JPH11174057A - 免疫測定用基材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 感度、再現性、信頼性に優れた免疫測定を行
うことが出来る免疫測定用基材を提供する。 【解決手段】 測定に用いる分子の非特異的吸着が５×
１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下である基材を用いること
で、ばらつきの原因である非特異的吸着を無くし、固相
化分子を基材表面に生成させた官能基を利用して固相化
させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応を利
用して抗体又は抗原を検出する免疫測定で、抗原又は抗
体を基材に固相化して測定する固相化法に用いる基材の
材質及び表面処理に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来の固相化法による免疫測定において
は、ポリスチレン等のプラスチック基材に非特異的吸着
又は共有結合を利用して抗体又は抗原等の分子を固相化
し、固相化した分子に対して免疫反応を利用してサンプ
ル溶液中の目的の分子を補足させ、最終的にラジオアイ
ソトープ、酵素、蛍光物質等で標識した分子を目的の分
子に特異的に補足させて定量する方法が一般的に行われ
ている。免疫測定は、研究開発の分野だけではなく、臨
床検査といった医療の分野でも多く用いられており、測
定結果が事実と誤った値であった場合、人命に係わる重
篤な事態を引き起こす恐れもあるため、測定感度、安定
性（再現性）については特に重要視すべきである。

【０００３】本来、抗原抗体反応は非常に特異的で安定
な反応であるため、その反応を利用した免疫測定法は理
論上非常に特異的、かつ高感度に目的分子を検出出来る
はずである。しかし、従来の方法においては、固相化分
子の固相化量を上げるために高吸着の材料又は表面処理
を行った材料を使用した基材を用いているため、固相化
分子以外の物質が非特異的吸着によって測定系に残留
し、その結果、感度、安定性が低下してしまう。

【０００４】尚、従来の免疫測定法においては前述のよ
うな固相化分子以外の非特異的吸着を防ぐために固相化
分子を固相化した後に、スキムミルクやアルブミン等の
一般的にブロッキング剤と呼ばれる吸着性の高い蛋白で
基材表面を覆い、他の分子の非特異的吸着を阻害するブ
ロッキング操作を行っていたが、ブロッキング操作に
は、ブロッキング剤の種類、溶媒の種類、ｐＨ、温度、
反応時間等のブロッキングの条件を間違うと全く効果が
得られず、条件の検討に時間を要すること、又最適な条
件を選択してもブロッキングによって完全に基材への吸
着を防ぐことは不可能であること、例え完全にブロッキ
ングが達成されたとしても、ブロッキング剤上への非特
異的吸着が避けられないこと、更に、固相化分子が低分
子量であった場合、分子量の比較的大きなブロッキング
剤の下に隠れてしまうといった問題点、及びブロッキン
グ効果及び非特異的吸着は測定時の湿度にも影響を受け
るために従来の免疫測定において測定毎の再現性が得ら
れない場合が多いといった問題点もあり、ブロッキング
によって完全に非特異的吸着を防ぐことは出来ず、結果
的にばらつきを増大させる原因になっていた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な従来の問題点を解決すべく鋭意検討の結果なされたも
ので、非特異的吸着を無くすことで目的以外の分子が測
定系へ残留することを無くし、その結果従来の免疫測定
より高感度で安定性（再現性）に優れた免疫測定用基材
の提供を目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち本発明は、測定に使
用する分子の非特異的吸着が２５℃において５×１０^-4
ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下である基材表面に、固相化に用い
る分子との結合が可能な官能基を有する免疫測定用基材
である。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明においては、従来の高吸着
な基材とは逆に、基材自体に分子の非特異的な吸着が５
×１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下である材料又は表面処理
を施したものを使用し、最初に固相化する分子は基材表
面に存在または生成させた官能基を利用し、イオン結合
もしくは共有結合によって固定化させることとした。そ
れによってばらつきの原因の一つであるブロッキング操
作は不要となり、目的以外の分子は系に残留することな
く、高感度で安定な測定が可能になる。更に、固相化分
子の固相化量を表面官能基だけで制御することで高感度
以外のメリットも生まれる。

【０００８】即ち、従来の免疫測定用基材においては、
多くの非特異的吸着が存在したため、固相化分子の固相
化量は溶液の濃度もしくは固相化時間で調節するしかな
かった。しかし、安定した固相化を行うには固相化分子
を過剰量加えて過剰時間吸着させることが必須であり、
基材が有する吸着能力以下の量を固相化する事は、固相
化量が安定せず非常に困難であった。

【０００９】本発明の免疫測定用基材においては、固相
化分子の固相化量は、基材表面の官能基の数だけで決定
されるため、官能基密度を制御する事で固相化量を制御
することが可能である。例えば低濃度の固相化分子を使
用する場合は、基材表面の官能基密度を下げる、つまり
固相化分子濃度が官能基密度に対して過剰量になる程度
に官能基密度を下げることで、安定した固相化を行うこ
とが出来る。一般的に使用される抗原等の固相化分子は
特に高価なものが多く、低濃度で安定した固相化が出来
れば、試薬節約の意味でも非常に有意義である。

【００１０】また、臨床検査用として用いる場合、検査
時に固相化から行うのではなく、固相化分子を基材に固
相した状態のものを一度に大量に作成し、保存してお
き、検査時にはすでに固相化している基材を取り出して
使用されるのが一般的であるが、非特異的吸着が存在す
ると、非特異的吸着により固相化された分子は不安定で
あるため保存状況によっては基材表面から脱離してしま
い、経時的にばらつきを発生する事が多い。しかし、本
発明の免疫測定用基材においては非特異的吸着は存在せ
ず、安定な共有結合、イオン結合によって固相化されて
いるため、固相化後の保存にも安定である。

【００１１】本発明の免疫測定用基材は、分子の非特異
的吸着が５×１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下といった非特
異的吸着を起こしにくい材料表面に固相化分子との結合
可能な官能基を生成させている点が特徴であり、最初に
固相化分子を該官能基と結合させた後は、分子が基材表
面に非特異的に吸着することは殆どなく目的の分子のみ
が特異的な免疫反応により基材表面に補足され、結果と
して高感度で安定した結果を得ることが出来る。前述の
通り、感度、安定性に最も優れているのは、目的以外の
分子の非特異的吸着が全く起こらない表面であるが、実
際、固相化法による免疫測定を行う場合、固相化分子の
固相化量は、５×１０^-3程度であるため、分子の非特異
的な吸着は５×１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下で有れば問
題はない。

【００１２】分子の非特異的な吸着が５×１０^-4ｎｍｏ
ｌ／ｃｍ²以下である表面を得るために使用する材料と
しては、分子の非特異的な吸着が５×１０^-4ｎｍｏｌ／
ｃｍ²以下である材料、若しくは分子の非特異的な吸着
が５×１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下である表面処理を施
した材料で有れば特に限定するものではないが、ポリプ
ロピレン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等
の高分子が挙げられる又、ポリスチレンの様に非特異的
吸着の起こりやすい材料を使用する場合には、プラズマ
暴露によるカルボキシル基及び／または水酸基の導入、
ポリメチルメタクリレートを使用する場合であればアル
カリによる表面部分加水分解でカルボキシル基を導入す
る等の表面改質により非特異的な吸着が５×１０^-4ｎｍ
ｏｌ／ｃｍ²以下である表面を実現することが出来る。
また分子の非特異的な吸着が５×１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ
²以下である材料をコーティングしても良い。

【００１３】基材表面に有する分子との結合が可能な官
能基は特に限定するものではないが、基材表面に有する
官能基がアミノ基である場合は、分子内にアミノ基を有
する固相化分子であればグルタルアルデヒドを介して固
相化する事が出来、又、分子内にカルボキシル基を有す
る固相化分子であればカルボジイミドを利用して固相化
する事が出来る。基材表面に有する官能基がカルボキシ
ル基である場合は、分子内にアミノ基を有する固相化分
子であれば、カルボジイミドを利用して固相化する事が
出来る。

【００１４】基材表面に官能基を付与する方法として
は、特に限定するものではないが、一般的に行われてい
るプラズマ暴露による官能基付与の方法を用いることが
出来る。例えば、アンモニアプラズマ又は窒素と酸素の
混合プラズマによってアミノ基を付与することが出来、
アルゴン、ヘリウム等の不活性ガスのプラズマ又は、酸
素プラズマによってカルボキシル基を導入することが出
来る。

【００１５】

【実施例】以下、実施例によって本発明を更に具体的に
説明する。 （実施例１）市販のポリスチレン製９６穴ＥＬＩＳＡ用
プレート（住友ベークライト製 ＭＳ−８４９６Ｆ）を
窒素と酸素の混合プラズマで１５分処理を行い、基材表
面に水酸基とアミノ基を生成させたものを実施例１とし
た。 （実施例２）９６穴マイクロプレートをポリメチルメタ
クリレートで成形、成形後ウェルに２Ｎの水酸化ナトリ
ウムを分注、５０℃で１０時間処理して表面部分加水分
解を行い、表面にカルボキシル基と水酸基を生成させた
ものを実施例２とした。 （比較例）市販のポリスチレン製９６穴ＥＬＩＳＡ用プ
レート（住友ベークライト製 ＭＳ−８４９６Ｆ）を比
較例として用いた。

【００１６】（非特異的吸着性の比較）非特異的吸着性
を比較するため、酵素で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（コ
スモバイオ 製）を１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、
１０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度系列で、各濃
度を２４ウェルづつ分注し、３時間吸着させた。尚、実
施例１及び実施例２のプレートについては、予めアミノ
基又はカルボキシル基を失活させてから検討に用いた。
標識酵素は、ペルオキシターゼを用いて、吸光度から吸
着量を求め、ウェルと溶液の接触面積から密度として算
出した。結果は、図１の通りで、実施例１、実施例２の
プレートともに比較例に比べ非特異的吸着性が低下して
いることを確認した。

【００１７】（免疫測定感度の比較）免疫測定感度の比
較として、固相化抗体として抗ラットアルブミン抗体、
測定抗原としてラットアルブミン、標識抗体としてペル
オキシターゼ標識抗ラットアルブミン抗体を用いて免疫
測定を行った。各プレートの測定法は下記の通り。

【００１８】（実施例１）プレートの各ウェルに、ｐＨ
７．４のリン酸緩衝液で２％に希釈したグルタルアルデ
ヒド（電子顕微鏡用２０％ 和光純薬製）を２００μＬ
／ウェルで分注し、３７℃で２時間静置した。次に、洗
浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０入りｐＨ７．４のリン
酸緩衝液）３００μＬ／ウェルで３回洗浄した後に、ｐ
Ｈ７．４のリン酸緩衝液で５μｇ／ｍｌに希釈した抗ラ
ットアルブミン抗体（コスモバイオ製）を２００μＬ／
ウェルで分注し３７℃で２時間静置した。

【００１９】次に、洗浄液３００μＬ／ウェルで３回洗
浄した後に、ラットアルブミン（コスモバイオ製）を1
μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、
０．１２５μｇ／ｍｌの濃度系列で各濃度２４ウェルづ
つ１００μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間静置し
た。次に洗浄液３００μＬ／ウェルで３回洗浄した後
に、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で２μｇ／ｍｌに希釈し
たペルオキシターゼ標識抗ラットアルブミン抗体（コス
モバイオ製）を２００μＬ／ウェルで分注し、室温で１
時間静置した。次に洗浄液３００μＬ／ウェルで３回洗
浄した後に、発色キット（ペルオキシターゼ用発色キッ
トＴ 住友ベークライト製）を使用して発色、プレート
リーダーで４５０ｎｍの波長の吸光度を測定した。

【００２０】（実施例２）プレートの各ウェルに、ｐＨ
５．８のリン酸緩衝液で１０％に調製した水溶性カルボ
ジイミド（和光純薬製）を２００μＬ／ウェルで分注
し、３７℃で１時間静置した。以降、抗体分注から発色
まで前記実施例１と同条件にて実施。

【００２１】（比較例）ｐＨ７．４のリン酸緩衝液で５
μｇ／ｍｌに希釈した抗ラットアルブミン抗体（コスモ
バイオ製）を２００μＬ／ウェルで分注し、４℃で２０
時間静置した。次に、洗浄液３００μＬ／ウェルで３回
洗浄した後に、ブロッキング剤（スキムミルクをｐＨ
７．４のリン酸緩衝液で５％に調製）２００μＬ／ウェ
ルで分注し、室温で２時間静置した。以降アルブミン分
注から発色まで前記実施例１と同条件にて実施。結果は
図２の通りで、実施例１、２共に比較例と較べてアルブ
ミン濃度に対する吸光度値に直線性が得られ、各濃度に
おける２４ウェルのデータの変動係数（ＣＶ％）も低
く、安定していた。

【００２２】

【発明の効果】本発明の免疫測定用基材は、測定に使用
する分子の非特異的吸着が２５℃において５×１０^-4ｎ
ｍｏｌ／ｃｍ²以下である基材表面に、固相化に使用す
る分子の結合が可能な官能基を有することで、目的以外
の分子が測定系に残留して結果に影響を及ぼすことな
く、高感度、安定な免疫測定が可能になる。また、固相
化分子の固相化量は、官能器量によって制御することが
可能であるため、測定する物質の溶液濃度に応じて固相
化分子の固相化量を調節することが出来る。また、不安
定な非特異的吸着が存在しないため、固相化分子固相化
後も安定であり、分子を固相化した状態で保存した基材
を用いても優れた再現性が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】非特異的吸着性の比較として、蛋白溶液濃度と
吸着量の関係を示す。

【図２】免疫測定感度の比較として、アルブミン濃度と
吸光度の関係を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 測定に使用する分子の非特異的吸着が２
   ５℃において５×１０^-4ｎｍｏｌ／ｃｍ²以下である基
   材表面に、固相化分子との結合が可能な官能基を有する
   ことを特徴とする免疫測定用基材。
2. 【請求項２】 基材表面に有する分子との結合が可能な
   官能基が、アミノ基および／またはカルボキシル基であ
   る請求項１記載の免疫測定用基材。