JPH10501413A - 合成リーダーペプチド配列類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、酵母においてポリペプチドを分泌するための合成リーダーペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 合成リーダーペプチド配列類 発明の分野 本発明は、酵母においてポリペプチドを分泌するための合成リーダーペプチド 配列類に関する。 発明の背景 酵母生物は、細胞内合成されるが、しかし細胞外での機能を有する多くのタン パク質を生成する。そのような細胞外タンパク質は分泌されたタンパク質として 言及される。それらの分泌されたタンパク質は、小胞体（ER）の膜を通してその 発現された生成物の効果的な方向性を確保するプレ配列を含む、前駆体又はプレ −タンパク質形で細胞の内部で初め発現される。通常シグナル配列と称するプレ 配列は一般的に、トランスロケーションの間、所望する生成物から分離される。 分泌経路に入った後すぐに、そのタンパク質はゴルジ体に運ばれる。そのゴルジ 体から、タンパク質は、細胞液胞又は細胞膜のような区画に導く異なった経路に 従い、又はそれは外部媒体に分泌されるよう細胞から経路を定められ得る(Pfeff er，S.R．and Rothman，J.E． Ann ．Rev．Biochem．56（1987）829-852)。 いくつかのアプローチが、酵母に対して異種のタンパク質の酵母における発現 及び分泌のために提案されて来た。公開されたヨーロッパ特許出願第88632号は 、所望するタンパク質及びシグナルペプチドをコードするDNAを有する発現ビー クルにより酵母生物を形質転換し、その形質転換された生物の培養物を調製し、 そしてその培養培地からタンパク質を回収することによって、酵母に対して異種 のタンパク質が発現され、プロセッシングされ、そして分泌される方法を記載す る。シグナルペプチドは、所望するタンパク質自体のシグナルペプチド、異種シ グナルペプチド又は生来のシグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブ リットであり得る。 酵母に対して異種のシグナルペプチドの使用に関して遭遇する問題は、その異 種シグナルペプチドが効果的なトランスロケーション及び／又はそのシグナルペ プチド後の分離を確実にしないことである。 サッカロミセス セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）MFα１（α−因 子）が、Ｎ−連結されたグリコシル化部位、続いて、(LysArg((Asp/Glu)Ala)_2-3 α因子)₄を包含する、19個のアミノ酸のシグナル−又はプレペプチド、続く64個 のアミノ酸の“リーダー”又はプロペプチドを含んで成る165個のアミノ酸のプ レプロ形として合成されている（Kurjan，J．and Herskowitz，I．Cell 30（198 2）933-943)。プレプロMFα１のシグナル−リーダー部分は、S.セレビシアエに おいて異種タンパク質の合成及び分泌を得るために広く使用されて来た。 酵母に対して同種のシグナル／リーダーペプチドの使用は、アメリカ特許第4, 546,082号明細書、公開されたヨーロッパ特許出願第116201号、第123294号、第1 23544号、第163529号及び第123289号、及びデンマーク特許出願第3614183号から 知られている。 ヨーロッパ特許第123289号においては、S.セレビシアエα−因子前駆体の利用 が記載されており、そしてWO84/01153はS. セレビシアエインベルターゼシグナル ペプチドの利用を示しており、そしてDK3614／83は外来性タンパク質の分泌のた めへのS.セレビシアエPHO5シグナルペプチドの利用を示している。 アメリカ特許第4,546,082号明細書、ヨーロッパ特許第16201号 、第123294号、第123544号及び第163529号は、S.セレビシアエ（MFα１又はMFα ２）からのα−因子シグナル−リーダーが酵母における発現された異種タンパク 質の分泌工程に利用される方法を記載する。S.セレビシアエMFａ１をコードする DNA配列を融合することによって、所望するタンパク質分泌及び所望するタンパ ク質のプロセッシングのための遺伝子の５′端でのシグナル／リーダー配列が示 された。 ヨーロッパ特許第206783号は、α−因子プロセッシング部位LysArgGluAla Glu Alaを通して異種ポリペプチドに融合されるリーダーペプチド自体を残すために 生来のリーダー配列上に存在する４種のα−因子単位を排除するよう切断された α−因子リーダー配列を用いてのS.セレビシアエからのポリペプチドの分泌のた めのシステムを開示する。この構成は、より小さなペプチド（50個よりも少ない アミノ酸）の効果的なプロセッシングを導くことを示される。より大きなポリペ プチドの分泌及びプロセッシングのためには、生来のα−因子リーダー配列が、 リーダーペプチドとポリペプチドとの間に１又は２つのα−因子単位を残すよう に切断されている。 多くの分泌されたタンパク質が、２個の連続した塩基性アミノ酸のカルボキシ 端でペプチド結合を切断できるタンパク質分解性プロセッシングシステムに暴露 されるよう経路を定められる。この酵素活性は、KEX2遺伝子によりコードされる S.セレビシアエに存在する(Julius，D.A.など.,Cell 37（1984b）1075)。KEX2プ ロテアーゼによる生成物のプロセッシングは活性S.セレビシアエ接合因子α１（ MFα１又はα−因子）の分泌のために必要とされるが、ところがKEX2は活性S.セ レビシアエ接合因子αの分泌に包含されない。 分泌される予定であるポリペプチドの分泌及び正しいプロセッシングは、上記 文献に示されるようにして構成されたベクターにより 形質転換される酵母生物を培養する場合に得られる。しかしながら、多くの場合 、分泌のレベルはひじょうに低いか、又は分泌は存在せず、又はタンパク質分解 性プロセッシングは不正確か又は不完全である。従って、ポリペプチドのより効 果的な発現及び／又はプロセッシングを確保するリーダーペプチドを供給するこ とが本発明の目的である。 発明の要約 驚くべきことには、酵母においてポリペプチドの高い収率での分泌を可能にす る新規タイプのリーダーペプチドが見出された。 従って、本発明は、次の配列： 5′-P-SP-LS-PS-^*遺伝子^*-(T)_i-3′ 〔配列中、Ｐはプロモーター配列であり； SPはシグナルペプチドをコードするDNA配列であり； LSは下記一般式（Ｉ） （式中、Ｘ¹はペプチド結合又はコードできるアミノ酸であり；Ｘ²はペプチド結 合、コードできるアミノ酸、又は同じであっても又は異なっていても良い４個ま でのコードできるアミノ酸の配列であり；Ｚはコードできるアミノ酸であり、但 しProを除き；そしてＸ³は同じであっても又は異なっていても良い４〜30個のコ ードできるアミノ酸の配列である）で表わされるリーダーペプチドをコードする DNA配列であり； PSはプロセッシング部位をコードするDNA配列であり； ^*遺伝子^*はポリペプチドをコードするDNA配列であり； Ｔはターミネーター配列であり；そして ｉは０又は１である〕を含んで成るDNA発現カセットに関する。 本明細書においては、用語“リーダーペプチド”とは、その機能が発現された ポリペプチドを小胞体からゴルジ体に及びさらに、媒体中への分泌のための分泌 小胞に指図すること（すなわち、細胞壁を横切って又は少なくとも細胞膜を通し て発現されたポリペプチドの細胞周辺胞中への輸送）を可能にするペプチドを示 唆するものとして理解される。リーダーペプチドと共に使用される用語“合成” とは、リーダーペプチドが天然において見出されないものであることを示唆する 。 用語“シグナルペプチド”とは、天然においては主に疎水性であり、そして酵 母において発現される細胞外タンパク質の前駆体形のＮ−末端配列として存在す るプレ配列を意味することが理解される。シグナルペプチドの機能は、発現され たタンパク質の小胞体に入るためへの分泌を可能にすることである。シグナルペ プチドは通常、この工程の間に分割される。シグナルペプチドは、タンパク質を 生成する酵母生物に対して異種であっても又は同種であっても良い。 用語“ポリペプチド”とは、異種ポリペプチド、すなわち天然において宿主酵 母生物により生成されないポリペプチド、及び同種ポリペプチド、すなわち天然 において宿主酵母生物において生成されるポリペプチド、並びにそれらのいづれ かのプレフォームを示唆するものとして意図される。好ましい態様においては、 本発明の発現カセットは異種ポリペプチドをコードする。 用語“コードできるアミノ酸”とは、ヌクレオチドのトリプレット（“コドン ”）によりコードされ得るアミノ酸を示唆するものとして意図される。 本明細書に与えられるアミノ酸配列において、スラッシュにより分離される、 ２つのアミノ酸の３文字コードが括弧で与えられる場 合、たとえば(Asp/Glu)の場合、これは、配列が適切な位置にそれらのアミノ酸 の１つ又は他のアミノ酸のいづれかを有することを示唆するものとして意図され る。 さらなる観点においては、本発明は、ポリペプチドを発現することができ、そ して本発明のリーダーペプチド配列を包含する上記のような酵母発現ベクターに より形質転換される酵母細胞を、ポリペプチドの発現及び分泌を得るために適切 な培地において培養し、この後、ポリペプチドを培地から回収することを含んで 成る、酵母においてポリペプチドを生成するための方法に関する。 図面の簡単な説明 本発明は添付される図面に関してさらに次のように説明される。 図１はプラスミドpAK492を図解して示し； 図２はシグナルペプチド／リーダー／MI3インスリン前駆体をコードするDNA配 列の一部を示し； 図３はプラスミドpAK546の構成を示し； 図４はリーダー配列番号４のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図５はYAP3シグナルペプチド、リーダー配列番号４及びMI3インスリン前駆体 をコードするS.セレビシアエ発現プラスミドpAK546のDNA配列、及びコードされ たアミノ酸配列を示し； 図６はリーダー配列番号６のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図７はリーダー配列番号８のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図８はリーダー配列番号17のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図９はリーダー配列番号16のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図10はリーダー配列番号19のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図11はリーダー配列番号20のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図12はリーダー配列番号21のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列を示 し； 図13は配列番号４及び６の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK5 27のDNAフラグメントを示し； 図14は配列番号８の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK531のDN Aフラグメントを示し； 図15は配列番号16及び17の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK5 55のDNAフラグメントを示し； 図16は配列番号19及び20の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK5 59のDNAフラグメントを示し； 図17は配列番号21の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK562のDN Aフラグメントを示し； 図18はリーダー配列番号27のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列番号6 6を示し； 図19はＮ−末端拡張されたMI3インスリン前駆体のアミノ酸配列（配列番号70 ）及びそれをコードするDNA配列（配列番号71）を示し； 図20はリーダー配列番号67のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA配列（配 列番号69）を示し； 図21は配列番号27の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK614のDN Aフラグメント配列番号72を示し；そして 図22は配列番号67の構成において直接的な鋳型として使用される、pAK625のDN Aフラグメント配列番号73を示す。 発明の詳細な開示 一般式ＩにおけるＸ¹がアミノ酸を示す場合、それは好ましくは、Ser，Thr又 はAlaである。一般式ＩにおけるＸ²が１つのアミノ酸を示す場合、それは好まし くはSer，Thr又はAlaである。一般式ＩにおけるＸ²が２つのアミノ酸の配列を示 す場合、それは好ましくは、SerIleである。一般式ＩにおけるＸ²が３個のアミ ノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、Ser Ala Ileである。一般式Ｉにお けるＸ²が４個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、Ser Phe Ala T hrである。好ましい態様において、Ｘ³は下記一般式（II）： Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶ （II） 〔式中、Ｘ⁴は同じであっても又は異なっていても良い１〜21個のコードできる アミノ酸の配列であり、Ｘ⁵はPro又はアミノ酸配列ValAsnLeu又はLeuAlaAsnValA laMetAlaの１つであり、そしてＸ⁶は同じであっても又は異なっていても良い１ 〜８個のコードできるアミノ酸の配列である〕で表わされるアミノ酸配列である 。 一般式IIにおいて、Ｘ⁴は好ましくは、LeuValAsnLeu，SerValAsnLeu，MetAlaA sp，ThrGluSer，ArgPheAlaThr又はValAlaMetAlaの１つ又は複数を含むアミノ酸 配列であり：又はＸ⁴は配列AsnSerThr又はAsnThrThrを含むアミノ酸配列であり ；又はＸ⁴は下記配列を含むアミノ酸配列であり： 又はＸ⁴は下記配列を含むアミノ酸配列であり： それらのいづれかの組合せである。 一般式IIにおいて、Ｘ⁵は好ましくは、Pro、又は配列ValAsnLeu，LeuAlaAsnVa lAlaMetAla，LeuAspValValAsnLeuProGly又はLeuAspValValAsnLeuIleSerMetを含 むアミノ酸配列である。 一般式IIにおけるＸ⁶が１つのアミノ酸を示す場合、それは好ましくは、Ala， Gly，Leu，Thr，Val又はSerである。一般式IIにおけるＸ⁶が２つのアミノ酸の配 列を示す場合、それは好ましくは、GlyAla又はSerAlaである。一般式IIにおける Ｘ⁶が３個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、AlaValAlaである。 一般式IIにおけるＸ⁶が８個のアミノ酸の配列を示す場合、それは好ましくは、 GlyAlaAspSerLysThrValGlu．である。 DNA配列LSによりコードされる好ましいリーダーペプチドの例は下記のもので ある： DNA配列LSによりコードされる特に好ましいリーダーペプチドは下記のもので ある。 シグナル配列（SP）は、細胞の分泌経路中への発現されたポリペプチドの効果 的な指図を確保するいづれかのシグナルペプチドをコードすることができる。シ グナルペプチドは、天然に存在するシグナルペプチド又はその機能的部分であり 得、又はそれは合成ペプチドでもあり得る。適切なシグナルペプチドは、α−因 子シグナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド、変性されたカ ルボキシペプチダーゼシグナルペプチド、酵母BAR1シグナルペプチド又はヒュー ミコララヌギノーザ （Humicola lanuginosa）リパーゼシグナルペプチド、又は それらの誘導体であることが見出された。マウスの唾液アミラーゼシグナル配列 が、Hagenbuchle，O．など.,Nature 289（1981）643-646により記載されている 。カルボキシペプチダーゼシグナル配列は、Valls，L.A．など.,Cell 48（1987 ）887-897により記載されている。BAR1グナルペプチドはWO87/0 2670に開示されている。酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチドは デンマーク特許出願第0828/93号に記載されている。 DNA配列PSによりコードされる酵母プロセッシング部位は適切には、Lys及びAr gのいづれか対合された組合せ、たとえばサッカロミセス・セレビシアエのKEX2 プロテアーゼ又は他の酵母種における同等のプロテアーゼによりポリペプチドの プロセッシングを可能にする、LysArg，ArgLys，ArgArg又はLysLysであり得る（ Julins，D.A.など., Cell 37（1984）1075）。KEX2プロセッシングが便利でない 場合、たとえばそれが所望する生成物内の２つの連続的な塩基性アミノ酸の存在 により、ポリペプチド生成物の分解を導く場合、ポリペプチド生成物に見出され ないアミノ酸の組合せを含んで成る、もう１つのプロテアーゼのためのプロセッ シング部位、たとえばEXaのためのプロセッシング部位IleGluGlyArgが選択され 得る(Sambrook，J.，Fritsch，E.F．及びManiatis，T.，Molocular Cloning ：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989) 。 本発明の方法により生成されるタンパク質は、酵母において都合良く生成され 得るいづれかのタンパク質であり得る。そのようなタンパク質の例は、異種タン パク質、たとえばアプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアー ゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、ヒト又はウシ成長ホルモン 、インターロイキン、グルカゴン、GLP-1，IGF-Ｉ，IGF-II、組織プラスミノー ゲン活性化因子、形質転換成長因子α又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又は それらの機能的類似体である。本明細書において、用語“機能的類似体”とは、 生来のタンパク質に類似する機能を有するタンパク質を示唆することを意味する （これは生来のタンパク質の生物学的活性のレベルよりもむしろ性質に関連する ものとして理 解されることを意図される）。タンパク質は生来のタンパク質に構造的に類似す ることができ、そして生来のタンパク質のＣ−及びＮ−末端のいづれか又は両者 への１又は複数のアミノ酸の付加、生来のアミノ酸配列における１又は多数の異 なった部位での１又は複数のアミノ酸の置換、生来のタンパク質のいづれかの又 は両方の末端で又はアミノ酸配列における１又はいくつかの部位での１又は複数 のアミノ酸の欠失、又は生来のアミノ酸配列における１又は複数の部位での１又 は複数のアミノ酸の挿入により生来のタンパク質から誘導され得る。そのような 変性は、上記いくつかのタンパク質のために良く知られている。また、他のタン パク質のための前駆体又は中間体は、本発明の方法により生成され得る。そのよ うな前駆体の例は、アミノ酸配列Ｂ（１−29）AlaAlaLys Ａ（１−21）（ここで 、Ａ（１−21）はヒトインスリンのＡ鎖であり、そしてＢ（１−29）はThr（Ｂ3 0）がミッシングしているヒトインスリンのＢ鎖である）を含んで成るMI3インス リン前駆体である。 リーダー配列をコードする好ましいDNA構造体は、図１〜12に示される通りで あり又はそれらの適切な変性体である。DNA配列の適切な変性の例は、タンパク 質のもう１つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかしDNA構造体が挿入される 酵母生物のコドン使用法に対応することができるヌクレオチド置換、又は異なっ たアミノ酸配列及び従って、たぶん、異なったタンパク質構造体を生ぜしめるヌ クレオチド置換である。可能な変性の他の例は、配列中への１又は複数のコドン の挿入、配列のいづれかの端での１又は複数のコドンの付加及び配列の又は配列 内のいずれかの端での１又は複数のコドンの欠失である。 発現カセット：5′-P-SP-LS-PS-^*遺伝子^*-(T)_i-3′ （ここで、Ｐ，SP，LS、^*遺伝子^*、Ｔ及びｉは上記の通りである ）を担持する組換え発現ベクターは、酵母生物において複製できるいづれかのベ クターであり得る。プロモーターは、酵母において転写活性を示すいづれかのDN A配列であり得、そして酵母に対して同種又は異種のいづれかのタンパク質をコ ードする遺伝子に由来する。プロモーターは好ましくは、酵母に対して異種のタ ンパク質をコードする遺伝子に由来する。適切なプロモーターの例は、サッカロ ミセス・セレビシアエMFα１，TPI，ADH又はPGKプロモーターである。 上記に示される配列は好ましくは、また適切なターミネーター、たとえばTPI ターミネーターに操作可能的に連結されるべきである(Alber，T．and Kawasaki ，G., J ．Mol．Appl．Genet．1(1982)419-434)。 本発明の組換え発現ベクターはさらに、酵母においてベクターの複製を可能に するDNA配列を含んで成る。そのような配列の例は、酵母プラスミド２μ複製遺 伝子REP1-3及び複製の起点である。ベクターはまた、選択可能マーカー、たとえ ばRussell，P.R.,Gene 40（1985）125-130により記載されるようなスキゾサッカ ロミセス・ポムベ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子も含むことができる 。 配列5′-P-SP-LS-PS-^*遺伝子^*-(T)_i-3′を連結し、そしてそれを酵母複製のた めに必要な情報を含む適切な酵母ベクター中に挿入するために使用される方法は 、当業者に良く知られている（たとえば、Sambrook，J.，Fritsch，E.F．and Ma niatis，T.，前記）。ベクターは、まず完全な配列5′-P-SP-LS-PS-^*遺伝子^*-(T )_i-3′を含むDNA構造体を調製し、そして続いて、このフラグメントを適切な発 現ベクター中に挿入することによって、又は個々の要素（たとえばプロモーター 配列、シグナルペプチド、リーダー配列GlnP roIle(Asp/Glu)(Asp/Glu)X¹(Glu/Asp)X²Asnz(Thr/Ser)X³、プロセッシング部位 、ポリペプチド及び存在するなら、ターミネーター配列）のための遺伝子情報を 含む適切なベクター中にDNAフラグメントを連続的に挿入し、続いて連結するこ とによって構成され得ることが理解されるであろう。 本発明の方法に使用される酵母生物は、培養に基づいて、多量の所望するポリ ペプチドを生成するいづれかの適切な酵母生物であり得る。適切な酵母生物の例 は、酵母種サッカロミセス・セレビシアエ，サッカロミセス・クルベク（Saccha romyce s kluvveri）、スキゾサッカロミセス・ポムベ又はサッカロミセス・ウバ ルム（Saccharomyces uvarum）の株である。酵母細胞の形質転換はたとえば、そ れ自体既知の手段でのプロトプラスト形成、続く形質転換によりもたらされ得る 。細胞を培養するために使用される培地は、酵母生物を増殖するのに適切ないづ れかの従来の培地であり得る。分泌されたポリペプチド（この有意な割合が正し くプロセッシングされた形で培地に存在するであろう）は、従来の方法、たとえ ば遠心分離又は濾過により培地から酵母細胞を分離し、塩、たとえば硫酸アンモ ニウムにより上清液又は濾液のタンパク質性成分を沈殿せしめ、続いて種々のク ロマトグラフィー方法、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ ークロマトグラフィー、又は同様の方法により精製することによって、培地から 回収され得る。 本発明は次の例によりさらに記載されるが、それらの例は本発明を限定するも のではない。 例プラスミド及びDNA材料 すべての発現ベクターはC-POTタイプのものである。そのような プラスミドは、ヨーロッパ特許出願第171142号に記載されており、そしてプラス ミドの選択及び安定化のためにスキゾサッカロミセス・ポムベトリオースリン酸 イソメラーゼ遺伝子(POT)を含むことにおいて特徴づけられる。POT−遺伝子を含 むプラスミドは、寄託されたＥ．コリ株（ATCC 39685）から入手できる。そのプ ラスミドはさらに、Ｓ．セレビシアエトリオースリン酸イソメラーゼプロモータ ー及びターミネーター（Ｐ_TPI及びＴ_TPI）を含む。それらは、pMT742（Egel-Mit ani，M．など., Gene 73（1988）113-120）（図１を参照のこと）と同一である が、但し、シグナル／リーダー／生成物のためのコード領域を包含するEcoRＩ-X baＩ制限部位により定義される領域を除く。 プラスミドpAK527，pAK531，pAK555，pAK559，pAK562，pAK614及びpAK625を、 例に記載されるリーダーの構成に適用されるPCR反応におけるDNA鋳型として使用 した。直接的な鋳型として作用する合成DNAフラグメントは図13〜17に示されて いる。示されるDNA領域を除いて、プラスミドは図１に示されるpAK492と同一で ある。 合成DNAフラグメントを、ホスホラミジット化学及び市販の試薬(Beaucage，S. L．and Caruthers，M.H.，Tetrahedron Letters 22（1981）1859-1869)を用いて 、自動DNA合成機(Applied Biosystems model 380A)上で合成した。 使用されるすべての他の方法及び材料は、当業者の知識の範囲内である（たと えば、Sambrook，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis，T., Molecular Cloning ：A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989 を参照のこと）。例 １． Ｓ．セレビシアエ（yAK546株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号４の合成 リーダー配列番号４は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： 次のポリメラーゼ鎖反応(PCR)を、製造業者の説明書に従って、Gene Amp PCR 反応キット(Perkin Elmer，761 Main Avewalk，CT 06859，USA)を用いて行った 。反応の間、PCR混合物を、100μｌの鉱油（Sigma Chemical Co．St．Louis MO ，USA）により被覆した：ポリメラーゼ鎖反応No.１ ５μｌのオリゴヌクレオチド＃94（50ｐモル） ５μｌのオリゴヌクレオチド＃333（50ｐモル） 10μｌの10X PCR緩衝液 16μｌのdNTP混合物 0.5μｌのTaq酵素 鋳型としての0.5μｌのpAK527プラスミド（図13）（0.2μｇのDNA）63μｌの水 合計12回のサイクルを実施し、１つのサイクルは94℃で１分；37℃で２分；72 ℃で３分であった。次に、PCR混合物を２％アガロースゲル上に負荷し、そして 電気泳動を標準技法（Sambrook，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis，T.，前記） を用いて行った。得られるDNAフラグメントをアガロースゲルから切断し、そし て製造業者の説明書に従って、Gene Cleanキット（Bio 101 inc.，PO BOX 2284 ，La Jolla，CA 92038，USA）を用いて単離した。ポリメラーゼ鎖反応No.２ ５μｌのオリゴヌクレオチド＃312（50ｐモル） ５μｌのオリゴヌクレオチド＃94（50ｐモル） 10μｌの10X PCR緩衝液 16μｌのdNTP混合物 0.5μｌのTaq酵素 10μｌのPCR No.1からの精製されたDNAフラグメント 53.5μｌの水 合計12回のサイクルを実施し、１つのサイクルは94℃で１分；37℃で２分；72 ℃で３分であった。ポリメラーゼ鎖反応No.2からのDNAフラグメントを単離し、 そして製造業者の説明書に従って、Gene Cleanキット（Bio 101 inc.，PO BOX 2 284，La Jolla，CA 92038，USA）を用いて精製した。 精製されたPCR DNAフラグメントを10μｌの水及び制限エンドヌクレアーゼ緩 衝液に溶解し、そして標準技法（Sambrook，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis， T.，前記）に従って合計15μｌの体積での制限エンドヌクレアーゼAsp718及びHi ndIIIにより切断した。167bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロース ゲル上での電気泳動にかけ、そして上記のようにしてGene Cleanキットを用いて 精製した。Ｓ．セレビシアエ発現プラスミドpAK492（図１に示される）は、前で 記載されたプラスミドpMT742の誘導体であり、ここで、シグナル／リーダー／イ ンスリン前駆体をコードするフラグメントが図２に示されるEcoRＩ-XbaＩフラグ メントにより置換されている。このフラグメントを、製造業者の説明書に従って 、Applied Biosystems DNA合成機により合成する。プラスミドpAK492を、制限エ ンドヌクレアーゼAsp718及びXbaＩにより切断し、そして10986bpのベクターフラ グメントを単離した。プラスミドpAK492を、制限エンドヌクレアーゼHindIII及 びXbaＩにより切断し、そしてMI3イン スリン前駆体の一部をコードする140bpのDNAフラグメントを単離した。前記３種 のDNAフラグメントを、標準条件下でT4 DNAリガーゼを用いて一緒に連結した（S ambrook，J.，Fritcsh，E.F．and Maniatis，T.，前記）。次に、連結混合物に より、成分Ｅ．コリ株（Ｒ−，Ｍ＋）を形質転換し、そして形質転換体を耐アン ピシリン性により同定した。プラスミドを、標準のDNA miniprep技法（Sambrook ，J.，Fritsch，E.F．and Maniatis，T.，前記）を用いて得られるＥ．コリのコ ロニーから単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼ、すなわちEcoRＩ，XbaＩ，N coＩ及びHindIIIにより調べた。選択されたプラスミドpAK546を、プライマー＃9 4を用いてDNA配列決定分析（Sequenase，U.S．Bio Chemical Corp.）により示し 、これはリーダー配列番号４をコードするDNA配列を含んでいた。リーダー配列 番号４をコードするDNA配列のためには、図４を参照のこと。プラスミドpAK546 を用いて、公開されたヨーロッパ特許出願第214826号に記載されるようにしてＳ ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株を、yAK546と称した。 発現プラスミドのタンパク質コード領域のDNA配列は図５に与えられる。例 ２． Ｓ．セレビシアエ（yAK531株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号６の合成 リーダー配列番号６は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した。 ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃331を、オリゴヌクレオチド＃333の代わ りに使用した。 168bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントをアガラスゲル上での電気泳動にゆ だね、そして例１に記載されるようにして精製した。Asp718/HindIII DNAフラグ メントを例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミド中にサブ クローン化した。選択されたプラスミドpAK531を例１に記載されるようにしてDN A配列決定分析により示し、リーダー配列番号６をコードするDNA配列を含むこと を示した。リーダー配列番号６をコードするDNA配列に関しては、図６を参照の こと。プラスミドpAK531を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載さ れるようにして、Ｓ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をy AK531と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体をコードするDNA配列 は、図５に示される配列と同じであった。例 ３． Ｓ．セレビシアエ（yAK547株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号８の合成 リーダー配列番号８は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃345をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに用い、そしてプラスミドpA K531（図14）を鋳型として使用した。 171bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動 にゆだね、そして例１に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII D NAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミ ド中にサブクローン化した 。選択されたプラスミドpAK547を、例１に記載されるようにしてDNA配列決定分 析により示し、リーダー配列番号８をコードするDNA配列を含むことを示した。 リーダー配列番号８をコードするDNA配列に関しては、図７を参照のこと。プラ スミドpAK547を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるように してＳ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得られる株をyAK547と命名 した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図５ に示される配列と同じであった。例 ４． Ｓ．セレビシアエ（yAK561株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号17の合成 リーダー配列番号17は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃376をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに用い、そしてプラスミドpA K555（図15）を鋳型として使用した。 180bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動 にゆだね、そして例１に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII D NAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミ ド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK561を、例１に記載される ようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号17をコードするDNA配 列を含むことを示した。リーダー配列番号17をコードするDNA配列に関しては、 図８を参照のこと。プラスミドpAK561を用いて、ヨ ーロッパ特許出願第86306721.1号に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ株MT 663を形質転換し、そして得られる株をyAK561と命名した。シグナルペプチド及 びインスリン前駆体MI3をコードするDNA配列は、図５に示される配列と同じであ った。例 ５． Ｓ．セレビシアエ（yAK559株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号16の合成 リーダー配列番号16は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃375をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに用い、そしてプラスミドpA K555（図15）を鋳型として使用した。 222bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動 にゆだね、そして例１に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII D NAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミ ド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK559を、例１に記載される ようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号16をコードするDNA配 列を含むことを示した。リーダー配列番号16をコードするDNA配列に関しては、 図９を参照のこと。プラスミドpAK559を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721 .1号に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得 られる株をyAK559と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコ ードするDN A配列は、図５に示される配列と同じであった。例 ６． Ｓ．セレビシアエ（yAK580株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号19の合成 リーダー配列番号19は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃384をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに用い、そしてプラスミドpA K559（図16）を鋳型として使用した。 228bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動 にゆだね、そして例１に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII D NAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミ ド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK580を、例１に記載される ようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号19をコードするDNA配 列を含むことを示した。リーダー配列番号19をコードするDNA配列に関しては、 図10を参照のこと。プラスミドpAK580を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721 .1号に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得 られる株をyAK580と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコ ードするDNA配列は、図５に示される配列と同じであった。例 ７． Ｓ．セレビシアエ（yAK583株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号20の合成 リーダー配列番号20は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃390をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに用い、そしてプラスミドpA K559（図16）を鋳型として使用した。 231bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動 にゆだね、そして例１に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII D NAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミ ド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK583を、例１に記載される ようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号20をコードするDNA配 列を含むことを示した。リーダー配列番号20をコードするDNA配列に関しては、 図11を参照のこと。プラスミドpAK583を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721 .1号に記載されるようにして、Ｓ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして 得られる株をyAK583と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3を コードするDNA配列は、図５に示される配列と同じであった。例 ８． Ｓ．セレビシアエ（yAK586株）におけるMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号21の合成 リーダー配列番号21は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃401をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに用い、そしてプラスミドpA K562（図17）を鋳型として使用した。 183bpのAsp718/HindIII DNAフラグメントを、アガロースゲル上での電気泳動 にゆだね、そして例１に記載されるようにして精製した。そのAsp718/HindIII D NAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミ ド中にサブクローン化した。選択されたプラスミドpAK586を、例１に記載される ようにしてDNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号21をコードするDNA配 列を含むことを示した。リーダー配列番号21をコードするDNA配列に関しては、 図12を参照のこと。プラスミドpAK586を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721 .1号に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得 られる株をyAK586と命名した。シグナルペプチド及びインスリン前駆体MI3をコ ードするDNA配列は、図５に示される配列と同じであった。例 ９． 本発明の選択されたリーダー配列を用いてのMI3インスリン前駆体の発現 上記のようなプラスミドを有する酵母株を、YPD培地(Sherman，F．など., Met hods in Yeast Genetics ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1981)におい て増殖した。個々の株のために、６個の個々の５ml培養物を30℃で72時間、振盪 し、約15の最終OD₆₀₀を得た。遠心分離の後、上清液をHPLC分析のために除き、 分泌されたインスリン前駆体の濃度を、Snel，L.など．Chromatographia 24 （1987）329-332により記載される方法により測定した。 表１においては、本発明の選択されたリーダー配列の使用により得られるイン スリン前駆体MI3の発現レベルを、Ｓ．セレビシアエのMFα(1)リーダーを用いて 、PMT742の形質転換体により得られるレベルの百分率として付与する。 例 10． Ｓ．セレビシアエ（yAK677株）における拡張されたMI3インスリン 前駆体の発現のためへのリーダー配列番号27の合成 リーダー配列番号27は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： 及び ポリメラーゼ鎖反応を例１に記載されるようにして行った。但し、オリゴヌク レオチド＃440を、オリゴヌクレオチド＃333の代わりに使用し、そしてプラスミ ドpAK614を鋳型として使用した。第２のポリメラーゼ鎖反応のためには、オリゴ ヌクレオチド＃441を、オリゴヌクレオチド＃312の代わりに使用した。 精製されたPCR DNAフラグメントを、例１に記載されるようにして、単離し、 そして制限エンドヌクレアーゼAsp718及びHindIIIにより消化した。268bpのAsp7 18/HindIII DNAフラグメントを、例１に記載されるようにして、アガロースゲル 上での電気泳動にゆだね、そして精製した。Asp718/HindIII DNAフラグメントを 、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラスミド中にサブクロー ン化した。但し、140bpのHindIII/XbaＩ DNAフラグメントがpAK602に由来し、そ してAsp^B28ヒトインスリンをコードする。選択されたプラスミドpAK616を、例１ に記載されるようにして、DNA配列決定分析により示し、リーダー配列番号27を コードするDNA配列を含むことを示した。リーダー配列番号27をコードするDNA配 列（配列番号66）に関しては、図18を参照のこと。pAK616からの268bpのAsp718/ HindIII DNAフラグメントを単離し、そしてpAK601からの10986bpのAsp718/XbaＩ DNAフラグメント及びpAK464からの140bpのHindIII/XbaＩ DNAフラグメント（As p^B28ヒトインスリンの拡張部分をコードする）と連結し、そしてpAK625と命名し た。pAK625からの180bpのAsp718/NcoＩ DNAフラグメントを単離し、そしてpJB14 6からの221bpのNcoＩ/XbaＩ DNAフラグメント（インスリン前駆体の拡張部分を コードする）及びpAK601からの10824bpのAsp718/XbaＩ DNAフラグメントと連結 し、そしてその得られるプラスミドをpAK677 と命名した。プラスミドpAK677を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号に 記載されるようにして、Ｓ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そしてその得 られる株をyAK677と命名した。リーダーをコードするDNA配列を除いて、シグナ ルペプチドをコードするDNA配列は図５に記載される通りである。拡張されたMI3 インスリン前駆体をコードするDNA配列は、図19に記載される通りである。例 11． Ｓ．セレビシアエ（yAK680株）における拡張されたMI3インスリン前駆体の発現のためへのリーダー配列番号67の合成 リーダー配列番号67は次のアミノ酸配列を有する： 次のオリゴヌクレオチドを合成した： PCRを例１に記載されるようにして実施した。但し、オリゴヌクレオチド＃577 をオリゴヌクレオチド＃333の代わりに使用し、そしてプラスミドpAK625を鋳型 として使用し、そして第２のPCRは実施されなかった。PCRフラグメントを制限エ ンドヌクレアーゼAsp718及びNcoＩにより例１に記載されるようにして消化した 。 190bpのAsp718/NcoＩ DNAフラグメントを、例１に記載されるようにして、ア ガロースゲル上での電気泳動にゆだね、そして精製した。但し、10824bpのAsp71 8/XbaＩベクターDNAフラグメントをpAK601から単離した。190bpのAsp718/NcoＩ DNAフラグメントを、例１に記載されるようにしてＳ．セレビシアエ発現プラ スミド中にサブクローン化した。但し、221bpのNcoＩ/XbaＩ DNAフラグメント （MI3インスリン前駆体の拡張された部分をコードする）をpAK677から単離し、 そしてHindIII/XbaＩ DNAフラグメントの代わりに使用した。選択されたプラス ミドを例１に記載されるようにして、DNA配列決定分析により示し、リーダー配 列番号67をコードするDNA配列を含むことを示し、そしてそれをpAK680と命名し た。リーダー配列番号67をコードするDNA配列（配列番号69）に関しては、図20 を参照のこと。プラスミドpAK680を用いて、ヨーロッパ特許出願第86306721.1号 に記載されるようにして、Ｓ．セレビシアエ株MT663を形質転換し、そして得ら れる株をyAK680と命名した。リーダーをコードするDNA配列を除いて、シグナル ペプチドをコードするDNA配列は図５に記載される通りであり、そして拡張され たインスリン前駆体MI3 DNA配列は図19に記載される通りである。例 12． 本発明のリーダ配列：配列番号27及び67を用いてのＮ−末端拡張されたMI3インスリン前駆体の発現 上記のようなプラスミドを有する酵母株をYPD培地(Sherman，F．など., Metho ds in Yeast Genetics ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1981)において 増殖した。個々の株のために、６個の個々の５ml培養物を30℃で72時間、振盪し 、約15の最終OD₆₀₀を得た。遠心分離の後、上清液をHPLC分析のために除き、分 泌されたインスリン前駆体の濃度を、Snel，L.など., Chromatographia 24（198 7）329-332に記載される方法により測定した。 表２においては、本発明のリーダー配列（配列番号27及び67）の使用により得 られた、いくらかＮ−末端拡張されたMI3インスリン前駆体の発現レベルが、Ｓ ．セレビシアエのMFα(1)リーダーを用いて、PMT742の形質転換体により得られ るレベルの百分率として付与される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記配列： 5′-P-SP-LS-PS-^*遺伝子^*-(T)_i-3′ 〔配列中、Ｐはプロモーター配列であり； SPはシグナルペプチドをコードするDNA配列であり； LSは下記一般式（Ｉ）： （式中、Ｘ¹はペプチド結合又はコードできるアミノ酸であり；Ｘ²はペプチド結 合、コードできるアミノ酸、又は同じであっても又は異なっていても良い４個ま でのコードできるアミノ酸の配列であり；Ｚはコードできるアミノ酸であり、但 しProを除き；そしてＸ³は同じであっても又は異なっていても良い４〜30個のコ ードできるアミノ酸の配列である）で表わされるリーダーペプチドをコードする DNA配列であり； PSはプロセッシング部位をコードするDNA配列であり； ^*遺伝子^*はポリペプチドをコードするDNA配列であり； Ｔはターミネーター配列であり；そして ｉは０又は１である〕を含んで成る DNA発現カセット。 ２．前記一般式ＩにおけるＸ¹がSer，Thr又はAlaである請求の範囲第１項記載 の発現カセット。 ３．前記一般式ＩにおけるＸ²がSer，Thr又はAlaである請求の範囲第１項記載 の発現カセット。 ４．前記一般式ＩにおけるＸ²がSerIleである請求の範囲第１項記載の発現カ セット。 ５．前記一般式におけるＸ²がSerAlaIleである請求の範囲第１ 項記載の発現カセット。 ６．前記一般式におけるＸ²がSerPheAlaThrである請求の範囲第１項記載の発 現カセット。 ７．前記一般式ＩにおけるＸ³が、下記一般式（II）： Ｘ⁴−Ｘ⁵−Ｘ⁶ （II） 〔式中、Ｘ⁴は１〜21個のコードできるアミノ酸の配列であり； Ｘ⁵はPro又はアミノ酸配列ValAsnLeu，LeuAlaAsnValAlaMetAla，LeuAspValValAs nLeuProGly、又はLeuAspValValAsnLeuIleSerMetを包含するアミノ酸配列であり ； そしてＸ⁶が１〜８個のコードできるアミノ酸の配列である〕で表わされるアミ ノ酸配列である請求の範囲第１項記載の発現カセット。 ８．前記一般式IIにおけるＸ⁴が配列LeuValAsnLeu，SerValAsnLeu，MetAlaAsp ，ThrGluSer，ArgPheAlaThr及びValAlaMetAlaの１つ又は複数を包含するアミノ 酸配列である請求の範囲第７項記載の発現カセット。 ９．前記一般式IIにおけるＸ⁴が配列AsnSetThr又はAsnThrThrを包含するアミ ノ酸配列である請求の範囲第７項記載の発現カセット。 10．前記一般式IIにおけるＸ⁴が下記配列： を包含するアミノ酸配列である請求の範囲第７項記載の発現カセット。 11．前記一般式IIにおけるＸ⁴が下記配列： を包含するアミノ酸配列である請求の範囲第７項記載の発現カセット。 12．前記一般式IIにおけるＸ⁵がProである請求の範囲第７項記載の発現カセッ ト。 13．前記一般式IIにおけるＸ⁵がアミノ酸配列ValAsnLeuである請求の範囲第７ 項記載の発現カセット。 14．前記一般式IIにおけるＸ⁵がアミノ酸配列LeuAlaAsnValAlaMetAlaである請 求の範囲第７項記載の発現カセット。 15．前記一般式IIにおけるＸ⁵がアミノ酸配列LeuAspValValAsnLeuProGlyであ る請求の範囲第７項記載の発現カセット。 16．前記一般式IIにおけるＸ⁵がアミノ酸配列LeuAspValValAsnLeuIleSerMetで ある請求の範囲第７項記載の発現カセット。 17．前記一般式IIにおけるＸ⁶がAla，Gly，Leu，Thr，Val又はSerである請求 の範囲第７項記載の発現カセット。 18．前記一般式IIにおけるＸ⁶がGlyAla又はSerA1aである請求の範囲第７項記 載の発現カセット。 19．前記一般式IIにおけるＸ⁶がAlaValAlaである請求の範囲第７項記載の発現 カセット。 20．前記一般式IIにおけるＸ⁶がGlyAlaAspSerLysThrValGluである請求の範囲 第７項記載の発現カセット。 21．DNA配列LSによりコードされる前記リーダーペプチドが、下記群： から選択され、DNA配列によりコードされる特に好ましいリーダーペプチドが： である請求の範囲第１項記載の発現カセット。 22．前記SPがα−因子シグナルペプチドをコードするDNA配列、マウス唾液ア ミラーゼのシグナルペプチド、カルボキシペプチダー ゼシグナルペプチド、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３シグナルペプチド又は 酵母BAR1シグナルペプチドである 請求の範囲第１項記載の発現カセット。 23．前記PSがLysArg，ArgLys，ArgArg，LysLys又はIle-GluGlyArgをコードす るDNA配列である 請求の範囲第１項記載の発現カセット。 24．前記ポリペプチドが、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他の プロテアーゼインヒビター、インスリン又はインスリン前駆体、インスリン様成 長因子Ｉ、インスリン様成長因子II、ヒト又はウシ成長因子、インターロイキン 、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１、組織プラスミノーガン活性化因子、形 質転換成長因子α又はβ、血小板由来の成長因子、酵素又はそれらの機能的類似 体から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の発現カセット。 25．請求の範囲第１〜24のいづれか１項記載の発現カセットを含んで成る酵母 発現ベクター。 26．ポリペプチドを発現することができ、そして請求の範囲第25項記載の酵母 発現ベクターにより形質転換される酵母細胞。 27．酵母においてポリペプチドを生成するための方法であって、所望するポリ ペプチドを発現することができ、そして請求の範囲第25項記載の酵母発現ベクタ ーにより形質転換される酵母細胞を適切な培地において培養し、ポリペプチドの 発現及び分泌を得、この後、前記ポリペプチドを培地から回収することを含んで 成る方法。