、付加、欠失、融合および末端切断（トランケー
ション）を生じさせることができる。典型的なポリペプ
チドの変異体は基準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で
相違する。一般的には、基準ポリペプチドの配列と変異
体の配列が全般的によく類似しており、多くの領域で同
一となるような差異に限られる。変異体と基準ポリペプ
チドは任意に組み合わせた１以上の置換、付加、欠失に
よりアミノ酸配列が相違していてよい。置換または挿入
されるアミノ酸残基は遺伝子コードによりコードされる
ものであっても、なくてもよい。ポリヌクレオチドまた
はポリペプチドの変異体はアレル変異体のように天然に
存在するものでも、天然に存在することが知られていな
い変異体であってもよい。ポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発法
または直接合成により調製することができる。

【００１８】「同一性」はヌクレオチド配列またはアミ
ノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級のマッ
チ（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」
それ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表さ
れた技法を使って計算することができる。例えば、COMP
UTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M. 編, Oxford
University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: I
NFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D.W. 編, Ac
ademic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF
SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin,
H.G. 編, Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE
ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, vonHeinje, G., Aca
demic Press, 1987; および SEQUENCE ANALYSIS PRIME
R, Gribskov, M. and Devereux, J.編, M Stockton Pre
ss, New York, 1991を参照のこと。２つのポリヌクレオ
チドまたはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法
は多数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当
業者には公知である (Carillo, H. and Lipton, D., SI
AM J Applied Math (1988) 48:1073) 。２つの配列間の
同一性または類似性を決定するために汎用される方法と
しては、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop
編, Academic Press, San Diego, 1994 および Carill
o, H. and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 4
8:1073 に記載される方法があるが、これらに限らな
い。同一性および類似性の決定方法はコンピュータプロ
グラムに体系化されている。２つの配列間の同一性およ
び類似性を決定するための好適なコンピュータプログラ
ム法としては、ＧＣＳプログラムパッケージ (Devereu
x, J.ら, Nucleic Acids Research (1984) 12(1):38
7)、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul, S.F.ら, J Mole
c Biol (1990) 215:403)があるが、これらに限らない。

【００１９】一例として、配列番号１の基準ヌクレオチ
ド配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一
性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配
列番号１の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌク
レオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうること
を除けば、基準配列と同一であることを意図している。
言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを得るには、基準配列中の５％までのヌクレオチドを
欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または
基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド
数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突
然変異は、基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位
置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基
準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列
内に１以上の連続するグループとして配置することがで
きる。

【００２０】同様に、配列番号２の基準アミノ酸配列に
対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペ
プチド配列が配列番号２の基準アミノ酸配列のそれぞれ
１００アミノ酸につき最高で５つのアミノ酸変更を含み
うることを除けば、基準配列と同一であることを意図し
ている。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失
させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列
中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列
に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準ア
ミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、また
はこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中
のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以
上の連続したグループとして配置することができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明はHOFNH30ポリペプチド
（またはHOFNH30タンパク質）に関する。このHOFNH30ポ
リペプチドには、配列番号２および４のポリペプチドだ
けでなく、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド、その全長において配列番号２のアミノ酸配列と少な
くとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ま
しくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドも含まれる。さらに、少なくとも９７〜９
９％同一であるものが特に好適である。また、その全長
において配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、
より好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配
列を有するポリペプチドもHOFNH30ポリペプチドに含ま
れる。さらに、少なくとも９７〜９９％同一であるもの
が特に好適である。HOFNH30ポリペプチドはこの受容体
の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好まし
い。

【００２２】HOFNH30ポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形であっても、融合タンパク質のような、より大き
いタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加の
アミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなア
ミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ
配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列な
どがある。

【００２３】また、HOFNH30ポリペプチドの断片も本発
明に含まれる。こうした断片は全体的に前記HOFNH30ポ
リペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部
とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。HOFNH30ポリペプチドと同様に、断片は「フリース
タンディング」（それ自体で独立）していても、より大
きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその
大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましく
は一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発
明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見
当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、
６１−８０、８１−１００、および１０１からHOFNH30
ポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、
「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、
５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えた
り減ったりした範囲を含むものである。

【００２４】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、HO
FNH30ポリペプチドのアミノ酸配列を有するトランケー
ション(truncation)ポリペプチドが含まれる。また、α
ヘリックスとαヘリックス形成領域、βシートとβシー
ト形成領域、ターンとターン形成領域、コイルとコイル
形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、
β両親媒性領域、可変性領域、表面形成領域、基質結合
領域、および高抗原指数領域を含む断片のような、構造
的または機能的特性により特徴づけられる断片も好適で
ある。その他の好適な断片は生物学的に活性な断片であ
る。生物学的に活性な断片は、同様の活性をもつ断片、
その活性が向上した断片、または望ましくない活性が減
少した断片を含めて、受容体活性を媒介するものであ
る。さらに、動物、特にヒトにおいて抗原性または免疫
原性がある断片も含まれる。

【００２５】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めた該受容体の生物学的活性を保持することが
好ましい。中でも、最も好ましい断片は配列番号４のア
ミノ酸配列をもつものである。特定された配列および断
片の変異型も本発明の一部を構成する。好適な変異型は
同類アミノ酸置換により対象物と異なるもの、すなわ
ち、ある残基が同様の性質の他の残基で置換されている
ものである。典型的なこうした置換は、Ala, Val, Leu
および Ileの間；Ser とThr の間；酸性残基 AspとGlu
の間；Asn とGln の間；塩基性残基 LysとArg の間；ま
たは芳香族残基 PheとTyr の間で起こる。特に、数個、
５〜１０個、１〜５個または１〜２個のアミノ酸が任意
の組合せで置換、欠失または付加されている変異型が好
適である。

【００２６】本発明のHOFNH30ポリペプチドは任意の適
当な方法で製造することができる。このようなポリペプ
チドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組
換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造された
ポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造
されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。

【００２７】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様はHOFNH30ポリヌクレオチドに
関する。HOFNH30ポリヌクレオチドには、HOFNH30ポリペ
プチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオ
チド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチド
が含まれる。さらに特定すると、本発明のHOFNH30ポリ
ヌクレオチドとしては、配列番号２のHOFNH30ポリペプ
チドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１および
３の特定配列を有するポリヌクレオチドがある。さら
に、HOFNH30ポリヌクレオチドには、配列番号２のHOFNH
30ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とその全
長において少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配
列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１のヌクレ
オチド配列とその全長において少なくとも８０％同一で
あるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれ
る。これに関連して、少なくとも９０％同一であるポリ
ヌクレオチドが好適であり、特に少なくとも９５％同一
であるものが好適である。さらに、少なくとも９７％同
一であるものがより好ましく、少なくとも９８〜９９％
同一であるものがより一層好ましく、少なくとも９９％
同一であるものが最も好ましい。また、増幅反応に使用
できる条件下、またはプローブやマーカーとして使用で
きる条件下でハイブリダイズするのに十分な、配列番号
１中に含まれるヌクレオチド配列との同一性を有するヌ
クレオチド配列もHOFNH30ポリヌクレオチドに含まれ
る。本発明はまた、このようなHOFNH30ポリヌクレオチ
ドと相補的なポリヌクレオチドを提供する。

【００２８】本発明のHOFNH30は、ヒトHOFNH30をコード
するｃＤＮＡの塩基配列決定の結果により示されるよう
に、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク
質と構造的に関連している。配列番号１のｃＤＮＡ配列
は配列番号２の３３８個のアミノ酸からなるポリペプチ
ドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレ
オチド番号３１−１０４４）を含んでいる。表２のアミ
ノ酸配列（配列番号２）は３０６個のアミノ酸残基の約
５５％がヒトEDG-2受容体（未発表；Zontag, G.C.M.ら,
GenBank アクセス番号U78192）と同一である（FASTA使
用）。さらに、HOFNH30（配列番号２）は３０６個のア
ミノ酸残基においてヒト・リゾホスファチジン酸受容体
と５５％同一である(Biochem. Biophys. Res. Commun.,
231, 619-622, 1997)。表１のヌクレオチド配列（配列
番号１）は９２８個のヌクレオチド残基の約６３％がラ
ットEDG-2受容体（未発表；Allard, J.ら, GenBank ア
クセス番号AFO14418）と同一である（FASTA使用）。さ
らに、HOFNH30（配列番号１）は９２８個のヌクレオチ
ド残基においてマウス・リゾホスファチジン酸受容体と
６３％同一である(J. Cell Biol., 135(4), 1071-1083,
1996)。したがって、本発明のHOFNH30ポリペプチドお
よびポリヌクレオチドは、とりわけ、それらの相同ポリ
ペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能
／特性をもつことが予測されるが、それらの有用性は当
業者には自明である。

【００２９】ヒトHOFNH30のヌクレオチド配列（配列番
号１）

【表１】 1 GACTAAAAGG ATGTTCACTT CTTCTCCACA ATGAATGAGT GTCACTATGA 51 CAAGCACATG GACTTTTTTT ATAATAGGAG CAACACTGAT ACTGTCGATG 101 ACTGGACAGG AACAAAGCTT GTGATTGTTT TGTGTGTTGG GACGTTTTTC 151 TGCCTGTTTA TTTTTTTTTC TAATTCTCTG GTCATCGCGG CAGTGATCAA 201 AAACAGAAAA TTTCATTTCC CCTTCTACTA CCTGTTGGCT AATTTAGCTG 251 CTGCCGATTT CTTCGCTGGA ATTGCCTATG TATTCCTGAT GTTTAACACG 301 GGCCCAGTTT CAAAAACTTT GACTGTCAAC CGCTGGTTTC TCCGTCAGGG 351 GCTTcTGGAC AGTAGCTTGA CTGCTTCCCT CACCAACTTG CTGGTTATCG 401 CCGTGGAGAG GCACATGTCA ATCATGAGGA TGCGGGTCCA TAGCAACCTG 451 ACCAAAAAGA GGGTGACACT GCTCATTTTG CTTGTCTGGG CCATCGCCAT 501 TTTTATGGGG GCGGTCCCCA CACTGGGCTG GAATTGCCTC TGCAACATCT 551 CTGCCTGCTC TTCCCTGGCC CCCATTTACA GCAGGAGTTA CCTTGTTTTC 601 TGGACAGTGT CCAACCTCAT GGCCTTCCTC ATCATGGTTG TGGTGTACCT 651 GCGGATCTAC ATGTATGTCA AGAGGAAAAC CAATGTTTTG TCTCCACATA 701 CGAGTGGGTC CATCAGCCGC CGGAAGACAC CCATGAAGCT GATGAAGACA 751 GTGATGACTG TCTTAGGGGC CTTTGTCGTG TGCTGGACCC CAGGCCTGGT 801 GGTTCTGCTG CTTGATGGCC TGAACTGTAC GCAGTGTGGC GTGCAGCATG 851 TCAAAAGGTG GTTCCTGCTG CTGGCGCTGC TGAACTCTGT CATGAACCCC 901 ATCATCTACT CCTACAAGGA CGAGGACATG TTACAGCACC ATGAAGAAGA 951 TGATCTGCTG CTTCTCTCAG GAGAGGAACC TGGACAGACG TCCCTCCCGC 1001 CTCCCCTCCA CCATCCTCAG CAGGAGCGAC ACGGGCAGCC AGTATAA

【００３０】ヒトHOFNH30のアミノ酸配列（配列番号
２）

【表２】 1 MNECHYDKHM DFFYNRSNTD TVDDWTGTKL VIVLCVGTFF CLFIFFSNSL 51 VIAAVIKNRK FHFPFYYLLA NLAAADFFAG IAYVFLMFNT GPVSKTLTVN 101 RWFLRQGLLD SSLTASLTNL LVIAVERHMS IMRMRVHSNL TKKRVTLLIL 151 LVWAIAIFMG AVPTLGWNCL CNISACSSLA PIYSRSYLVF WTVSNLMAFL 201 IMVVVYLRIY MYVKRKTNVL SPHTSGSISR RKTPMKLMKT VMTVLGAFVV 251 CWTPGLVVLL LDGLNCTQCG VQHVKRWFLL LALLNSVMNP IIYSYKDEDM 301 LQHHEEDDLL LLSGEEPGQT SLPPPLHHPQ QERHGQPV

【００３１】HOFNH30をコードする本発明の一つのポリ
ヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリー
ニングにより、ヒト胎盤、卵巣、胸腺の細胞に含まれる
ｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、エ
クスプレスド・シークエンス・タグ（expressed sequen
ce tag: EST)分析 (Adams, M.D.ら, Science (1991)25
2:1651-1656; Adams, M.D.ら, Nature (1992) 355:632-
634; Adams, M.D.ら,Nature (1995) 377 Supp:3-174)
を用いて得ることができる。また、本発明のポリヌクレ
オチドはゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から
得ることができ、商業的に入手可能な公知の技法を用い
て合成することもできる。

【００３２】配列番号２のHOFNH30ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリペプ
チドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号３１−
１０４４）と同一であっても、遺伝子コードの重複性
（縮重）のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコ
ードする配列であってもよい。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドをHOFNH30ポリ
ペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌ
クレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列または
その断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもし
くは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タン
パク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする
もの）と同じリーディングフレームにある成熟ポリペプ
チドのコード配列またはその断片が含まれる。例えば、
融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列がコ
ードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例とし
て、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, Inc.)に
より提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ−ヒス
チジンペプチド、またはＨＡタグである。また、このポ
リヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例えば、転
写されるが翻訳されない配列、スプライシングおよびポ
リアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、およびｍ
ＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。

【００３４】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、表２のHOFNH30ポリペプチドのアミノ酸配列（配
列番号２）を含むHOFNH30変異型をコードするポリヌク
レオチドである。中でも、本発明の好適なポリヌクレオ
チドは表４のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする
表３のヌクレオチド配列（配列番号３）中に含まれる。

【００３５】ヒトHOFNH30の部分ヌクレオチド配列（配
列番号３）

【表３】 1 CGGGTCGACC CACGCGTCCG CCTGACGAAA AAGAGGGTTA CGCTGCTCAT 51 TTTGAGTATC TGGGCCATCG CCATCTTTAT GGGGGCTGTC CCCACCCTGG 101 GCTGGAATTG CCTCTGTGAC ATCTCTGCCT GCTCTTCCCT GGCCCCCATT 151 TATAGCAGGA GTTACCTCAT TTTCTGGACA GTGTCCAACC TTGTGGCCTT 201 TTTCATCATG GTTGTGGTGT ACCTGCGGAT CTACATGTAT GTCAAGAGGA 251 AAACCAATGT TTTGTCTCCA CATACGAGTG GGTCCATCAG CCGCCGGAAG 301 ACACCCATGA AGCTGATGAA GACAGTGATG ACTGTCTTAG GGGCCTTTGT 351 CGTGTGCTGG ACCCCAGGCC TGGTGGTTCT GCTGCTTGAT GGCCTGAACT 401 GTACGCAGTG TGGCGTGCAG CATGTCAAAA GGTGGTTCCT GCTGCTGGCG 451 CTGCTGAACT CTGTCATGAA CCCCATCATC TACTCCTACA AGGACGAGGA 501 CATGTTACAG CACCATGAAG AAGATGATCT GCTGCTTCTC TCAGGAGAGG 551 AACCTGGACA GACGTCCCTC CCGCCTCCCC TCCACCATCC TCAGCAGGAG 601 CGACACGGGC AGCCAGTATA A

【００３６】ヒトHOFNH30の部分アミノ酸配列（配列番
号４）

【表４】 1 RVDPRVRLTK KRVTLLILSI WAIAIFMGAV PTLGWNCLCD ISACSSLAPI 51 YSRSYLIFWT VSNLVAFFIM VVVYLRIYMY VKRKTNVLSP HTSGSISRRK 101 TPMKLMKTVM TVLGAFVVCW TPGLVVLLLD GLNCTQCGVQ HVKRWFLLLA 151 LLNSVMNPII YSYKDEDMLQ HHEEDDLLLL SGEEPGQTSL PPPLHHPQQE 201 RHGQPV

【００３７】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００３８】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発
明のポリヌクレオチドは、HOFNH30ポリペプチドをコー
ドする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するた
めに、また、HOFNH30遺伝子との配列類似性が高い他の
遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソロ
グ体(ortholog)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いることができる。このようなハイブリダイゼーシ
ョン技法は当業者には公知である。一般的に、これらの
ヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列に対して
８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同
一性を有する。プローブはたいてい１５個以上のヌクレ
オチドを含み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以
上のヌクレオチドを有していてもよい。特に好ましいプ
ローブは３０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するも
のである。

【００３９】一実施態様において、HOFNH30ポリペプチ
ド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体
を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、
配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片（配列番
号３のヌクレオチド配列を含む）を有する標識プローブ
を用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション
条件下で適当なライブラリーをスクリーニングし、前記
のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮＡおよびゲノ
ムクローンを単離する各工程を含んでなる。このような
ハイブリダイゼーション技法は当業者に公知である。ス
トリンジェントなハイブリダイゼーション条件は上で定
義したとおりであるか、または、50% ホルムアミド、５
×SSC (150mM NaCl, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50
mMリン酸ナトリウム (pH7.6)、５×Denhardt溶液、10%
デキストラン硫酸および20μg/mlの変性し剪断したサケ
精子ＤＮＡを含有する溶液中で４２℃で一夜インキュベ
ートし、次いでフィルターを 0.1×SSC 中約６５℃で洗
浄する条件である。

【００４０】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００４１】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００４２】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davisら, BASIC METHODS IN MOLE
CULAR BIOLOGY (1986) およびSambrookら, MOLECULAR C
LONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版, Cold SpringHa
rbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1
989)などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載され
る方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクショ
ン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクショ
ン、トランスベクション(transvection)、マイクロイン
ジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクショ
ン、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープロ
ーディング(scrape loading)、射出導入(ballistic int
roduction)または感染により行うことができる。

【００４３】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００４４】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。

【００４５】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００４６】スクリーニングアッセイで使用するためHO
FNH30ポリペプチドを発現させようとする場合、そのポ
リペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先
立って細胞を回収する。HOFNH30ポリペプチドが培地に
分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、そ
の細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する
必要がある。

【００４７】組換え細胞培養物からHOFNH30ポリペプチ
ドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタ
ノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロ
マトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め
た公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、
高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリ
ペプチドが単離および／または精製中に変性されるとき
は、タンパク質を再生させるための公知の技法を用い
て、活性のあるコンフォメーションを復元することが可
能である。

【００４８】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのHOFNH30ポリヌクレオチ
ドの使用に関する。機能障害と関連したHOFNH30遺伝子
の変異型の検出は、HOFNH30の過少発現、過剰発現また
は変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診
断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツー
ルを提供するだろう。HOFNH30遺伝子に変異がある個体
を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すこ
とができる。

【００４９】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様のやり方でＲＮＡまたはｃＤＮＡ
を使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常
な遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化に
より検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識HOFNH3
0ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定
できる。完全にマッチした配列とミスマッチの二重鎖と
はＲＮアーゼ消化により、または融解温度の差異により
区別できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用い
るまたは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動
度の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても
検出できる（例えば、Myersら, Science (1985) 230:12
42 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレア
ーゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよ
びＳ１プロテクション）または化学的開裂法によっても
確認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1
985) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様で
は、例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを
行うため、HOFNH30ヌクレオチド配列またはその断片を
含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築するこ
とができる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性
を有し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を
含めた分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために
用いられている（例えば、M. Cheeら, Science, Vol.27
4, pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００５０】診断アッセイは、前記の方法によりHOFNH3
0遺伝子の変異を検出することで、感染症（例えば、細
菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特に
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼
痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パー
キンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗
しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性
前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そ
ううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異
常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）への罹りやすさを診断または判定
する方法を提供する。

【００５１】さらに、被験者から得られたサンプルから
HOFNH30ポリペプチドまたはHOFNH30ｍＲＮＡのレベルの
異常な低下または増加を測定する方法により、感染症
（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる
感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす
感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食
症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血
圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、ア
レルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不
安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅
滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジ
ル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）の診断を下すこと
ができる。発現の低下または増加は、当技術分野で公知
のポリヌクレオチド定量法のいずれか、例えばＰＣＲ、
ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮアーゼプロテクション、ノーザンブ
ロット、その他のハイブリダイゼーション法によりＲＮ
Ａレベルで測定することができる。宿主から得られたサ
ンプル中のHOFNH30ポリペプチドのようなタンパク質の
レベルを測定するためのアッセイ法は当業者によく知ら
れている。こうしたアッセイ法として、ラジオイムノア
ッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、
ＥＬＩＳＡアッセイなどがある。

【００５２】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、特に感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およ
びウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ
−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満
症、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不
全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心
筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神およ
び神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴
呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハンチント
ン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）
などの疾病または疾病への罹りやすさを診断するための
キットに関し、このキットは、(a) HOFNH30ポリヌクレ
オチド（好ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列）
またはその断片、(b) (a) のポリヌクレオチドに相補的
なヌクレオチド配列、(c) HOFNH30ポリペプチド（好ま
しくは、配列番号２のポリペプチド）またはその断片、
または(d) HOFNH30ポリペプチド（好ましくは、配列番
号２のポリペプチド）に対する抗体、を含んでなる。こ
のようなキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)
が実質的な構成成分であることが理解されよう。

【００５３】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。

【００５４】患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲノム
配列の差異も調べることができる。患者の一部または全
部に変異が観察されるが、どの正常個体にも観察されな
い場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。

【００５５】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、HOFNH30ポリペプチド
に免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使
用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が
従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親
和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い
親和性を有することを意味する。

【００５６】HOFNH30ポリペプチドに対する抗体は、慣
用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以
外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノ
クローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により
産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることがで
きる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Kohler, G.
およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、ト
リオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法 (Kozbor
ら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技法(Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 198
5) などがある。

【００５７】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。HOFNH30ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、
感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルス
による感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き
起こす感染症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、
過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、
高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰
瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害
（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精
神遅滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病また
はジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）の治療に使用
できる可能性がある。

【００５８】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に感染症（例え
ば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘
息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿
閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギ
ー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神
分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および
運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・
ラ・ツレット症候群を含む）から前記動物を防御するた
めの抗体および／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十
分なHOFNH30ポリペプチドまたはその断片を哺乳動物に
接種することを含んでなる。本発明のさらに別の態様
は、哺乳動物を疾病から防御する抗体を産生させるよう
な免疫学的応答を引き出すために、in vivo でHOFNH30
ポリヌクレオチドの発現を指令するベクターを介してHO
FNH30ポリペプチドを供給することを含んでなる、哺乳
動物において免疫学的応答を引き出す方法に関する。

【００５９】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてHOFNH30ポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン
製剤（組成物）に関し、この組成物はHOFNH30ポリペプ
チドまたはHOFNH30遺伝子を含有する。ワクチン製剤は
適当な担体をさらに含んでいてもよい。HOFNH30ポリペ
プチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、
筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含む）に投与するこ
とが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液
と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注
射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含んでいてもよい
水性および非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は
１回量容器または数回量容器（例えば、密閉アンプルお
よびバイアル）で提供することができ、また、使用直前
に無菌の液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で
保管することもできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫
原性を増強するためのアジュバント系、例えば水中油型
のアジュバント系や当技術分野で公知の他のアジュバン
ト系を含んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で
変化し、ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。

【００６０】スクリーニングアッセイ 本発明のHOFNH30ポリペプチドは、この受容体と結合し
て本発明の受容体ポリペプチドを活性化する化合物（ア
ゴニスト）またはその活性を阻害する化合物（アンタゴ
ニスト）のスクリーニング法において使用することがで
きる。こうして、本発明のポリペプチドは、例えば、細
胞、無細胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産
物の混合物中の小分子基質およびリガンドを評価するた
めにも用いられる。これらの基質およびリガンドは天然
の基質およびリガンドであってよく、また、構造的もし
くは機能的な模擬物であってもよい（Coliganら, Curre
ntProtocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を
参照のこと）。

【００６１】HOFNH30ポリペプチドは多くの病理を含め
て多数の生物学的機能に関与している。したがって、一
方ではHOFNH30を刺激し、他方ではHOFNH30の機能を阻害
し得る化合物および薬物を見つけ出すことが望まれる。
一般的に、アゴニストは感染症（例えば、細菌、真菌、
原生動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１
またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、糖
尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう
症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺
肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そうう
つ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例
えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット
症候群を含む）のような症状の治療および予防目的で用
いられる。アンタゴニストは感染症（例えば、細菌、真
菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ
−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、
癌、糖尿病、肥満症、拒食症、過食症、喘息、パーキン
ソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょ
う症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立
腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そうう
つ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例
えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット
症候群を含む）のような症状のさまざまな治療および予
防目的で使用しうる。

【００６２】一般に、こうしたスクリーニング法は細胞
表面に本発明の受容体ポリペプチドを発現する適当な細
胞を作製することを含む。この種の細胞には哺乳動物、
酵母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸菌細胞が
含まれる。次いで、この受容体を発現する細胞（もしく
は発現された受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触
させて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害
を観察する。

【００６３】一つのスクリーニング法は、受容体の活性
化により生じた細胞外ｐＨまたは細胞内カルシウムの変
化を測定する系において本発明の受容体を発現する細胞
（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用
するものである。この技法では、本発明の受容体ポリペ
プチドを発現する細胞を化合物と接触させる。その後、
第二メッセンジャーの応答、例えばシグナル伝達、ｐＨ
変化またはカルシウムレベルの変化を測定して、候補化
合物がこの受容体を活性化するか阻害するかを判定す
る。

【００６４】もう一つの方法は、受容体により媒介され
るｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の
阻害または刺激を調べることにより受容体阻害剤をスク
リーニングするものである。この種の方法は、本発明の
受容体を用いて真核細胞をトランスフェクトし、その細
胞表面に該受容体を発現させることを含む。次に、本発
明の受容体の存在下でこの細胞を候補アンタゴニストに
さらし、その後ｃＡＭＰの蓄積量を測定する。候補アン
タゴニストが該受容体と結合し、その結果受容体への結
合を阻害する場合は、受容体により媒介されるｃＡＭＰ
またはアデニル酸シクラーゼの活性レベルが低下または
増加するだろう。

【００６５】本発明の受容体のアゴニストまたはアンタ
ゴニストを検出するための別の方法は、米国特許第5,48
2,835 号に記載されるような酵母ベースの技法である。
これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試験す
ることができ、そこでは候補化合物と直接または間接に
結合された標識により、または標識した競合物質との競
合を用いるアッセイにより、該受容体を担持する細胞へ
の付着が検出される。さらに、これらのアッセイでは、
該受容体を表面に担持する細胞に適した検出系を用い
て、候補化合物が該受容体の活性化により生ずるシグナ
ルを結果的にもたらすか否かを試験することができる。
一般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存在下
でアッセイされ、候補化合物の存在がアゴニストによる
活性化に与える影響が調べられる。

【００６６】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
とHOFNH30ポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混
合物をつくり、この混合物中のHOFNH30活性を測定し、
そしてこの混合物のHOFNH30活性を標準と比較する各ス
テップを含むだけでよい。

【００６７】また、HOFNH30のｃＤＮＡ、タンパク質ま
たはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内での
HOFNH30ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加
化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てるこ
とができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によ
りモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、
HOFNH30タンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベル
を測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、こ
れは適切に操作された細胞または組織からのHOFNH30の
生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニス
トまたはアゴニストともいう）の探索に用いることがで
きる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方
法は当技術分野でよく理解されている。

【００６８】HOFNH30の可能性のあるアンタゴニストの
例としては、抗体、ある場合には、HOFNH30のリガンド
と密接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパ
ク質（例えば、リガンドの断片）、または該受容体と結
合するが応答を誘導しない（それゆえ該受容体の活性を
妨げる）小分子などがある。

【００６９】かくして、他の態様において、本発明は、
HOFNH30ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、
リガンド、受容体、基質、酵素など、またはHOFNH30ポ
リペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定
するためのスクリーニングキットに関し、このキット
は、(a) HOFNH30ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）(b) HOFNH30ポリペプチド（好まし
くは、配列番号２のポリペプチド）を発現する組換え細
胞、(c) HOFNH30ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）を発現する細胞膜、または(d) HOFN
H30ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプ
チド）に対する抗体、を含んでなる。このようなキット
において、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成
成分であることが理解されよう。

【００７０】予防法および治療法 本発明は、HOFNH30活性の過剰量と不足量のどちらにも
関係した異常な状態の治療法を提供する。HOFNH30の活
性が過剰である場合は、いくつかのアプローチが利用可
能である。一つのアプローチは、リガンドのHOFNH30へ
の結合をブロックすることにより、または第二シグナル
を抑制することで異常な状態を軽減することにより活性
化を阻害するのに有効な量で、前記の阻害剤化合物（ア
ンタゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者
に投与することを含んでなる。もう一つのアプローチで
は、リガンドと結合する能力がまだある可溶性形態のHO
FNH30ポリペプチドを、内因性のHOFNH30との競合状態で
投与することができる。このような競合剤の典型的な例
はHOFNH30ポリペプチドの断片である。

【００７１】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性HOFNH30をコードする遺伝子の発現を抑制
することができる。こうした公知技術は、体内で生成さ
れるか別個に投与されるアンチセンス配列の使用を必要
とする。例えば、Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, BocaRat
on, FL (1988)中のO'Connor, J Neurochem (1991) 56:5
60 を参照のこと。あるいはまた、この遺伝子と共に三
重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給すること
もできる。例えば、Leeら, Nucleic Acids Res (1979)
6:3073; Cooneyら, Science (1988) 241:456; Dervan
ら, Science (1991) 251:1360 を参照のこと。これらの
オリゴマーはそれ自体を投与することもできるし、関連
オリゴマーをin vivo で発現させることもできる。

【００７２】HOFNH30およびその活性の過少発現に関係
した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプロー
チを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有
効な量のHOFNH30を活性化する化合物（すなわち、前記
のアゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者
に投与して、異常な状態を緩和することを含んでなる。
別法として、患者の関連細胞においてHOFNH30を内因的
に産生させるために遺伝子治療を用いることができる。
例えば、上で述べたような複製欠損レトロウイルスベク
ターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺
伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離
し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有す
るレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入された
パッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージ
ング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性のウイルス粒
子を産生するようになる。in vivo での細胞処理および
in vivo でのポリペプチド発現のために、これらの産生
細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に関しては、
Human Molecular Genetics, T Strachanand and A PRea
d, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 中のChapt
er 20, Gene Therapyand other Molecular Genetic-bas
ed Therapeutic Approaches(およびその中の引用文献)
を参照のこと。

【００７３】製剤および投与 可溶性形態のHOFNH30ポリペプチドのようなペプチド、
アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分
子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化するこ
とができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペ
プチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または
賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らな
い。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当
技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記
の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器
を含んでなる医薬用パックおよびキットに関する。本発
明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用して
も、他の化合物例えば治療用化合物と一緒に使用しても
よい。

【００７４】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００７５】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００７６】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００７７】

【実施例】実施例１： 哺乳動物細胞による発現 ヒト胚腎臓 293 (ＨＥＫ293)細胞または接着dhfrＣＨＯ
細胞のいずれかで本発明の受容体を発現させた。受容体
の発現を最大限高めるために、一般的には、ｐＣＤＮま
たはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前に受容体ｃＤＮ
Ａから全部の5'および3'非翻訳領域（ＵＴＲ）を除去し
た。リポフェクションを用いて細胞を個々の受容体ｃＤ
ＮＡによりトランスフェクトし、400 mg/ml のＧ４１８
の存在下で選択した。３週間の選択後、個々のクローン
を取り上げ、更なる分析のため増殖させた。ベクターの
みでトランスフェクトしたＨＥＫ293 またはＣＨＯ細胞
を陰性対照として用いた。各受容体を安定して発現して
いる細胞系を分離するため、一般的には約２４個のクロ
ーンを選択し、ノーザンブロットにより分析した。受容
体ｍＲＮＡは、通常、分析したＧ４１８耐性クローンの
約５０％において検出可能であった。

【００７８】実施例２： 結合および機能アッセイ用の
リガンドバンク スクリーニングのために２００以上の推定上の受容体リ
ガンドを含むバンクが構成されている。このバンクに
は、ヒト７膜貫通（７ＴＭ）受容体を介して作用するこ
とが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイ
ン；ヒト７ＴＭ受容体の推定上のアゴニストでありうる
天然の化合物；哺乳動物の等価物がまだ同定されていな
い非哺乳動物の生理活性ペプチド；および天然には見い
だせないが未知の天然リガンドと共に７ＴＭ受容体を活
性化する化合物が含まれる。このバンクは、結合アッセ
イと機能（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフ
ィジオメーター(microphysiometer)、卵母細胞の電気生
理学など、下記参照）アッセイの両方を用いて、既知リ
ガンドについて該受容体を最初にスクリーニングするた
めに使用された。

【００７９】実施例３： リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは受容体の薬理を確かめるための
直接的な方法を提供するもので、高処理量のフォーマッ
トに適応可能である。結合実験のために、受容体の精製
したリガンドを高比活性（50〜2000 Ci/mmol) に放射性
標識した。次に、この放射性標識化のプロセスがリガン
ドのその受容体の方へ向かう活性を弱めないことを確認
した。膜受容体源と全細胞受容体源の両方に使用可能な
シグナル対ノイズ比を確立するために、緩衝液、イオ
ン、ｐＨおよび他のモジュレーター（例えば、ヌクレオ
チド）についてのアッセイ条件を最適化した。これらの
アッセイでは、特異的な受容体結合を、過剰の未標識競
合リガンドの存在下で測定した放射能を全結合放射能か
ら引いた放射能値として規定した。可能な場合は、２以
上の競合リガンドを用いて残留非特異的結合を規定す
る。

【００８０】実施例４： ツメガエル卵母細胞による機
能アッセイ 本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状プラスミド鋳
型からのキャップされたＲＮＡ転写物を、標準的な手法
に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitroで合成し
た。このin vitro転写物を0.2 mg/mlの最終濃度で水中
に懸濁した。成熟雌カエルから卵巣葉(ovarian lobes)
を摘出し、卵胞を取り除いた第Ｖ期の卵母細胞を得、マ
イクロインジェクション装置を使って50 nlボーラスで
ＲＮＡ転写物（卵母細胞につき10 ng)を注入した。２個
の電極電圧クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応
答して発生した個々のツメガエル卵母細胞からの電流を
測定した。Ｃａ²⁺不含のBarth培地中で室温にて記録し
た。このツメガエル系は活性化用リガンドに関して既知
のリガンドおよび／または組織／細胞抽出物をスクリー
ニングするのに使用できる。

【００８１】実施例５： ミクロフィジオメトリックア
ッセイ さまざまな第二メッセンジャー系を活性化すると、細胞
から少量の酸が排出される。この酸は主に細胞内シグナ
ル伝達プロセスを刺激するのに必要とされる代謝活性の
増強の結果として生成される。この細胞の周辺培地のｐ
Ｈ変化はごくわずかであるが、CYTOSENSORミクロフィジ
オメーター (Molecular Devices Ltd.,Menlo Park, CA)
により検出可能である。かくして、このCYTOSENSOR
は、本発明のＧタンパク質共役受容体のような、細胞内
シグナル伝達経路を利用するエネルギーと共役する受容
体の活性化を検出することが可能である。

【００８２】実施例６： 抽出物／細胞上清スクリーニ
ング 多数の哺乳動物受容体は、同一動物種のその活性化用リ
ガンド（アゴニスト）が今のところまだ見いだされてい
ない。それゆえ、これらの受容体の活性リガンドはこれ
までに同定されたリガンドバンクに含まれていない可能
性がある。したがって、本発明の７ＴＭ受容体も、天然
リガンドを同定するために組織抽出物に対して機能的に
（カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター、卵
母細胞の電気生理学などの機能スクリーンを用いて）ス
クリーニングされた。活性化用リガンドが単離・同定さ
れるまで、陽性の機能応答をもたらした抽出物を順次サ
ブ分画化する。

【００８３】実施例７： カルシウムおよびｃＡＭＰ機
能アッセイ ＨＥＫ293 細胞において発現された７ＴＭ受容体は、Ｐ
ＬＣおよびカルシウムの動員の活性化および／またはｃ
ＡＭＰの刺激または阻害に機能的に共役することが判明
した。受容体−トランスフェクト細胞またはベクター対
照細胞におけるＨＥＫ293 細胞での基底カルシウムレベ
ルは、正常な100 nM〜200 nMの範囲にあることが観察さ
れた。組換え受容体を発現しているＨＥＫ293 細胞にfu
ra 2を添加し、一日で150を超える選択したリガンドま
たは組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員
に関して評価した。同様に、組換え受容体を発現してい
るＨＥＫ293 細胞を、標準的なｃＡＭＰ定量アッセイを
用いて、ｃＡＭＰ生成の刺激または阻害について評価し
た。カルシウムの一過性動員またはｃＡＭＰの変動を示
すアゴニストをベクター対照細胞において試験し、その
応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特
異なものであるかを調べた。

【００８４】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【００８５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１０４７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 GACTAAAAGG ATGTTCACTT CTTCTCCACA ATGAATGAGT GTCACTATGA CAAGCACATG 60 GACTTTTTTT ATAATAGGAG CAACACTGAT ACTGTCGATG ACTGGACAGG AACAAAGCTT 120 GTGATTGTTT TGTGTGTTGG GACGTTTTTC TGCCTGTTTA TTTTTTTTTC TAATTCTCTG 180 GTCATCGCGG CAGTGATCAA AAACAGAAAA TTTCATTTCC CCTTCTACTA CCTGTTGGCT 240 AATTTAGCTG CTGCCGATTT CTTCGCTGGA ATTGCCTATG TATTCCTGAT GTTTAACACG 300 GGCCCAGTTT CAAAAACTTT GACTGTCAAC CGCTGGTTTC TCCGTCAGGG GCTTCTGGAC 360 AGTAGCTTGA CTGCTTCCCT CACCAACTTG CTGGTTATCG CCGTGGAGAG GCACATGTCA 420 ATCATGAGGA TGCGGGTCCA TAGCAACCTG ACCAAAAAGA GGGTGACACT GCTCATTTTG 480 CTTGTCTGGG CCATCGCCAT TTTTATGGGG GCGGTCCCCA CACTGGGCTG GAATTGCCTC 540 TGCAACATCT CTGCCTGCTC TTCCCTGGCC CCCATTTACA GCAGGAGTTA CCTTGTTTTC 600 TGGACAGTGT CCAACCTCAT GGCCTTCCTC ATCATGGTTG TGGTGTACCT GCGGATCTAC 660 ATGTATGTCA AGAGGAAAAC CAATGTTTTG TCTCCACATA CGAGTGGGTC CATCAGCCGC 720 CGGAAGACAC CCATGAAGCT GATGAAGACA GTGATGACTG TCTTAGGGGC CTTTGTCGTG 780 TGCTGGACCC CAGGCCTGGT GGTTCTGCTG CTTGATGGCC TGAACTGTAC GCAGTGTGGC 840 GTGCAGCATG TCAAAAGGTG GTTCCTGCTG CTGGCGCTGC TGAACTCTGT CATGAACCCC 900 ATCATCTACT CCTACAAGGA CGAGGACATG TTACAGCACC ATGAAGAAGA TGATCTGCTG 960 CTTCTCTCAG GAGAGGAACC TGGACAGACG TCCCTCCCGC CTCCCCTCCA CCATCCTCAG 1020 CAGGAGCGAC ACGGGCAGCC AGTATAA 1047

【００８６】配列番号：２ 配列の長さ：３３８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Met Asn Glu Cys His Tyr Asp Lys His Met Asp Phe Phe Tyr Asn Arg 1 5 10 15 Ser Asn Thr Asp Thr Val Asp Asp Trp Thr Gly Thr Lys Leu Val Ile 20 25 30 Val Leu Cys Val Gly Thr Phe Phe Cys Leu Phe Ile Phe Phe Ser Asn 35 40 45 Ser Leu Val Ile Ala Ala Val Ile Lys Asn Arg Lys Phe His Phe Pro 50 55 60 Phe Tyr Tyr Leu Leu Ala Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Phe Ala Gly 65 70 75 80 Ile Ala Tyr Val Phe Leu Met Phe Asn Thr Gly Pro Val Ser Lys Thr 85 90 95 Leu Thr Val Asn Arg Trp Phe Leu Arg Gln Gly Leu Leu Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Thr Ala Ser Leu Thr Asn Leu Leu Val Ile Ala Val Glu Arg His 115 120 125 Met Ser Ile Met Arg Met Arg Val His Ser Asn Leu Thr Lys Lys Arg 130 135 140 Val Thr Leu Leu Ile Leu Leu Val Trp Ala Ile Ala Ile Phe Met Gly 145 150 155 160 Ala Val Pro Thr Leu Gly Trp Asn Cys Leu Cys Asn Ile Ser Ala Cys 165 170 175 Ser Ser Leu Ala Pro Ile Tyr Ser Arg Ser Tyr Leu Val Phe Trp Thr 180 185 190 Val Ser Asn Leu Met Ala Phe Leu Ile Met Val Val Val Tyr Leu Arg 195 200 205 Ile Tyr Met Tyr Val Lys Arg Lys Thr Asn Val Leu Ser Pro His Thr 210 215 220 Ser Gly Ser Ile Ser Arg Arg Lys Thr Pro Met Lys Leu Met Lys Thr 225 230 235 240 Val Met Thr Val Leu Gly Ala Phe Val Val Cys Trp Thr Pro Gly Leu 245 250 255 Val Val Leu Leu Leu Asp Gly Leu Asn Cys Thr Gln Cys Gly Val Gln 260 265 270 His Val Lys Arg Trp Phe Leu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Ser Val Met 275 280 285 Asn Pro Ile Ile Tyr Ser Tyr Lys Asp Glu Asp Met Leu Gln His His 290 295 300 Glu Glu Asp Asp Leu Leu Leu Leu Ser Gly Glu Glu Pro Gly Gln Thr 305 310 315 320 Ser Leu Pro Pro Pro Leu His His Pro Gln Gln Glu Arg His Gly Gln 325 330 335 Pro Val

【００８７】配列番号：３ 配列の長さ：６２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CGGGTCGACC CACGCGTCCG CCTGACGAAA AAGAGGGTTA CGCTGCTCAT TTTGAGTATC 60 TGGGCCATCG CCATCTTTAT GGGGGCTGTC CCCACCCTGG GCTGGAATTG CCTCTGTGAC 120 ATCTCTGCCT GCTCTTCCCT GGCCCCCATT TATAGCAGGA GTTACCTCAT TTTCTGGACA 180 GTGTCCAACC TTGTGGCCTT TTTCATCATG GTTGTGGTGT ACCTGCGGAT CTACATGTAT 240 GTCAAGAGGA AAACCAATGT TTTGTCTCCA CATACGAGTG GGTCCATCAG CCGCCGGAAG 300 ACACCCATGA AGCTGATGAA GACAGTGATG ACTGTCTTAG GGGCCTTTGT CGTGTGCTGG 360 ACCCCAGGCC TGGTGGTTCT GCTGCTTGAT GGCCTGAACT GTACGCAGTG TGGCGTGCAG 420 CATGTCAAAA GGTGGTTCCT GCTGCTGGCG CTGCTGAACT CTGTCATGAA CCCCATCATC 480 TACTCCTACA AGGACGAGGA CATGTTACAG CACCATGAAG AAGATGATCT GCTGCTTCTC 540 TCAGGAGAGG AACCTGGACA GACGTCCCTC CCGCCTCCCC TCCACCATCC TCAGCAGGAG 600 CGACACGGGC AGCCAGTATA A 621

【００８８】配列番号：４ 配列の長さ：２０６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列 Arg Val Asp Pro Arg Val Arg Leu Thr Lys Lys Arg Val Thr Leu Leu 1 5 10 15 Ile Leu Ser Ile Trp Ala Ile Ala Ile Phe Met Gly Ala Val Pro Thr 20 25 30 Leu Gly Trp Asn Cys Leu Cys Asp Ile Ser Ala Cys Ser Ser Leu Ala 35 40 45 Pro Ile Tyr Ser Arg Ser Tyr Leu Ile Phe Trp Thr Val Ser Asn Leu 50 55 60 Val Ala Phe Phe Ile Met Val Val Val Tyr Leu Arg Ile Tyr Met Tyr 65 70 75 80 Val Lys Arg Lys Thr Asn Val Leu Ser Pro His Thr Ser Gly Ser Ile 85 90 95 Ser Arg Arg Lys Thr Pro Met Lys Leu Met Lys Thr Val Met Thr Val 100 105 110 Leu Gly Ala Phe Val Val Cys Trp Thr Pro Gly Leu Val Val Leu Leu 115 120 125 Leu Asp Gly Leu Asn Cys Thr Gln Cys Gly Val Gln His Val Lys Arg 130 135 140 Trp Phe Leu Leu Leu Ala Leu Leu Asn Ser Val Met Asn Pro Ile Ile 145 150 155 160 Tyr Ser Tyr Lys Asp Glu Asp Met Leu Gln His His Glu Glu Asp Asp 165 170 175 Leu Leu Leu Leu Ser Gly Glu Glu Pro Gly Gln Thr Ser Leu Pro Pro 180 185 190 Pro Leu His His Pro Gln Gln Glu Arg His Gly Gln Pro Val 195 200 205

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＵ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＡＢＶ 16/28 ＡＣＶ Ｃ１２Ｎ 1/15 ＡＣＸ 1/19 ＡＤＤ 1/21 ＡＤＰ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＳ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ ＡＤＺ 33/531 Ａ 39/395 ＡＤＵ 33/566 ＡＤＹ 33/577 Ｂ 48/00 ＡＣＮ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/705 ＡＡＢ 16/28 ＡＢＰ Ｃ１２Ｎ 1/15 ＡＢＵ 1/19 ＡＢＶ 1/21 ＡＣＶ 5/10 ＡＣＸ Ｃ１２Ｐ 21/02 ＡＤＤ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＤＰ 33/531 ＡＤＳ 33/566 ＡＤＺ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ (71)出願人 597173691 スミスクライン ビーチャム コーポレー ション，パブリック．リミテッド．カンパ ニー. イギリス国 ティダブリュ８ ９イーピ ー，ミドルセックス，ブレントフォード, グレート ウエスト ロード，ツー ニ ュー ホライズン コート （番地なし) (72)発明者 キャサリン イー．エリス アメリカ合衆国 08028 ニュージャージ ー州， グラスボロ，フォーダム プレイ ス 831 (72)発明者 ヘレン エリザベス クリンケンバード イギリス国 エス ジー13 ７エイチ ビ ー ハートフォードシャー，ハートフォー ド， ウェア ロード 236，リトルスト ーン (72)発明者 ガネシュ サセ アメリカ合衆国 19406 ペンシルバニア 州， キング オブ プラッシア，ハンタ ーズ ラン ロード 107 (72)発明者 ステファニー ヴァン ホーン アメリカ合衆国 19464 ペンシルバニア 州， ポッツタウン，バターナット ドラ イブ 129

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のHOFNH30ポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも８
   ０％同一であり、かつHOFNH30ポリペプチドの活性を有
   するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
   はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
   配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
   のHOFNH30ポリペプチドをコードする配列番号１中に含
   まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記のポリヌクレオチドが、その全長に
   おいて配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０
   ％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
   請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
   記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号２のHOFNH30ポリペプチドのア
   ミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、
   欠失または置換されており、かつHOFNH30ポリペプチド
   の活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
   配列を含んでなるポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
   するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％
   同一であるアミノ酸配列を含むHOFNH30ポリペプチドを
   産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡまたは
   ＲＮＡ分子。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現系を含有する宿主
   細胞。
9. 【請求項９】 HOFNH30ポリペプチドを産生させるのに
   十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、こ
   の培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んで
   なる、HOFNH30ポリペプチドの産生方法。
10. 【請求項１０】 宿主細胞が適当な培養条件下でHOFNH3
    0ポリペプチドを産生するように、請求項７に記載の発
    現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
    ションすることを含んでなる、HOFNH30ポリペプチドを
    産生する細胞の作製方法。
11. 【請求項１１】 全長において配列番号２のアミノ酸配
    列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで
    なるHOFNH30ポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
    求項１１に記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のHOFNH30ポリペプ
    チドに免疫特異的な抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のHOFNH30ポリペプ
    チドの増大した活性または発現を必要としている患者を
    治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量
    の、 (a) 前記受容体に対するアゴニスト、および／または
    (b) 前記受容体活性のin vivo 生産をもたらす形の、配
    列番号２のHOFNH30ポリペプチドをコードするヌクレオ
    チド配列と全長において少なくとも８０％同一であるヌ
    クレオチド配列、または前記ヌクレオチド配列に対して
    相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離されたポリ
    ヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のHOFNH30ポリペプ
    チドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療
    するための医薬組成物であって、治療上有効な量の、 (a) 前記受容体に対するアンタゴニスト、および／また
    は(b) 前記受容体をコードするヌクレオチド配列の発現
    を抑制する核酸分子、および／または(c) 前記受容体と
    そのリガンドについて競合するポリペプチド、を含んで
    なる医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のHOFNH30ポリペプ
    チドの発現または活性と関連した被験者の疾病またはそ
    の罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者由来のゲノム中のHOFNH30ポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列に突然変異があるかどう
    かを調べる、および／または(b) 前記被験者から得られ
    たサンプル中のHOFNH30ポリペプチド発現の存在または
    量を分析する、ことを含んでなる方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のHOFNH30ポリペプ
    チドに対するアゴニストの同定方法であって、 (a) HOFNH30ポリペプチドを発現している細胞と候補化
    合物とを接触させ、そして(b) その候補化合物がHOFNH3
    0ポリペプチドの活性化によりシグナルを発生させるか
    否かを調べる、ことを含んでなる方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法により同定さ
    れたアゴニスト。
19. 【請求項１９】 請求項１１に記載のHOFNH30ポリペプ
    チドに対するアンタゴニストの同定方法であって、 (a) HOFNH30ポリペプチドを発現している細胞とアゴニ
    ストとを接触させ、そして(b) 前記アゴニストにより発
    生したシグナルが候補化合物の存在下で減少するか否か
    を調べる、ことを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法により同定さ
    れたアンタゴニスト。
21. 【請求項２１】 請求項１０に記載の方法により作製さ
    れた組換え宿主細胞またはHOFNH30ポリペプチドを発現
    しているその膜。