JPH11106395A

JPH11106395A - 新規な糖脂質、その製造方法及びその用途

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Publication number: JPH11106395A
Application number: JP10008829A
Authority: JP
Inventors: Keisuke Ota; 慶祐太田; Kengo Sakaguchi; 謙吾坂口; Kotaro Nakayama; 小太郎中山; Kazuyoshi Masaki; 和好正木
Original assignee: Toyo Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Toyo Suisan Kaisha Ltd
Priority date: 1997-01-24
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 1999-04-20
Anticipated expiration: 2018-01-20
Also published as: JP4454051B2

Abstract

(57)【要約】【課題】特にβ型のＤＮＡ合成酵素に対する高い阻害
作用を有し、かつ非拮抗型の作用機序を有する新規生理
活性物質及びその製造方法を提供すること。【解決手段】次の式（Ｉ）【化１】により表される糖脂質。上記式（Ｉ）により表される糖
脂質は、紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラから抽出
することができる。上記式（Ｉ）で表される糖脂質は、
ＤＮＡ合成酵素β阻害剤、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害
剤、免疫抑制剤及び特に他の制癌剤と併用した場合に制
癌剤として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な糖脂質、そ
の製造方法並びに高等動物ＤＮＡ合成酵素及びＨＩＶ(h
uman immunodeficiency virus)由来逆転写酵素に対する
阻害剤、免疫抑制剤及び制癌剤としてのその用途に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】高等生物のＤＮＡ合成酵素群は、生体内
の細胞分裂、分化などに根源的に関与することから、生
物の恒常性維持に不可欠な要素である。ＤＮＡ合成酵素
群のうちＤＮＡ合成酵素α、β、γ、δ及びεの５種類
については、ここ１０年ほどで各々の酵素反応の特徴が
主にイン・ビトロでの証明から明らかになっている。

【０００３】例えば、ＤＮＡ合成酵素βは、ＤＮＡ鎖の
組み換え(recombination) に深く関与する酵素であると
いわれている。ここで「組み換え」とは、１つの細胞内
にあるＤＮＡ同士の組み換えをいい、特定蛋白をコード
するＤＮＡを、大腸菌などに組み込む遺伝子工学でいう
「組み換え」とは異なる。

【０００４】ＤＮＡ合成酵素βが関与するＤＮＡの組み
換えは、主に次の２つの場面で必要であると考えられて
いる。１つは、ＤＮＡ中に散在する傷の修復の際であ
り、他の１つは、細胞で新たな遺伝情報を発現する際で
ある。前者はＤＮＡの組み換え修復と呼ばれ、後者は体
細胞型ＤＮＡ組み換えと呼ばれる。

【０００５】ＤＮＡ合成酵素βが関与する上記２種類の
組み換えのうち体細胞型ＤＮＡ組み換えは、未だどのよ
うな組織で、あるいは生体反応のいかなる場面で起こり
うるか完全には分かっていないが、少なくとも免疫担当
細胞では必ず起こっているということが明らかになって
いる。

【０００６】例えば、広瀬らの「マウス組織中のＤＮＡ
合成酵素βの発現レベルにおける相違」(Experimental
Cell Research, 181(1989), 169-180)には、ＤＮＡ合成
酵素βは、動物組織のうち精巣、胸腺、脾臓、大脳にお
いて、酵素量としても、ｍＲＮＡの発現量でも突出して
多く存在することが報告されている（図２、３、４、表
１）。この広瀬らの文献には、胸腺、脾臓の組織におけ
るＤＮＡ合成酵素βが、体細胞型ＤＮＡ組み換えを司り
得ると記載されている（第１７８頁、第３１〜３８
行）。

【０００７】広瀬らによりＤＮＡ合成酵素βが多く存在
すると報告される上記４つの組織のうち胸腺及び脾臓
は、免疫担当細胞が多く存在する組織である。胸腺はＴ
リンパ球、脾臓はＢリンパ球の存在組織とされている。
Ｂリンパ球及びＴリンパ球は、侵入抗原に対し最も特異
的な抗体（Ｔリンパ球では細胞表面の抗原レセプター）
を産生すべく前駆細胞から分化する。このような、免疫
反応において限られた遺伝子情報から多様な（異なる無
数の）抗原に対し特異的に反応する抗体（又はＴリンパ
球抗原レセプター）を生産する仕組みにＤＮＡ合成酵素
βが関与していると考えられている。

【０００８】より詳細に説明すると、Ｂリンパ球では、
分化の途上で抗体蛋白をコードするＤＮＡのＶ遺伝子と
Ｊ遺伝子との間で、上述したＤＮＡ合成酵素βが関与す
る体細胞型ＤＮＡ組み換えが起こる。この組み換えをＶ
−Ｊ組み換えという。このような組み換えにより、限ら
れた遺伝情報から組み合わせを変えることにより多様な
抗体蛋白を生産し得る。これをＤＮＡ再構成という。

【０００９】Ｔリンパ球の抗体レセプター蛋白も抗体と
同様、該当ＤＮＡの組み換え、再構成により、多様な、
言い換えれば個々の抗原の違いに対応できる特異的なレ
セプターを産生できる。

【００１０】このように、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反
応のＤＮＡ再構成において抗原特異的に反応する抗体あ
るいはレセプター分子を作り出す根源に関与するといえ
る。したがって、ＤＮＡ合成酵素βを阻害すると、ＤＮ
Ａ再構成を中心とした免疫反応が抑制されると推測され
る。

【００１１】上述したように、免疫反応において限られ
た遺伝子情報から多様な抗原に対し特異的に反応する抗
体を生産する仕組みとしてＶ−Ｊ組み換えが存在する一
方で、多様性の獲得には、このほかにもう一つ別の分子
機構がある。すなわち、抗体遺伝子上に変異が起こるこ
とにより、組み換えと併せて更に多様性に幅ができると
いうものである。ここでいう「変異」は、例えば抗体蛋
白の一部分が全て欠落してしまうような大規模なもので
はなく、塩基配列の一部が置換されたり新たな配列が挿
入されてアミノ酸の構成が少しづつ違う抗体ができると
いうようなものである。したがって、変異といっても有
害なものではなく、むしろある程度までは発生した方が
免疫反応には都合が良いということになる。

【００１２】この変異にもＤＮＡ合成酵素βが一定の役
割を果たしていると考えられている。例えば、トーマス
(Thomas)らによる「末端トランスフェラーゼにより仲介
されるＤＮＡの転移」(Proceedings National Academy
of Science of the United States of America, vol. 8
3, pp.1867-1871, March 1986)には、ＴｄＴ(terminal
deoxyribonucleotidyl transferase) とＤＮＡ合成酵素
βを共存させた実験系で変異の頻度を測定した結果が報
告されている。ＴｄＴは、上記５つのＤＮＡ合成酵素α
〜εとは異なる特殊なＤＮＡ合成酵素であり、トーマス
らによれば、変異の出現又はその頻度を上げるのに密接
に絡んでいるとされる酵素である。トーマスらの文献の
表２には、ＴｄＴの濃度に依存して変異頻度も上昇し、
最大の４４％の変異頻度は、ＤＮＡ合成酵素β単独の場
合よりも、ＴｄＴ単独の場合よりも高いことが報告され
ている。さらに、トーマスらの文献には、ＴｄＴとＤＮ
Ａ合成酵素βとの両酵素が競合的に反応して変異を起こ
すと記載されている（１８６８頁、左欄）。

【００１３】トーマスらの報告から、ＤＮＡ合成酵素β
は、ＴｄＴが誘発する変異を、少なくとも補助的に増幅
させる役割を果たしていると解釈することができる。す
なわち、ＤＮＡ合成酵素βは、変異による抗体の多様性
に一定の役割を果たしていることになる。このことから
も、ＤＮＡ合成酵素βの阻害は免疫反応を抑制すること
につながると考えられる。

【００１４】現在、ＤＮＡ合成酵素βを選択的に阻害す
る化合物としては、ジデオキシＴＴＰが知られている
（テルサ(Tersa) ら、Annual Review of Biochemistry
1991 60 513-552)。しかしながら、ジデオキシＴＴＰ
は、生体内では毒性が強く、際立つ生理活性は観察され
ていない。

【００１５】一方、ＤＮＡ合成酵素群の酵素のうちＨＩ
Ｖ由来逆転写酵素は、周知のごとくＨＩＶ感染時の中心
的役割を担う酵素である。ＨＩＶ由来逆転写酵素を阻害
することによりＨＩＶに対して治療効果をもたらし得る
ことは、例えばアジドチミジンのような既に市販の臨床
薬によっても実証されている（日本医薬情報センター
編、株式会社薬事時報社発行、「１９９６年度版医療
薬日本医薬品集」、第５９９頁）。しかしながら、容
易に変異するＨＩＶに対してはアジドチミジンなど現存
の薬剤のみでは対応が難しく、新たなＨＩＶ由来逆転写
酵素に対する阻害物質の開発が望まれている。

【００１６】上記ジデオキシＴＴＰ、アジドチミジンを
含む多くのＤＮＡ合成酵素阻害物質は、その構造がＤＮ
Ａの類似体であり、ＤＮＡ合成反応において拮抗型阻害
を示す。拮抗型の阻害剤は、その阻害率は良好である反
面、他の様々なＤＮＡ代謝酵素にも取り込まれてしまい
生体に対する副作用を示す一因となり得る欠点を有して
いる。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明は、特
にβ型のＤＮＡ合成酵素に対する高い阻害作用を有し、
かつ非拮抗型の作用機序を有する新規生理活性物質及び
その製造方法を提供することを課題とする。

【００１８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、特定の藻
類から抽出される糖脂質が、ＤＮＡ合成酵素βに対する
高い阻害作用を有し、かつ非拮抗型の作用機序を有する
こと、さらには、この糖脂質がＨＩＶ由来逆転写酵素に
対する阻害作用、及び特に特定の制癌剤と併用すること
により癌細胞増殖抑制作用を有することを見い出し本発
明を完成するに至った。

【００１９】また、上述したように、ＤＮＡ合成酵素β
は、免疫反応の根源に関与する酵素である。したがっ
て、ＤＮＡ合成酵素βの阻害活性を有する本発明の糖脂
質は、免疫抑制剤として作用すると考えられる。すなわ
ち、本発明は次の（１）〜（６）を提供する。（１）次の式（Ｉ）

【００２０】

【化７】により表される糖脂質。

【００２１】（２）紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネ
ラから上記式（Ｉ）により表される糖脂質を製造する方
法において、前記紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラ
をアセトン、酢酸エチル、クロロホルム、メタノール又
はクロロホルム−メタノール混液からなる群から選ばれ
る有機溶媒又は有機溶媒混液の１つにより抽出する工程
と、前記有機溶媒抽出物を減圧濃縮する工程と、前記減
圧濃縮した抽出物を酸性条件下に酢酸エチル−水による
層分配に供し、水層を分離する工程と、前記分離した水
層をアルカリ性条件下に酢酸エチルとの層分配に供し、
酢酸エチル層を分離する工程と、前記分離した酢酸エチ
ル層を減圧濃縮し、得られた緑色の粗粉末を回収する工
程と、前記粗粉末を精製する工程と、前記精製工程で得
られた溶液を減圧濃縮し、得られた白色粉末を回収する
工程とを具備することを特徴とする方法。

【００２２】（３）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有
効成分とする医薬。（４）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有効成分とする
ＤＮＡ合成酵素β阻害剤。

【００２３】（５）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有
効成分とするＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤。（６）上記式（Ｉ）で表される糖脂質を有効成分とする
免疫抑制剤。

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、本発明の式（Ｉ）で表され
る糖脂質（以下ＫＭ０４３ともいう）について詳細に説
明する。本発明のＫＭ０４３の製造方法の一例を挙げ
る。

【００２５】すなわち、海藻類から有機溶媒により抽出
される物質を、酸性条件下に有機溶媒と水との液層分配
に供する。得られた水層をアルカリ性条件下に有機溶媒
との液層分配に供する。得られた有機層をさらに精製す
ることにより本発明のＫＭ０４３を製造することができ
る。

【００２６】海藻としては、例えば紅藻スギノリ属ギガ
ルティナ・テネラ(Gigartina tenella) を用いることが
できる。抽出溶媒としては、例えばアセトン、酢酸エチ
ル、クロロホルム、メタノール又はクロロホルム−メタ
ノール混液（２：１（体積比））を用いることができ
る。抽出溶媒としては、アセトンがＫＭ０４３の収量の
観点から好ましい。

【００２７】抽出溶媒は、ＫＭ０４３の抽出効率の観点
からできるだけ多く用いることが好ましい。抽出溶媒
は、通常、海藻乾燥重量の５倍以上を用い、海藻乾燥重
量の３０倍の抽出溶媒を用いるとより抽出効率が上が
る。しかしながら、抽出溶媒の量は、抽出効率とコスト
等の観点から適宜設定することができる。

【００２８】本発明のＫＭ０４３の製造方法をより詳細
に説明する。ギガルティナ・テネラ藻体の乾燥物を粉砕
処理し、アセトンで抽出する。得られたアセトン層を減
圧濃縮後、好ましくはpH２〜５、さらに好ましくはpH２
の条件下に酢酸エチルと酢酸エチルに対して１〜３倍体
積の水とにより液層分配を行う。液層分配に用いる水の
量は、酢酸エチルに対して３倍体積が好ましい。得られ
た水層に対して１〜３倍体積、好ましくは３倍体積の酢
酸エチルを添加、混合し、好ましくはpH９〜１１、さら
に好ましくはpH９の条件下に液層分配を行い、酢酸エチ
ル層を得る。これを減圧濃縮すると緑色の粗粉末が得ら
れる。

【００２９】この粗粉末は、例えば次のような工程にさ
らに供することにより精製することができ、白色粉末状
の本発明の糖脂質の精製物が得られる。すなわち、得ら
れた粗粉末を、次の精製工程であるシリカゲルカラムク
ロマトグラフィーの展開溶媒として用いる有機溶媒に溶
解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーに付す。展
開溶媒としては、例えば酢酸エチル、メタノールを用い
ることができる。酢酸エチル−メタノール−水（１０
０：３０〜１５：５、好ましくは１００：２０：５（い
ずれも体積比））の混合溶媒で溶出する分画を集める。
これを減圧濃縮後、高速液体クロマトグラフィーに付
し、アセトニトリル８０〜７０％水溶液、好ましくは７
０％水溶液により溶出する分画を得る。これを減圧濃縮
後、さらに高速液体クロマトグラフィーに付し、アセト
ニトリル７０〜６０％、好ましくは６５％水溶液により
溶出する分画を得る。この分画を減圧濃縮することによ
り、白色粉末状の本発明の糖脂質の精製物が得られる。

【００３０】ＫＭ０４３は、上記の方法以外に、セファ
デックスＬＨ−２０（ファルマシア社製）等による分配
クロマトグラフィー、他の活性アルミナ樹脂、イオン交
換樹脂のような適当な既知の吸着剤に吸着させて溶離さ
せる方法、あるいは高速液体クロマトグラフィー法など
を組み合わせることにより精製することもできる。

【００３１】本発明のＫＭ０４３及びその薬学的に許容
し得る塩は、医薬として用いることができる。具体的に
は、本発明のＫＭ０４３及びその薬学的に許容し得る塩
（以下、医薬の説明において、単に「本発明のＫＭ０４
３」ともいう）は、免疫抑制剤、ＨＩＶに対する抗ウイ
ルス剤、抗癌剤又は既存の抗癌剤と共に治療効果を促進
するための助剤として用いることができる。

【００３２】ＫＭ０４３の薬学的に許容し得る塩の例と
しては、ナトリウム及びカリウムのような一価の陽イオ
ンの塩を挙げることができる。本発明のＫＭ０４３を医
薬として用いる場合、ＫＭ０４３を単独で用いることも
できるが、薬学的製剤として用いることが好ましい。薬
学的製剤において、本発明のＫＭ０４３は、薬学的に許
容され得る適切な担体または希釈剤等と組み合わせて製
剤することができる。また、本発明のＫＭ０４３は、薬
学的製剤において、薬学的に許容され得る他の活性化合
物と共に用いることもできる。

【００３３】本発明のＫＭ０４３を含有する薬学的製剤
は、経口投与、非経口投与又は直腸内投与することがで
きる。薬学的製剤は、これらの各の投与経路に対して適
切な、それ自体は既知の通常用いられる方法により固
体、半固体、液体又は気体の剤形にすることができる。
具体的には、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロッ
プ剤、エリキシル剤、懸濁剤・乳剤、坐剤、注射剤、吸
入剤及びエアロゾルなどの剤形とすることができる。し
かしながら、本発明のＫＭ０４３を含有する薬学的製剤
の剤形はこれらに限定されるものではない。

【００３４】本発明のＫＭ０４３を経口投与する場合、
錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキ
シル剤、懸濁剤・乳剤等に製剤することができる。錠
剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤には、本発明のＫＭ０４
３を適切な担体と共に処方することにより製剤すること
ができる。好適な担体として用い得るものには、例えば
ラクトース、マンニトール、コーンスターチ又は馬鈴薯
デンプンのような通常用いられる担体；結晶セルロー
ス、セルロース誘導体、コーンスターチ又はゼラチンの
ようなバインダー；コーンスターチ、馬鈴薯デンプン又
はカルボキシメチルセルロースナトリウムのような錠剤
崩壊剤；タルク又はステアリン酸マグネシウムのような
潤滑剤等が含まれ、さらに、必要に応じて、希釈剤、緩
衝剤、浸潤剤、保存剤及びフレーバー剤等を添加するこ
とができる。

【００３５】シロップ剤、エリキシル剤及び懸濁剤・乳
剤には、所定量のＫＭ０４３と注射用滅菌水や規定生理
食塩水のような薬学的に許容され得る溶媒を用い単位剤
型に調製することができる。本明細書において、「単位
剤型」との用語は、投与対象のための単位となる容量と
して適する物理的に個別の単位を指し、各単位は薬学的
に許容され得る希釈剤、担体又は溶媒等と共に、必要な
薬効を与えるのに十分な量に計算されたＫＭ０４３を所
定量含有するものをいう。

【００３６】また、本発明のＫＭ０４３は、液体又は微
細粉末の形態で吸入用製剤として処方することができ
る。吸入用製剤には、気体又は液体の噴霧剤と共に、必
要に応じて浸潤性付与剤のような従来用いられる助剤を
添加することができる。吸入用製剤としては、本発明の
ＫＭ０４３をエアロゾル容器に充填することもできる
し、ネブライザーのような非加圧容器に充填することも
できる。エアロゾル容器に充填する場合、本発明のＫＭ
０４３は、ジクロロフルオロメタン、プロパン、窒素等
の薬学的に許容し得る加圧ガス中に添加したものとする
ことができる。

【００３７】非経口投与する場合、本発明のＫＭ０４３
は、植物性油、合成樹脂酸グリセリド、高級脂肪酸のエ
ステル又はプロピレングリコールのような水性又は非水
性の溶媒中に溶解、懸濁又は乳化し、さらに、必要に応
じて可溶化剤、浸透圧調節剤、乳化剤、安定剤及び保存
料のような従来の添加剤を添加することにより注射用製
剤として処方することができる。

【００３８】直腸内投与する場合、本発明のＫＭ０４３
を乳化基剤又は水溶性基剤のような種々の基剤と混合す
ることにより坐薬製剤として処方することができる。基
剤の一例を挙げると、体温で融解するが室温では固化し
ているカカオバター、カーボンワックス及びポリエチレ
ングリコールなどがある。

【００３９】本発明のＫＭ０４３の投与量は、その用途
すなわち、免疫抑制剤、ＨＩＶに対する抗ウイルス剤、
抗癌剤及び既存の抗癌剤と共に治療効果を促進するため
の助剤、並びに投与経路、対象とする疾病の程度や段階
等に応じて適宜設定することができる。一例を挙げる
と、ＫＭ０４３を経口剤として投与する場合には、好ま
しくは１〜８０ｍｇ／ｋｇ体重／日に設定することがで
きる。ＫＭ０４３を注射剤として投与する場合には、１
〜３０ｍｇ／ｋｇ体重／日に設定することができる。こ
れらの投与量は、医者等のような治療を行う者により、
治療対象者の病状等に対応させて適宜調節することがで
きる。

【００４０】

【実施例】以下に本発明の実施例を説明するが、本発明
は、これらに限定されるものではない。（実施例１）本発明の一般式（Ｉ）で表される糖脂質の抽出及び精製海浜より採取したギガルティナ・テネラ藻体の乾燥物約
２００グラムを粉砕処理し、２リットルのアセトンで１
週間抽出した。

【００４１】抽出物を減圧濃縮後、酢酸エチル−水
（１：１（体積比））を用いてpH２条件下に液層分配を
行い、水層を得た。残りの酢酸エチル層にこれと同体積
の水を添加し、pH２条件下に液層分配を行い、水層を得
た。再度残りの酢酸エチル層にこれと同体積の水を添加
し、pH２条件下に液層分配を行い、水層を得た。得られ
た水層を集め、水層に対して同体積の酢酸エチルを添加
し、pH９の条件下に液層分配を行い、酢酸エチル層を得
た。残りの水層にこれと同体積の酢酸エチルを添加し、
pH９の条件下に液層分配を行い、酢酸エチル層を得た。
再度残りの水層にこれと同体積の酢酸エチルを添加し、
pH９の条件下液層分配を行い、酢酸エチル層を得た。得
られた酢酸エチル層を集め、これを減圧濃縮し、緑色の
粗粉末を得た。この緑色の粉末を酢酸エチルに再溶解
し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(4cm×40cm、
ワコーゲルC ２００和光純薬社製）に付し、酢酸エチ
ル−メタノール−水（１００：２０：５（体積比））の
混合溶媒で溶出する分画を集めた。これを減圧濃縮する
ことにより得られる黄色の粗粉末を、高速液体クロマト
グラフィー(C18カラム YMC D-ODS-5-ST 120A （株）ワ
イエムシイ社製) に付し、アセトニトリル７０％水溶液
により溶出する分画を得た。これを減圧濃縮後、さらに
高速液体クロマトグラフィー(C8 カラム InertsilC8
ジーエルサイエンス（株）製）に付し、アセトニトリル
６５％水溶液により溶出する分画を得た。この分画を減
圧濃縮し、本発明の式（Ｉ）により表される糖脂質（Ｋ
Ｍ０４３）を白色粉末として約２ミリグラム得た。

【００４２】上記実施例１で得られたＫＭ０４３は、結
晶化させることができず、融点を測定することができな
かった。＜測定例１＞上記実施例１で得た白色粉末を高速原子衝
撃質量分析(FAB-MS)に供した。得られたスペクトルを図
１に示す。

【００４３】図１のスペクトルより、FAB-MS m/z 839.2
(M-H) ^- が得られ、ＫＭ０４３の分子量（測定値）とし
て８４０を得た。（分子式：Ｃ₄₅Ｈ₇₆Ｏ₁₂Ｓからの計算
値：８４０）。

【００４４】＜測定例２＞実施例１で得たＫＭ０４３に
ついて、溶媒としてＣＤ₃ ＯＤ（重メタノール）、内部
標準にＴＭＳ（テトラメチルシラン）を用い、¹ Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルを測定した。

【００４５】得られたスペクトルを図２に示す。図２に
おいて、（ａ）〜（ｆ）を付したシグナルは、それぞれ
次のものと思われる。

【００４６】（ａ）メチル基、（ｂ）メチレン鎖、（ｃ）＝ＣＨ−ＣＨ₂ −ＣＨ₂ −、（ｄ）−ＣＨ₂ −ＣＯ−、（ｅ）＝ＣＨ−ＣＨ₂ −ＣＨ＝、（ｆ）−ＣＨ₂ −ＨＣ＝ＣＨ−ＣＨ₂ − 上記シグナル（ａ）〜（ｆ）は、ＫＭ０４３の構造にお
いて不飽和高級脂肪酸鎖の存在を示すものであり、式
（Ｉ）の構造と合致した。シグナル（ｄ）は、ＫＭ０４
３において脂肪酸と糖がグリセロール骨格を介して結合
する「グリセロ糖脂質」であることを示唆し、式（Ｉ）
の構造と合致する。

【００４７】図２において、シグナル（ｇ）及び（ｇ'
）は、それぞれが糖のプロトンを示すものである。こ
のことから、実施例１で得られたＫＭ０４３の糖部分が
単糖であり、その１位と２位以下のプロトンの組み合わ
せを示すものであり、式（Ｉ）の構造と合致する。

【００４８】＜測定例３＞実施例１で得たＫＭ０４３を
中性メタノールに溶解し、ＵＶスペクトルを測定した。

【００４９】得られたスペクトルを図３に示す。＜測定例４＞実施例１で得たＫＭ０４３を以下に示す薄
層クロマトグラフィーに付し、Ｒf値を求めた。

【００５０】吸着剤：シリカゲルプレート(Kieselgel60
F254 メルク社製）展開溶媒が酢酸エチル−メタノール−水（１００：２
０：５）の場合のＲf 値は０．２０であった。

【００５１】展開溶媒がイソプロパノール−メタノール
（５：１）の場合のＲf 値は０．1０であった。＜測定例５＞実施例１で得たＫＭ０４３について、化学
分解後、ガスクロマトグラフィーを行い、結合する脂肪
酸を調べた。

【００５２】得られたガスクロマトグラフを図４に示
す。図４のガスクロマトグラフから、Ｃ_16:0とＣ_20:5の
脂肪酸に対応するピークの面積が同じであることが分か
り、従って１：１の割合でそれぞれの脂肪酸がグリセロ
ール骨格に存在することを示すものである。

【００５３】＜測定例６＞実施例１で得たＫＭ０４３の
旋光度を測定し、［α］_D＝＋５７．０２°（ｃ＝０．
１１ＭｅＯＨ）を得た。

【００５４】＜定性試験１＞上記実施例１で得たＫＭ０
４３は、メタノール、ジメチルスルフォキシドに易溶で
あり、水、クロロホルムに難溶であった。

【００５５】＜定性試験２＞上記実施例１で得たＫＭ０
４３は、硫酸オルシノール、ヨードに対して陽性であっ
た。この結果は、ＫＭ０４３に炭素化合物が含有される
ことを示すものであり、式（Ｉ）の構造と合致する。

【００５６】＜定性試験３＞上記実施例１で得たＫＭ０
４３は、ニンヒドリンに対して陰性であった。この結果
は、ＫＭ０４３には蛋白、ペプチド、アミノ酸が含有さ
れていないことを示すものであり、式（Ｉ）の構造と合
致する。

【００５７】＜測定例７＞上記実施例１で得られたＫＭ
０４３のＤＮＡ合成酵素群に対する活性を次の方法で調
べた。

【００５８】ＤＮＡ合成酵素群としてＤＮＡ合成酵素
α、ＤＮＡ合成酵素β及びＨＩＶ由来のＤＮＡ合成酵素
（逆転写酵素）を試験した。ＤＮＡ合成酵素αは、牛胸
腺から常法により抽出精製した標品を、ＤＮＡ合成酵素
βは、ラット由来の該当遺伝子を通常の遺伝子組み換え
法により大腸菌に組み込み、生産させた標品を、ＨＩＶ
由来のＤＮＡ合成酵素（逆転写酵素）は、市販（Worthi
ngton Biochemical 社製）の標品を用いた。

【００５９】これらのＤＮＡ合成酵素に対するＫＭ０４
３の阻害作用の測定には、一般的なＤＮＡ合成酵素反応
系（日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸ＩＶ、
東京化学同人、第６３頁〜６６頁）を用いた。すなわ
ち、放射性同位元素で標識した［³ Ｈ］−ＴＴＰを含む
系においてＤＮＡ合成酵素反応を行い、放射比活性を生
成物（合成ＤＮＡ鎖）量の指標とするものである。

【００６０】阻害率は、（ａ）コントロールでの合成Ｄ
ＮＡ量、（ｂ）実施例１に示した方法で生成したＫＭ０
４３の存在下での合成ＤＮＡ量について、（ａ−ｂ）／ａ×１００＝阻害率（％）として評価した。得られた結果を次の表１に示す。

【００６１】

【表１】

【００６２】表１の結果から、ＫＭ０４３は、ＤＮＡ合
成酵素βに対して高い阻害作用を有することが分かる。
上記従来の技術の欄において説明したように、ＤＮＡ合
成酵素βは、免疫反応のＤＮＡ再構成において抗原特異
的に反応する抗体あるいはレセプター分子を作り出す根
源に関与するとともに、変異による抗体の多様性に一定
の役割を果たしているともいわれている。これらのこと
から、ＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応に密接に関連し、
ＤＮＡ合成酵素βを抑制することは、免疫反応の抑制に
つながると推測される。よって、ＤＮＡ合成酵素β抑制
作用を有するＫＭ０４３は、免疫抑制剤としての作用を
有することが期待される。

【００６３】表１の結果から、ＫＭ０４３は、ＨＩＶ由
来ＤＮＡ合成酵素（逆転写酵素）に対しても高い阻害作
用を有することが分かる。＜測定例８＞上記実施例１で得られたＫＭ０４３のＤＮ
Ａ合成酵素阻害の作用機構をLineweaver-Burk プロット
により調べた。

【００６４】ＤＮＡ合成酵素βに関してＫＭ０４３は、
活性化ＤＮＡ及びｄＴＴＰに対し共に非拮抗的阻害を示
した。＜測定例９＞上記実施例１で得られたＫＭ０４３の癌細
胞増殖抑制効果を次の方法を用いて評価した。

【００６５】i)細胞培養方法本実験に用いた細胞は、ヒト子宮癌由来Ｈｅｌａ−Ｓ３
細胞である。培地としては、イーグル最少（ＭＥＭ）培
地（日水製薬社製）に、０．２％（Ｗ／Ｖ）炭酸水素ナ
トリウム、０．０００３％（Ｗ／Ｖ）グルタミン、及び
子牛血清１０％（V ／V ）を添加したものを用いた。培
養は、５％ＣＯ₂ インキュベータにて３７℃で行った。

【００６６】ii) ＫＭ０４３の添加および細胞生存率の
測定上記に示した培地に、予め各試験濃度になるようにＫＭ
０４３を溶解した。ただし、ＫＭ０４３は水に難溶であ
るため、一度ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシド）に溶
解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培養中
の培地内に存在するＤＭＳＯの終濃度は、すべての試験
区で１％以下になっており、本測定例で用いたＨｅｌａ
−Ｓ３細胞の増殖の抑制にＤＭＳＯが関わる可能性は否
定できる状態である。

【００６７】本試験のための培養は、９６穴マイクロプ
レートで行った。各ウエルに２．０×１０³ 個の細胞を
植込み、１つの試験濃度に対し３ウエルずつ与えた。ま
たポジティブコントロールとして培地に１％のＤＭＳＯ
を含むものを用いた。

【００６８】ＫＭ０４３添加後は、５％ＣＯ₂ インキュ
ベータ内、３７℃で４８時間培養し、各試験区の細胞生
存率の判定を行った。生存率の判定は、文献（「Rapid
Colorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva
l: Application to Proliferation and Cytotoxicity A
ssays 」、Tim Mosmann, Journal of Immunological Me
thods, 65 (1983) 55 〜63）に記載されているＭＴＴア
ッセイ法を用いた。即ち、上記４８時間培養後テトラゾ
リウム塩ＭＴＴを添加し、更に４時間培養した。生細胞
による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞数に比
例するとみなし、５７０ｎｍの光学密度（Ｏ．Ｄ．）で
定量した。

【００６９】細胞生存率は次の式により算出した。細胞生存率（％）＝試験区のＯ. Ｄ. ［５７０ｎｍ］／
対照区のＯ. Ｄ. ［５７０ｎｍ］得られた結果を図５に示す。なお図５に示すデータは３
ウエルの平均値である。

【００７０】図５の結果から、ＫＭ０４３は、濃度依存
的に癌細胞の増殖を抑えることが分かる。しかしなが
ら、その細胞増殖抑制作用は、ブレオマイシンのような
既知抗癌剤に比べると低い。

【００７１】＜測定例１０＞上記実施例１で得られたＫ
Ｍ０４３が他の抗癌剤と併用された場合に示す抗癌作用
を次の方法を用いて測定した。

【００７２】i)細胞培養細胞培養条件は、上記測定例９と同じに行った。 ii) ＫＭ０４３及びブレオマイシン(Bleomycin) の添加予め５０μＭのＫＭ０４３（上記測定例９と同じ方法で
溶解した）と所定濃度のブレオマイシンを溶解した培地
（１）：「ＫＭ０４３５０μＭ＋ブレオマイシンの試
験区」、及び所定濃度のブレオマイシンのみを溶解した
培地（２）：「ブレオマイシンのみの試験区」）を用意
した。

【００７３】各ブレオマイシン濃度に対しては、３ウエ
ルずつを与えた。各ウエルには２．０×１０³ 個の細胞
を植込み、続いて薬剤を含む培地を加えた。「ＫＭ０４
３５０μＭ＋ブレオマイシンの試験区」、「ブレオマ
イシンのみの試験区」について、それぞれ５％ＣＯ₂ イ
ンキュベータ内、３７℃で４８時間培養後、細胞生存率
を測定した。（測定方法は、上記測定例９と同じ）。

【００７４】得られた結果を図６に示す。図６におい
て、破線により結ばれる黒い丸は、培地（１）：「ＫＭ
０４３５０μＭ＋ブレオマイシンの試験区」の結果
を、実線により結ばれる黒い四角は培地（２）：「ブレ
オマイシンのみの試験区」の結果を表す。

【００７５】図６の結果から、実施例１で得たＫＭ０４
３は、測定例９に示したようにその濃度が癌細胞の増殖
にほとんど影響がないほどの低濃度（５０μＭ）である
にもかかわらず、低濃度のブレオマイシンと併用するこ
とによりブレオマイシンのみの場合より癌細胞の増殖を
強く抑えることが分かる。

【００７６】現在、抗癌剤治療においてその副作用が問
題となっているが、実施例１で得たＫＭ０４３を併用す
ることにより、抗癌剤の量をへらしつつ同等の治療効果
を維持することができると考えられる。

【００７７】

【発明の効果】本発明によれば、新規な糖脂質、その製
造方法及びその用途が提供される。本発明の式（Ｉ）で
表される糖脂質は特にβ型のＤＮＡ合成酵素に対する高
い阻害作用を有し、かつ非拮抗型の作用機序を有する。

【００７８】このようなＤＮＡ合成酵素βは、免疫反応
の根元に関与する酵素であるので、ＤＮＡ合成酵素βの
阻害活性を有する式（Ｉ）で表される糖脂質は、免疫抑
制剤として作用すると考えられる。さらに、その作用機
序が非拮抗型であるので、式（Ｉ）で表される糖脂質
は、生体に対する副作用が少ないことが予想される。

【００７９】また、式（Ｉ）で表される糖脂質は、ＨＩ
Ｖ由来逆転写酵素阻害作用を有する。さらに、式（Ｉ）
で表される糖脂質は、特に他の抗癌剤との併用により強
い癌細胞増殖抑制作用を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質の高速原子
衝撃質量分析スペクトル。

【図２】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質の¹ Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトル。

【図３】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質のＵＶスペ
クトル。

【図４】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質のガスクロ
マトグラフ。

【図５】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質（単独）の
癌細胞増殖抑制作用を表すグラフ。

【図６】本発明の式（Ｉ）で表される糖脂質（併用）の
癌細胞増殖抑制作用を表すグラフ。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ // Ａ６１Ｋ 35/80 Ａ６１Ｋ 35/80 Ｚ (72)発明者正木和好東京都港区港南２丁目13番40号東洋水産株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次に示す式（Ｉ）【化１】により表される糖脂質。
【請求項２】紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラか
ら次に示す式（Ｉ）【化２】により表される糖脂質を製造する方法において、前記紅藻スギノリ属ギガルティナ・テネラをアセトン、
酢酸エチル、クロロホルム、メタノール又はクロロホル
ム−メタノール混液からなる群から選ばれる有機溶媒又
は有機溶媒混液の１つにより抽出する工程と、前記有機溶媒抽出物を減圧濃縮する工程と、前記減圧濃縮した抽出物を酸性条件下に酢酸エチル−水
による層分配に供し、水層を分離する工程と、前記分離した水層をアルカリ性条件下に酢酸エチルとの
層分配に供し、酢酸エチル層を分離する工程と、前記分離した酢酸エチル層を減圧濃縮し、得られた緑色
の粗粉末を回収する工程と、前記粗粉末を精製する工程と、前記精製工程で得られた溶液を減圧濃縮し、得られた白
色粉末を回収する工程とを具備することを特徴とする方
法。
【請求項３】次の式（Ｉ）【化３】により表される糖脂質を有効成分とする医薬。
【請求項４】次の式（Ｉ）【化４】により表される糖脂質を有効成分とするＤＮＡ合成酵素
β阻害剤。
【請求項５】次の式（Ｉ）【化５】により表される糖脂質を有効成分とするＨＩＶ由来逆転
写酵素阻害剤。
【請求項６】次の式（Ｉ）【化６】により表される糖脂質を有効成分とする免疫抑制剤。