JPH111480A

JPH111480A - 新規物質ｆ−９７７５ａ及びｆ−９７７５ｂ

Info

Publication number: JPH111480A
Application number: JP15180497A
Authority: JP
Inventors: Aiya Satou; 藹也佐藤; Tadaaki Morishita; 忠昭森下; Takeshi Hosoya; 剛細矢; Yuichi Ishikawa; 裕一石川
Original assignee: Sankyo Co Ltd
Current assignee: Sankyo Co Ltd
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1997-06-10
Publication date: 1999-01-06

Abstract

(57)【要約】【課題】骨粗鬆症等の治療薬として有用な新規化合物を
提供する。【解決手段】下記式Ｉで示されるF-9775A ：【化１】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、骨粗鬆症等の治療
薬として有用な新規化合物F-9775A 及びF-9775B、該化
合物の製造法、該化合物からなる医薬並びに該化合物の
生産菌等に関する。

【０００２】

【従来の技術】骨粗鬆症は骨量が減少する疾患であり、
その重大な症状として脊椎圧迫骨折、大腿骨頸部骨折、
上腕部頸部骨折、前腕骨末端骨折等が挙げられる（藤田
拓男、オステオポロ−シス−治療と診断−、１９９３、
ライフサイエンス社参照）。また、骨粗鬆症は高齢者に
なるほど疾病率が高くなることより、高齢化社会におい
て、極めて社会的影響の大きい疾病の一つである。骨は
一見静的にみえる組織であるが、実際は常に骨形成と骨
吸収を繰り返しており、そのバランスを維持することに
より正常な状態を保っている。ところが、そのバランス
が崩れ、骨吸収が骨形成を上回ると骨量が減少し、骨粗
鬆症を呈する（藤田拓男、オステオポロ−シス−治療と
診断−、１９９３、ライフサイエンス社参照）。

【０００３】よって、骨吸収抑制剤は骨粗鬆症の治療あ
るいは予防薬として有用である。従来、骨吸収抑制剤と
して、エストロジェン製剤、カルシトニン等が用いられ
てきたが、副作用あるいはエスケープ現象等が見られ、
十分な治療効果が得られておらず、異なった機序での骨
吸収抑制剤が待望されている（骨粗鬆症治療剤の開発動
向、NEW CURRENT, 1996,第7 巻, 1-50頁参照）。

【０００４】骨吸収を担っているのは破骨細胞であり、
骨表面に接触し、脱灰に引き続き骨基質の分解を行い骨
吸収を遂行する。骨基質の大部分はＩ型コラーゲンが占
めており、Ｉ型コラーゲンの分解にはシステインプロテ
ア−ゼが大きく関与していることが報告されている。実
際、システインプロテア−ゼの阻害剤であるE-64をウサ
ギに投与することにより、骨吸収が抑制されるという報
告がある（P.A. Hill等:J. Cell Biochem., 56 巻, 118
-130 頁(1994)参照）。

【０００５】これまで、Ｉ型コラーゲンの分解に関与し
ているシステインプロテア−ゼとしてカテプシンL （カ
ケガワ等:FEBS Letters, 321巻, 247-250 頁(1993)参
照）が知られている。この酵素阻害剤は骨吸収を抑制す
ることにより骨粗鬆症等の治療薬になることが期待さ
れ、該酵素に対する阻害剤の研究が広く行なわれてき
た。このような阻害剤として、ロイペプチン (ニシムラ
等:Biol. Pharm. Bull., 18巻, 945-950 頁参照) 、カ
テスタチン類（Je-Tae Woo等:Biosci. Biotech. Bioche
m., 59巻, 350-352 頁(1995)；兎ら：特開平７−７００
９８号参照）、エポキシ琥珀酸誘導体 (クボタニ等:EP-
655447参照) 、ペチディルビニルスルフォン誘導体(D.
Bromme等:Biochem. J., 315 巻, 85-89 頁(1996)参
照）、E-64 (B.J. Gour-Salin 等:Bioorg. Chem., 22
巻, 227-241 頁(1994)参照）、キモスタチノ−ル類（浜
野等：特開平８−３１８８号参照）、TAK-726 （左右田
等：特開平８−２８３２２１号参照）、ＹＭ−５７４０
９ (安室等：特開平９−８７２６５号参照）が知られて
いる。

【０００６】近年、イナオカ等により破骨細胞に選択的
に、且つ大量に発現しているシステインプロテア−ゼで
あるカテプシンＫがクロ−ニングされた（T. Inaoka
等:Biochem. Biophy. Res. Comm., 206 巻, 89-96 頁(1
995)参照）。さらに最近、Ｘ線結晶解析によりカテプシ
ンＫの立体配座が決定されいる（M.E. McGrath等: Natu
re Structure Biology, 4 巻, 105-109 頁(1997);B. Zh
ao等:Nature StructureBiology, 4巻, 109-111 頁(199
7)参照）。かかるカテプシンＫの発現の選択性より、該
酵素の特異的阻害剤は骨吸収の抑制に対して選択的に作
用し、副作用の少ない骨粗鬆症等の治療薬となりうるも
のと考えられる。カテプシンＫ阻害剤研究は未だ緒につ
いたばかりであり、前出のカテプシンＬ阻害剤であるペ
チディルビニルスルフォン誘導体やＥ−６４に加えて、
ＡＰＣ３３２８（J.Ｔ. Palmer等、Ｊ. Med. Chem., 38
巻, 3193-3196 頁(1995)参照）はカテプシンＫも非特異
的に阻害する。しかし、カテプシンＫに特異的な阻害剤
は未だ知られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、安全性の
高い骨粗鬆症などの治療薬を求めて活性が強く且つ選択
性の高いカテプシンＫ阻害剤を微生物資源に求め、カビ
・ペシロマイセス・カ−ネウス（Paecilomyces carneu
s） SANK15996株の培養液より強いカテプシンＫ阻害作
用を有する新規物質を単離・精製し、本発明を完成し
た。

【０００８】

【発明が解決するための手段】本発明は、（１）下記式
Ｉで示されるF-9775A ：

【０００９】

【化３】、

【００１０】（２）下記式ＩＩで示されるF-9775B ：

【００１１】

【化４】、

【００１２】（３）ペシロマイセス属に属するF-9775A
及び／又はF-9775B 生産菌を培養し、該培養液からF-97
75A 及び／又はF-9775B を単離及び精製することを特徴
とする、F-9775A 及び／又はF-9775B の製造法、（４）
ペシロマイセス・カ−ネウス種に属するF-9775A 及び／
又はF-9775B 生産菌を培養し、該培養液からF-9775A 及
び／又はF-9775B を単離及び精製することを特徴とす
る、F-9775A 及び／又はF-9775B の製造法、（５）ペシ
ロマイセス・カ−ネウスSANK15996 株を培養し、該培養
液からF-9775A 及び／又はF-9775B を単離及び精製する
ことを特徴とする、F-9775A 及び／又はF-9775B の製造
法。

【００１３】（６）ペシロマイセス・カ−ネウスSANK15
996 （FERM BP-5916) 株、（７）F-9775A 及び／又はF-
9775からなる医薬、に関する。

【００１４】本発明の新規化合物 F-9775A 及びF-9775
B は、以下の物理化学的性質を有する。

【００１５】［F-9775A ］１．物質の性状：赤色針状晶２．融点：>270℃（分解）３．旋光度：[a] ²⁵ _D 0°(c 0.52,メタノール) ４．ＣＤスペクトル：プレ−ンカ−ブ（コットン効
果無し）５．分子式：C₂₁H₁₆O₈（高分解能ファブマススペク
トルより）６．分子量：396 （ファブマススペクトルより）７．紫外線吸収スペクトル（エタノ−ル）：208 (2
9000),305 (4700)(sh), 364 (4700),420 (2900) ８．赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：3391,3273,
2957,2928,2873,1712,1636,1601,1528,1515,1433,1384,
1339,1261,1232,1204,1137,1084,1041,984,967,831,80
1,722, 615,584 ９． ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル(d, 重メタノ−
ル) ：1.85 (s), 1.99 (s), 2.33 (s), 3.51 (s), 6.03
(brs), 6.40 (brs),6.46 (brs). １０． ¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル(d, 重メタノ−
ル) ：20.3 (q), 21.0 (q), 29.4 (q), 46.0 (s), 6
1.2 (d), 88.6 (s),108.8 (d), 116.2 (d), 121.6 (s),
128.7 (s), 132.7 (d),133.2 (s), 136.2(s),141.2
(s),147.0 (s), 150.0 (s), 157.0 (s),176.6 (s), 17
7.1 (s), 196.8 (s), 201.3 (s) ［F-9775B ］１．物質の性状：赤色針状晶２．融点：>280℃（分解）３．旋光度：[a]²⁵ _D 0°(c 0.52,メタノール) ４．ＣＤスペクトル：プレ−ンカ−ブ（コットン効
果無し）５．分子式：C₂₁H₁₆O₈（高分解能ファブマススペク
トルより）６．分子量：396 （ファブマススペクトルより）７．紫外線吸収スペクトル（エタノ−ル）：227 (3
7000),304 (10000),367 (4000)(sh),418 (5000) ８．赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）：3288,2980,
2926,1733,1699,1657,1598,1524,1508,1458,1433,1412,
1378,1357,1319,1357,1319,1291,1263,1209,1156,1129,
1102,1085,946, 841, 829, 782, 773, 604, 578. ９． ¹Ｈ−核磁気共鳴スペクトル(d, 重メタノ−
ル) ：1.87(3H, s), 2.18 (3H, s), 2.34 (3H, s), 3.6
1 (1H, s),6.02 (1H,s), 6.42 (1H d) １０． ¹³Ｃ−核磁気共鳴スペクトル(d, 重メタノ−
ル) ：17.7 (q), 18.8 (q), 27.5 (q), 43.6 (s), 58.8
(d), 86.2 (s),106.7 (d), 112.2 (d), 118.4 (s),12
5.2 (s), 130.2 (d),130.6 (s), 135.1 (s),141.0 (s),
144.4 (s), 148.3 (s),154.9 (s), 173.7 (s), 175.1
(s), 194.4 (s),199.3 (s) １１．溶解性：メタノ−ル，エタノ−ル，ジメチルス
ルホキシドに難溶本発明の新規化合物F-9775A 及びF-9775B は、種々の立
体異性体を有する。式Ｉ及びＩＩにおいては、これらの
立体異性体およびこれらの異性体の混合物がすべて単一
の式で示されている。従って、本発明においてはこれら
の立体異性体およびこれらの立体異性体の混合物をもす
べて含むものであるまた、本発明の新規化合物F-9775A 及びF-9775B は、溶
剤和物（例えば水和物）を形成する場合には、これらを
もすべて含むものである。

【００１６】例えば、本発明の新規化合物F-9775A 及び
F-9775B が、大気中に放置されたりまたは再結晶をする
ことにより、水分を吸収し、吸着水が付着したり、水和
物を形成する場合がある。本発明にはこのような溶剤和
物も含まれる。

【００１７】更に本発明において、生体内において代謝
されてF-9775A または9775B に変換される化合物、いわ
ゆるプロドラッグもすべて本発明に含まれる。

【００１８】本発明の新規化合物 F-9775 及び F-9775B
の製造法において用いられるぺシロマイセス（Paecil
omyces）属に属する菌株としては、例えばペシロマイセ
ス・カ−ネウス (Paecilomyces carneus） SANK 15996
株（以下、「 SANK 15996 株」と略称する。）を挙げる
ことができる。SANK 15996株は、茨城県筑波市で採集さ
れた土壌より分離されたものである。

【００１９】SANK 15996株の菌学的特徴は、次のとおり
である。

【００２０】マリンアガ−上でのコロニー成長は２週
間、23℃で直径20-23mm に達する。コロニー表面は、胞
子形成がさかんで粉状を呈し、中心は羊毛状となり、色
は最初白色、培養を継続することによって中心部は黄色
みをおびたピンク色となる。裏面はオリーブ色であり、
培養を継続することによって濃緑色になることもある。
においは生じない。栄養菌糸はやや薄壁、平滑、幅は2
μm であり、分生子柄は単生して埋没菌糸から直立し、
輪生した1-4 個のフィアライドをつける。フィアライド
は14-17 x 2.5 μm であり、基部は円筒形で、細長い頚
部に向かって細くなる。分生子は2.5 x 2.5-3 μm であ
り、亜球形で表面は粗面から針状であり、長く連鎖し散
開する。以上の特徴は、文献（ Samson, R. A. (1974)
Paecilomyces and some allied hyphomycetes. Studies
in Mycology 6:9-74.参照）で取り上げられているペシ
ロマイセス・カ−ネウス（Paecilomyces carneus）の特
徴に一致する。そこで本菌株をペシロマイセス・カ−ネ
ウス（Paecilomyces carneus）と同定した。

【００２１】本菌株は、Paecilomyces carneus (Duche
& Hein) Brown & Smith SANK15996株として、１９９７
年４月１５日通商産業省工業技術院生命工学工業研究所
に寄託され、寄託番号 FERM BP-5916 が付与された。

【００２２】以上、F-9775A 及びF-9775B の生産菌につ
いて説明したが、細菌の諸性質は一定したものではな
く、自然にあるいは人工的に容易に変化することは周知
の通りである。本発明のSANK15996 株もこの点は同じで
ある。本発明にいうSANK15996株は、その全ての変異株
を含有する。又、これらの変異株には遺伝学的方法、例
えば組換え、形質導入、形質転換により得られたものも
包含される。即ち、F-9775A 及びF-9775B を生産するSA
NK15996 株、その変異株及びそれらと明確に区別できな
い菌株は、全て本発明のSANK15996 株に包含されるもの
である。

【００２３】本発明の新規化合物F-9775A 及びF-9775B
を得るため、これらの微生物の培養は一般の醗酵生産物
生産用培地中で行われる。この様な培地には、微生物が
資化できる炭素源、窒素源及び無機塩が含有される。培
地の調製には水道水を用いる。

【００２４】一般に、炭素源としてグルコース、フラク
ト−ス、マルト−ス、シュ−クロ−ス、マンニト−ル、
グリセロ−ル、デキストリン、オ−トミ−ル、ライ麦、
ト−モロコシ澱粉、ジャガイモ、ダイズ粉、綿実油、糖
蜜、クエン酸、酒石酸等を単一に、あるいは併用して用
いることができ、一般には、これらの炭素源は培地量の
１−１０重量％用いられる。

【００２５】窒素源としては、一般に蛋白質を含有する
物質を発酵工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆
粉、フスマ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水
分解物、ファ−マミン、魚粉、ペプトン、肉エキス、イ
−ストエキス、マルトエキス、硝酸ナトリウム、硝酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム等である。窒素源は、単
一に又は併用して培地量の０．２−０．６重量％用いら
れる。

【００２６】培地中に取り入れる無機塩は、ナトリウ
ム、アンモニウム、カルシウム、フォスフォネ−ト、サ
ルフェート、クロリド、カ−ボネ−ト等のイオンを与え
る通常の塩類である。又、カリウム、コバルト、マンガ
ン、マグネシウム等の微量の金属も含む。液体培養に際
しては、シリコン油、植物油、界面活性剤が消泡剤とし
て用いられる。

【００２７】F-9775A 及びF-9775B は、SANK15996 株を
好気的に培養して得られるが、好気的培養法として、液
体振とう培養法、通気撹拌液体培養法等が採用される。
前述の炭素源、窒素源、及び無機塩を適当に含み、１２
０℃、２０分間加熱滅菌した培養培地中へスラントより
接種し、２０℃で７日間前培養する。その後、同じ培養
培地へ上記の前培養液を接種して２０℃で７日間本培養
する。培養は、フラスコ、ジャ−、タンク等の培養器中
で行われる。

【００２８】培養終了後、培養液にセライトを加えて濾
過して菌体と上清とに分ける。濾液をｐＨ３に調整し、
酢酸エチルで抽出する。この酢酸エチルエキスは、更に
吸着剤、例えばシリカゲル、活性炭、アンバーライトＸ
ＡＤ−１、−４（ロ−ム＆ハ−ス社製）、ダイヤイオン
ＨＰ−２０、ＣＨＰ−２０、ＨＰ−５０［三菱化成
（株）社製］等を用いて精製できる。この様にして得ら
れた部分精製品は、更にセファデックスＬＨ−２０（フ
ァルマシア社製）等を用いた分配カラムクロマトグラフ
ィ−、オクタデシルやデシル化されたシリカゲルを充填
剤として用いたロ−バ−カラム［ＲＰ−８、１８（メ
ルク社製）］低圧逆相カラムクロマトグラフィ−、セン
シュウパックＯＤＳ−Ｈ、Ｓ；ペガシルＯＤＳ（センシ
ュウ科学社製）；ノバパック（ミリポア社製）等を用い
たＨＰＬＣなどにより精製することがきる。

【００２９】

【発明の実施の形態】本発明のF-9775A やF-9775B のカ
テプシンＫ阻害作用は、以下に示す方法により算定でき
る。

【００３０】ヒトカテプシンＫｃＤＮＡの全翻訳領域を
既報（T.Inaoka et al : Biochem.Biophys. Res. Comm
um., 206, 89-96(1995)参照）のヒトカテプシンＫの塩
基配列を基に、Quick-Screen^TM Human cDNA Library Pa
nel （クローンテク・ラボラトリー社製：CLONTECH Lab
oratories, Inc. ）に含まれるヒト肺ｃＤＮＡ（λgt1
1）を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Ch
ain Reaction:以下「ＰＣＲ」という。）法によりクロ
ーニングした。次に、このｃＤＮＡがコードする蛋白質
はシグナルペプチド領域を含んでおり、このｃＤＮＡよ
りシグナルペプチド領域を除き、プロ−成熟体に相当す
る領域をＰＣＲ法により増幅した断片をサブクローニン
グし、大腸菌の発現ベクター pTrcHisB （ストラタゲン
社製：STRATAGEN Ltd.）に挿入した発現プラスミドを作
成した。このプラスミドで大腸菌M15[pREP4]株（Nal^S,
Str^S, rif^S, lac^-, ara^-, gal^-, mtl^-, F^-, recA⁺, uvr
⁺ ）（キアゲン社製：QIAGEN GmbH ）を形質転換し、形
質転換株を得た。この形質転換株より発現させたヒトカ
テプシンＫを、Xpress^TM System protein purification
（インビトロゲン社製：INVITOROGEN BV）を用いて精製
後、リフォールディング操作を行なった。更に、ｐＨを
４．０に下げ、自己消化（オートプロセシング）を行な
わせ、活性型ヒトカテプシンＫを得た。得られた活性型
ヒトカテプシンＫに、基質として４０μM のＺ−フェニ
ルアラニンーアルギニンーアミノメチルクマリン（Z-Ph
e-Arg-AMC(ペプチド研究所) ）と被検検体を加え、３０
℃で１５分間反応した。反応停止液 (100mM モノクロロ
酢酸(monochloroacetic acid) 、30mM酢酸ナトリウム(s
odium acetate)、70mM酢酸(acetic acid) 、(pH4.3) ）
を加え、蛍光測定機(Labsystems 社製Labsystems Fluol
oskan II) で、励起波長３５５nm、蛍光波長４６０nmで
遊離したアミノメチルクマリンの蛍光を測定した。ま
た、対照としては、被検検体の替わりに、被検検体の溶
解に用いた溶媒を加え、この時の酵素活性を１００％と
して残存する酵素活性を求めた。各被検検体について６
段階希釈を行い、下記式に従いIC₅₀値を算出した。

【００３１】カテプシンＫ阻害作用＝［１−（Ａ／Ｂ）］ × １００（％）Ａ：阻害物質存在下におけるアミノエチルクマリンの生
成量Ｂ：阻害物質非存在下におけるアミノエチルクマリンの
生成量本発明のF-9775A やF-9775B のカテプシンＬ阻害作用
は、以下に示す方法により算定できる。

【００３２】浜野らの方法（特開平８−３１８８号参
照）で調製したラットカテプシンＬ酵素に基質・Ｚ−フ
ェニルアラニンーアルギニンーアミノメチルクマリン及
び被検検体を反応させ、該酵素で生成したアミノエチル
クマリンを蛍光定量した。また、対照としては被検検体
を溶解した溶媒のみを加えたものを用い、この時の酵素
活性を１００％として残存する酵素活性を求めた。各被
検検体について、下記式に従いIC₅₀値を算出した。

【００３３】カテプシンＬ阻害作用＝［１−（Ａ／Ｂ）］ × １００（％）Ａ：阻害物質存在下におけるアミノエチルクマリンの生
成量Ｂ：阻害物質非存在下におけるアミノエチルクマリンの
生成量 F-9775及びF-9775B は文献未記載の新規化合物であり、
カテプシンＫ阻害作用を有し、例えば骨粗鬆症などの骨
代謝疾患の予防、治療薬として有用である。

【００３４】本発明のF-9775A やF-9775B を医薬として
用いる場合、常法に従ってそれ自体又は薬学的に許容さ
れる担体、賦形剤と混合し、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カ
プセル剤、注射剤などの形態で経口的または非経口的に
安全に投与できる。これらの製剤は、賦形剤、滑沢剤、
結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添
加剤を用いて周知の方法で製造される。賦形剤として
は、例えば乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビ
ット、のような糖誘導体；トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱
粉、α−澱粉、デキストリン、カルボキシメチル澱粉の
ような澱粉誘導体；結晶セルロ−ス、低置換度ヒドロキ
シプロピルセルロ−ス、ヒドロキシメチルセルロ−ス、
カルボキシメチルセルロ−ス、カルボキシメチルセルロ
−スカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロ−ス
のようなセルロ−ス誘導体；アラビアゴム、デキストラ
ン、プルランなどの有機系賦形剤；及び軽質無水珪酸、
合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウ
ムなどの珪酸塩誘導体; 燐酸カルシウム等の燐酸塩；硫
酸カルシウムなどの硫酸塩などの無機系賦形剤を挙げる
ことが出来る。滑沢剤としては、例えばステアリン酸、
ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウムの
ようなステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；
ビ−ガム；ゲイ蝋のようなワックス類；硼酸；アジピン
酸；硫酸ナトリウムなどの硫酸塩；グリコ−ル；フマル
酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬ−ロイシン；脂肪酸ナト
リウム；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネ
シウムなどのラウリル硫酸塩；及び上記澱粉誘導体を挙
げることが出来る。結合剤としては、例えばポリビニル
ピロリドン、マクロゴ−ル及び前記賦形剤と同様な物質
を挙げることが出来る。崩壊剤としては、前記賦形剤と
同様な物質の他に、クロスカルメロ−スナトリウム、カ
ルボキシメチルスタ−チナトリウム、架橋ポリビニルピ
ロリドンのような化学修飾された澱粉、セルロ−ス類な
どを挙げることが出来る。安定剤としては、例えばメチ
ルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息
香酸エステル類；クロロブタノ−ル、ベンジルアルコ−
ル、フェネチルアルコ−ルのようなアルコ−ル類；塩化
ベンザルコニウム；フェノ−ル、クレゾ−ルなどのフェ
ノ−ル類；チメロサ−ル；デヒドロ酢酸；及びソルビン
酸を挙げることが出来る。矯味矯臭剤としては、例えば
通常使用される甘味料、酸味料、香料などを挙げること
が出来る。

【００３５】本発明のF-9775A 及びF-9775B の投与量
は、対象疾患、投与経路、投与回数などで異なるが、例
えば成人に対して経口投与の場合、１日１〜１０００ｍ
ｇを症状に応じて１回から数回に分けて投与するのが望
ましい。静脈内投与の場合、１日０．０１〜１００ｍｇ
を１回から数回に分けて、症状にあわせて投与するのが
望ましい。

【００３６】

【実施例】以下に実施例、試験例、製剤例を挙げて本発
明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され
ない。

【００３７】実施例１．［培養］下記の表１に示した培地Ａを１２０℃、２０分
加熱滅菌した。滅菌後の同培地をそれぞれ１００ｍｌ含
む５００ｍｌ三角フラスコにペシロマイセス・カ−ネウ
ス（Paecilomyces carneus） SANK15996株をスラントか
ら１白金耳接種し、２０℃、７日間しんとう培養した。
同じ培地Ａを１５Ｌづつ、３０Ｌジャ−培養器２基に分
注し、この前培養液を２０℃、７日間通気撹袢培養し
た。

【００３８】

【表１】培地Ａ培地組成グリセリン５０ｇモルトエキス（ディフコ）５ｇポテト５０ｇイ−ストエキス（ディフコ）５ｇニッサンディスフォ−ムＣＢ−４４２１０％アセトン溶液（日本油脂）０．５ｍｌ水道水１０００ｍｌ［単離・精製］培養終了液 (27 L) にセライト(1.5 kg)
を加えて菌体を濾別した。濾液(28L)をｐＨ３．０に調
整して酢酸エチル(20L, 30L)で２度抽出した。抽出液を
水道水(25L) 、飽和食塩水(27L) で順次洗浄した後、抽
出液を無水Na₂SO₄(1.0 kg)で脱水した。減圧下酢酸エチ
ルを留去して得られた油状物(9.3 g) のうち、3.0 g を
ヘキサンと９０％含水メタノ−ルで分配した。活性のあ
った９０％含水メタノ−ル層について、減圧下酢酸エチ
ルを留去して活性画分(8.4 g) を得た。この内、3.0 g
をHPLCカラム［Nova pack （ミリポア社製） 40 f x 21
0 mm］に供与し、溶媒（５０％含水メタノール＋０．３
％トリフロロ酢酸）を用いて50 ml/分の流速でクロマト
操作を行い、保持時間７−１１分の分画を集めて粗活性
分画(391.4mg)を得た。この粗活性分画のうち330 mgを
再度、HPLCカラム［Nova pack （ミリポア社製） 40 f
x 210 mm］に供与し、溶媒（４０％含水メタノール＋
０．２％トリフロロ酢酸）を用いて流速 50 ml/ 分でク
ロマト操作を行い、保持時間１７．５−１８．５分 (3
4.3 mg)及び３１−３７分 (101.4 mg) の画分を集め
た。前者は１０％含水エタノ−ル(20 ml) により再結晶
して、F-9775B 画分(11.1 mg) とした。後者も１０％含
水エタノ−ル(20 ml) により再結晶して、F-9775A 画分
(79.8 mg) とした。

【００３９】試験例１．［ヒトカテプシンＫのcDNAのクローニング］ヒトカテプ
シンＫの全翻訳領域をＰＣＲ法によりクローニングする
ために、既報（T.Inaoka et al : Biochem. Biophys.
Res. Commum., 206, 89-96(1995)参照）のカテプシンＫ
の塩基配列を基に、配列番号１及び配列番号２に示すプ
ライマーをオリゴ１０００DNA シンセサイザー（Oligo
1000 DNA synthesizer：ベックマン社製 (BECKMAN Co.,
Ltd.)）を用いて合成した。

【００４０】センス・プライマー：5'-GCAGGATGTGGGGGC
TCAAG-3'（配列番号：１）アンチセンス・プライマー：5'-GGAGTCACATCTTGGGGAAG-
3'（配列番号：２）ＰＣＲ法の鋳型としてはQuick-Screen^TM Human cDNA Li
brary Panel （クロンテック社製：CLONTECH Laborator
ies, Inc. ）を用いた。Quick-Screen^TM HumancDNA Lib
rary Panel に含まれるヒト肺ｃＤＮＡ（λgt11）を１
μl 、上記プライマー各２０μM を１μl ずつを用い、
ギブコ（GIBCO ）BRL 社のプロトコールに従い、反応容
量を１００μl として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件
は９４℃、２分間処理後、９４℃、１分間、５５℃、２
分間、７２℃、３分間の反応を２５回繰り返し行い、最
後に７２℃、７分間保温した。ＰＣＲ反応液１０μl を
１％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、文献
（T.Inaoka et al : Biochem. Biophys. Res. Commu
m., 206, 89-96(1995)参照）から予測される大きさ（９
９９ｂｐ）に相当するバンドが確認されたので、ＰＣＲ
法により増幅されたヒトカテプシンＫｃＤＮＡ断片をTA
クロ−ニング・キット（ Cloning Kit：インビトロゲン
社製（INVITOROGEN BV））を用い、キット添付のpCR^TM
IIプラスミドを用いて直接クローニングした。即ち、Ｐ
ＣＲ反応液２μl 、pCR ^TM II プラスミド溶液２μl 、
滅菌蒸留水４μl 、キット添付のライゲーション・バッ
ファー１μl 及びキット添付のリガーゼ１μl を混合
し、１６℃で一夜反応させた。反応液１μl を用い、 T
A クロ−ニング・キット（Cloning Kit ）添付の大腸菌
INV αF 株コンピテントセルを形質転換した。得られた
形質転換体より、プラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI
で処理し、ヒトカテプシンＫｃＤＮＡが挿入されたプラ
スミドを得たことを確認し、pCK1と命名した。当業者周
知の方法によりpCK1に挿入されたヒトカテプシンＫｃＤ
ＮＡの塩基配列を決定した。（配列番号：３）に示す通
り、既報の配列（T.Inaoka et al : Biochem. Biophy
s. Res. Commum.,206, 89-96(1995)参照）と一箇所異な
っていた（７６８のシトシンがチミンに変換）が、この
位置のＤＮＡがコードするアミノ酸（フェニルアラニ
ン）には変化が無かったので、このヒトカテプシンＫｃ
ＤＮＡを用い、大腸菌での発現系を構築した。

【００４１】試験例２．［ヒトカテプシンＫの大腸菌での発現ベクターの構築］
試験例１で得たヒトカテプシンＫｃＤＮＡよりプロ- 成
熟体領域のみを発現ベクターに挿入するために、以下の
配列番号４に示すセンス・プライマーと前述の配列番号
２に示すアンチセンス・プライマーを用いＰＣＲ法によ
りプロ- 成熟体領域のみを増幅した。

【００４２】センス・プライマー：5'-GGATCCTCTGTACCC
TGAGGAGATAC-3'（配列番号：４）なお、センス・プライマーには制限酵素BamHI の認識配
列を付加した。ＰＣＲの鋳型には試験例１で得たpCK1を
用い、ＰＣＲの反応条件は試験例１に示した条件で行な
った。増幅された断片を１％アガロースゲル電気泳動で
確認した後、試験例１で示したTAクローニング・キット
を用い、試験例１と同様の方法で形質転換体を得た。得
られた形質転換体より、プラスミドを抽出し、制限酵素
EcoRI で処理し、ヒトカテプシンＫ・プロ- 成熟体領域
のｃＤＮＡが挿入されたプラスミドを得たことを確認
し、pCKpro-mat1 と命名した。次に、pCKpro-mat1 をEc
oRI及びBamHI で処理し、１％アガロースゲル電気泳動
を行い、ヒトカテプシンＫのプロ- 成熟体領域を含むBa
mHI-EcoRI 断片をDNA 回収用フィルター付遠心チューブ
（宝酒造（株）製）を用い抽出した。抽出したヒトカテ
プシンＫのプロ- 成熟体領域を含むBamHI-EcoRI 断片Ｄ
ＮＡと、大腸菌の発現ベクターであるpTrcHisB(STRATAG
EN Ltd.,)をEcoRI 及びBamHI で処理したものをＤＮＡ
ライゲーションキット・ヴァージョン１（宝酒造株式会
社）を用い、１６℃、３０分間処理で連結し、大腸菌JM
109 株を形質転換した。得られた形質転換体より、プラ
スミドを抽出し、制限酵素EcoRI 及びBamHI で処理し、
ヒトカテプシンＫプロ- 成熟体領域のｃＤＮＡが発現ベ
クターpTrcHisBのEcoRI-BamHI 間に挿入されたプラスミ
ドを確認し、pTrcpmCK4 と命名した。

【００４３】試験例３．［ヒトカテプシンＫの大腸菌での発現及び変性型ヒトカ
テプシンＫの精製］大腸菌M15[pREP4]株（Nal^S， Str^S,
rif^S ， lac^-, ara^- , gal^-, mtl^-, F ^-,recA⁺, uv
r⁺）（キアゲン社製：QIAGEN GmbH ）を試験例２で作製
した発現プラスミドpTrcpmCK4 で形質転換した。形質転
換株を５０μg/mlのアンピシリン及び５０μg/mlのカナ
マイシンを含む２×ＹＴ培地 (２×ＹＴ :１６g バクト
・トリプトン（ディフコ社製：Difco)、１０g イースト
・エキストラクト（ディフコ社製：Difco)、５g 塩化ナ
トリウム／１L ）３mlに一白金耳植菌し、３７℃で一晩
培養したものを同培地100ml に1ml 植菌した。３７℃で
２時間半培養後、終濃度が１mMとなるようにイソプロピ
ルβ-D(-)-チオガラクトピラノシド（isopropylβ-D(-)
-thiogalactopyranoside (IPTG)）を添加し、更に５時
間培養を行なった。培養終了後、菌体を遠心分離（8,00
0 r.p.m., ５分間) により回収した。１０mlのネイティ
ブ・バインディング・緩衝液（Native binding buffer
：20mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.8), 500mM 塩化
ナトリウム）１０ｍｌで菌体を懸濁し、超音波処理によ
り菌体を破砕した。遠心分離（10,000 r.p.m.,１０分
間）後、沈澱物を１０ｍｌのディネイチャリング・バイ
ンディング・緩衝液Ｉ（Denaturing binding buffer
Ｉ：20mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.8), 500mM 塩化
ナトリウム, 8M尿素) に懸濁した。遠心分離（10,000
r.p.m.,１０分間）後上清を回収し、変性型ヒトカテプ
シンＫ溶液とした。次に、この変性型ヒトカテプシンK
溶液より、Xpress^TM System protein purification（イ
ンビトロゲン社製：INVITOROGEN BV）を用い、変性型ヒ
トカテプシンK を精製した。即ち、キット添付のProBon
d ^TM column をディネイチャリング・バインディング・
緩衝液Ｉで平衡化した後、上記変性型ヒトカテプシンK
溶液をProBond ^TM column に供した。１４ｍｌのディネ
イチャリング・バインディング・緩衝液Ｉ、１４ｍｌの
ディネイチャリング・バインディング・緩衝液ＩＩ（20
mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH6.0), 500mM 塩化ナトリ
ウム, 8M尿素）、１４ｍｌのディネイチャリング・バイ
ンディング・緩衝液ＩＩＩ（20mMリン酸ナトリウム緩衝
液 (pH5.3), 500mM 塩化ナトリウム, 8M尿素）で洗浄し
た後、１０ｍｌのディネイチャリング・溶出緩衝液（20
mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH4.0), 500mM 塩化ナトリ
ウム, 8M尿素）で溶出した。溶出画分１０ｍｌ中に、変
性型ヒトカテプシンＫは１０ｍｇ含まれており、これを
精製変性型ヒトカテプシンK 溶液（1mg/ml）とした。

【００４４】試験例４．［ヒトカテプシンK の活性化］試験例３で得た精製変性
型ヒトカテプシンＫ溶液に終濃度が其々10mM, 1mM とな
るようにジチオスレイトール（dithiothreitol (DT
T)）, エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ethylene
diamine tetra acetic acid, disodium salt：以下「ED
TA」という。）を加え、室温で２時間静置した。この溶
液 1 ml を４℃にて、100 ml のリフォールディング・
緩衝液（refolding buffer：50mMリン酸カリウム緩衝液
(pH10.7), 2.5mM EDTA, 1mM 還元型グルタチオン(reduc
ed formed glutathione), 0.1mM 酸化型グルタチオン(o
xidized formed glutathione) ）に１．５ml／時間で加
え、４℃にて一晩撹袢した。本操作終了後、遠心分離
（10,000r.p.m., １５分間）により不溶物を除去し、上
清を回収した。このとき上清のタンパク濃度は５μg/ml
となっていた。回収した上清（約 100 ml ）に終濃度が
１０μM となるようにペプスタチンＡ（pepstatin A ）
を添加し、２M 酢酸ナトリウム緩衝液 (pH3.0)でpH４．
０に調製後、室温で２時間静置し、活性型ヒトカテプシ
ンＫ溶液を得た（約 110 ml ）。

【００４５】試験例５．［ヒトカテプシンＫ阻害活性の測定］試験例４で得た活
性型ヒトカテプシンＫ溶液に終濃度が２mMとなるように
DTTを添加し、９６ウェルプレート（ヌンク社製：Nunc
FluoroNunc^TM Plates）の各ウエルに７５μl を加え
た。ここに、基質として0.2% ジメチルスルホキシドに
溶解した４０μM のＺ−フェニルアラニンーアルギニン
ーアミノメチルクマリン（Z-Phe-Arg-AMC(ペプチド研究
所) ）を２５μl と100% メタノールに溶解した被検検
体１μl を加え、３０℃で１５分間反応した。１００μ
l の反応停止液 (100mM モノクロロ酢酸(monochloroace
tic acid) 、30mM酢酸ナトリウム(sodiumacetate)、70m
M酢酸(acetic acid) 、(pH4.3) ）を加え、反応を終了
させた。反応終了後、蛍光測定機（ラブシステム社:Lab
ystems製 Labsystems FluoloskanII) で、励起波長３
５５nm、蛍光波長４６０nmで遊離したアミノメチルクマ
リンの蛍光を測定した。また、対照としては、被検検体
の替わりに被検検体の溶解に用いた溶媒（100% メタノ
ール）を１μl 加え、この時の酵素活性を１００％とし
て被検検体添加時の残存酵素活性を求めた。被検検体に
ついては100% メタノールで段階希釈を行い、以下の式
に従って求めた阻害率より阻害曲線を作りIC₅₀値を算出
した。

【００４６】カテプシンＫ阻害作用＝［１−（Ａ／Ｂ）］ × １００（％）Ａ：阻害物質存在下におけるアミノエチルクマリンの生
成量Ｂ：阻害物質非存在下におけるアミノエチルクマリンの
生成量Ｆ-9775A及びF-9775B のカテプシンＫに対する５０％阻
害濃度(IC₅₀)は、それぞれ28.8 mM 及び14.3 mM であっ
た。

【００４７】試験例６．［ヒトカテプシンＬ阻害活性の測定］浜野らの方法（特
開平８−３１８８号記載）で調製したラットカテプシン
Ｌ酵素に、同方法に従い基質・Ｚ−フェニルアラニンー
アルギニンーアミノメチルクマリン及び被検検体を反応
させ、本酵素で生成したアミノエチルクマリンを蛍光定
量した。また、対照としては被検検体を溶解した溶媒
（100% メタノールのみ）を加えたものとし、この時の
活性を１００％として残存活性を求めた。被検検体につ
いて100 % メタノールにより段階希釈を行い、以下の式
に従って求めた阻害率より阻害曲線を作りIC₅₀値を算出
した。

【００４８】カテプシンＬ阻害作用＝［１−（Ａ／Ｂ）］ × １００（％）Ａ：阻害物質存在下におけるアミノエチルクマリンの生
成量Ｂ：阻害物質非存在下におけるアミノエチルクマリンの
生成量Ｆ-9775A及びF-9775B のカテプシンＬに対する５０％阻
害濃度(IC₅₀ ) は、それぞれ98.9 mM 及び 61.3 mMであ
った。

【００４９】

【発明の効果】以上のように、Ｆ-9775A及びF-9775B
は、選択的カテプシンＫ阻害剤として骨粗鬆症等の治療
薬や予防薬として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトカテプシンＫの発現プラスミドの構築図。

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：Ｎｏアンチセンス：No 配列 GCAGGATGTG GGGGCTCAAG 20 配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGAGTCACAT CTTGGGGAAG 20 配列番号：３配列の長さ：９９０配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNAハイホ゜セティカル :No アンチセンス：No 起源生物名：ホモサピエンス組織：肺配列の特徴特徴を表す記号：CDS 位置：1..987 特徴を表す記号： mat_peptide 位置：343..987 特徴を表す記号: sig_peptide 位置：1..45 配列 ATG TGG GGG CTC AAG GTT CTG CTG CTA CCT GTG GTG AGC TTT GCT CTG 48 Met Trp Gly Leu Lys Val Leu Leu Leu Pro Val Val Ser Phe Ala Leu -114 -110 -105 -100 TAC CCT GAG GAG ATA CTG GAC ACC CAC TGG GAG CTA TGG AAG AAG ACC 96 Tyr Pro Glu Glu Ile Leu Asp Thr His Trp Glu Leu Trp Lys Lys Thr -95 -90 -85 CAC AGG AAG CAA TAT AAC AAC AAG GTG GAT GAA ATC TCT CGG CGT TTA 144 His Arg Lys Gln Tyr Asn Asn Lys Val Asp Glu Ile Ser Arg Arg Leu -80 -75 -70 ATT TGG GAA AAA AAC CTG AAG TAT ATT TCC ATC CAT AAC CTT GAG GCT 192 Ile Trp Glu Lys Asn Leu Lys Tyr Ile Ser Ile His Asn Leu Glu Ala -65 -60 -55 TCT CTT GGT GTC CAT ACA TAT GAA CTG GCT ATG AAC CAC CTG GGG GAC 240 Ser Leu Gly Val His Thr Tyr Glu Leu Ala Met Asn His Leu Gly Asp -50 -45 -40 -35 ATG ACC AGT GAA GAG GTG GTT CAG AAG ATG ACT GGA CTC AAA GTA CCC 288 Met Thr Ser Glu Glu Val Val Gln Lys Met Thr Gly Leu Lys Val Pro -30 -25 -20 CTG TCT CAT TCC CGC AGT AAT GAC ACC CTT TAT ATC CCA GAA TGG GAA 336 Leu Ser His Ser Arg Ser Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Pro Glu Trp Glu -15 -10 -5 GGT AGA GCC CCA GAC TCT GTC GAC TAT CGA AAG AAA GGA TAT GTT ACT 384 Gly Arg Ala Pro Asp Ser Val Asp Tyr Arg Lys Lys Gly Tyr Val Thr 1 5 10 CCT GTC AAA AAT CAG GGT CAG TGT GGT TCC TGT TGG GCT TTT AGC TCT 432 Pro Val Lys Asn Gln Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Ser 15 20 25 30 GTG GGT GCC CTG GAG GGC CAA CTC AAG AAG AAA ACT GGC AAA CTC TTA 480 Val Gly Ala Leu Glu Gly Gln Leu Lys Lys Lys Thr Gly Lys Leu Leu 35 40 45 AAT CTG AGT CCC CAG AAC CTA GTG GAT TGT GTG TCT GAG AAT GAT GGC 528 Asn Leu Ser Pro Gln Asn Leu Val Asp Cys Val Ser Glu Asn Asp Gly 50 55 60 TGT GGA GGG GGC TAC ATG ACC AAT GCC TTC CAA TAT GTG CAG AAG AAC 576 Cys Gly Gly Gly Tyr Met Thr Asn Ala Phe Gln Tyr Val Gln Lys Asn 65 70 75 CGG GGT ATT GAC TCT GAA GAT GCC TAC CCA TAT GTG GGA CAG GAA GAG 624 Arg Gly Ile Asp Ser Glu Asp Ala Tyr Pro Tyr Val Gly Gln Glu Glu 80 85 90 AGT TGT ATG TAC AAC CCA ACA GGC AAG GCA GCT AAA TGC AGA GGG TAC 672 Ser Cys Met Tyr Asn Pro Thr Gly Lys Ala Ala Lys Cys Arg Gly Tyr 95 100 105 110 AGA GAG ATC CCC GAG GGG AAT GAG AAA GCC CTG AAG AGG GCA GTG GCC 720 Arg Glu Ile Pro Glu Gly Asn Glu Lys Ala Leu Lys Arg Ala Val Ala 115 120 125 CGA GTG GGA CCT GTC TCT GTG GCC ATT GAT GCA AGC CTG ACC TCC TTT 768 Arg Val Gly Pro Val Ser Val Ala Ile Asp Ala Ser Leu Thr Ser Phe 130 135 140 CAG TTT TAC AGC AAA GGT GTG TAT TAT GAT GAA AGC TGC AAT AGC GAT 816 Gln Phe Tyr Ser Lys Gly Val Tyr Tyr Asp Glu Ser Cys Asn Ser Asp 145 150 155 AAT CTG AAC CAT GCG GTT TTG GCA GTG GGA TAT GGA ATC CAG AAG GGA 864 Asn Leu Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr Gly Ile Gln Lys Gly 160 165 170 AAC AAG CAC TGG ATA ATT AAA AAC AGC TGG GGA GAA AAC TGG GGA AAC 912 Asn Lys His Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu Asn Trp Gly Asn 175 180 185 190 AAA GGA TAT ATC CTC ATG GCT CGA AAT AAG AAC AAC GCC TGT GGC ATT 960 Lys Gly Tyr Ile Leu Met Ala Arg Asn Lys Asn Asn Ala Cys Gly Ile 195 200 205 GCC AAC CTG GCC AGC TTC CCC AAG ATG TGA 990 Ala Asn Leu Ala Ser Phe Pro Lys Met 210 215 配列番号：４配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）ハイポセティカル：No アンチセンス：No 配列 GGATCCTCTG TACCCTGAGG AGATAC ２
６

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/14 Ｃ１２Ｒ 1:79） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:79） (72)発明者石川裕一東京都品川区広町１丁目２番58号三共株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記式Ｉで示されるF-9775A ：【化１】
【請求項２】下記式ＩＩで示されるF-9775B ：【化２】
【請求項３】ペシロマイセス属に属するF-9775A 及び／
又はF-9775B 生産菌を培養し、該培養液からF-9775A 及
び／又はF-9775B を単離及び精製することを特徴とす
る、F-9775A 及び／又はF-9775B の製造法。
【請求項４】ペシロマイセス・カ−ネウス種に属するF-
9775A 及び／又はF-9775B 生産菌を培養し、該培養液か
らF-9775A 及び／又はF-9775B を単離及び精製すること
を特徴とする、F-9775A 及び／又はF-9775B の製造法。
【請求項５】ペシロマイセス・カ−ネウスSANK15996 株
を培養し、該培養液からF-9775A 及び／又はF-9775B を
単離及び精製することを特徴とする、F-9775A 及び／又
はF-9775B の製造法。
【請求項６】ペシロマイセス・カ−ネウスSANK15996
（FERM BP-5916) 株。
【請求項７】F-9775A 及び／又はF-9775B からなる医
薬。