JPH11187886A

JPH11187886A - 抗−血管新生ペプチドをコードするｄｎａを含む担体：ｄｎａ複合体およびそれらの遺伝子療法における使用

Info

Publication number: JPH11187886A
Application number: JP10201996A
Authority: JP
Inventors: A James Mixson; エイ．ジェイムズ，ミクソン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-07-16
Filing date: 1998-07-16
Publication date: 1999-07-13
Also published as: US6080728A; EP0921193A1; US20020151516A1

Abstract

(57)【要約】【課題】腫瘍の遺伝子療法において，抗腫瘍療法に最
も有効な遺伝子および移入遺伝子の標的組織への送達の
ためのベクター送達系の提供．【解決手段】少なくとも１種の抗- 血管新生遺伝子ま
たはペプチドをコードするＤＮＡ，ならびに所望により
さらに腫瘍抑制タンパク質をコードするＤＮＡからなる
担体：ＤＮＡ複合体が提供される．担腫瘍対象に投与さ
れた場合，この複合体は腫瘍の増殖を阻害することがで
きる．

Description

【発明の詳細な説明】

本願は1996年７月16日付出願の出願番号680,845 号の一
部継続出願である．

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は，抗- 血管新生遺伝
子または抗- 血新生成ペプチドをコードするＤＮＡのイ
ンビボにおける腫瘍への送達およびそのＤＮＡの発現に
よる腫瘍の増殖の阻止に関する．少なくとも１種の抗-
血管新生タンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡ
からなり，所望により腫瘍抑制タンパク質をコードする
ＤＮＡをさらに含有する担体：ＤＮＡ複合体が提供され
る．これらの複合体は腫瘍の増殖阻止のための遺伝子療
法に有用である．

【０００２】

【従来の技術】Ｉ．遺伝子療法遺伝子療法技術の発展は新生物および代謝性疾患の処置
のための臨床的実用化に近づきつつある．標的組織への
移入遺伝子の送達のためのベクター送達系および抗腫瘍
療法に最も有効な遺伝子の同定の両者における改良の実
質的な必要性が残されている．

【０００３】遺伝子輸送のためのベクターはウイルスで
も非ウイルスでもよい．たとえば複製欠損レトロウイル
スベクターは分裂細胞に効率的にトランスフェクトする
ことができる．チミジンキナーゼを移入遺伝子として含
有するレトロウイルスの局所腫瘍内注射の使用は，神経
膠腫の退行に効果的に影響した（Culverら, Science,25
6: 1550-1552, 1992)．レトロウイルスベクターとは異
なり，アデノウイルベクターは非分裂細胞にもトランス
フェクトし，それらが挿入突然変異誘発を誘導する能力
を著しく低下させることができる．しかしながら，それ
らには，ヒトにおいて免疫系を活性化する望ましくない
可能性がある（Crystal, Science, 270:404-410, 199
5)．アデノウイルベクターの免疫原性を最小限にする試
みが進められている．

【０００４】ＤＮＡの非ウイルスベクターには、主とし
てリポソーム，ペプチド，タンパク質およびポリマーが
包含される（Ledley, Current Opinion in Biotechnolo
gy,5: 626-636, 1994）．これらの中でリポソームは，
最近もっとも一般的なＤＮＡの非ウイルスベクターであ
る．レトロウイルスに対するリポソームの大きな利点
は，ＤＮＡがゲノム中に導入されることがなく，アデノ
ウイルベクターとは異なり，免疫原性がないことであ
る．しかしながら，リポソームの大きな限界は多くの細
胞タイプにトランスフェクトするという点で，ウイルス
ベクターほど効率的ではないことである．最近まで，そ
れらの医学的有用性には，貪食細胞によってそれらが速
やかに取り込まれることによる限界があった．リポソー
ムのベクターとしての興味は２つの技術的進歩によって
増大した．第一に，さらに非反応性で網内系（ＲＥＳ）
によって容易に取り込まれない立体的に安定化された
（遮蔽）リポソームが開発された．遮蔽リポソームは，
それらの頭部のグループが酸素に富む脂質（エチレング
リコールまたは糖脂質）から構成され，それが膜の外側
に立体的障壁を提供する．その結果，遮蔽リポソーム
は，慣用のリポソームよりも100 倍までも長時間にわた
り血中に滞留し，したがって，薬理学的効率を増大させ
ることができる（Papahajopoulos, In: Stealth Liposo
mes, Lasicら編, CRCPress, 1995;および Lasicら, Sci
ence, 276: 1275-76, 1995)．しかしながら遮蔽リポソ
ームも細胞のトランスフェクションまたはＤＮＡのベク
ターとしてはとくに効率的というわけではない．

【０００５】リポソーム技術における第二の著しい進歩
は，陰性に荷電したＤＮＡと複合化するカチオニックリ
ポソームの使用である．カチオニックリポソームはＤＮ
Ａを濃縮することが可能で，トランスフェクション効率
を数オーダーの大きさに上昇させる．カチオニックリポ
ソーム：ＤＮＡ複合体では，核酸またはオリゴヌクレオ
チドが封入されるのではなく，単に小さい単層薄膜の小
胞と静電気相互作用によって複合体が形成される．カチ
オニックリポソーム：ＤＮＡ複合体の正確な本質は完全
には分かっていないが，カチオニックリポソーム：ＤＮ
Ａ複合体の複雑なトポロジーの再配列が，ＤＮＡの縮
合，リポソームの凝集および融合を含めて，起こってい
るものと思われる．この巨大分子複合体は，インビトロ
での細胞への付加，非経口的な注射，または肺への適用
のためにエアゾル化することが可能である（Lasic ら,
Science, 267: 1275-1276, 1993)．さらに，カチオニッ
クリポソームと複合化した高濃度のＣＡＴ遺伝子（100
μg またはそれ以上）のマウス静脈内注射は血管が十分
に多い組織たとえば脾臓で40％のトランスフェクション
効率を生じることが見出されている（Zhu ら, Science,
261: 209-211, 1993)．これらの進歩にもかかわらず，
遺伝子療法の大きな挑戦として一次腫瘍のサイズおよび
それらの転移を効果的に低下させる移入遺伝子の腫瘍ま
たは腫瘍辺縁領域への全身的送達の問題が残されてい
る．血管系に富み，血流から巨大分子をろ過する能力が
高い脾臓や骨髄とは異なり，大部分の臓器および腫瘍
は，このような能力を示さず，これらの組織のリポソー
ムによるトランスフェクション効率は低い（Marshall,
Science, 269:1051-1055, 1995) ．しかもカチオニック
リポソーム：ＤＮＡ複合体には血流中でのそれらの半減
期は通常１時間未満であるという限界がある（Allen
ら, In: Liposome Technology, III 巻, Gregoriadis
G.ら編, CRC Press, 1993; Li & Huang, J. of Liposom
e Research, 6: 589, 1996）．治療用遺伝子を運ぶベク
ターによる標的細胞の十分なトランスフェクションが，
現在まで，遺伝子療法の律速工程になっている．

【０００６】II．腫瘍抑制遺伝子腫瘍抑制遺伝子は本技術分野で周知であり，ｐ53遺伝子
（Baker ら, Science,249: 912-915, 1990），ｐ21遺伝
子（El-Deiryら, Cell, 75: 817-825, 1990 および Har
per ら, Cell, 75: 805-816, 1993)，およびｒｂ遺伝子
（Bookstein ら, Science,247: 712-715, 1990）を包含
する．

【０００７】腫瘍抑制遺伝子ｐ53における突然変異は，
転移乳癌を含めて，ヒト腫瘍の50％以上に存在すること
が知られている．多くの研究グループが，乳癌細胞を含
めて様々な腫瘍細胞へのｐ53移入遺伝子の単一コピーの
誘導された輸送により野生型ｐ53の再導入が，これらの
トランスフェクトされた細胞をヌードマウス中に移植し
た場合，腫瘍増殖速度の低下および／または腫瘍の進展
の軽減を生じることを見出している（Wangら, Oncogen
e, 8: 279-288, 1993; Baker ら, Science, 249:912-91
5, 1990; Bookstein ら, Science, 247: 712-715, 199
0; Changら, CancerRes. 52: 222-226, 1992; Isaacs
ら, Cancer Res. 51:4716-4720, 1991; Dillerら, Mol.
Cell.Biol. 10: 5772-5781, 1990; Chene ら, Oncogen
e, 6: 1799-1805,1991; Zouら, Science, 263: 526-52
9, 1994)．さらに，ｐ53移入遺伝子を含むレトロウイル
スの気管内注射が肺腫瘍の増殖を有意に阻止することが
明らかにされている（Fujiwaraら, J.Natl.Cancer Ins
t., 86: 1458-1462, 1994）．

【０００８】カチオニックリポソームに複合体化したｐ
53コード配列を含むβ- アクチンプロモーター含有ベク
ターの全身的静脈内注射がヌードマウスに注射した悪性
系統の乳癌細胞の腫瘍増殖に影響することが見出されて
いる（Lesoon-Wood ら, Proc.Am.Ass.Cancer Res. 36:
421, 1995; Lesoon-Woodら, Human Gene Ther. 6: 39-4
06, 1995）．この研究で処置された腫瘍15例中，これら
の腫瘍の４例は処置に応答しなかった．これらの腫瘍の
不応答性により，本発明においては，これらの腫瘍のサ
イズをさらに効果的に低下させる新しい治療法が探索さ
れた．

【０００９】ｐ53はＤＮＡ損傷に対する多重応答を統合
する．ＤＮＡ損傷はｐ53タンパク質レベルの上昇を招来
する．ＤＮＡ損傷後，野生型ｐ53機能の重要な機能は細
胞のＧ１からＳ期への進行をコントロールすることであ
る．最近，数研究グループがｐ53は，サイクリン依存性
キナーゼ（ＣＤＫ）のインヒビターであるｐ21 kd タン
パク質（ＷＡＦ１またはＣＩＰ１としても知られる）を
転写的に活性化することを見出している（El-Deiryら,
前出および Harper ら, 前出）．ＣＤＫ活性の阻害は転
写因子Ｅ２Ｆおよび網膜芽腫タンパク質ＲＢからの関連
転写因子の放出を遮断し，その結果，Ｓ期に入るために
必要な遺伝子の転写の活性化が行われないと考えられて
いる（Harperら, 前出および Xiongら, Nature, 366: 7
01-704,1993）．ｐＲＢがｐ53- 誘導Ｇ１停止期の下流
エフェクターであるモデルと一致する証拠が，最近，報
告されている（Dulic ら, Cell, 76: 1013-1023, 199
4)．すなわち，ｐ53は２種のタンパク質：ｐ21およびｒ
ｂによって細胞周期を調節している．

【００１０】III ．抗- 血管新生タンパク質抗- 血管新生活性をもつタンパク質はよく知られてい
て，たとえばトロンボスポンジンＩ（Kosfeld ら, J.Bi
ol.Chem. 267: 16230-16236, 1993; Tolsma ら,J.Cell
Biol. 122:497-511, 1993; Dameron ら, Science, 265:
1582-1584, 1993) ，ＩＬ-12 （Voest ら, J. Natl. Ca
ncer Inst. 87: 581-586, 1995)，プロタミン（Ingber
ら, Nature, 348: 555-557, 1990），アンギオスタチン
（O'Reillyら, Cell, 79: 315-328, 1994)，ラミニン
（Sakamotoら, Cancer Res. 5: 903-906,1991)，エンド
スタチン（O'Reillyら, Cell, 88: 277-285, 1997)およ
びプロラクチンフラグメント（Clapp ら, Endocrinol.
133: 1292-1299, 1993）が包含される．さらに，これら
のタンパク質から数種の抗- 血管新生ペプチドが単離さ
れている（Maioneら, Science, 247: 77-79, 1990; Wol
teringら, J.Surg.Res.50: 245-251, 1991;および Eija
nら, Mol.Biother. 3: 38-40, 1991)．

【００１１】トロンボスポンジンＩ（以下，ＴＳＰＩと
いう）は３つの同一の 180 kd サブユニットからなり
（Lahav ら, Semin.Thromb.Hemostasis, 13:352-360, 1
987)，ジスルフィド結合によって連結した大きなトリマ
ー糖タンパク質である（Lawerら, J.Cell Biol. 103: 1
635-1648, 1986; Lahavら, Eur.J.Biochem. 145: 151-1
56, 1984)．大部分の抗- 血管新生活性はこのタンパク
質の中央幹部領域に見出される（Tolsmaら, 前出）．こ
の中央幹部領域には，新血管形成を阻害する少なくとも
２つの異なる構造ドメインが存在する（Tolsmaら, 前
出）．

【００１２】ＴＳＰＩのほかに，血管新生を阻害するペ
プチドが単離されている６種の他のタンパク質（フィブ
ロネクチン，ラミニン，血小板因子- ４，アンギオスタ
チン，エンドスタチンおよびプロラクチンフラグメン
ト）がある．さらに，ＦｌＫ１の優性ネガティブフラグ
メントおよびペプチドソマトスタチンの類縁体は血管新
生を阻害することが知られている．

【００１３】フィブロネクチン（ＦＮ）は多くの正常細
胞の主要表面成分であると同時に，強力な細胞拡散因子
である．トランスフォーメーション時に，細胞ＦＮの喪
失が観察されている．さらに，トランスフォームされた
細胞へのフィブロネクチンの付加は正常表現型を復元す
る．ＦＮからのヘパリン結合または細胞接着フラグメン
トはいずれも，実験的転移を阻止できることが見出さ
れ，細胞表面プロテオリグリカンが転移腫瘍細胞の接着
の仲介に重要であることが示唆される（McCarthyら，J.
Natl.Cancer Inst. 80:108-116, 1988）．ＦＮおよびそ
のペプチドの１種がインビボ血管新生を阻害することも
見出されている（Eijan ら, Mol.Biotech.3: 38-40, 19
91）．

【００１４】ラミニンは基底膜の主要成分であり，内皮
および腫瘍細胞に結合する数種の生物活性部位をもつこ
とが知られている．ラミニンは１個のＡ鎖および２個の
Ｂ鎖からなる３つの鎖から構成される十字架状の分子で
ある．ラミニン中に数個の部位が細胞結合ドメインとし
て同定されている．これらの部位は，インビトロにおけ
る細胞活性，たとえば細胞拡散，遊走および細胞分化を
促進する．ラミニンのＢ１鎖の２つの部位からの２種の
ペプチドは血管新生を阻害することが知られている（Gr
ant ら, Path.Res.Pract. 190: 854-863, 1994）．

【００１５】血小板因子-4（ＰＦ４）は，本来，ヘパリ
ンに対するその高い親和性を特徴とする血小板α- 顆粒
タンパク質である．このタンパク質は凝集時に，ＰＦ４
ポリペプチドのテトラマーとコンドロイチン硫酸の高分
子量複合体として血小板から放出され，高いイオン強度
で解離する．ＰＦ４は免疫抑制，好中球，単球，および
線維芽球に対する走化性活性，骨吸収の阻害，ならびに
血管新生の阻害を含む数種の生物学的性質を有する．ヒ
トＰＦ４の血管新生停止作用はその分子のヘパリン結合
領域であるカルボキシル末端に関連する．それから誘導
される12アミノ酸の合成ペプチドが著しい血管新生停止
作用を有することが発見された（Maioneら, Science, 2
47: 77-79, 1990)．

【００１６】エンドスタチンはコラーゲンＸVIIIの 20
kDa タンパク質フラグメントである．それは最近，腫瘍
血管新生および腫瘍増殖の強力なインヒビターであるこ
とが見出された（O'Reillyら, Cell, 88: 277-285, 199
7)．

【００１７】ソマトスタチンはタンパク質ではないが，
その最も顕著な機能は成長ホルモン（ＧＨ）分泌の阻害
である，天然に存在する環状の14アミノ酸ペプチドであ
る．ソマトスタチンは，脳に広く分布し，神経調節的な
役割を果たし，また胃腸管の幾つかの臓器に分布し，そ
こで傍分泌因子としてまたは真の循環因子として作用で
きる．ソマトトロピン放出阻止因子（ＳＲＩＦ）として
も知られる神経ペプチド，ソマトスタチンが，ヒト癌に
おいて果たす役割についてはよく分かっていない．正常
および新生物ヒト組織におけるソマトスタチン受容体に
関する最近の研究では，その作用は複雑で，直接および
間接の両機構の関与が示唆されている．これらの合成ソ
マトスタチン類縁体の抗腫瘍機構の一つは，抗- 血管新
生作用の可能性がある（Woltering ら, J.Surg.Res. 5
0: 245-50, 1990）．最近の研究では，天然のソマトス
タチンおよび９種のソマトスタチン類縁体について血管
新生の阻害能力が評価されている．最も強力なソマトス
タチン類縁体は，天然に存在するソマトスタチンよりも
ほぼ２倍強力であることが見出された（Barrieら, J.Su
rg.Res. 50: 245-50, 1990）．

【００１８】アンギオスタチンはプラスミノーゲンの 3
8 kDa フラグメントである．プラスミノーゲンはフィブ
リノーゲン活性をもたないが，アンギオスタチンは著し
い血管新生活性を有する（O'Rielly MS.ら, Cell, 79:
315-28, 1994）．一次腫瘍による転移の抑制が観察され
る場合に，アンギオスタチンが単離された．すなわち一
次腫瘍を除去した場合に，転移癌細胞が増殖した．アン
ギオスタチンの投与は新血管系の形成および転移癌細胞
の増殖を遮断する．

【００１９】ＦｌＫ１受容体は血管内皮増殖因子（ＶＥ
ＧＦ）の受容体である．ＦｌＫ- １はもっぱら内皮細胞
の表面上で発現する．ＶＥＧＦが受容体に結合すると，
続いてＦｌＫ- １受容体がホモダイマー化して内皮細胞
の分裂を刺激する．ＦｌＫ-１の突然変異受容体を内皮
細胞にトランスフェクトすると，突然変異受容体が野生
型ＦｌＫ- １受容体とダイマー化する．突然変異ＦｌＫ
- １受容体でトランスフェクトされたこの内皮細胞で
は，ＶＥＧＦは内皮細胞の分裂を刺激することができな
い．ＦｌＫ- １ｃＤＮＡを運搬するレトロウイルスを共
投与すると（Millauer B. ら, Nature, 367, 1994)，腫
瘍の増殖が阻害される．これは，受容体が固形腫瘍の血
管新生に重要な役割を果たしていることを確認するもの
である．

【００２０】最後に，プロラクチンの 16 kdフラグメン
トは抗- 血管新生活性を示すことが見出された．プラス
ミノーゲンと同様，プロラクチンは抗- 血管新生活性を
示さないが，プロラクチンフラグメントは血管新生の強
力なインビボおよびインビトロ阻害剤である（Clapp C.
ら, Endocrinology, 133: 1292-1299, 1993)．

【００２１】抗- 血管新生ペプチドが有用な抗腫瘍剤で
あり得ることが明らかであり，血管系に向けて遺伝子を
標的化することに興味がもたれるにもかかわらず，抗-
血管新生ＤＮＡ配列を利用する有効なインビボ遺伝子療
法規準に関しては，これまで何の報告も発表されていな
い．

【００２２】トランスフェクトされて腫瘍の増殖を阻害
することがこれまでに示された抗-血管新生遺伝子は完
全長のトロンボスポンジンＩのみである．その研究にお
いては（Weinstat-Saslow ら, Cancer Research 54, 65
04-6511, 1994)，インビトロにおいてベースライン細胞
よりも15倍高レベルのトロンボスポンジンＩを発現する
腫瘍細胞がマウスに移植された．このトランスフェクト
された完全長のトロンボスポンジンＩは腫瘍細胞から分
泌され，腫瘍を60％まで効率的に低下させた．すなわ
ち，この研究では，腫瘍細胞の100 ％を高発現および高
分泌抗- 血管新生遺伝子でトランスフェクトすることに
より腫瘍サイズを減少できることが確認されている．

【００２３】

【課題を解決するための手段】本発明の目的は抗- 血管
新生遺伝子および／または抗- 血管新生ペプチドをコー
ドするＤＮＡを，インビボにおいて好ましくは注射で腫
瘍部位に送達させることにあり，この場合このＤＮＡは
腫瘍部位で発現して腫瘍の増殖を阻害する．

【００２４】本発明のさらに他の目的は，抗- 血管新生
ペプチドをコードするＤＮＡを含有する担体複合体を提
供することにある．担体は，とくに腫瘍および／または
腫瘍血管系に標的化することができる．複合体は抗- 血
管新生遺伝子療法の提供および対象における腫瘍の増殖
の阻害に有用である．

【００２５】本発明のさらに他の目的は，抗- 血管新生
遺伝子もしくはペプチドをコードするＤＮＡ，または２
種以上の抗- 血管新生遺伝子もしくはペプチドをコード
するＤＮＡ，およびさらに腫瘍抑制遺伝子コードするＤ
ＮＡを含有する担体複合体を提供することにある．

【００２６】現時点において好ましい実施態様において
は，担体材料は，カチオニックポリマーまたはカチオニ
ックリポソームおよび１種もしくは２種以上の抗- 血管
新生ペプチドをコードするＤＮＡ，ならびに所望により
腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡを含有する複合体で
ある．

【００２７】複合体は，患者に，腫瘍阻害有効量を，好
ましくは複合体の注射によって投与される．

【００２８】

【発明の実施の形態】図面の説明図１は，抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮＡを含
有する複合体を腫瘍内に投与した実施例８以下に記載の
実験の結果を示すグラフである．図２は実施例10に記載
したように，抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮＡ
と複合化したカチオニックポリマー担体を用いた内皮細
胞へのインビトロトランスフェクション実験の結果を示
すグラフである．図３は，実施例14に記載のように担癌
マウスに抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮＡと複
合化したカチオニックポリマー，Superfect （ＳＦ）ま
たはリポソーム担体を用いてインビボ注射した実験の結
果を示すグラフである．各処置の注射時に腫瘍容量（mm
³) を測定した．最終測定時には注射は行わなかった．

【００２９】本発明の上述の目的は，一実施態様におい
ては，少なくとも１種の抗- 血管新生遺伝子またはペプ
チドをコードするＤＮＡ，および所望によりさらに腫瘍
抑制タンパク質をコードするＤＮＡからなる担体：ＤＮ
Ａ複合体により達成された．ＤＮＡは完全長の抗- 血管
新生タンパク質をコードするものであっても，抗- 血管
新生活性を有するペプチドをコードするものであって
も，またこれらのＤＮＡの組合わせであってもよい．

【００３０】好ましい担体ビヒクルはリポソーム，ポリ
マー，ウイルス（たとえばレトロウイルスおよびアデノ
ウイルス），ウイルス殻，ミセル，マイクロスフェア等
である（たとえば Nabel E. ら, Vectors for Gene The
rapy, in Current Protocolsin Human Genetics on CD-
ROM, John Wiley and Sons, 1977 参照）．本発明に用
いられる担体は，ＤＮＡをインビボにおいて腫瘍および
／または腫瘍血管系を含む辺縁領域に送達され，ＤＮＡ
が発現されるように選択できる．

【００３１】リポソーム担体は本技術分野において周知
である．たとえば Liposome Technology, 2d Edition,
CRC Press: Boca Raton, 1983;および Stealth Liposom
e, Lasic and Martin, Eds., CRC Press: Boca Raton,
1995を参照されたい．カチオニック脂質の例には，1,2-
ジオレオイル-sn-グリセロ-3- エチルホスホコリン（Av
anti, Birmingham, AL），1,2-ジミリストイル-sn-グリ
セロ-3- エチルホスホコリン（Avanti, Birmingham, A
L）および (2,3-ジオール- エイルオキシ) プロピル-
Ｎ, Ｎ, Ｎ- トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴ
ＭＡ，Syntex Corp.,Palo Alto, CA）が包含される．

【００３２】カチオニック脂質は，ジオレオイルホスフ
ァチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ，Avanti, Birmin
gham, AL）と混合して使用することができる．カチオニ
ックリポソームの実施態様においては，混合物中に存在
するカチオニック脂質の量は一般に 100〜40モル％の範
囲，好ましくは約50モル％である．混合物中に存在する
ＤＯＰＥの量は一般に０〜60モル％の範囲，好ましくは
約50モル％である．

【００３３】リポソームは，本明細書においては「ペギ
ル化脂質」と呼ぶポリエチレングルコール（ＰＥＧ）の
脂質誘導体を含有してもよい．ペギル化脂質の創成に有
用な成分には，たとえば 1,2- ジアシル-sn-グリセロ-3
- ホスホエタノールアミン-Ｎ-[ポリ( エチレングリコ
ール)2000]が包含される．ペギル化脂質成分が存在する
場合には，一般に０〜10モル％の範囲，好ましくは１〜
５モル％の量が包含される．

【００３４】カチオニックリポソームは，他のリポソー
ムと同様にして，たとえば，カチオニック脂質をＤＯＰ
ＥとともにまたはＤＯＰＥを加えないで溶媒たとえばク
ロロホルムに溶解して調製する．脂質をついで丸底フラ
スコ中ロータリーエバポレーターで一夜乾燥する．次
に，得られた脂質を滅菌水で１時間にわたり水和して，
大きな多重薄層ベジクルリポソームを形成させる．リポ
ソームのサイズを低下させるため，リポソームを超音波
処理するか，またはポリカルボネート膜を前後に通過さ
せることができる．リポソームの形成後，それらを含有
する溶液についでＤＮＡを添加する．

【００３５】本発明との関連で有用なカチオニックポリ
マー担体には，ポリエチレンイミン（Avanti Lipids か
ら入手可能），ポリリジン（Simma から入手可能），ポ
リヒスチジン（Simma ），および Superfect（Qiagenか
ら入手可能）が包含される．インビトロおよびインビボ
における遺伝子送達のためのカチオニックポリマー担体
の使用は，Goldman ら（Nature Biochemistry, 15: 46
2, 1977）により文献に記載されている．

【００３６】遮蔽リポソームは多分それらが「漏孔に富
む」容器であることから，固形腫瘍に濃縮される．遮蔽
リポソームの細胞への取り込みはそれらの表面のペギル
化により低下するが，この低下は循環中におけるそれら
の長い半減期によってさらに相殺される．すなわち，ペ
ギル化リポソームはＤＮＡの優れた担体である．ミセル
はそれらが両極性の膜を欠く以外はリポソームに極めて
類似している．それらは極性脂質から作成され，それら
の一部はリポソーム中に用いられるのと同一のカチオニ
ック脂質であってもよい．リポソームの場合と同様に，
ミセルは，細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクト
することが知られている（Zhang YP. ら,Pharmaceutica
l Res. 14: 190-6, 1997；Labat-Moleur F. ら, Gene T
herapy 3: 1010-7, 1996）．

【００３７】本技術分野において周知のように，ウイル
スベクターの静脈内注射には問題の可能性がある．しか
しながら，ウイルスは局所的な動脈内および／または腫
瘍内注射により移入遺伝子を送達することができる．移
入遺伝子を運ぶウイルスベクターの構築は広範に報告さ
れていて，遺伝子療法に用いて成功している（Nabel,E.
"Current Protocols in Human Genetics on CD-ROM",
John Wiley and Sons,1977）．

【００３８】インビボにおける標的への複合体の送達
は，特定の細胞マーカーに対し親和性を有する複合体中
にリガンドを包含させることにより増大させることがで
きる．リガンドは，抗- 血管新生ＤＮＡの分泌型が送達
される場合には，複合体を腫瘍血管系もしくは腫瘍血管
系関連内皮細胞または腫瘍細胞自体に誘導する働きがあ
る抗体，細胞表面マーカー，ウイルスペプチド等を包含
する．抗体リガンドは，腫瘍マーカー，たとえばＨer2
，ＣＥＡ，フェリチン受容体，または腫瘍血管系に関
連するマーカー（インテグリン，組織因子またはβ- フ
ィブロネクチンイソフォーム）に対して特異的な抗体ま
たは抗体フラグメントとすることができる．抗体または
他のリガンドは本技術分野で周知のように，担体たとえ
ばリポソームおよびウイルスにカップリングさせること
ができる（たとえば，Neriら, NatureBiotechnology, 1
5: 1271, 1997; Kirpotin,D.ら, Biochemistry 36:66,
1997;Cheng, Human Gene Therapy, 7: 275, 1996; Pasq
ualini ら, Nature Biotechnology, 15: 542, 1997;な
らびに Park ら, Proc.Am.Ass.Canc.Res. 38:342, 199
7;Mori & Huang,前出, Nabel,前出参照）．また，レト
ロウイルスの偽型化を，特定の細胞へのウイルスの標的
化に使用することもできる（Martinら, Mol.Med.Today,
3: 396, 1997)．

【００３９】他の実施態様においては，複合体には，さ
らに腫瘍抑制遺伝子が包含される．このような腫瘍抑制
遺伝子の例には，ｐ53遺伝子，ｐ21遺伝子（El-Deiry
ら, 前出および Harper ら, 前出）およびｒｂ遺伝子
（Bookstein ら, 前出）がある．ｐ53遺伝子が現時点で
は好ましい主要抑制遺伝子である．

【００４０】抗- 血管新生ＤＮＡによってコードされる
特定の抗- 血管新生タンパク質またはペプチドが本発明
に必須のわけではない．適当なペプチドの例には，ｉ）配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するトロンボ
スポンジンＩのフラグメント（ＴＳＰｆ）：このフラグ
メントは配列番号：２に示すＤＮＡ配列（ＴＳＰＩ遺伝
子のヌクレオチド 1013-1650）によってコードされる． ii）配列番号：３のアミノ酸配列を有するＴＳＰｆのコ
ンカテマー：これは配列番号：４に示すＤＮＡ配列によ
ってコードされる． iii) 配列番号：５に示すアミノ酸配列を有するラミニ
ンペプチド：これは配列番号：６に示すＤＮＡ配列によ
ってコードされる． iv）配列番号：７に示すアミノ酸配列を有するラミニン
配列のコンカテマー：これは配列番号：８に示すＤＮＡ
配列によってコードされる．ｖ）配列番号：９に示すアミノ酸配列をもつ血小板因子
- ４からのペプチド：これは配列番号：10に示すＤＮＡ
配列によってコードされる． vi）配列番号：11に示すアミノ酸配列を有する血小板因
子- ４ペプチドのコンカテマー：これは配列番号：12に
示すＤＮＡ配列によってコードされる． vii) 配列番号：13に示すアミノ酸配列を有するソマト
スタチンインヒビターペプチド：これは配列番号：14に
示すＤＮＡ配列によってコードされる． viii) 配列番号：15に示すアミノ酸配列を有するソマト
スタチンインヒビターのコンカテマー：これは配列番
号：16に示すＤＮＡ配列によってコードされる． ix）配列番号：17に示すアミノ酸配列を有するフィブロ
ネクチンインヒビターペプチド：これは配列番号：18に
示すＤＮＡ配列によってコードされる．ｘ）配列番号：19に示すアミノ酸配列を有するフィブロ
ネクチンインヒビターペプチドのコンカテマー：これは
配列番号：20に示すＤＮＡ配列によってコードされる． xi）配列番号：21に示すアミノ酸配列を有するアンギオ
スタチンペプチド：これは配列番号：22に示すＤＮＡ配
列によってコードされる． xii) 配列番号：23に示すアミノ酸配列を有するアンギ
オスタチンペプチドのコンカテマー：これは配列番号：
24に示すＤＮＡ配列によってコードされる． xiii) 配列番号：25に示すアミノ酸配列を有するプロラ
クチンペプチド：これは配列番号：26に示すＤＮＡ配列
によってコードされる． xiv) 配列番号：27に示すアミノ酸配列を有するプロラ
クチンペプチドのコンカテマー：これは配列番号：28に
示すＤＮＡ配列によってコードされる． xv）配列番号：34に示す配列をもつＦｌｋ- ＤＮペプチ
ド：これは配列番号：35に示すＤＮＡ配列によってコー
ドされる． xvi) 配列番号：36に示す配列を有するエンドスタチン
のペプチド：これは配列番号：37に示すＤＮＡ配列によ
ってコードされる．

【００４１】上述の配列は例示であって，本発明の範囲
を限定するものではない．これらのフラグメントのある
種のドメインが抗- 血管新生活性を有することは文献に
報告されていて既知である．これらの配列の一部は，以
上から明らかなように，コンカテマーである．コンカテ
マーの使用は，送達に必要なベクターの量を変更しない
で抗- 血管新生用量のレベルを上昇させることができ
る．コンカテマーは長さ約4400塩基（大タンパク質のコ
ード領域）まで伸長することが可能であり，可能なコン
カテマー数は単一抗- 血管新生ペプチド- コード単位の
塩基数に依存する．上記の例から明らかなように，コン
カテマーのリピートは介入配列によって分離することが
できる．

【００４２】フィブロネクチンでは，コンカテマーの範
囲は約２〜約66である．ＴＳＰｆについては，抗- 血管
新生単位の最大数は約６であるが，このコンカテマー数
は，たとえば相当するアミノ酸配列を配列番号：30に示
した配列番号：29に示すように，抗- 血管新生効果に対
して重要性の小さな配列を除去することにより増大させ
ることができる．同様に，血小板因子- ４ペプチド，ソ
マトスタチンインヒビター，アンギオスタチン，および
プロラクチンのコンカテマー数も修飾し，増大させるこ
とができる．

【００４３】２以上の抗- 血管新生経路が存在するの
で，２種またはそれ以上の型のインヒビターから構成さ
れるコンカテマーが，同種のコンカテマーよりも有効で
ある．たとえばＴＳＰＩとフィブロネクチンインヒビタ
ーの異種コンカテマーを同一のベクター中に挿入するこ
とができる．このような異種コンカテマーをコードする
ＤＮＡの例は配列番号：31に示す．このような異種コン
カテマーでは，各配列のペプチドコードリピートはブロ
ック状および／または無作為に連結することができる．

【００４４】異種コンカテマーは抗- 血管新生ペプチド
のみに限定される必要はない．たとえば，タンパク質ア
ンギオスタチンまたはプロラクチンの大ポリペプチドフ
ラグメントは，抗- 血管新生ペプチドをコードする遺伝
子で修飾することができる．この場合も，コンカテマー
数は単位血管新生インヒビターのヌクレオチド塩基の数
に依存して変動させることができる．大および小抗- 血
管新生インヒビターのコンカテマーでは，大対小インヒ
ビターの比は 0.1対〜 0.9，好ましくは 1:1である．

【００４５】ペプチドには転写開始シグナルＭetならび
に転写停止コドン（ＴＡＡ）が包含される．

【００４６】上記配列中に存在するＳalＩ部位は，たと
えばインビボにおいてβ- アクチンプロモーターからタ
ンパク質を効率的に発現するために有用なことが知られ
ているＢＡＰベクターのようなベクターにＤＮＡを挿入
するための有用なクローニング手段になる（Ray ら, Ge
nes Dev. 5: 2265-2273, 1991)．他の制限部位は，本技
術分野において容易に評価されるように，他のベクター
へのクローニングのためのＤＮＡ中に挿入することがで
きる．

【００４７】ＤＮＡ配列を含有させるための他の有用な
ベクターには，シミアンウイルスプロモーターたとえば
ｐＺeoＳＶ（Invitrogen）；ＣＭＶプロモーター，たと
えばｐｃＤＮＡ３，ｐＲｃ/ ＣＭＶまたはｐｃＤＮＡ１
（Invitrogen）；またはホスホグリセレートキナーゼ
（ＰＧＫ）プロモーター（Abudら, Developmental Gene
tics 19: 51, 1996)を有するプラスミドが包含される．
ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドは，多重クロー
ニング部位のイントロン５' を含有していてもよい（Zh
u ら, 前出）．ウイルスＳＶ40ポリＡターミネーターの
代わりにＢＧＨターミネーターを含有するプラスミドた
とえばｐｃＤＮＡ３，ｐＲｃ/ ＣＭＶ，ｐＲｃ/ ＲＳＶ
（Normanら, IBC's 5th Annual Meeting, 1995; Inviro
gen ベクター）もまた，標的化細胞内において腫瘍抑制
遺伝子および抗- 血管新生ペプチド（単数および複数）
の発現を増大させるように本発明において使用できる．

【００４８】腫瘍抑制タンパク質をコードするＤＮＡお
よび抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮＡの発現
は，様々なプロモーターを用いて達成することができ
る．たとえば，プロモーターは，全般性のプロモーター
たとえばβ- アクチンプロモーター，シミアンウイルス
プロモーター，もしくはＣＭＶプロモーター，または組
織特異的なプロモーター，たとえば，肝臓に特異的なα
- 胎児プロテインプロモーター（Kanekoら, Cancer Re
s. 55: 5283-5287, 1995)，メラノーマ細胞に特異的な
チロシナーゼプロモーター（Hughesら, Cancer Res. 5
5: 3339-3345, 1995)，またはニューロン特異的なエノ
ラーゼプロモーター（Andersenら, Cell. Molec.Neurob
iol. 13: 503-515, 1993）とすることができる．

【００４９】プラスミドベクターには発現効率を増大さ
せるため，多重プロモーターを含有させることができ
る．さらにプラスミドベクターには，異なるＤＮＡコー
ド配列の間に，同一の転写体から２種以上のペプチドの
翻訳を可能にするＩＲＥＳ配列（内部リボソームエント
リー部位）を包含させることができる．コード配列は発
現レベルを増大させるため，ベクター内で分泌配列と結
合させることができる．本発明のさらに他の実施態様に
おいては，ベクターは染色体複製ベクターから構成する
こともできる（たとえば，Calos ら, TIG 12: 463, 199
6 参照）．発現を至適化するこれらのおよび他の技術は
本技術分野において周知である．

【００５０】本発明の複合体中に包含される特定のＤＮ
Ａ量にはとくに限定はなく，複合体中で投与される総Ｄ
ＮＡ量は一般的に約 0.005〜0.32μg/ｐＭ担体の範囲，
好ましくは 0.045〜0.08μg/ｐＭ担体である．

【００５１】腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡは一般
に 0.0025 〜0.16μg/ｐＭ担体，好ましくは 0.028〜0.
04μg/ｐＭ担体の量を存在させる．抗- 血管新生ペプチ
ドをコードするＤＮＡは一般的に，0.0025〜0.16μg/ｐ
Ｍ担体，好ましくは 0.028〜0.04μg/ｐＭ担体の量を存
在させる．

【００５２】抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮＡ
に対する腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡのモル比も
変動させることができる．一般的にモル比は，1:5 〜5:
1 ，好ましくは約 1:1である．

【００５３】腫瘍抑制遺伝子および抗- 血管新生ペプチ
ドをコードするＤＮＡは同一のベクター内に含有されて
いてもよくまた別個のベクター中に含有されていてもよ
い．抗- 血管新生ペプチドをコードする異なるＤＮＡは
複合体内の同一のまたは異なるベクター上に提供されて
いてもよい．

【００５４】他の実施態様においては，本発明の上述の
目的は，担腫瘍患者における腫瘍の増殖を阻止する方法
において，抗- 血管新生タンパク質もしくはペプチド
（単数または複数）をコードするＤＮＡからなり，さら
に腫瘍抑制遺伝子をコードするＤＮＡを加えたまたは加
えない担体：ＤＮＡ複合体を患者に投与する方法により
達成される．

【００５５】様々な種類の腫瘍を処置することができ
る．本発明によって処置することができる腫瘍の例に
は，たとえば肺，結腸，脳，乳房およびメラノーマ腫瘍
のような固形腫瘍が包含される．これらの腫瘍は，すべ
てそれらの増殖の維持が，血管の供給に極めて高い依存
性を示す．

【００５６】本発明の担体：ＤＮＡ複合体の特定の投与
様式は様々な因子に依存するが，好ましい様式には静脈
内，皮下または腫瘍内注射が包含される．静脈内注射は
発生する腫瘍血管に複合体を分布させるために好ましい
投与様式である．

【００５７】投与される担体：ＤＮＡの量は，患者の年
齢，体重，性別，ならびにその患者における腫瘍の容量
および腫瘍の増殖速度に依存して変動する．一般的には
投与されるＤＮＡの量は約 1〜60μg ，好ましくは約 5
〜16μg である．

【００５８】

【実施例】以下の実施例は例示の目的で提供されるもの
であって，本発明の範囲を限定するものと解釈すべきで
はない．

【００５９】材料ＤＮＡベクターの製造Ａ．ＴＳＰＩベクターＴＳＰＩ遺伝子のコード領域は既知である（ＧＢ受入れ
コード；Ｘ14787)．ＴＳＰＩ遺伝子は，ＢＡＰベクター
（Ray ら, 前出）のＸbaＩ部位に挿入され，ＴＳＰＩ遺
伝子の発現がβ- アクチンプロモーターによって制御さ
れるＴＳＰＩベクターを製造した．さらに詳細には，Ｔ
ＳＰＩｃＤＮＡおよびＢluescript プラスミド（Promeg
a)をＨind ＩとＸbaＩで消化して，ついでＴＳＰＩｃＤ
ＮＡをＢluescript にライゲートした．次に，ＴＳＰｃ
ＤＮＡおよびＢＡＰベクターを含有するＢluescript を
ＳalＩとＢamＨＩで消化し，ＴＳＰｃＤＮＡをＢＡＰベ
クターのＸbaＩ部位に挿入した．ＢＡＰベクター中にお
けるＴＳＰＩ遺伝子の正しい方向はＤＮＡ配列決定によ
って確認した．

【００６０】Ｂ．ＴＳＰｆベクターＴＳＰｆベクターは，２個の抗- 血管新生ドメイン（ヌ
クレオチド 992-1650)（Tolsmaら, 前出）ならびに開始
コドンおよび停止コドンを有するＴＳＰＩ遺伝子のＤＮ
Ａフラグメントを含有するベクターである．このＤＮＡ
フラグメントは鋳型としてトロンボスポンジンＩｃＤＮ
Ａ，ならびに以下のプライマー 5'-TAGGTCTAGA ATG ACTGAAGAGAACAAAGAG-3' （配列番号：32）および 5'-ATGGTCTAGA TTA GAGACGACTACGTTTCTG-3' （配列番号：33）を用いるＰＣＲによってＴＳＰＩ遺伝子のヌクレオチド
1013-1650を増幅して製造した．いずれのプライマーも
ＸbaＩ部位（下線）を含有し，第１のプライマーはＡＴ
Ｇ開始コドン（太字）を含有し，第２のプライマーはＴ
ＴＡ停止コドン（逆方向，太字）を含有する．得られた
ＴＳＰＩ遺伝子の 638塩基対フラグメント（以下ＴＳＰ
ｆ）は血管新生インヒビターとして知られたペプチド
（Tolsmaら, 前出）をコードする．増幅後，ＤＮＡフラ
グメントを精製し，ＸbaＩで消化し，消化したフラグメ
ントをＢＡＰベクターのＸbaＩ部位に，ＴＳＰｆ遺伝子
の発現がβ- アクチンプロモーターによって制御される
ように（Ray ら, 前出；Lesoon-Wood ら, Human GeneTh
er. 6: 395-405, 1995）挿入した．ＢＡＰベクター中に
おけるフラグメントの正しい方向をＢamＨＩで消化して
証明し，ＤＮＡ配列決定により確認した．

【００６１】Ｃ．ｐ53ベクターｐ53遺伝子のコード配列をＸbaＩによってプラスミドｐ
1 ＳＶhp53c62 （Zakut-Houri ら, EMBO J. 4: 1251-12
55, 1985）から切断し，これを，ｐＧＥＭ32ベクター
（Promega, Madison, WI）の多重クローニング部位に挿
入した．得られたベクターをＳalＩおよびＢamＨＩで消
化して 1900 bpフラグメントを発生させ，これをついで
ＢＡＰベクターのＳalＩおよびＢamＨＩ部位に，ｐ53遺
伝子の発現がβ- アクチンプロモーターにより制御され
るように挿入した．ＢＡＰベクター中におけるｐ53遺伝
子の正しい方向はＤＮＡ配列決定によって確認した．

【００６２】Ｄ．ラミニンペプチドベクターは，以下の
２つのオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングするこ
とによって調製された． 5'-CTATCGTCGACATGTATATTGGTTCTCGTTAAGTCGACCTATC-3' （配列番号：38） 5'-GATAGGTCGACTTAACGAGAACCAATATACATGTCGACGATAG-3' （配列番号：39）これらはラミニンからの抗- 血管新生フラグメント，開
始および停止コドン，ならびにＸbaＩ制限部位を含有す
る．アニーリングしたオリゴヌクレオチドを，ついでＸ
baＩで消化し，ＢＡＰベクターのＸbaＩ部位に挿入し
た．プラスミドは配列を決定して正しい方向性を確証し
た．

【００６３】Ｅ．アンギオスタチンベクターは，プラス
ミノーゲンｃＤＮＡのアンギオスタチンをコードする配
列を，以下のプライマーを用いて増幅することによって
調製された． 5'-AGTATCTAGAATGAGTGTATCTGTCACAATG-3' （配列番号：40） 5'-GAATTCTAGATCACCTATGAGGGGTTTGCTC-3' （配列番号：41）遺伝子操作によって調製されたＡＴＧ開始部位ならびに
ＴＡＡ停止部位を含有する得られた増幅フラグメント
を，ＸbaＩで消化し，精製し，ＢＡＰベクターのＸbaＩ
部位に挿入した．プラスミドの配列を決定し正しい方向
性を確認した．

【００６４】Ｆ．ラミニンペプチドコンカテマーベクタ
ーはまず，以下の２つのオリゴヌクレオチドをアニーリ
ングして調製した． 5'-CTATCGTCGACATGTATATTGGTTCTCGTAAAAGATATATTGGTTCTCGTGGTAAAAGAGATATT GGTTCTCGTGGTAAAAGATAAGTOGACCTATC-3'（配列番号：41） 5'-GATAGGTCGACTTAT-3' （配列番号：43）前者のオリゴヌクレオチドはラミニンからの抗- 血管新
生フラグメントの４回リピート，開始および停止コド
ン，ならびにＸbaＩ制限部位を含有する．アニーリング
したオリゴヌクレオチドをＰＦＵ（Stratagene）で伸長
し，ＳalＩで消化し，ＢＡＰベクターのＳalＩ部位に挿
入した．プラスミドを配列決定して正しい方向を確認し
た．

【００６５】カチオニックリポソーム：ＤＮＡ複合体の
調製ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥリポソーム混合物は，インビトロ
において内皮細胞を効率的にトランスフェクトすること
が知られている（Tilkins ら, Focus, 16: 117-119, 19
94）．したがってリポソーム：ＤＮＡ複合体を，Debs
ら, J.Biol.Chem.265: 10189-10192, 1990)の記載にほ
ぼ従い，ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥを 1:1の比で用いて調製
した．同様のリポソームプレパレーションは，ＤＯＰＥ
を他のカチオニック脂質，たとえば 1,2- ジオレオイル
-sn-グリセロ-3- エチルホスホコリン，および 1,2- ジ
ミリストイル-sn-グリセロ-3- エチルホスホコリンと
1:1の比で混合して調製することができる．

【００６６】さらに詳しくは，ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰ
Ｅの 400 nmol の混合物を，ロータリーエバポレーター
上で一夜乾燥した．ついで，脂質を 1.5 ml の水で２時
間再水和した．次に，ミルク状のリポソームプレパレー
ションをバスソニケーターにより澄明になるまで超音波
処理した．得られたリポソームプレパレーションを，つ
いで，LipsoFast-Basic 押出機（Avestin, Ottawa, On)
を用い，50 nm ポリカルボネートフィルターを15〜20回
通過させた．

【００６７】ＤＮＡ（以下の実施例参照）は，最大の Q
iagen キット（Qiagen Inc., Chatsworth, Ca)によって
調製し，70％（v/v)エタノール中で２回洗浄した．つい
でＤＮＡを，蒸留水で洗浄するかまたは水に対して24時
間透析して，残留する塩を除去した．

【００６８】リポソームプレパレーション約 400 pmol
を，エッペンドルフ管中において，10〜35μg の総ＤＮ
Ａと穏やかに混合した．各エッペンドルフ管中のこの量
は，２回の注射に十分であった．同量のＤＮＡを単一処
置基準として併用療法で注射した．たとえば，16μg の
ＤＮＡを，併用療法（8.0 μg のｐ53および 8.0μgの
ＴＳＰｆ）として１群の各マウスに注射し，第２群のマ
ウスにはついで 16 μg のｐ53を注射した．

【００６９】実施例１担体：ＤＮＡ複合体の抗- 血管新生作用はｐ53欠損ＭＤ
Ａ- ＭＢ-435乳癌腫瘍を有するマウス（American Type
Tissue Culture, Bethesda, MD）において評価した．

【００７０】さらに詳しくは，126 匹の無胸腺ヌードマ
ウス（NCI)に麻酔薬メトファンを投与したのち，2.0 ×
10⁵のＭＤＡ- ＭＤ-435腫瘍細胞を，ステッパー（Trid
ak）および 27.5 g の針を用いてマウスの乳房の脂肪パ
ットに注入した．２週後，腫瘍が増殖したマウスを，様
々な処置基準に分割し各処置基準あたり18匹とした．処
置基準は：（１）非処置，（２）空のＢＡＰベクター，
（３）ＴＳＰＩベクター単独，（４）ＴＳＰｆベクター
単独，（５）ｐ53ベクター単独，（６）ｐ53ベクター＋
ＴＳＰＩベクター，および（７）ｐ53ベクター＋ＴＳＰ
ｆベクターとした．マウスに悪性細胞を移植後14日に第
１の注射，マウスに悪性細胞を移植後24日に第２の注射
の，２回静脈内注射を行った．第１の注射は，総ＤＮＡ
16 μgと複合体化したリポソーム 200 pmol とした．
第２の注射は総ＤＮＡ 12.0 μgと複合体化したリポソ
ーム 200 pmol とした．腫瘍のサイズは第２の注射後７
日に測定した．結果は以下の表１に示す．

【表１】ＴＳＰＩおよびＴＳＰｆの抗- 腫瘍効果候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）非処置 113.5＋ 6.41 ＢＡＰ 102.9＋ 6.83 ＴＳＰＩ 103.2＋ 8.96 ＴＳＰｆ 89.4＋11.06 ｐ53 80.1＋12.7^* ｐ53＋ＴＳＰＩ 82.9＋ 6.95 ^* ｐ53＋ＴＳＰｆ 53.2＋ 8.37 ^** ^* ｐ53またはｐ53＋ＴＳＰＩ vs 非処置，ｐ＜0.05 ^**ｐ53＋ＴＳＰｆ vs 非処置またはＢＡＰ，ｐ＜0.01

【００７１】表１に示すように，ｐ53処置群は２回の注
射後，非処置群とは統計学的に異なることが見出された
（ｐ＜0.05）．しかしながら，ｐ53処置群では，空のＢ
ＡＰベクター群とは統計学的に差がなかった．これは，
５回の注射まで空のＢＡＰベクター群と統計学的に差が
なかった Lesoon-Woodら, Human Gene Ther. 6: 395-40
6, 1995 の報告した結果と類似した．

【００７２】しかしながら，ｐ53をＴＳＰｆと組合わせ
ると，ｐ53単独の場合より効率的に腫瘍が減退した．こ
の併用療法での２回注射直後にはｐ53単独の場合に比較
して腫瘍の増殖にさらに35％の減少が認められた．併用
群は非処置および空のＢＡＰベクター群の両者と有意に
異なっていた（ｐ＜0.01）．ＴＳＰｆのみではｐ53より
効果がわずかに劣るが，ＴＳＰｆは予期に反してＴＳＰ
Ｉよりも実質的に有効であった．実際，完全長ＴＳＰＩ
- 処置群は，空のＢＡＰまたは非処置群のいずれよりも
効果が低かった．これは幾つかの理由により，すなわ
ち，１）トロンボスポンジンＩは，完全長でもフラグメ
ントでも，抗- 血管新生ペプチドを含有した，および
２）以前のエキソビボ実験において（Weinstat-Saalow
ら, 前出）完全長トロンボスポンジンＩが腫瘍の増殖の
阻害に有効であったことから予期し得なかった．

【００７３】実施例２第２の実験は，ｐ53とＴＳＰｆの併用療法が低用量で有
効であるかどうかを決定し，ｐ53とＴＳＰｆの組合わせ
がｐ53単独よりも有意に腫瘍サイズを低下させることを
確認するために実施した．

【００７４】さらに詳しくは，36匹のマウスに 2.0×10
⁵のＭＤＡ- ＭＤ-435腫瘍細胞を乳房の脂肪パットに注
入した．２週後，腫瘍が増殖したマウスを様々な処置基
準に分割し各処置基準あたり12匹とした．処置基準は：
（１）空のＢＡＰベクター，（２）ｐ53ベクター単独，
および（３）ｐ53ベクター＋ＴＳＰｆベクターとした．
マウスに総ＤＮＡ 8.0μg と複合体化したリポソーム 2
00 pmol を静脈内投与した．ついで次の４回の注射で
は，マウスを総ＤＮＡ 12 μg と複合体化したリポソー
ム 200 pmol で同様に処置した．各注射の間隔には10日
間とした．腫瘍サイズは各注射の前および最後の注射後
７日に測定した．結果は以下の表２に示す．

【表２】ｐ53およびＴＳＰｆの抗- 腫瘍効果候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）ＢＡＰ 855±345 ｐ53 616±142 ｐ53＋ＴＳＰｆ 265±133 ^* ^* ｐ53＋ＴＳＰｆ vs ＢＡＰ，ｐ＜0.02

【００７５】上記表２に示すように，ｐ53とＴＳＰｆの
併用療法はＢＡＰとは統計学的に異なり，一方，ｐ53単
独処置には差がなかった．この実験では，ｐ53とＴＳＰ
ｆがｐ53単独よりも有効であることが確認された．さら
に，表１における実験で使用された総ＤＮＡ 16 μg の
最初のブースター用量がない異なる投与基準は，併用処
置とｐ53単独処置の間の差を強調した．

【００７６】実施例３実施例２の実験を，リポソームに複合体化したＢＡＰ-
ＴＳＰｆが，移植された腫瘍の増殖を効果的に阻害する
ことを確認するために反復した．リポソーム：ＤＮＡ複
合体の注射を５回，１）ＢＡＰ，２）ＴＳＰＦ，または
３）ｐ53の３群に静脈内投与した．結果は以下の表３に
示す．

【表３】ＴＳＰｆの抗- 腫瘍効果候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）ＢＡＰ 619±65 ＴＳＰｆ 386±35^* ｐ53 419±26^* ^* ＴＳＰｆ vs ＢＡＰ，ｐ＜0.05 ｐ53 vs ＢＡＰ，ｐ＜0.05 14.5μg の用量での５回の静脈内注射後，ＴＳＰｆ処置
群はＢＡＰ群と統計学的に差を示した．

【００７７】実施例４アンギオスタチンおよびラミニンの抗- 血管新生ペプチ
ドフラグメントをコードするＤＮＡを運搬する担体の有
効性を検討する実験を実施した．実施例２に記載のよう
にＭＤＡ- ＭＤ-435腫瘍細胞を注射した 126匹のマウス
を，（１）ＢＡＰベクター，（２）ＴＳＰｆベクター単
独，（３）ラミニンペプチドベクター単独，および
（４）アンギオスタチンベクター単独で処置した．マウ
スには４回の注射を行い，第１の注射はマウスへの悪性
細胞の移植後10日に，以後の注射は10日間の間隔を置い
て実施した．注射は総ＤＮＡ 12.5 μg と複合体化した
リポソーム 200 pmol とした．結果は以下の表４に示
す．

【表４】候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）ＢＡＰ 194.7±11.9 ＴＳＰｆ 135.9±11.9^* ラミニンペプチド 126.4± 8.4^* アンギオスタチン 95.2± 6.3^*,** ^* ＴＳＰ，ラミニンペプチド，およびアンギオスタチン vs ＢＡＰ，ｐ＜0.05 ^**アンギオスタチン vs ＢＡＰ，ｐ＜0.01 上記表４に示すように，抗- 血管新生ペプチド（ＴＳＰ
ｆ，ラミニンペプチドおよびアンギオスタチン）をコー
ドするＤＮＡを含有するカチオニックリポソームは腫瘍
の増殖を有意に阻害した．

【００７８】実施例５２つの正常ｐ35対立遺伝子を有する乳癌細胞系であるＭ
ＣＦ７細胞（AmericanTissue Culture, Bethesda, MD）
を，マウスに 4.0×10⁶細胞を注射し，第３の注射には
ＤＮＡ 12 μg を含有させた以外は上述の場合と同様に
して評価した．各注射の間には10日間の間隔を置いた．
９匹のマウスに以下の処置のいずれか：（１）非処置
（動物数８匹），（２）ＢＡＰ，（３）ｐ53，および
（４）ｐ53＋ＴＳＰで処置した．結果は以下の表５に示
す．

【表５】ＭＣＦ７細胞におけるｐ53およびＴＳＰの効果候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）非処置 124.6± 7.3 ＢＡＰ 136 ±16.8 ｐ53 83.1±13.6^* ｐ53＋ＴＳＰｆ 69.0±13 ^** ^* ｐ53 vs 非処置またはＢＡＰ，ｐ＜0.05 ^**ｐ53＋ＴＳＰｆ vs 非処置またはＢＡＰ，ｐ＜0.01 上記表５に示したように，ＭＣＦ７に対して最も有効な
治療は，ｐ53ならびにＴＳＰＩであった．ｐ53とＴＳＰ
ｆを非処置またはＢＡＰ群に対して比較した場合，ｐ53
＋ＴＳＰｆ療法の有意レベルはｐ53単独よりも大きかっ
た．上記実験はｐ53とＴＳＰｆが，ｐ53処置または非処
置群よりもＭＣＦ７腫瘍を大きく低下させることを確認
した．

【００７９】実施例６ 4 ×10⁵ＭＣＦ７細胞を28匹のヌードマウスの乳房脂肪
パッドに両側性に注射した．増殖２週後，これらのマウ
スを無作為に４つの群：１）空のベクタ−，２）ｐ53，
３）ｐ53＋ＴＳＰｆ，および４）非処置に分割した．マ
ウスには，14μg のＤＮＡと複合体化したリポソーム 2
00 pmol を１回注射し，処置後10日に各処置群からの腫
瘍を測定した．結果は以下の表６に示す．

【表６】候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）空のベクター 54.7±4.0 ｐ53 45.5±5.0 ｐ53＋ＴＳＰｆ 33.9±3.6 ^* 非処置 61.9±8.3 ^* ｐ53＋ＴＳＰｆ vs 非処置，ｐ＜0.025 表６と前表に示したように，ｐ53単独の使用と比較し
て，ｐ53およびＴＳＰｆを組合わせて使用することによ
る腫瘍の更なる低下は，ＴＳＰｆとｐ53が異なる作用機
構を有することを示唆している．この用量はｐ53の標的
が腫瘍の血管系であることを排除するものではないが，
ｐ53による腫瘍の阻害機構は現時点では明らかではな
い．しかしながら，ｐ53および／またはトロンボスポン
ジンＩによる腫瘍の阻害機構は，腫瘍の低いトランスフ
ェクション効率を説明するものでなければならない．ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼマーカ
ーに複合体化したリポソームを用いて，ＭＤＡ- ＭＤ-4
35細胞に由来する腫瘍の５％未満がマーカー遺伝子によ
りトランスフェクトされたことが証明され，この場合も
同様のトランスフェクション効率を仮定すると，極めて
低レベルのトランスフェクションにもかかわらず，これ
らの好ましい結果が観察されたことになる．

【００８０】実施例７さらに他の実験では，ラミニンペプチドをコードするＤ
ＮＡに複合体化したリポソームが，腫瘍の増殖を阻害で
きることが明らかにされた．さらに詳しくは，24匹の雌
性無胸腺ヌードマウスに麻酔薬メトファンを投与したの
ち，3.0 ×10⁵のＭＤＡ- ＭＢ-435腫瘍細胞を，ステッ
パーおよび 27.5 g の針を用いてマウスの乳房の脂肪パ
ットに注射した．２週後，腫瘍が増殖したマウスを様々
な処置基準に分割し，各処置基準あたり８匹とした．処
置基準は：（１）ＢＡＰ，（２）ラミニン，および
（３）ｐ53＋ラミニンとした．マウスには総ＤＮＡ 12.
5 μg，組合わせを用いる場合は各ベクター 6.25 μg
と複合体化したリポソーム 200pmol を静脈内に注射し
た．マウスにはついで，10日間の間隔をおいて３回注射
を行った．腫瘍は各注射時および最後の注射時に測定し
た．結果は以下の表７に示す．

【表７】候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）ＢＡＰ 345±23.5 ラミニンペプチド 280±32.4 ラミニンペプチド＋ｐ53 192±10.5^* ^*ＢＡＰ vs ラミニン＋ｐ53，ｐ＜0.05 上記表７に示したように，ラミニンペプチド＋ｐ53をコ
ードするＤＮＡの組合わせを含有するカチオニックリポ
ソームは，その抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮ
Ａを単独で使用した場合よりも腫瘍の増殖を効率的に低
下させた．すなわち腫瘍抑制遺伝子，ｐ53は抗- 血管新
生ペプチドの抗腫瘍作用を増大させる．

【００８１】実施例８静脈内注射が好ましいが，リポソーム：ＤＮＡ複合体の
投与方法には限定はない．腫瘍内注射が効果的であるこ
とも証明されている．腫瘍内注射に関連した実験では，
18匹のマウスに 3×10⁵のＣ６グリオーマ細胞（ラット
脳腫瘍）を皮下に注射した．注射後６日に，マウスを，
１）ＢＡＰ，２）ＦＬＫ- ＤＮ（ドミナントネガティブ
受容体）および３）アンギオスタチンの３群に分割し
た．第２の腫瘍内注射後には，アンギオスタチンとＢＡ
Ｐ群の間に，統計学的な差が生じた（図１参照）．すな
わち，本発明の治療は，複合体を腫瘍内に投与した場合
にも有効である．この治療は乳癌以外の腫瘍に対しても
有効である．

【００８２】実施例９リポソーム：分泌アンギオスタチン構築体が非分泌類縁
体よりも有効であることも見出された．この実験では，
24匹のヌードマウスに 3×10⁵のＭＤＡ- ＭＢ-435細胞
を注射した．２週後に，マウスを３群に分けて，以下の
治療を静脈内に実施した．１）リポソーム：ＢＡＰ，
２）リポソーム：分泌アンギオスタチン，および３）リ
ポソーム：アンギオスタチンである．マウスに注射した
ＤＮＡの濃度は 14.5 μg とした．マウスにリポソー
ム：ＤＮＡ複合体を１回注射し，それらの腫瘍を注射10
日後に測定した．

【表８】分泌アンギオスタチンの効果候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）アンギオスタチン 28.8±2.2 分泌アンギオスタチン 18.6±1.8 ^* ＢＡＰ 30.5±3.3 ^*ｐ＜0.05，ＢＡＰ vs 分泌アンギオスタチン表８に示したように，分泌アンギオスタチン処置群は，
腫瘍のサイズの低下にベクター対照またはアンギオスタ
チン処置群よりも有効であった．この実験から抗- 血管
新生インヒビターの 5' 部分に挿入された分泌配列はそ
の効果を増大させ得ることが明らかである．

【００８３】実施例10 さらに他の実験では，カチオニックポリマーが本治療に
おける担体として使用できることおよびある条件下に担
体の選択が可能であることが指示される．以下の実施例
では，内皮細胞をＣＡＴマーカーによりインビトロにお
いてトランスフェクトするための担体として，カチオニ
ックポリマー（Superfect)を，カチオニックリポソーム
と比較した．ポリマーとの比較に用いたカチオニックリ
ポソームは，インビトロでスクリーニングした14種の脂
質中で最善の結果を与えたＤＯＳＰＥＲ（Boerhinger）
とした．この実験では６ウエルプレートの各ウエルに 1
×10⁶Huvec 細胞を配置した．2 μg のＤＮＡと複合体
化した Superfect 25 μl を，細胞の初期接種から24時
間後に各プレートに添加し，カチオニックリポソームと
複合体化したＤＮＡ 2μg を添加したプレートと比較し
た．トランスフェクション後36時間に，細胞を溶解させ
てＣＡＴタンパク質の量をアッセイした．結果は表９に
示す．

【表９】ベクター活性（ＤＰＭ/ タンパク質）ＢＡＰとカチオニックリポソーム 31.1± 7.2 ＣＡＴとカチオニックリポソーム 682 ±129 ＢＡＰと Superfect 21.4± 0.458 ＣＡＴと Superfect 10816 ±687 ^* ^*ｐ＜0.01，Superfect vsカチオニックリポソーム- ＣＡＴこの実験は，内皮細胞のトランスフェクションにはカチ
オニックポリマーの方が優れていることを示唆し，本発
明者らは腫瘍の内皮細胞が治療用遺伝子の一次標的であ
ると仮定していることから，これは重要である．同様
に，一部の細胞系においては，Superfect はカチオニッ
クリポソームよりもインビボにおいては優れたトランス
フェクション剤であることが見出された．

【００８４】実施例11 Superfect がインビトロでの内皮細胞のトランスフェク
ションにおいてカチオニックリポソームよりも優れてい
ると思われたことから，治療用遺伝子に複合体化された
Superfectが相当するリポソーム複合体に比し，腫瘍の
増殖をより有効に阻害するかどうかを検討した．この実
験は他の細胞ではなく，内皮細胞がこれらのカチオニッ
クビヒクル：ＤＮＡ複合体の一次標的であるという仮定
に基づいている．この実験では，６匹のマウスの乳房の
脂肪パッドに，2.5 ×10⁵のＭＤＡ細胞を両側性に注射
した．これらの腫瘍は２カ月間大きなサイズにまで増殖
させた．このサイズでは，腫瘍の増殖は指数関数的速度
で急速に上昇し，小さな腫瘍に比べて処置に抵抗性を示
す．マウスは，尾静脈からカチオニックリポソーム：Ｂ
ＡＰ- ｐ53/ ＣＭＶ- ＴＡＰｆまたは Superfect：ＢＡ
Ｐ- ｐ53/ ＣＭＶ-ＴＡＰｆのいずれかで静脈内処置し
た．9.5 μg のＤＮＡを Superfect（108 μg ）または
カチオニックリポソーム（200 pmol）に複合体化した．
マウスにはこれらの治療用量を１回のみ投与し，10日後
に腫瘍を測定した．マウスはいずれの治療にも耐容性を
示し，見掛けの毒性は認められなかった．結果は以下の
表に示す．

【表１０】リポソーム Superfect 処置前 380±95^* 384±86 処置後 525±80 403±72 ^*腫瘍サイズ（mm³） Superfect はこれらの大きな腫瘍において１回用量の投
与後でもリポソーム担体より優れているように思われ
る．Superfect-処置群にはわずかな増大（５％）を示し
たのみであったが，リポソーム- 処置群では著しい増大
（38％）が認められた．個々の腫瘍の増殖を調べて処置
前の測定値と比較すると，リポソーム- 処置群における
６つの腫瘍すべてにおいてそれらのサイズは増大した．
これに反しSuperfect 群の６例の腫瘍中４例では，処置
前の測定値に比較してそれらのサイズの減少を示した．

【００８５】実施例12 この実験は抗- 血管新生ペプチドをコードするコンカテ
マーＤＮＡを用い実施した．ＭＤＡ- ＭＤ-435腫瘍細胞
を注射したマウスを，以下のように処置した．（１）ＢＡＰベクター，（２）ラミニンペプチドコンカ
テマー単独および（３）ラミニンペプチベクタ−単独．
マウスには，２回注射を行い，第１の注射はマウスへの
悪性細胞の移植後10日に，第２の注射はさらに10日後に
行った．注射は，ベクターＤＮＡ 12.5 μg で複合体化
したリポソーム 200 pmol とした．結果は以下の表11に
示す．

【表１１】候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）ＢＡＰ 86.8±12.0 ラミニンペプチドコンカテマー 63.9± 4.8 ラミニンペプチド 53.7± 3.0^* ^*ラミニンペプチド vs ＢＡＰ，ｐ＜0.05 表11に示したように，ラミニンコンカテマーまたはラミ
ニンペプチドをコードするＤＮＡを含有する複合体は，
対照（ＢＡＰベクター）に比較して腫瘍の増殖を低下さ
せた．

【００８６】実施例13 抗- 血管新生ペプチドをコードするＤＮＡの組合わせを
用いて有効性を評価するため，ＭＤＡ- ＭＢ-435腫瘍細
胞を注射したマウスに以下の処置を実施した．（１）ＢＡＰベクター，（２）ＴＳＰｆベクター＋アン
ギオスタチンベクター，（３）ラミニンペプチドベクタ
ー＋ＴＳＰｆベクター，（４）ラミニンペプチドベクタ
ー＋アンギオスタチンベクター，ならびに（５）ラミニ
ンペプチドおよびＦｌＫ- ＤＮ受容体．マウスには５回
静脈内注射を行い，第１の注射はマウスへの悪性細胞の
移植後10日に，以後の注射はさらに10日の間隔をおいて
実施した．注射は，総ベクターＤＮＡ 12.5 μg で複合
体化したリポソーム 200 pmol とし，組合わせを用いる
場合は各ベクター 6.25 μg とした．結果は以下の表12
に示す．

【表１２】候補抗- 腫瘍ＤＮＡ腫瘍サイズ（mm³）ＢＡＰ 626±78 ＴＳＰｆ＋アンギオスタチン 296±40^* ラミニンペプチド＋ＴＳＰｆ 461±54^* ラミニンペプチド＋アンギオスタチン 483±46 ラミニンペプチドとＦｌＫ- ＤＮ 482±21 ^*ＴＳＰｆ＋アンギオスタチン vs ＢＡＰ，ｐ＜0.01 表12に示したように，抗- 血管新生ペプチドをコードす
るＤＮＡの組合わせを含有するカチオニックリポソーム
は腫瘍の増殖に好ましい阻害を示した．

【００８７】実施例14 ｐ53/ ＴＳＰｆに複合体化したポリマーは腫瘍の増殖を
顕著に阻害する腫瘍の有糸分裂内皮細胞が非ウイルスト
ランスフェクションの標的であることから，様々な担体
を評価するインビトロアッセイはインビボにおける腫瘍
の阻害を予測するのに有用である．数種のトランスフェ
クション剤のスクリーニングののちに，インビトロアッ
セイにおいて，カチオニックポリマー，Superfect は内
皮細胞に効率的にトランスフェクトすることが見出され
た．これらのインビトロ実験では，Superfect （ＳＦ）
がインビボモデルにおいてリポソームに匹敵することが
示唆された．担癌マウスにおいて，担体，Superfect
は，治療用遺伝子とカップリングさせた場合（ＳＦ：Ｂ
ＡＰ- ｐ53/ ＢＡＰ- ＴＳＰｆ），リポソームの場合
（Ｌip：ＢＡＰ- ｐ53/ ＢＡＰ- ＴＳＰｆ）よりも優れ
た抗腫瘍活性を示した（図３）．

【００８８】さらに，ＳＦ- ＢＡＰは，Ｌip：ＢＡＰと
比較した場合，非特異的作用が極めて小さい（図３）．
非特異的作用は治療用遺伝子を含まないベクターと複合
体化したリポソームの抗腫瘍作用と定義される．Superf
ect におけるこの非特異的作用の欠如はリポソームの評
価を容易にする．しかしながら，Superfect のインビボ
における毒性についてはほとんど分かっていない．Supe
rfect に反して，リポソームは治療用遺伝子の評価を遮
蔽する非特異的作用を発揮することができる．リポソー
ムの非特異的作用はリポソームの脂質濃度の50％までを
占めるＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノー
ルアミン）によるものである．ＤＯＰＥをＤＰＰＣ（ジ
パルミトイルホスファチジルコリン）に置換することに
よって，この非特異的作用の量を低下させることが可能
である．たとえば，リポソーム混合物中のＤＯＰＥをＤ
ＰＰＣで置換すると，マクロファージの毒性は極めて低
くなる．

【００８９】Superfect は，プレリソソーム小胞の酸性
ｐＨを緩衝できるカチオニック担体のクラスに属する分
岐状カチオニックポリマーである．Superfect および他
の類似の担体（すなわち，ポリエチレンイミン）の緩衝
能力はＤＮＡを分解から保護し，これによって高いトラ
ンスフェクション効率を生じる．

【００９０】Superfect のこの特徴に基づいて，緩衝能
力を有し，代謝可能なカチオニック担体が開発された．
たとえば，緩衝能力をもつ脂質を含有するカチオニック
リポソームは，インビトロおよびインビボの両者でＤＮ
Ａのトランスフェクション効率を有意に上昇させること
ができる．以前には，カチオニックリポソームは天然の
脂質を構成する脂質成分，コレステロールまたはＤＯＰ
Ｅが50％でなければならないと考えられていた．インビ
トロにおけるトランスフェクションはこれらの天然の脂
質の存在に依存するが，インビボにおけるトランスフェ
クションはそうではない．この発見は，脂質の少なくと
も一部を，天然の脂質に代えて緩衝能力をもつ脂質に置
換することを可能にし，腫瘍容器のインビボトランスフ
ェクションをさらに改良する可能性を提供する．一般的
に使用される滴定可能な脂質は，6.7 のｐＫａをもつ
1,2- ジアシル-3- ジメチルアンモニウムプロパン（Ｄ
ＡＰ）である（Avanti）．すなわち，一部ＤＡＰで構成
されるリポソームは，リポソームが酸性のプレリソソー
ム小胞内に入った場合に緩衝能力を提供するものと思わ
れる．このリポソームは腫瘍の内皮細胞のトランスフェ
クションに有用な可能性がある．また，ヒスチジンおよ
びリジンアミノ酸からなる直鎖状または分岐状のコポリ
マーは，生理的ｐＨにおいて陽性に荷電しているので，
分解可能なＤＮＡに結合する．このポリマーの利点は，
ペプチド結合からなることから，分解性であることであ
る．これらの担体のトランスフェクション効率は，腫瘍
の血管形成を標的とするよりも広い適用を有することが
考えられる．

【００９１】実施例15 ＣＭＶプロモーターはインビトロの遺伝子発現を増大さ
せる様々なプロモーターが，インビトロにおいて，内皮
細胞中でルシフェラーゼを発現する能力が調べられてい
る．表13には，ＣＭＶプロモーターが，β- アクチンプ
ロモーターに比較して，ルシフェラーゼを25倍も強力に
発現することの予備的データを示す．

【表１３】処置群インビトロルシフェラーゼ活性（RLU/mg タンパク質）対照 0 ＢＡＰ- ルシフェラーゼ 91±15.5 ＣＭＶ- ルシフェラーゼ 2670±583 ^* ^*ｐ＜0.01，ＣＭＶプロモーター vs ＢＡＰプロモーター様々なプロモーターが，本治療の効果を上昇させ，マー
カー（ルシフェラーゼを含む）の検出能力を上昇させ，
治療用遺伝子の抗腫瘍活性を増大させ，それらは本発明
の範囲内に包含される．

【００９２】以上，本発明を，その特定の実施態様を参
照しながら詳細に説明したが，本技術分野の通常の熟練
者には自明のように，本発明の精神および範囲から逸脱
することなく，様々な改変および修飾が可能である．本
明細書に引用された文献は，本発明の実施に関係する範
囲において引用により本明細書に導入される．

【００９３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：218 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列： Met Thr Glu Glu Asn Lys Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg Arg Pro Pro 1 5 10 15 Leu Cys Tyr His Asn Gly Val Gln Tyr Arg Asn Asn Glu Glu Trp Thr 20 25 30 Val Asp Ser Cys Thr Glu Cys His Cys Gln Asn Ser Val Thr Ile Cys 35 40 45 Lys Lys Val Ser Cys Pro Ile Met Pro Cys Ser Asn Ala Thr Val Pro 50 55 60 Asp Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Trp Pro Ser Asp Ser Ala Asp Asp 65 70 75 80 Gly Trp Ser Pro Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser Cys Gly 85 90 95 Asn Gly Ile Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn Asn Arg 100 105 110 Cys Glu Gly Ser Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln Glu Cys 115 120 125 Asp Lys Arg Phe Lys Gln Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp 130 135 140 Ser Ser Cys Ser Val Thr Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Thr 145 150 155 160 Asn Leu Cys Ser Pro Ser Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly 165 170 175 Arg Glu Ala Glu Thr Lys Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Ile Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Gly Pro Trp Ser Pro Trp Asp Ile Cys Ser Val Thr Cys 195 200 205 Gly Gly Gly Val Gln Lys Arg Ser Arg Leu 210 215 配列番号：２配列の長さ：657 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： ATGACTGAAG AGAACAAAGA GTTGGCCAAT GAGCTGAGGC GGCCTCCCCT ATGCTATCAC 60 AACGGAGTTC AGTACAGAAA TAACGAGGAA TGGACTGTTG ATAGCTGCAC TGAGTGTCAC 120 TGTCAGAACT CAGTTACCAT CTGCAAAAAG GTGTCCTGCC CCATCATGCC CTGCTCCAAT 180 GCCACAGTTC CTGATGGAGA ATGCTGTCCT CGCTGTTGGC CCAGCGACTC TGCGGACGAT 240 GGCTGGTCTC CATGGTCCGA GTGGACCTCC TGTTCTACGA GCTGTGGCAA TGGAATTCAG 300 CAGCGCGGCC GCTCCTGCGA TAGCCTCAAC AACCGATGTG AGGGCTCCTC GGTCCAGACA 360 CGGACCTGCC ACATTCAGGA GTGTGACAAA AGATTTAAAC AGGATGGTGG CTGGAGCCAC 420 TGGTCCCCGT GGTCATCTTG TTCTGTGACA TGTGGTGATG GTGTGATCAC AAGGATCCGG 480 CTCTGCAACT CTCCCAGCCC CCAGATGAAT GGGAAACCCT GTGAAGGCGA AGCGCGGGAG 540 ACCAAAGCCT GCAAGAAAGA CGCCTGCCCC ATCAATGGAG GCTGGGGTCC TTGGTCACCA 600 TGGGACATCT GTTCTGTCAC CTGTGGAGGA GGGGTACAGA AACGTAGTCG TCTCTAA 656 配列番号：３配列の長さ：414 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列： Met Thr Glu Glu Asn Lys Glu Leu Ala Asn Glu Leu Arg Arg Pro Pro 1 5 10 15 Leu Cys Tyr His Asn Gly Val Gln Tyr Arg Asn Asn Glu Glu Trp Thr 20 25 30 Asp Val Ser Cys Thr Glu Cys His Cys Gln Asn Ser Val Thr Ile Cys 35 40 45 Lys Lys Val Ser Cys Pro Ile Met Pro Cys Ser Asn Ala Thr Val Pro 50 55 60 Asp Gly Glu Cys Cys Pro Arg Cys Trp Pro Ser Asp Ser Ala Asp Asp 65 70 75 80 Trp Gly Ser Pro Trp Ser Glu Trp Thr Ser Cys Ser Thr Ser Cys Gly 85 90 95 Gly Asn Ile Gln Gln Arg Gly Arg Ser Cys Asp Ser Leu Asn Asn Arg 100 105 110 Cys Glu Gly Ser Ser Val Gln Thr Arg Thr Cys His Ile Gln Glu Cys 115 120 125 Asp Lys Arg Phe Lys Gln Asp Gly Gly Trp Ser His Trp Ser Pro Trp 130 135 140 Ser Ser Cys Ser Val Thr Cys Gly Asp Gly Val Ile Thr Arg Ile Thr 145 150 155 160 Leu Cys Asn Ser Pro Ser Pro Gln Met Asn Gly Lys Pro Cys Glu Gly 165 170 175 Glu Ala Arg Glu Thr Lys Ala Cys Lys Lys Asp Ala Cys Pro Ile Asn 180 185 190 Gly Gly Trp Gly Pro Trp Ser Pro Trp Asp Ile Cys Ser Val Thr Cys 195 200 205 Gly Gly Gly Val Gln Lys Arg Ser Arg Leu Cys Val Asp Ser Arg Met 210 215 220 Thr Glu Glu Asn Lys Glu Leu Ala 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Asp Ile 100 105 110 Ala Ser Thr Val Tyr Val Tyr Val Arg Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile 115 120 125 Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Ile Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys 130 135 140 Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn 145 150 155 160 Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly 165 170 175 Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr 180 185 190 Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp 195 200 205 Glu Thr Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg 210 215 220 Ile Tyr Asp Val Ile Leu Ser Pro Pro His Glu Ile Glu Leu Ser Ala 225 230 235 240 Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val 245 250 255 Gly Leu Asp Phe Thr Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys 260 265 270 Lys Ile Val Asn Arg Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys 275 280 285 Met Phe Lys Ser Thr Leu Thr Ile Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gln 290 295 300 Gly Glu Tyr Thr Cys Val Ala Ser Ser Gly Arg Met Ile Lys Arg Asn 305 310 315 320 Arg Thr Phe Val Arg Val His Thr Lys Pro Phe Ile Ala Phe Gly Ser 325 330 335 Gly Met Lys Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Ser Gln Val Arg Ile 340 345 350 Pro Val Lys Tyr Leu Ser Tyr Pro Ala Pro Asp Ile Lys Trp Tyr Arg 355 360 365 Asn Gly Arg Pro Ile Glu Ser Asn Tyr Thr Met Ile Val Gly Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Ile Met Glu Val Thr Glu Arg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val 385 390 395 400 Ile Leu Thr Asn Pro Ile Ser Met Glu Lys Gln Ser His Met Val Ser 405 410 415 Leu Val Val Asn Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ala Leu Ile Ser 420 425 430 Pro Met Asp Ser Tyr Gly Tyr Gly Thr Met Gln Thr Leu Thr Cys Thr 435 440 445 Val Tyr Ala Asn Pro Pro Leu His His Ile Gln Trp Tyr Trp Gln Leu 450 455 460 Glu Glu Ala Cys Ser Tyr Arg Pro Gly Gln Thr Ser Pro Tyr Ala Cys 465 470 475 480 Lys Glu Trp Arg His Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu 485 490 495 Val Thr Lys Asn Gln Tyr Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val 500 505 510 Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys 515 520 525 Glu Ala Ile Asn Lys Ala Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His 530 535 540 Val Ile Arg Gly Pro Glu Ile Thr Val Gln Pro Ala Ala Gln Pro Thr 545 550 555 560 Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Leu Cys Thr Ala Asp Arg Asn Thr Phe 565 570 575 Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Ser Gln Ala Thr Ser Val His 580 585 590 Met Gly Glu Ser Leu Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Ala Leu Trp 595 600 605 Lys Leu Asn Gly Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile 610 615 620 Val Ala Phe Gln Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys 625 630 635 640 Ser Ala Gln Asp Lys Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gln 645 650 655 Leu Ile Ile Leu Glu Arg Met Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn Leu Glu 660 665 670 Asn Gln Thr Thr Thr Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr Cys Pro Ala 675 680 685 Ser Gly Asn Pro Thr Pro His Ile Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr 690 695 700 Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Arg Asp Gly Asn Arg Asn Leu 705 710 715 720 Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gln 725 730 735 Ala Cys Asn Val Leu Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe Ile Ile 740 745 750 Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu Val Ile Ile Leu Val Gly 755 760 765 Thr Ala Val Ile Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Leu Val 770 775 780 Arg Thr Val Lys Arg Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu 785 790 795 800 Ser Ile Val Met Asp 805 配列番号：35 配列の長さ：2431 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： AGACGTCATG GAGAGCAAGG CGCTGCTAGC TGTCGCTCTG TGGTTCTGCG TGGAGACCCG 60 AGCCGCCTCT GTGGGTTTGC CTGGCGATTT TCTCCATCCC CCCAAGCTCA GCACACAGAA 120 AGACATACTG ACAATTTTGG CAAATACAAC CCTTCAGATT ACTTGCAGGG GACAGCGGGA 180 CCTGGACTGG CTTTGGCCCA ATGCTCAGCG TGATTCTGAG GAAAGGGTAT TGGTGACTGA 240 ATGCGGCGGT GGTGACAGTA TCTTCTGCAA AACACTCACC ATTCCCAGGG TGGTTGGAAA 300 TGATACTGGA GCCTACAAGT GCTCGTACCG GGACGTCGAC ATAGCCTCCA CTGTTTATGT 360 CTATGTTCGA GATTACAGAT CACCATTCAT CGCCTCTGTC AGTGACCAGC ATGGCATCGT 420 GTACATCACC GAGAACAAGA ACAAAACTGT GGTGATCCCC TGCCGAGGGT CGATTTCAAA 480 CCTCAATGTG TCTCTTTGCG CTAGGTATCC AGAAAAGAGA TTTGTTCCGG ATGGAAACAG 540 AATTTCCTGG GACAGCGAGA TAGGCTTTAC TCTCCCCAGT TACATGATCA GCTATGCCGG 600 CATGGTCTTC TGTGAGGCAA AGATCAATGA TGAAACCTAT CAGTCTATCA TGTACATAGT 660 TGTGGTTGTA GGATATAGGA TTTATGATGT GATTCTGAGC CCCCCGCATG AAATTGAGCT 720 ATCTGCCGGA GAAAAACTTG TCTTAAATTG TACAGCGAGA ACAGAGCTCA ATGTGGGGCT 780 TGATTTCACC TGGCACTCTC CACCTTCAAA GTCTCATCAT AAGAAGATTG TAAACCGGGA 840 TGTGAAACCC TTTCCTGGGA CTGTGGCGAA GATGTTTTTG AGCACCTTGA CAATAGAAAG 900 TGTGACCAAG AGTGACCAAG GGGAATACAC CTGTGTAGCG TCCAGTGGAC GGATGATCAA 960 GAGAAATAGA ACATTTGTCC GAGTTCACAC AAAGCCTTTT ATTGCTTTCG GTAGTGGGAT 1020 GAAATCTTTG GTGGAAGCCA CAGTGGGCAG TCAAGTCCGA ATCCCTGTGA AGTATCTCAG 1080 TTACCCAGCT CCTGATATCA AATGGTACAG AAATGGAAGG CCCATTGAGT CCAACTACAC 1140 AATGATTGTT GGCGATGAAC TCACCATCAT GGAAGTGACT GAAAGAGATG CAGGAAACTA 1200 CACGGTCATC CTCACCAACC CCATTTCAAT GGAGAAACAG AGCCACATGG TCTCTCTGGT 1260 TGTGAATGTC CCACCCCAGA TCGGTGAGAA AGCCTTGATC TCGCCTATGG ATTCCTACCA 1320 GTATGGGACC ATGCAGACAT TGACATGCAC AGTCTACGCC AACCCTCCCC TGCACCACAT 1380 CCAGTGGTAC TGGCAGCTAG AAGAAGCCTG CTCCTACAGA CCCGGCCAAA CAAGCCCGTA 1440 TGCTTGTAAA GAATGGAGAC ACGTGGAGGA TTTCCAGGGG GGAAACAAGA TCGAAGTCAC 1500 CAAAAACCAA TATGCCCTGA TTGAAGGAAA AAACAAAACT GTAAGTACGC TGGTCATCCA 1560 AGCTGCCAAC GTGTCAGCGT TGTACAAATG TGAAGCCATC AACAAAGCGG GACGAGGAGA 1620 GAGGGTCATC TCCTTCCATG TGATCAGGGG TCCTGAAATT ACTGTGCAAC CTGCTGCCCA 1680 GCCAACTGAG CAGGAGAGTG TGTCCCTGTT GTGCACTGCA GACAGAAATA CGTTTGAGAA 1740 CCTCACGTGG TACAAGCTTG GCTCACAGGC AACATCGGTC CACATGGGCG AATCACTCAC 1800 ACCAGTTTGC AAGAACTTGG ATGCTCTTTG GAAACTGAAT GGCACCATGT TTTCTAACAG 1860 CACAAATGAC ATCTTGATTG TGGCATTTCA GAATGCCTCT CTGCAGGACC AAGGCGACTA 1920 TGTTTGCTCT GCTCAAGATA AGAAGACCAA GAAAAGACAT TGCCTGGTCA AACAGCTCAT 1980 CATCCTAGAG CGCATGGCAC CCATGATCAC CGGAAATCTG GAGAATCAGA CAACAACCAT 2040 TGGCGAGACC ATTGAAGTGA CTTGCCCAGC ATCTGGAAAT CCTACCCCAC ACATTACATG 2100 GTTCAAAGAC AACGAGACCC TGGTAGAAGA TTCAGGCATT GTACTGAGAG ATGGGAACCG 2160 GAACCTGACT ATCCGCAGGG TGAGGAAGGA GGATGGAGGC CTCTACACCT GCCAGGCCTG 2220 CAATGTCCTT GGCTGTGCAA GAGCGGAGAC GCTCTTCATA ATAGAAGGTG CCCAGGAAAA 2280 GACCAACTTG GAAGTCATTA TCCTCGTCGG CACTGCAGTG ATTGCCATGT TCTTCTGGCT 2340 CCTTCTTGTC ATTCTCGTAC GGACCGTTAA GCGGGCCAAT GAAGGGGAAC TGAAGACAGG 2400 CTACTTGTCT ATTGTCATGG ATTAAGACGT C 2431 配列番号：36 配列の長さ：185 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列： Met His Thr His Gln Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu 1 5 10 15 Asn Thr Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe 20 25 30 Gln Cys Phe Asn Asn Ala Arg Val Gly Leu Ser Gly Thr Phe Arg Ala 35 40 45 Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala 50 55 60 Asp Arg Gly Ser Val Pro Ile Val Gln Asn Leu Arg Asp Glu Val Leu 65 70 75 80 Ser Pro Ser Trp Asp Ser Leu Phe Ser Gly Ser Gln Gly Gln Leu Gln 85 90 95 Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Arg Asp Val Leu Arg His 100 105 110 Pro Ala Trp Pro Gln Arg Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Ser Gly 115 120 125 Arg Arg Leu Met Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Thr Thr 130 135 140 Gly Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Ser Gly Arg Leu Leu Glu 145 150 155 160 Gln Arg Ala Ala Ser Cys His Asp Ser Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu 165 170 175 Asn Ser Phe Met Thr Ser Phe Ser Arg 180 185 配列番号：37 配列の長さ：565 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： AGACGTCATG CATACTCATC AGGACTTTCA GCCAGTGCTC CACCTGGTGG CACTGAACAC 60 CCCCCTGTCT GGAGGCATGC GTGGTATCCG TGGAGCAGAT TTCCAGTGCT TCCAGCAAGC 120 CCGAGCCGTG GGGCTGTCGG GCACCTTCCG GGCTTTCCTG TCCTCTAGGC TGCAGGATCT 180 CTATAGCATC GTGCGCCGTG CTGACCGGGG GTCTGTGCCC ATCGTCAACC TGAAGGACGA 240 GGTGCTATCT CCCAGCTGGG ACTCCCTGTT TTCTGGCTCC CAGGGTCAAC TGCAACCCGG 300 GGCCCGCATC TTTTCTTTTG ACGGCAGAGA TGTCCTGAGA CACCCAGCCT GGCCGCAGAA 360 GAGCGTATGG CACGGCTCGG ACCCCAGTGG GCGGAGGCTG ATGGAGAGTT ACTGTGAGAC 420 ATGGCGAACT GAAACTACTG GGGCTACAGG TCAGGCCTCC TCCCTGCTGT CAGGCAGGCT 480 CCTGGAACAG AAAGCTGCGA GCTGCCACAA CAGCTACATC GTCCTGTGCA TTGAGAATAG 540 CTTCATGACC TCTTTCTCCA AATAG 565 配列番号：38 配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列： CTATCGTCGA CATGTATATT GGTTCTCGTT AAGTCGACCT ATC 43 配列番号：39 配列の長さ：43 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）配列： GATAGGTCGA CTTAACGAGA ACCAATATAC ATGTCGACGA TAG 43 配列番号：40 配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： AGTATCTAGA ATGAGTGTAT CTGTCACAAT G 31 配列番号：41 配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： GAATTCTAGA TCACCTATGA GGGGTTTGCT C 31 配列番号：42 配列の長さ：93 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： CTATCGTCGA CATGTATATT GGTTCTCGTA AAAGATATAT TGGTTCTCGT GGTAAAAGAG 60 ATGGTTCTCG TGGTAAAAGA TAAGTGACCT ATC 93 配列番号：43 配列の長さ：15 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列： GATAGGTCGA CTTAT 15

【図面の簡単な説明】

【図１】リポソーム：ＤＮＡ複合体の腫瘍内注射^* Ａngio vs ＢＡＰ，ｐ＜0.05

【図２】インビトロでの内皮細胞に対する様々な処置群
の効果^* ＢＡＰ vs ＢＡＰ- ｐ53またはＢＡＰ- ＴＳＰｆ，ｐ
＜0.05^** ＢＡＰ- ｐ53またはＢＡＰ- ＴＳＰｆ vs ＢＡＰ- ｐ
53/ ＢＡＰ- ＴＳＰｆ，ｐ＜0.01

【図３】腫瘍の増殖に対する Superfect：ｐ53ＴＳＰｆ
の効果^* ｐ＜0.05；非処置 vs Ｌip：ＢＡＰ- ｐ53/ ＴＳＰｆ^** ｐ＜0.0001；非処置またはＳＦ：ＢＡＰ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/525 Ｃ１２Ｎ 11/08 ＡＣ１２Ｎ 11/08 11/16 11/16 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも１種の抗- 血管新生タンパク
質またはペプチドをコードするＤＮＡからなる担体：Ｄ
ＮＡ複合体であって，この複合体はインビボにおいて腫
瘍部位に送達可能であり，さらに腫瘍または腫瘍血管系
における抗-血管新生ＤＮＡの発現のための調節エレメ
ントからなる複合体．
【請求項２】担体はリポソーム，カチオニックポリマ
ー，ミセル，マイクロスフェア，ウイルス，ウイルス成
分またはそれらの担体の組合わせからなる群より選択さ
れる「請求項１」記載の複合体．
【請求項３】複合体はさらに腫瘍抑制タンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有する「請求項１」記載の複合体．
【請求項４】複合体はさらに腫瘍抑制タンパク質をコ
ードするＤＮＡを含有する「請求項２」記載の複合体．
【請求項５】腫瘍抑制タンパク質はｐ５３である「請
求項３」記載の複合体．
【請求項６】腫瘍抑制タンパク質はｐ５３である「請
求項４」記載の複合体．
【請求項７】インビボにおいて複合体を腫瘍または腫
瘍辺縁領域に向けるマーカーからなる「請求項１」記載
の複合体．
【請求項８】ＤＮＡは，配列番号：１，配列番号：
３，配列番号：５，配列番号：７，配列番号：９，配列
番号：11，配列番号：13，配列番号：15，配列番号：1
7，配列番号：19，配列番号：21，配列番号：23，配列
番号：25，配列番号：27，配列番号：31，配列番号：3
5，および配列番号：37からなる群より選択される「請
求項１」記載の複合体．
【請求項９】抗- 血管新生ＤＮＡは少なくとも１種の
プロモーターを含有するベクター中にで提供される「請
求項１」記載の複合体．
【請求項１０】担腫瘍患者における腫瘍の増殖を阻止
する方法であって，抗- 血管新生タンパク質またはペプ
チドの少なくとも１種をコードするＤＮＡを担体中にお
いて患者に投与し，インビボで腫瘍部位に送達させ，患
者生体内の腫瘍部位で発現させることからなる方法．
【請求項１１】担体はリポソーム，カチオニックポリ
マー，ミセル，マイクロスフェア，ウイルス，ウイルス
成分またはそれらの担体の組合わせからなる群より選択
される「請求項10」記載の方法．
【請求項１２】担体上にさらに腫瘍抑制タンパク質を
コードするＤＮＡを含有させる「請求項10」記載の方
法．
【請求項１３】投与は注射による「請求項10」記載の
方法．
【請求項１４】投与は注射による「請求項12」記載の
方法．
【請求項１５】投与は静脈内注射による「請求項12」
記載の方法．
【請求項１６】投与は静脈内注射による「請求項13」
記載の方法．
【請求項１７】担腫瘍患者における腫瘍の増殖を阻止
する方法であって，抗- 血管新生ＤＮＡを腫瘍または腫
瘍辺縁領域で発現される形態で患者に注射することから
なる方法．
【請求項１８】腫瘍抑制タンパク質をコードするＤＮ
Ａを腫瘍または関連腫瘍血管系内で発現される形態でさ
らに注射することからなる「請求項16」記載の方法．
【請求項１９】注射は静脈内に行われる「請求項17」
記載の方法．
【請求項２０】注射は腫瘍内に行われる「請求項17」
記載の方法．