JPH10504720A - 三つ葉状のペプチド２量体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ２量体の形になっていることを特徴とする、唯一の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】 三つ葉状のペプチド２量体 発明の属する分野 本発明は三つ葉状の（trefoil）ペプチド２量体、三つ葉状のペプチドの２量 体を調製する方法、三つ葉状のペプチド２量体を含む医薬組成物及びそれらの胃 腸疾患の治療における使用に関する。 発明の背景 三つ葉状のペプチドは主に胃腸管と関連して見い出されるペプチドのファミリ ーを形成する。哺乳類の三つ葉状のペプチドは１またはそれよりも多い特徴的な 三つ葉状のドメイン（Thim他、1989年）を含有し、その各々は、６つの半−シス チン残基が配置１−５，２−４及び３−６で結合している、38または39アミノ酸 残基の配列からなり、したがって特徴的な三つ葉状の構造を形成している（Thim ，1989年）。 現在公知の哺乳類の三つ葉状のペプチドは１または２のいずれかの三つ葉状の ドメインを含有するのに対し（復習のためにThim，1994年；Poulson及びWright ，1993年；Hoffmann及びHauser．1993年）、１（Hauser及びHoffmann，1991年） 、２（Hauser他、1992年ａ）、４（Hoffmann，1998年）または６（Hauser及びHo ffmann，1993年ｂ）三つ葉状のドメインを含有する、かえる（Xenopus laevis ）のペプチド及びタンパク質が記載された。１つのドメインを含有する哺乳類三 つ葉状のペプチドは、これまでヒト（Jakowlev他、1984年；Prud'homme他、1985 年）及びマウス（Lefebvre他、1993年）に公知の乳がんに関係するpS２ペプチド 並びにこれまでヒト（Podo lsky他、1993年；Hauser他、1993年）及びラット（Suemori他、1991年、Chinery 他、1992年）に公知の腸の三つ葉状の因子である。２つの三つ葉状のドメインを 含有する鎮痙性ポリペプチド（SP）はヒト（Tomasetto他、1990年）、ブタ（Thi m他、1982年）及びマウス（Tomasetto他、1990年）について記載されている。ヒ トでは３つの三つ葉状のペプチド、hpS２、hITF及びhSPはすべて通常の状態で胃 腸管中に、すなわちhSP及びhps２は胃の上皮粘膜層中に（Tomasetto他、1990年 ；Rio他、1988年）並びにhITFは小腸及び結腸の上皮粘膜層中に（Podolsky他、1 993年）発現されている。 三つ葉状のペプチドの生理的機能は非常によくは分かっていない。胃腸管にお ける三つ葉状のペプチドの増大した発現が粘膜損傷、たとえば炎症性の腸の病気 （Rio他、1991年；Poulson他、1992年；Wright他、1993年）及び胃及び十二指腸 における潰瘍（Rio他、1991年；Hanby他、1993年；Wright他、1990年）を含むい くつかの状態で報告されている。結果的に、三つ葉状のペプチドの粘膜修復機能 が示唆された（たとえば、Wright他、1993年）。三つ葉状のペプチドが損傷後の 粘膜の上皮の復旧を促進するという証拠は最近Dignass他（1994年）、Playford 他（1994年）及びBabyatsky他（1994年）が示した。三つ葉状のペプチドがその 修復機能を促進するメカニズムは、ムチン−糖タンパク質を交叉結合させて消化 酵素耐性の粘弾性ゲル層を生成させることかもしれない（Thim，1994年；Gajhed e他、1993年）。 ラットとヒトの単一ドメインの腸の三つ葉状の因子のクローン化及び腸の三つ 葉状の因子を胃腸の損傷の治療に用いることは国際特許出願公開第92／14837号 に記載されている。 発明の概要 今や、唯一の三つ葉状のドメインを有し、興味深い薬理的性質を有する三つ葉 状の因子の２量体の調製が可能であることを見い出された。 従って、本発明は唯一の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドで あって、２量体の形になっていることを特徴とするペプチドに関する。 上記のように、三つ葉状のペプチドは腸管の粘膜層を安定化することによって 消化性潰瘍及び他の粘膜の損傷の治癒に貢献することは確かだと思われる。この 安定化のメカニズムは現在分かってはいない。しかしながら、２つの三つ葉状の ドメインを有するブタの膵臓の鎮痙性ポリペプチド（PSP）のＸ線構造（Gajhede 他、1993年参照）は、大部分の保存された残基は、８〜10Å幅の裂け目を与え、 各々の三つ葉状のドメインに見い出されることを示した。予備的な短かく切る実 験はその裂け目はオリゴサッカリド鎖の一部、たとえばムチン糖タンパク質に結 合した炭水化物に一致するだろうことを示した。もし、これが事実なら、２つの 上記裂け目をもつPSPはムチンを交叉結合して、粘膜上皮上に保護ゲルを形成す るのを助けるだろう。現在では唯一の三つ葉状のドメイン（たとえばITF及びpS ２）をもつ三つ葉状のペプチドが生体内で２量体を形成して同様な機能を働かせ るのか、またはそれが、異ったメカニズムの作用を有するのかは分かっていない 。しかしなが、現在は、このような三つ葉状のペプチドの２量体は本当にムチン を交叉結合し、したがって、活性型のペプチドであると確信されている。 本発明の他の面は唯一の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドの ２量体を調製する方法であって、そのペプチドの産生を可能とする条件下で１つ の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列で形 質転換された適当な宿主細 胞を培養し、その培養から結果として生じる三つ葉状のペプチド２量体を回収す ることを含む方法に関する。 本発明の更なる面は、医薬として許容し得る希釈剤または媒体と共に唯一の三 つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドの２量体を含む医薬組成物に関 する。 本発明のなお、更なる面は薬剤として用いるための１つの三つ葉状のドメイン を含有する三つ葉状のペプチドの２量体及び胃腸疾患の予防または治療用の薬剤 の調製のための１つの三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドの２量 体の使用に関する。 発明の詳細な説明 三つ葉状の因子の２量体は特に腸の三つ葉状の因子（ITF）または乳がんに関 係するペプチド（pS２）であり得る。 特に、三つ葉状の因子はヒトのITF単量体状アミノ酸配列であって、 （式中、ＺはGlu，GlnまたはpyrGlu）もしくは２量体化可能で同様な活性を示す その同族体またはヒトのpS２単量体状アミノ酸配列であって、 （式中、ＺはGlu，GlnまたはpyrGlu）もしくは２量体化可能で同様な活性を示す その同族体である。 ITFまたはpS２の同族体は同じシステイン型及びジスルフィド配列（図１）を 含み、ループ１，２及び３において特定の配列相同性（対応する位置での同一の アミノ酸または保存的置換のいずれかを 意味する）を示す。ループ領域の配列相同性は１〜10までのアミノ酸残基を変更 し、各ループ中のアミノ酸残基の数（システインは別にして）は７〜12、好まし くは９〜10まで変更し得る。 ITFまたはpS２の同族体は１以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有し得る 。これらの変化は好ましくは置換がそのタンパク質の折りたたみまたは活性に実 質的に影響を与えないような性質のものである。小さな欠失は典型的にはループ 領域の１〜約３アミノ酸並びにＮ−及びＣ−末端領域の１〜約10アミノ酸、１個 のアミノ末端もしくはカルボキシ末端延長、たとえばアミノ末端メチオニン残基 、約10残基までの小さいリンカーペプチドまたは精製を容易にさせる小さい延長 、たとえばポリヒスチジン区域、抗原エピトープもしくは結合ドメインである。 一般的にはFord他の「Protein Expression and Purification」２：第95〜107頁 （1991年）参照。保存的置換の例は塩基性アミノ酸（たとえばアルギニン、リシ ン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（たとえばグルタミン酸及びアスパルチン酸） 、極性アミノ酸（たとえばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（た とえばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（たとえばフェニル アラニン、トリプトファン、チロシン）及び小さいアミノ酸（たとえばグリシン 、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の範囲内である。 上記置換は分子の機能に決定的な領域以外の領域でなされ、なお活性なポリペ プチドを生じることができることは当業者に明らかであろう。この三つ葉状のペ プチドの活性に必須の、したがって、好ましくは置換を受けていないアミノ酸は 、当業界で公知の方法、たとえば部位特異的変異誘発またはアラニン走査変異誘 発に従って同定されるだろう（Cunningham及びWells「Science」244 、等1081〜 1085頁、1989年）。後者の技術では変異は分子中のすべての残基 に導入され、結果的に生じた変異分子を生理的活性について試験し（たとえば、 粘膜の治癒、粘膜の保護、胃潰瘍の治癒）、分子の活性に決定的であるアミノ酸 残基を同定する。 同族体はアレレ変異体、すなわち、変異により生じた遺伝子の別の形または変 異した遺伝子によりコードされた変更されたペプチドであるが本ペプチドと実質 的に同じ活性を有するペプチドであってもよい。したがって、変異は無症状（コ ードされたペプチドに変化がない）であり得るか、または別のアミノ酸配列を有 するペプチドをコードするかもしれない。 三つ葉状のペプチドの同族体は相同の種、すなわち、他の種、たとえばマウス 、ラット、ウサギ、ウシ、ブタまたはかえるから得る同様な活性をもつポリペプ チドであってもよい。 好ましい態様では、本発明の三つ葉状のペプチド２量体は約13000の分子量を 有している。その２量体はITF様単量体の位置57またはpS２様単量体の位置58に おける２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって結合された２つの 三つ葉状のペプチド単量体からなる。 三つ葉状のペプチド２量体は好ましくは組換えDNA技術によって製造される。 三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列は、ゲノムまたはcDNAライブラリーを 調製し、標準技術（Sambrook他「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Co ld Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、1989年 ）に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイズにより、 ペプチドのすべてまたは一部をコードするDNA配列についてスクリーニングする ことによって、最後には単離し得る。この目的のためには、そのペプチドをコー ドするDNA配列は好ましくはヒトからのもの、すなわち、ヒトゲノムDNAまたはcD NAライブラリー由来のも のである。 その三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列も、標準方法たとえばボケージ 及びカルーサーズ（Beaucage及びCaruthers「Tetrahedron Letters」22，1981年 、第1859〜1869頁によって記載されたホスホアミダイト法またはマッテス他（Ma tthes et al，「EMBO Journal」３，1984年、第801〜805頁）に記載された方法 によって合成的に製造してもよい。ホスホアミダイト法に従って、オリゴヌクレ オチドをたとえば自動DNA合成機中で合成し、精製し、アニールし、結合させ、 適当なベクター中でクローン化する。 DNA配列を特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応、たとえば米国特 許第4,683,202号、サイキ（saiki）他の「Scennce」239 ，1988年、第487〜489 頁、またはサムブルック他の上記に記載されたような方法によっても製造し得る 。 三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列は通常、適宜組換えDNA方法を受け得 るいかなるベクターであってもよい組換えベクターに挿入され、ベクターの選択 はしばしば導入されるべき宿主細胞に依存するだろう。したがって、ベクターは 自己複製ベクター、すなわち、染色体外の存在として存在し、その複製は染色体 の複製とは独立であるベクター、たとえばプラスミドであり得る。代りに、ベク ターは、宿主細胞に導入された時に宿主細胞ゲノムに組み込まれ、組み込まれた 染色体と共に複製されるものであり得る。 ベクターは、好ましくは三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列がDNAの転写 に必要な付加的なセグメントに作用可能に結合された発現ベクターである。一般 に発現ベクターはプラスミドまたはウイルス性DNAから得るか、または両方の要 素を含有してもよい。用語「作用可能に結合された」は、そのセグメントが、そ れらがそれらの意図された目的のために協力して作用するように、たとえば転 写がプロモーター中で開始し、ポリペプチドをコードするDNA配列を通って進行 するように配置されていることを表わす。 プロモーターは選択された宿主細胞中で転写活性を示すいかなるDNA配列であ ってもよく、宿主細胞に相同または異種性のいずれかであるタンパク質をコード する遺伝子から得ることができる。 哺乳類細胞中で三つ葉状のペプチドをコードするDNAの転写を指示するための 適当なプロモーターの例はSV40プロモーター（Subraman他「Mol．Cell Biol．」１ （1981年）第854〜864頁）、MT−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター （Palmiter他「Science」222（1983年）第809〜814頁）またはアデノウイルス２ 主要後期プロモーターである。 昆虫の細胞で用いるための適当なプロモーターの例は多角体（polyhedrin）プ ロモーター（米国特許第4,745,051号明細書、Vasuvedan他「FEBS Lett．311 第７〜11頁）、Ｐ10プロモーター（J．M．Vlak他「J．Gen．Virology」69，1988 年、第765〜776頁）、オートグラファ カリホルニカ 多面体（Autographa cal ifornicapolyhedrosis）ウイルス性塩基性タンパク質プロモーター（欧州特許第 397485号）、バキュロウイルス即時初期遺伝子１プロモーター（米国特許第5,15 5,037号、米国特許第5,162,222号）またはバキュロウイルス遅延された初期遺伝 子プロモーター（米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162,222号）である。 酵母宿主細胞において用いる適当なプロモーターの例は、解糖遺伝子（Hitzem an他「J．Biol．Chem．」255 （1980年）第12073〜12080頁、Alber及びKawasaki 「J．Mol．Appl．Gen．」１（1982年）第419〜434頁）もしくはアルコール脱水 素酵素遺伝子（Young他「Genetic Engineering of Microorganisms for Chemica ls（Hollaender他編）」中に、Plenum Press、ニューヨーク州、1982年）からの プロモーターまたはTPI １（米国特許第4,599,311号）もしくはADH２−４ｃ（Ru ssell他「Nature」304 （1983年）第652〜654頁）プロモーターを含む。 糸状菌宿主細胞に用いるのに適当なプロモーターの例は、たとえばADH ３プロ モーター（McKnight他「The EMBO J．」４（1985年）第2093〜2099頁）またはtp iAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、Ａ．オリザエTAKAアミ ラーゼ、リゾムコル ミエヘイ（Rhizomucor miehei）アスパルチン プロテイ ナーゼ、Ａ．ニガー（niger）中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー酸安定α−アミ ラーゼ、Ａ．ニガーもしくはＡ．アワモリグルコアミラーゼ（gluA）、リゾムコ ル ミエヘイ リパーゼ、Ａ．オリザエ アルカリ性プロテアーゼ、Ａ．オリザ エ トリオースリン酸塩、異性化酵素またはＡ．ニドラン（nidulans）アセタミ ダーゼから得たものである。TAKA−アミラーゼとgluAプロモーターが好ましい。 適当なプロモータ−はたとえば欧州特許第238023号及び欧州特許第383779号に記 載されている。 三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列は適当なターミネーター、たとえば ヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiter他「Science」222 ，1983年、第809 〜814頁）または（真菌宿主のために）TPI１（Alber及びKawasaki「J．Mol．App l．Gen．」１，1982年、第419〜434頁）もしくはADH ３（McKnight他「The EMBO J．」４，1985年、第2093〜2099頁）ターミネーター、にも必要ならば作用可能 に結合してもよい。 ベクターは、更に要素、たとえばポリアデニル化シグナル（たとえばSV40また はアデノウイルスの５Elb領域）、転写エンハンサー配列（たとえばSV40エンハ ンサー）及び翻訳エンハンサー配列（たとえばアデノウイルスVA RNAsをコード するもの）を含み得る。 組換えベクターは更にベクターを問題の宿主細胞中に複製できるようにするDN A配列を含み得る。そのような配列の例は（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）、SV4 0複製開始点である。 宿主細胞が酵母細胞のとき、ベクターを複製できるようにする適当な配列は酵 母プラスミド２μ複製遺伝子REP１−３及び複製開始点である。 ベクターは選択マーカー、たとえば、その産生物が宿主細胞の欠損を捕捉する 遺伝子、たとえばジヒドロホレート レダクターゼ（DHFR）またはシゾサッカロ ミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）TPI遺伝子(P．R．Russellによっ て、「Gene」40，1985年、第125〜130頁に記載されている）または薬物、たとえ ば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、 ネオマイシン、ヒグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性を与える 遺伝子も含み得る。糸状菌については、選択マーカーはamdS，pyrG，argB，niaD またはsCを含む。 本発明の三つ葉状のペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグ ナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られている） を組換えベクター中に提供し得る。分泌シグナル配列を、正しいリーディグフレ ーム中に三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列に結合する。分泌シグナル配 列は一般にペプチドをコードするDNA配列に対し５′に位置する。分泌シグナル 配列は普通にはペプチドと関連する配列であるか、他の分泌されたタンパク質を コードする遺伝子からであり得る。 酵母細胞からの分泌について、分泌シグナル配列はその細胞の分泌経路への発 現された三つ葉状のペプチドの効率的な指示を保証するどのようなシグナルペプ チドをコードするものでよい。シグナルペプチドは天然のシグナルペプチドもし くはそれらの機能的な部分 であるか、または合成ペプチドでもよい。適当なシグナルペプチドは、α−因子 シグナルペプチド（米国特許第4,870,008号参照）、マウスの唾液のアミラーゼ のシグナルペプチド（O．Hagenbuchle他「Nature」289 ，1981年、第643〜646頁 参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L．A．Vall他「 Cell」48,1987年、第887〜897頁参照）、酵母BAR １シグナルペプチド（国際特 許出願公開第87／02670号参照）または酵母アスパルチン プロテアーゼ３（YAP ３）シグナルペプチド（M．Egel−Mitani他「Yeast」６，1990年、第127〜137頁 参照）であることを見い出した。 酵母における効率的な分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列をシ グナル配列の下流及び三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入し てもよい。リーダーペプチドの機能は発現されたペプチドを小泡体からゴルジ装 置に、そして更に培地中への分泌のために分泌小泡へ誘導させること（すなわち 、三つ葉状のペプチドを細胞壁を通して、または少くとも細胞膜を通して酵母細 胞の細胞周辺腔へ運び出すこと）である。リーダーペプチドは酵母α−因子リー ダー（それを用いることは、たとえば米国特許第4,546,082号、米国特許第4,870 ,008号、欧州特許第16201号、欧州特許第123294号、欧州特許第123544号及び欧 州特許第163529号に記載されている）であってもよい。代りに、リーダーペプチ ドは、合成リーダー（すなわち、天然にはないリーダーペプチド）であってもよ い。合成リーダーペプチドは、たとえば国際特許出願公開第89／02463号または 国際特許出願第92／11378号に記載されているように構築してもよい。 糸状菌に用いるために、シグナルペプチドをアスペルギルス種アミラーゼもし くはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコル ミエヘイ リパーゼも しくはプロテアーゼまたはフミコーラ ラヌギノサ リパーゼをコードする遺伝子から適宜得てもよい。シグナルペプチ ドは好ましくは、Ａ．オリザエ TAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー中性α−アミラー ゼ、Ａ．ニガー酸安定アミラーゼまたはＡ．ニガー グルコアミラーゼをコード する遺伝子から得られる。適当なシグナルペプチドは、たとえば欧州特許第2380 23号及び欧州特許第215594号に記載されている。 昆虫の細胞で用いるためには、シグナルペプチドは適宜昆虫の遺伝子（国際特 許第90／05783号）、たとえば鱗翅目のマンズカ セクスタ（Manduca sexta）脂 質動員ホルモン前駆体シグナルペプチド（米国特許第5,023,328号）から得ても よい。 三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列、プロモーター及び任意にターミネ ーター及び／または分泌シグナル配列をそれぞれ結合し、複製のために必要な情 報を含有する適当なベクターにそれらを挿入するのに用いられる方法は当業者に よく知られている（たとえば、Sambrook他「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor、ニューヨーク州（1989年）参照）。 三つ葉状のペプチドをコードするDNA配列を導入する宿主細胞は、ペプチドを ２量体の形で産生可能ないかなる細胞でもよく、酵母、真菌及びより高級な真核 細胞を含む。 適当な哺乳類細胞系の例は、COS(ATCC CRL 1650)，BHK(ATCC CRL 1632，ATCC CCL 10)，CHL(ATCC CCL 39)またはCHO(ATCC CCL 61)細胞系である。哺乳類細胞 をトランスフェクトし、細胞内に導入されたDNA配列を発現する方法は、たとえ ば、Kaufman及びSharpの「J．Mol．Biol．」159 （1982年）第601〜621頁、Sout hern及びBergの「J．Mol．Appl．Genet．」１（1982年）第327〜341頁、Loyter 他の「Proc．Nath．Acad．Sci．USA」79（1982年）第422〜426頁、Wigler他の「 Cell」14（1978年）第725頁、Corsar及びPe asonの「Somatic Cell Genetics」７（1981年）第603頁、Graham及びvan der Eb の「Virology」52（1973年）第456頁及びNeumann他の「EMBO J．」１（1982年） 第841〜845頁に記載されている。 適当な酵母細胞の例はサッカロミセス種またはシゾサッカロミセス種、特にサ ッカロミセス セレビシアエまたはサッカロミセスクルイベリの株である。酵母 細胞を異種DNAで形質転換し、それから異種ポリペプチドを産生する方法は、た とえば、米国特許第4,599,311号、米国特許第4,931,373号、米国特許第4,870,00 8号及び米国特許第4,845,075号に記載されており、これらのすべては参照により 本明細書に組み入れられる。形質転換された細胞は選択マーカー、一般に薬剤耐 性または特定の栄養素、たとえばロイシンの不存在で増殖する能力によって決定 される表現型により選択される。酵母で用いるのに好ましいベクターは、米国特 許第4,931,373号に記載されているPOT１ベクターである。シグナル配列及び任意 にリーダー配列（たとえば上記のような）は三つ葉状のペプチドをコードするDN A配列の先に立つ。更に適当な酵母細胞の例は、クルイベロミセスの株、たとえ ば、Ｋ．ラクチス（lactis）、ハンセヌラ（Hansenula）、たとえば、Ｈ．ポリ モルファ（polymorpha）またはピチア（Pichia）、たとえばＰ．パストリス（pa storis）である（Gleeson他「J．Gen．Microbiol.」132 ，1986年、第3459〜346 5頁、米国特許第4,882,279号参照）。 他の真菌細胞の例は、糸状菌、たとえばアスペルギルス種、ニューロスポラ（ Neurospora）種、フサリウム（Fusarium）種またはトリコデルマ（Trichoderma ）種、特にＡ．オリザエ、Ａ．ニドランまたはＡ．ニガーの細胞である。タンパ ク質の発現のためにアスペルギルス種を用いることは、たとえば欧州特許第2722 77号、欧州特許第184438号に記載されている。Ｆ．オキシスポルム（oxysporum ）の 形質転換は、たとえば、Malardier他（「Gene」78，1989年、第147〜156頁）に より記載されているように実施する。トリコデルマ種の形質転換は、たとえば欧 州特許第244234号に記載されているように実施し得る。 糸状菌を宿主細胞として用いる時は、適宜DNA構成物を宿主の染色体に組み込 み、組換え宿主細胞を得ることにより、本発明のDNA構成物で形質転換し得る。 この組込みは、DNA配列が細胞中により安定に維持されるようであるので、一般 に利点と考えられている。DNA構成物の宿主染色体への組込みは慣用の方法、た とえば相同の、または異種性の組換えによって実施し得る。 昆虫細胞の形質転換及びその中での異種ポリペプチドの産生は、米国特許第4, 745,051号、米国特許第4,879,236号、米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162 ,222号及び欧州特許第397,485号（参照によりすべてが本明細書に組み入れられ る）に記載されているように実施する。宿主として用いられる昆虫細胞系は適切 には、レピドプテラ（Lepidoptera）細胞系、たとえばスポドプテラ フルギペ ルダ（Spodoptera frugiperda）細胞、またはトリコプルシア ニ(Trichoplusia ni)細胞（米国特許第5,077,214号）であり得る。培養条件は適切には、たとえ ば国際出願公開第89／01029号もしくは国際出願公開第89／01028号または前述の 参照文献に記載されているものでよい。 上記形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、次いで三つ葉状のペ プチドの発現を許容する条件下で適当な栄養培地中で培養し、その後生じたペプ チドのすべてまたは一部を２量体の形で培養から回収し得る。細胞を培養するの に用いられる条件は、宿主細胞を増殖させるのに適当ないかなる慣用の培地、た とえば、適当な補足を含有する最小培地または複合培地である。適当な培地は営 利供給者から得られるか、または出版された処方箋（たとえば、American Type Culture Collection中の）にしたがって調製し得る。細胞により産生された三つ 葉状のペプチドを、次いで遠心分離またはろ過による培地からの宿主細胞の分離 上清またはろ液のタンパク質成分の塩、たとえば硫酸アンモニウムの手段による 沈殿、種々のクロマトグラフ手段、問題のポリペプチドの型に依存して、たとえ ばイオン交換クロマトグラフ、ゲルろ過クロマトグラフ、アフィニティークロマ トグラフまたはその他同様なものによる精製を含む慣用の方法により培地から回 収し得る。 本発明の医薬組成物では、三つ葉状のペプチド２量体を医薬組成物を処方する 任意の確立された方法、たとえば「Remington's Pharmaceutical sciences」（1 985年）に記載されたように処方し得る。その組成物は全身注射または点滴に適 する形でよく、それ自体、滅菌水または等張塩類液またはグルコース溶液で処方 し得る。組成物は当業界で良く知られた慣用の殺菌技術により殺菌し得る。生じ る水溶液を使用のために包装するか、または無菌条件下でろ過し、凍結乾燥して もよく、凍結乾燥された調製物は殺菌された水溶液と投与の前に結合させる。組 成物は医薬として許容し得る、およその生理的条件に必要な補助物質、たとえば 緩衝剤、張性調整剤及び同様なもの、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム 、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有し得る。 本発明の医薬組成物は経鼻、経皮または経腸投与にも用い得る。前記組成物に 用い得る医薬として許容し得る担体または希釈剤は、いかなる慣用の固体担体で もよい。固体担体の例は、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天 、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸である。同 様に、担体または希釈剤は当業界で公知の任意の持続性放出物質、たとえばモノ ステアリン酸グリセロールまたはジステアリン酸グリセロール（単独でまたはワ ックスと混合して）を包含し得る。固体担体の量は非常に大きく変化するが、通 常、約25mg〜約１ｇであろう。 組成物中の三つ葉状のペプチドの濃度は広く、すなわち、約５％〜約100重量 ％に変化し得る。好ましい濃度は50〜100重量％の範囲である。組成物の単位投 薬量は典型的には約１mg〜約200mg、好ましくは約25mg〜約75mg、特に約50mgの ペプチドを含有し得る。 上記のように、本発明の三つ葉状の２量体は前記ペプチドの活性型であると確 信された。それ自体胃腸疾患の予防または治療のために用いることは有利である と考える。より詳細には、胃もしくは消化性潰瘍、炎症性の腸の病気、クローン 病または放射線療法、細菌もしくは他の感染により生じた腸管の損傷等の治療に 用いることが考えられる。患者に投与されるポリペプチドの用量は治療される状 態の型及び重症度により広く変化するだろうが、一般に0.1〜1.0mg／kg体重の範 囲である。 図面の簡単な説明 本発明を添付した図面と関連して例においてさらに詳細に記載する。 図１：ヒトの腸の三つ葉状の因子ITFの提案された構造。最初のアミノ酸配列 はHauser他（1993年）からとり、ジスルフィド結合をPSP及びpS２（Thim，1988 年）に一致させて置いた。 図２：ラットITFを発現している酵母株HW756からの上清のVydac214TP54での逆 相HPLC。 図３：部分的に精製されたヒトITFの高速（Fast Flow）SP−セファロースカラ ム上のイオン交換クロマトグラフィ。hITF（単量体）及びhITF（２量体）の量を 分析的HPLCにより測定した。棒は単量体 及び２量体の形のさらなる精製のために貯留された分画を示す。点線は溶離液中 のNaClの濃度を示す。 図４：精製されたラットのITF２量体（Ａ）、ヒトのITF（単量体）Ｂ及びヒト のITF（２量体Ｃ）のVydac214TP54 C4カラムでの逆相HPLC。 図５：精製されたラットのITF（２量体）（Ａ）、ヒトのITF（単量体）（Ｂ） 及びヒトのITF（２量体）（Ｃ）の再構築された質量スペクトル。 図６：ヒトのITFの２量体の型の構造。 図７：プラスミドKFN1003の制限マップ。 図８：プラスミドpHW756の構築。 図９：プラスミドpHW1066の構築。 例 物質及び方法ラットのITF（rITF）及びヒトのITF（hITF）のクローン化 ラット及びヒトのITFのクローン化を国際特許出願公開第92／14837号に記載さ れたように及びSuemori他（1991年）及びChinery他（1992年）（ラットのITF） 並びにPodolsky他（1993年）及びHauser他（1993年）（ヒトのITF）により記載 されたように実施した。rITF 及びhITF発現プラスミドの構築 ラットのITFの分泌のための発現プラスミドpHW756及びヒトのITFの分泌のため の発現プラスミドpHW1066を図７〜９に概説したように構築した。酵母発現ベク ターpKFN1003（国際特許出願公開90／10075号に記載されている）はプラスミドC POT(Kawasaki，G「International Conference on Yeast Genetics and Molecula r Biology」1984年9月17日〜24日、エジンバラ・スコットランド要約第15頁 )の誘導体である。それは選択マーカーとしてのシゾサッカロミセス ポンベTPI 遺伝子（POT）（Russell，P.R．「Gene」40（1985年）第125〜130頁）及び発現 の調節のためにＳ．セレビシアエトリホースホスフェート イソメラーゼ（TPI ）プロモーター及びターミネーターを有している（Alber，T及びKawasaki，G． 「J．Mol．Appl．Genet．」１（1982年）第419〜434頁）。 ラットのITF遺伝子は最初にBluescript II KS（−）（Stratagene）中にクロ ーン化され、それから図８に従って増殖させる。有用なクローン化部位を提供す るヘルパーベクターpSX54はpC18及びpDN1 T．「Plasmid」30（1993年）第312〜315頁）。合成DNAリンカーNco１−PflMIは 次の式を有する。 前記リンカーはコドンの選択にいくつかの変化を有するThim，L. ersen J.の「FEBS Lett．」318 （1993年）第345〜352頁に記載されたリーダー 配列のＣ−末端８−アミノ酸及びラットのITF遺伝子Ｎ−末端部、すなわちQEFVG LSPSQCをコードしている。シグナル及びリーダーのアミノ酸配列は同所に記載さ れている。 ヒトのITF遺伝子をPUC19中にクローン化し、図９に記載したように増殖させた 。合成DNAリンカーNcol１−BsaAlは次の配列を有している。 前記リンカーはrITF構築について記載されたＣ−末端８−アミノ酸のリーダー 及びhITF遺伝子のＮ−末端３アミノ酸：EEYをコードする。シグナル及びリーダ ーは上記と同じである。 唯一の炭素源としてのグルコースでの増殖についての選択により、発現プラス ミドをＳ．セレビシアエ株MT663（Ｅ２−７B X E11−36ａ／α，Δtpi／Δtpi， pep４−３／pep４−３）に形質転換した。 ラットのITF及びヒトのITFを発現する酵母形質転換体をそれぞれHW756及びHW1 067と名づけた。発酵 上記形質転換体を追加の酵母抽出物（60ｇ／ｌ）を補足した酵母ペプトンデキ ストロース（YPD）培地（Sherman他、1981年）中で30℃で72時間培養した。発酵 の終りに660nmでのOD価はHW756（rITF）及びHW1066（hITF）について、それぞれ 、153及び232に達した。発酵の終りにpHを１Ｍリン酸で2.5に調整し、酵母細胞 を3000rpm、15分間の遠心分離により除去した。組換えrITFの精製 酵母発酵肉汁培地及び精製の間に得られた分画におけるrITFの濃度を分析的HP LCにより測定した。30℃で平衡化されたVydac214TP54逆相C4 HPLCカラム（0.46 ×25cM）にアリコート（通常50〜200μｌ）を15％（ｖ／ｖ）のアセトニトリル 中の0.1％（ｖ／ｖ）のTFAと共に流量1.5ml／分で注入した。10分間の定組成溶 離の後、溶離溶媒中のアセトニトリルの濃度は40分にわたって55％に上昇した。 吸収は214nmで測定した。26.5分、27.3分及び２８．２分で溶離する３つのピー ク（図２）はrITFの２量体型を表わすことを見い出した。計算されたhSP標準（T him他、1993年）を用いて、そのペプ チドの量を測った。 本酵素系中の組換えラットITFの発現レベルは113mg／ｌであった。 10ｌの発酵槽から、遠心分離により8.7ｌの発酵肉汁培地を分離した。上清を1 4.8ｌの蒸留水で希釈し伝導率を下げた。その試料をFast Flow S-Sepharose（Ph armacia）カラム（５×42cM）に流量６00ml／時間でポンプで注入した。適用の 前にカラムを50mMの50mMのNaClを含有する、ギ酸緩衝液、pH3.7中で平衡化させ た。600ml／時間の流量で100mlの分画を収集し、rITFの量について分析した。rI TFを含有する前の段階の分画を貯留し（2.3ｌ）、Amberchrome（Ｇ−71）カラム （５×10cM）にポンプで注入した。適用の前に、10mM酢酸アンモニウム緩衝液pH 4.8で流量0.5ｌ／時間でカラムを平衡化した。適用後、カラムを0.5ｌの平衡緩 衝液で洗浄し、60％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有する。pH4.8の10mM酢酸アン モニウムで、流量0.1ｌ／時間で溶離させた。10mlの分画を収集し、rITFの量に 従って貯留した。貯留中のエタノール濃度は２容積のエタノール（99.9％、ｖ／ ｖ）を加えることによって60％（ｖ／ｖ）から87％（ｖ／ｖ）に増加し、結果と して生じた混合物を−25℃に16時間冷却することによりrITFは沈殿した。 沈殿物を10,000ｇで、−25℃で１時間の遠心分離により収集し、室温で130ml の20mMギ酸pH3.0に再溶解した。試料をFast Flow SP-Sepharose（Pharmacia）カ ラム（５×20cM）に流量50ml／時間でポンプで注入した。適用の前にカラムを20 mMギ酸pH3.0で平衡化した。1.5ｌの50mMぎ酸pH3.0及び0.5Ｍ NaClを含有する1. 5ｌのギ酸pH3.0の間の直線グラジエントによりペプチドをカラムから溶離した。 分画（10ml）を流量80ml／時間で収集し、280nmで吸収を測定した。分画はrITF の量について分析した。rITFに相当する分画 を貯留した。ラットのITFをさらに予備的HPLCで精製した。貯留された分画（900 ml）を0.1％（ｖ／ｖ）TFAで平衡化した、Vydac214TP1022C4予備的HPLCカラム（ 2.2×25cM）にポンプで注入した。ペプチドを、MeCN／H₂O／TFA（10：89.9：0.1 ，ｖ／ｖ／ｖ）及びMeCN／H₂O／TFA（65：34.9：0.1，ｖ／ｖ／ｖ）から形成し た直線グラジエント（540ml）を用いて、25℃で流量5ml／分で溶離した。UV吸収 を280nmで監視し、10mlに相当する分画を収集し、rITFの量について分析した。r ITFを含有する分画を貯留し、真空遠心分離によって容積を30％に減少させた。 生じた貯留から、rITFを凍結乾燥により単離した。8.7ｌの発酵培地からのrITF の全収量は236mgであって、全精製収率24％に相当した。組換えhITFの精製 酵母発酵肉汁培地及び精製の間に得られた分画中のhITFの濃度をrITFについて 記載したものと同一のHPLC系で測定した。この系においては、質量スペクトル及 びシークエンス分析により、２つの溶離ピークが21.2分及び27.1分で見い出され 、hITFの２量体型及び単量体型を表わす。この酵母系における組換えヒトITFの 発現レベルは90mg／ｌであった。 10ｌの発酵槽から、8.0ｌの肉汁培地が遠心分離によって分離された。試料を4 0ｌの10mMギ酸、pH2.5に対して３回（各回24時間で）透析した。試料をSP-Sepha rose Fast Flow（Pharmacia）カラム（５×40cM）にポンプで注入した（0.25ｌ ／時間）。カラムを５ｌの20mMギ酸、pH2.5で洗浄し、５ｌの20mMギ酸、pH2.5及 び５ｌの１ＭのNaClを含有するギ酸、pH2.5で形成した直線グラジエントで溶離 した。100mlの分画を収集し、hITFの量について分析した（図３）。hITFの２つ の型がカラムから溶離し、１つはhITFの単量体型（0.5ＭのNaClで溶離）を表わ し、１つはhITFの２量体型（0.78ＭのNa Clで溶離）を表わした。２つの型に相当する分画を別々に貯留した。 各分画を３つの等しい分量（容積：約700ml）に分割し、0.1％（ｖ／ｖ）TFA 中で平衡化したVydac214TP1022 C4カラム（2.2×25cM）にポンプで注入した。ペ プチドはMeCN／H₂O／TFA(10：89.9：0.1，ｖ／ｖ／ｖ）及びMeCN／H₂O／TFA（65 ：34.9：0.1，ｖ／ｖ／ｖ）の間の直線グラジエント（540ml）を用いて、流量４ ml／分で溶離した。UV吸収を280nmで監視し、10mlに相当する分画を収集し、hIT Fの量について分析した。 hITF（単量体）及びhITF（２量体）を含有する前段階からの分画を別々に貯留 し、pHを3.0に調整した。試料を別々に、40％（ｖ／ｖ）のエタノールを含有す る20mMのギ酸pH3.0で平衡化されたSP-Sepharose HiLoad 16／10（Pharmacia）カ ラム（1.6×10cM）に適用した。カラムを80mMの平衡緩衝液で洗浄し、200mlの20 mMギ酸、pH3.0、40％（ｖ／ｖ）エタノール及び200mlの40％（ｖ／ｖ）の１Ｍ NaClを含有する20mMギ酸、pH3.0の間の直線グラジエントで、流量４ml／分で溶 離した。分画（５ml）を収集し、hITFの量について分析した。 hITF（単量体）及びhITF（２量体）をそれぞれ含有する分画を貯留し、エタノ ール濃度を90％（ｖ／ｖ）に調節し、混合物を−25℃で72時間冷却することによ りペプチド含有量を沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって収集し、凍結乾燥し た。８ｌの発酵肉汁培地からの総収量は226mg hITF（単量体）及び133mg hITF（ ２量体）で総精製収率は単量体型及び２量体型について、それぞれ50％及び65％ であった。組換えrITF及びhITFの特徴づけ 真空密封管内で６Ｍ HClで110℃で24，48，96時間、加水分解後 、試料（50μｇ）をベックマン（Model 121 MB）自動アミノ酸分析機で分析した 。半−シスチンを、トリブチルホスフィンによるジス ニルピリジンを用いるカップリング（Friedman他、1970年）後、Ｓ−β−（４− ピリジルエチル）誘導体として測定した。４−ビニルピリジン処理試料の加水分 解を４Ｍメタンスルホン酸または３Ｍメルカプトエタンスルホン酸により、110 ℃で24時間上記のように実施した。アミノ酸配列分析をApplied Biosystems Mod el 470A気相シークエンサーを用いて自動化エドマン分解によって測定した（Thi m他、1987年）。 質量スペクトル分析をAPI III LC／MS／MSシステム（Sciex，Thornhill，Ont. ，Canada）を用いて実施した。３つの部分からなる四極子器具は2400の質量対荷 電（ｍ／Ｚ）範囲を有しており、空気補助電子スプレイ（イオンスプレイともい う）はインターフェースにはまっている（Bruins他、1987年；Covey他、1988年 ）。試料の導入は液体流量0.5〜１μｌ／分に固定された溶融毛細管（内径75μ ｍ）を通って、シリンジ注入ポンプ（Sage Instruments，Cambridge、マサチュ セッツ州）によって行った。器具のｍ／Ｚの目盛は単位分析のもとにポリプロピ レングリコール（PPGs）の単独に荷電したアンモニウム付加物イオンで目盛を決 めた。質量測定の精度は一般に0.02％よりも良い。 図４は精製rITF（図４Ａ）及びhITF（図４Ｂ及び４Ｃ）について得られた分析 的HPLCクロマトグラムを示す。組換えrITFは３つの密接に関連したペプチドの混 合物を含有し、これらの型を分離する試みはなされなかった。電子スプレイ質量 分析法により分析した時、13112.2，13096.6及び13078.8に相当する、３つの優 位な分子量が見い出された（図５Ａ）。Cys−57が遊離SH基を含有する単量体型 におけるラットのITFの計算された分子量は6558.3である。２量体型（たとえば Ｓ−Ｓ架橋が２つのCys−57の間に確立されている）中のラットのITFの計算され た分子量は13114.6である。組換えラットITFについて見い出された分子量から、 すべての３つのペプチドはrITFの２量体型を表わすことは明らかである。Ｎ−末 端アミノ酸残基がGln、たとえばPSPである他の三つ葉状のペプチドからは（Thim 他、1985年及びTomasetto他、1990年）、この残基は環化してピロリドンカルボ ン酸（pyrGlu）を形成する傾向がある。予想されたＮ−末端配列である、Gln-Gl u-Phe-Val-Glyを有するラットのITFの場合、Ｎ−末端Glnも環化してpyrGluを形 成するだろうと仮定するのが合理的なようである。このような誘導体化はラット のITF（２量体）の17（１つのpyrGlu）または34（２つのpyrGlu）質量単位のそ れぞれの分子量の減少を生ずるだろう。観察された分子量13096.6及び13078.8（ 図５Ａ）は、それぞれ１つ、２つのＮ−末端Cln残基が環化された、ラットのITF の２量体型に相当する。これらの型の計算分子量は13097.6及び13080.6であって 、実験的に測定された値とよく一致している。このように、HPLC（図４Ａ）及び 質量分析（図５Ａ）から、組換え体ラットITFは３つの異った２量体型、すなわ ち、２つのＮ−末端Glnを含有するもの、１つのＮ−末端Glnと１つのＮ−末端py rGluを含有するもの及び２つのＮ−末端pyrGluを含有するものからなると結論す る。表ＩはラットのITFのアミノ酸組成を示し、予想値と良く一致している。 図５Ａ及び５Ｂは、分析的HPLCにより分析した時のhITF（単量体）及びhITF（ ２量体）のそれぞれの純度を示す。２量体型（図５Ｃ）は、相対的に純粋にみえ るが、単量体型（図５Ｂ）はペプチドの前に溶離する物質で汚染されているよう である。しかしながら、主要なピークで溶離する物質の再クロマトグラフィーに よると、同様 なクロマトグラムが得られた（結果を示していない）。これは不純物よりもむし ろ逆相カラムでのhITF（単量体）の異常行動を示すようである。我々は以前高度 に純粋なブタのPSP並びに高度に純粋な組換えhSPの同様な行動を観察した（Thim 他、1993年）。 hITF（単量体）の質量分析は主要なピークの分子量が6694.0（図５Ｂ）に相当 することを示す。アミノ酸配列（図１）から計算すると、分子量はCys−57がSH 型で存在すると仮定して、6574.4である。アミノ酸配列分析（表II）は、予想さ れたＮ−末端配列のGlu-Glu-Tyr-Val-Gly-を示す。アミノ酸組成分析（表Ｉ）は 、7.3（８）システインの存在を除いて予想された値を示す。hITF単量体のCys− 57に結合する追加のシステインは質量分析法により測定した値（6694.0）に非常 に近い、6694.7に分子量を増加させるだろう。したがって、hITF（単量体）では 、Cys−57は追加のシステインにジスルフィド結合していると思われる。質量ス ペクトル（図５Ｂ）における小さい分子量ピークは他のCys−57誘導体を表わす か、調製物中の不純物であるかもしれない。 ２つの単量体が２つのCys−57残基の間のジスルフィド結合によって結合して いる、hITF（２量体）の計算分子量は13146.8である。これは質量分析法により 測定された値（13147、図５Ｃ）と良く一致している。質量スペクトルにおける 他のピーク（13169）はたぶんhITF（２量体）のNa⁺付加物を表わす。配列分析（ 表Ｉ）並びにアミノ酸組成分析（表II）も予想された値と良く一致している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ニールセン，ペル フランクリン デンマーク国，デーコー−3500 ベルレ ス，ヨンフルバッケン ３ゲー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２量体の形になっていることを特徴とする、唯一の三つ葉状のドメインを 含有する三つ葉状のペプチド。 ２．腸の三つ葉状の因子（ITF）である請求項１に記載のペプチド。 ３．ヒトのITFである請求項２に記載のペプチド。 ４．分子量約13000である請求項２に記載のペプチド ５．ITF２量体が、各単量体の位置57における２つのシステイン残基の間のジ スルフィド結合によって結合された２つのITF単量体からなる請求項２に記載の ペプチド。 ６．乳がんに関係するペプチド（pS２）である請求項１に記載のペプチド。 ７．ヒトのpS２である請求項６に記載のペプチド。 ８．pS２２量体が、各単量体の位置58における２つのシステイン残基の間のジ スルフィド結合によって結合された２つのpS２単量体からなる請求項７に記載の ペプチド。 ９．唯一の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドの２量体を製造 する方法であって、１つの三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドを コードするDNA配列で形質転換された適当な宿主をそのペプチドの産生を許容す る条件下で培養し、その培養から結果として生ずる三つ葉状のペプチドの２量体 を回収することを含む前記方法。 10．唯一の三つ葉状のドメインを含有する三つ葉状のペプチドの２量体と共に 医薬として許容し得る希釈剤または媒体を含む医薬組成物。 11．請求項２〜８のいずれかに記載のペプチドを含む、請求項10 に記載の医薬組成物。 12．薬剤として用いるための１つの三つ葉状のドメインを含む三つ葉状のペプ チドの２量体。 13．胃腸疾患の予防または治療用の薬剤の調製のための１つの三つ葉状のドメ インを含有する三つ葉状のペプチドの２量体の使用。