JPH10117777A - ラット由来エオシノフィル・カチオニック・プロテインをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ラット好酸球由来エオシノフィル・カチオニ
ック・プロテイン及び該プロテインをコ−ドするＤＮＡ
の提供。 【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を実
質的に含み、細胞傷害活性をもたらすラット好酸球由来
エオシノフィル・カチオニック・プロテイン前駆体、及
び配列番号２又は３で表される前記プロテイン前駆体を
コードするＤＮＡ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ラット好酸球由来
エオシノフィル・カチオニック・プロテイン（ Eosinop
hil cationic protein; ECP ）及び該ECP をコードする
DNAに関する。ラット好酸球由来のECP は、該遺伝子Ｄ
ＮＡから一旦前駆体蛋白質として翻訳され、切断により
成熟型蛋白質となる。

【０００２】

【従来の技術】アレルギ−性疾患、例えば、慢性気管支
喘息において、抗原となるアレルゲンの侵入により誘起
される免疫反応は、先ず、肥満細胞上の IgEレセプタ−
に結合した抗原特異的 IgEに抗原アレルゲンが結合し、
ヒスタミン、アラキドン酸代謝物等の種々メディエータ
ーが放出される初期の反応、すなわち即時型反応（imme
diate type reaction）が起こるというものである。そ
の後、抗原となるアレルゲンの侵入後、数時間にわた
り、好酸球を中心とした白血球の患部への浸潤に伴う、
炎症性の反応が見られる。この過程は、遅発型反応（la
te phase reaction）と呼ばれ、好酸球を中心とした白
血球が放出する幾つかの塩基性蛋白質により引き起こさ
れる細胞傷害性の反応の一つである。

【０００３】この遅発型反応に関与する好酸球由来の塩
基性蛋白質の一つに、好酸球由来のエオシノフィル・カ
チオニック・プロテイン（Eosinophil cationic protei
n; ECP) と称されるものがある。このECPは、好酸球由
来 Major Basic Protein (MBP)と同様に、そのアミノ酸
配列中に多数のアルギニンを含み、このため等電点が約
11の塩基性蛋白質である。このECPは、成熟好酸球中の
顆粒体、特にそのマトリックス（基質）に局在した蛋白
質として存在している。上記の顆粒体において、そのコ
ア（芯）には好酸球由来の Major Basic Protein (MBP)
が存在し、マトリックス（基質）にはECPの他にeosinop
hil derived neurotoxin (EDN) と eosinophil peroxid
ase (EPO)とが存在していることから、ECP はMBP 、EDN
及びEPOとともに、炎症性反応に際し何れも顆粒体から
成熟蛋白質として放出されると考えられている。

【０００４】例えば、ヒト由来ECPには、分子量の異な
る数種類のECP （例えばECP-1 及びECP-2)が存在するこ
とが報告されている。そして、そのECP-1とECP-2 との
間では、解明されたアミノ酸配列にはかなりの遺伝子内
由来の相違（heterogeneity）があり、クローニングさ
れたECP-1及びECP-2 のcDNAからもその分子量及びアミ
ノ酸配列の差違が報告されている（J. Exp. Med.170, 1
63-176 (1989), J. Immunol. 143, 952-955 (1989)を参
照）。

【０００５】また、ヒト由来ECPは、遺伝子上で分子量
約22kDaの前駆体蛋白質としてコードされており、前駆
体蛋白質から切断を受け、種類により若干異なるもの
の、その分子量は18〜19kDaの成熟型蛋白質となること
が判明している。ヒト由来ECPの生理活性については、
気管支上皮細胞に作用して細胞剥離を引き起こしたり、
重症の喘息などでは、気管支内腔への炎症細胞の貯留を
すすめ、粘液栓の形成を引き起こす働きが報告されてい
る。加えて、このECPは、混合リンパ球反応におけるリ
ンパ球の増殖を阻害する作用、血漿凝固時間を短縮化す
る作用、あるいはウロキナーゼ誘起のプラスミノーゲン
活性化を促進する作用を示すことが報告されている。そ
の他に、ヒト由来ECP は寄生虫に対する極めて強い殺傷
害性を有しており、その殺傷性はMBPの８〜10倍である
ことが知られている。

【０００６】ECPは、寄生虫、細菌などに対する強い細
胞傷害性を有していることから、住血吸虫など寄生虫病
等の治療目的に利用できることが想定される。他方、該
ECPは炎症の遅発型反応に特徴的な分泌性の蛋白質であ
るので、病理学的な試験研究において、炎症反応の進行
を追跡する指標、手段（検査薬）として高い利用価値が
ある。

【０００７】この観点から、汎用される実験動物である
ラットに関しても、その好酸球由来の ECPの単離、その
アミノ酸配列の解明、並びにその前駆体蛋白質に翻訳さ
れるmRNA から調製される cDNA の取得及びその塩基配
列の解明は、利用価値が高く、その単離・解明と提供が
強く待ち望まれていた。更には、この単離されたラット
の好酸球由来の ECPに対する IgG抗体の創製も待たれて
いた。即ち、このラット由来の ECPをコードする cDNA
を利用し、遺伝子組み換えによる組換え蛋白質の生産と
それを用いた IgG抗体の創製も待たれていた。

【０００８】しかしながら、ラットにおいても好酸球由
来の ECPの存在は期待されてはいたものの、本出願にお
ける本発明者らの提供に先立ち、ラットにおいて、好酸
球由来の ECPが実際に存在することを明確に示唆する報
告、更には、そのアミノ酸配列及びそれをコードするcD
NAの単離はなされていなかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の課題
を解決するもので、本発明の目的は、ラット由来の Eos
inophil cationic protein (ECP)のアミノ酸配列の解
明、その前駆体蛋白質に翻訳される mRNA から調製され
る cDNA の取得とその塩基配列の解明に伴い、従来知ら
れていなかった、ラット好酸球由来の Eosinophil cati
onic protein (ECP)、及びその前駆体蛋白質をコ−ドす
るＤＮＡを提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記の課
題を解決すべく鋭意研究を行ない、ラットにも好酸球由
来のECPが存在することを見い出し、腹腔浸潤好酸球を
多量に採取し、当該好酸球由来のECP の単離・精製を行
なった。引き続き、当該ECPの部分アミノ酸配列の解析
を進め、また、単離したECPは成熟型のECPであることを
確認した。その結果、ECP の前駆体蛋白質に翻訳される
mRNA から調製される cDNA の取得とその塩基配列の解
明に成功を収めた。本発明は、係る知見に基づき、完成
されたものである。

【００１１】すなわち、本発明は、配列番号１１で表さ
れるアミノ酸配列を実質的に含み、細胞傷害活性をもた
らすラット由来エオシノフィル・カチオニック・プロテ
イン（Eosinophil cationic protein; ECP）である。配
列番号１１で表されるアミノ酸配列は、配列番号１にお
いてその第２２番目のロイシン(Leu) 以降のアミノ酸配
列を示したものである。

【００１２】さらに、本発明は、配列番号１１で表され
るアミノ酸配列を実質的に含むラット由来ECP をコード
するＤＮＡである。該ＤＮＡとしては、例えば配列番号
２で表される塩基配列の第64〜468 番目の塩基配列を含
むものが挙げられる。さらに、本発明は、配列番号１で
表されるアミノ酸配列を実質的に含むラット由来ECP の
前駆体をコードするＤＮＡである。ECP の前駆体をコー
ドするＤＮＡとしては、配列番号２で表されるものが挙
げられる。さらに、本発明は、配列番号３で表される塩
基配列を実質的に含む、ECP の前駆体をコードするＤＮ
Ａである。

【００１３】ここで、「実質的に」とは、本発明のECP
が天然の活性型ECP 成熟蛋白質の有する生理活性、特に
は、細胞傷害活性を有する限り、当該タンパク質に含ま
れるアミノ酸配列に１個又は数個の置換、付加、欠失、
挿入等の変異が生じてもよいことを意味する。また、本
発明のＤＮＡが前記のECP を発現させる機能を保持する
限り、当該遺伝子の塩基配列にこれらの変異に対応する
コドン１個又は数個の置換、付加、欠失、挿入等の変異
が生じてもよいことを意味する。更には、非翻訳領域に
おける塩基配列への置換、付加、欠失、挿入等の変異が
生じてもよいことを意味する。

【００１４】従って、例えば本発明のECP 前駆体（配列
番号２）に含まれるアミノ酸配列の第１（メチオニン）
〜21番目（メチオニン）の部分が欠失しているものなど
も、このアミノ酸配列の変化によるタンパク質に含まれ
る。また、本発明のECP に含まれるアミノ酸をコードす
る塩基配列のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一
のポリペプチドをコードする縮重異性体も本発明のＤＮ
Ａに含まれる。なお、上記のラット由来の活性型ECP
は、所謂成熟型のECP を意味し、 ECPの前駆体とは、顆
粒体内への移行に用いられるシグナルペプチド配列領域
を所謂成熟型のECPのN末に有するものを意味する。以
下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明のラット好酸球由来のECP
は、以下の方法でラット好酸球を大量に採取し、その好
酸球顆粒から分離・精製することができる。また、好酸
球に分化する過程にある骨髄中の多能性造血幹細胞、或
いはそれから分化誘導される前駆細胞（colony forming
unit; CFU-Eo）などを採取し、それら好酸球に分化す
る過程にある細胞中の mRNA から、ラット好酸球に由来
するECP の前駆体をコ−ドするcDNA を調製し、その塩
基配列を解明することができる。

【００１６】〔１〕ラット好酸球の採取 ラット好酸球は、本発明者らが既に刊行物に掲載した論
文（M. Watanabe et al., Int. Arch. Allergy Immuno
l. 108, 11-18 (1995)を参照）に報告した手法により採
取することができる。すなわち、ラットを Ascaris suu
m の抽出抗原で免疫感作した後、該免疫済ラットの腹腔
に Ascaris suum 抗原溶液を注射接種することにより、
腹腔内に顕著な好酸球浸潤を誘発する。

【００１７】被免疫ラットとして、Sprague-Dawley系雄
性ラット４〜５週齢（specific pathogen-free, Charle
s River Japan Inc.より購入）などを用いる。 Ascaris
suum の抽出抗原は、 Greer Lab. 等より市販されてい
るものを利用する。初回免疫の２日前に、0.5 ％(w/v)
カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC-Na)水溶液
に溶解したシクロホスファミド（cyclophosphamide）
を、100mg/kgの用量で該ラットに予め経口投与する。

【００１８】初回免疫の抗原液は、 Ascaris suum の抽
出抗原 4 mg protein 量に、水酸化アルミニウム 10 mg
を加えて、生理食塩水に懸濁し全量 1 ml に調製する。
この懸濁液を、肩２ヵ所、腰３ヵ所の計５ヵ所に各 0.1
ml ずつ皮内注射し、腹腔内に 0.5 ml を注射して感作
する。初回感作の10日後、追加免疫を施す。この追加免
疫の抗原液として、 Ascaris suum の抽出抗原 2 mg pr
otein 量に、水酸化アルミニウム 5 mg を加えて、生理
食塩水に懸濁し全量 0.5 ml に調製した懸濁液を用い
る。

【００１９】前記追加免疫の７日後、 Ascaris suum の
抽出抗原 8 mg protein 量に生理食塩水を加えて全量 3
0 mlに調製した抗原溶液を、腹腔内に注射して抗原刺激
を行なう。この抗原刺激後、腹腔内への好酸球浸潤は、
約８時間経過した時点で最大に達し、約72時間経過後ま
で持続する。従って、抗原刺激後48時間経過した時点
で、当該抗原刺激したラットをエ−テル麻酔下、頸動脈
切断して脱血死させる。

【００２０】次いで、死後のラット腹腔に PBS(-) 20 m
l を注入し、腹壁をよくマッサ−ジする。しかる後、腹
壁に小穴を穿ち、腹腔内液をプラステックチュ−ブ（フ
ァルコン製）に回収する。 PBS(-) 8 mlを前記小穴から
再度注入し、マッサ−ジした後、別のプラステックチュ
−ブ（ファルコン製）に回収する。更に、同じ操作を繰
り返し、残余する腹腔内細胞を回収する。得られた腹腔
内細胞を含む ＰＢＳ（−）液は、３５０ × g、４℃
で３分間遠心し、上清と腹腔細胞とに分離し、腹腔細胞
を回収する。採取される腹腔細胞の組成は主に好酸球で
あり、おおよそ好酸球 92％、好中球 5.0％、単核球 3.
1％から構成されている。なお、腹腔細胞の採取と並行
して脛骨及び大腿骨を採取し、採取した骨の両端を切断
し、一端からそれぞれ PBS 2 ml を注入し、骨髄細胞を
別途回収する。採取される腹腔細胞を、一旦 RPMI-1640
培地 2 ml に懸濁させ、この細胞浮遊液を比重 1.080の
Percoll-PBS溶液に重層し、1,000 × g、室温で30分間
遠心することにより純化を進め、好酸球をペレットに回
収する。

【００２１】〔２〕ラット好酸球に由来するECPの分離
・精製 純化された好酸球を破砕し、該細胞中の顆粒を４℃で遠
心により採取する。分離される顆粒からのECP の分離・
精製は、既に報告されているヒト好酸球由来ECP の分離
・精製法（G. J. Gleich et al. , Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 83, 3146-3150 (1986)などを参照）に準じ
て行なうことができる。

【００２２】先ず、顆粒に含まれる蛋白質を0.1 N 塩酸
に溶解した後、この蛋白質溶液を Sephadex G-50カラム
に載せ、 150 mM NaCl, 20 mM 酢酸-酢酸ナトリウム緩
衝液（pH 4.3）にて溶出させ、かかるゲル濾過により粗
精製品を含む画分を分取する。次に、得られる粗精製品
を含む画分から、逆相クロマトグラフィ−により更なる
精製を行なう。例えば、粗精製の蛋白質を0.1 ％トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液に溶解し、Vydac C-4 カラ
ムにかけ、溶出は、溶媒Ａ（0.1 ％ＴＦＡ水溶液）及び
溶媒Ｂ（アセトニトリル：0.1 ％ＴＦＡ水溶液＝９：
１）を用いて、linear gradient 法にて分離・精製を行
なうことができる。蛋白質の検出は、280nm における吸
収による。

【００２３】なお、上記の各精製過程において、ラット
好酸球由来ECP の純度検定は、SDS-PAGE法において、分
子量(Mr)＝約19 kDaに見い出される該ECP のバンド密度
を測定し、蛋白質量を見積ることにより行われる。同時
に、等電点を測定し、 pI 値は約11であることを確認す
る。

【００２４】〔３〕ラット好酸球由来ECPの前駆体ペプ
チドをコ−ドする cDNA の採取とその塩基配列の解析 好酸球は、骨髄中において多能性造血幹細胞から分化誘
導される前駆細胞（colony forming unit; CFU-Eo）を
経て、それぞれ特有の顆粒を持つ好酸球に成熟する。こ
の分化・成熟の過程において、顆粒に局在する蛋白質の
翻訳がなされるので、抗原刺激後、好酸球への分化増殖
が進行する間に、骨髄細胞においては、ラット好酸球由
来ECP の前駆体ペプチドへの翻訳に利用される mRNA が
多量に転写される。この点を考慮に入れ、上記〔１〕の
工程において好酸球を主に含む腹腔細胞を採取すること
と期を同じくして、回収した骨髄細胞から mRNA を採取
する。

【００２５】骨髄細胞を、 5 mM クエン酸ナトリウム、
0.1 Mβ-メルカプトエタノ−ル、0.5％ sodium sarkos
ylを添加した 6 M guanidine-thiocyanate水溶液（pH
7.0）中で破砕し、細胞懸濁液とする。 0.1 M EDTA を
含むトリフルオロ酢酸セシウム水溶液（pH 7.0、比重
1.51 ）上にこの細胞懸濁液を重層し、85,000× g、 25
℃で約24時間遠心する。全 RNAは遠心チュ−ブの底に
分離され、それを分取する。全 RNAからpoly(A)＋RNA
を分離し、poly(A)＋RNA 標品を得る。この poly(A)＋R
NA 標品 1μg を鋳型として、市販の cDNA 合成キット
（宝酒造（株）他）を用い、逆転写して cDNA を合成す
る。また、 cDNA クロ−ニングキット（λgt10ファ−ジ
ベクタ−）を用いて cDNA ライブラリ−を作製する。

【００２６】ラット由来ECP の前駆体ペプチドに対する
cDNA 中、成熟蛋白質のＣ末領域をコ−ドする領域の部
分塩基配列を以下の方法で解析する。先ず、既に報告さ
れている、ヒト好酸球由来のECP-1、ECP-2の前駆体ペプ
チドに対する cDNA の塩基配列と対応するアミノ酸配列
とを対比して、両者の塩基配列と対応するアミノ酸配列
中、相同な部分が存在することを確認する。この部分
は、哺乳動物の種間においても保存されていると仮定
し、相同な部分塩基配列を基に、混合型プライマ−を合
成する。なお、ヒト好酸球由来のECPは、そのアミノ酸
配列にEDNとの類似性があるため、この両者の類似性の
高い領域はプライマーの設計の対象外として前記の混合
型プライマーを調製する。具体的には、下記のセンス型
プライマーとアンチセンス型プライマーをそれぞれ合成
した。

【００２７】 アミノ酸部分配列を基にした cDNA の部分塩基配列ＰＣＲ増幅用プライマー mix primer sense 5- TGYAARGGNATHAAYACNTT -3 （配列番号４） mix primer anti-sense 5- GGRTCNACNCCNACNGTRTA -3 （配列番号５） 但し、 Y ＝ C or T R ＝ A or G H ＝ A or C or T N ＝ A or G or C or T を意味する。

【００２８】前記の混合型プライマ−の塩基配列全て
は、目的とするラット由来 ECPの前駆体ペプチドに対す
る cDNA の塩基配列中に、必ずしも完全に一致する部分
又は相補的な部分が存在するとは限らないが、これらと
類似性の高い部分塩基配列が存在するならば、ＰＣＲ法
により増幅される産物が得られる。

【００２９】上述のpoly(A)＋RNA 標品を鋳型として調
製した cDNA に対して、前記のプライマ−、並びにpoly
(A)部分に対する汎用のアダプタ−プライマ−（Adapter
primer）及びオリゴ dT 配列を付加した Oligo dT-ア
ダプタ−プライマ−（Oligo dTアダプタ−プライマ−）
をそれぞれ用いてＰＣＲを行う。そして、ＰＣＲ法によ
り増幅される cDNA 断片の有無を検証する。ＰＣＲ反応
では、 cDNA 0.2 μg、50 mM KCl、1.5 mM MgCl₂、dNTP
(dATP, dGTP, dCTP 及びdTTP) を各 250μMずつ、セン
ス型プライマ−及びアンチセンス型プライマ−を各 0.2
μM ずつ、並びに2.5 U の Taq DNAポリメラ−ゼを、10
mM Tris-HCl緩衝液 100μl （pH 8.3）に添加した反応
液を用いる。ＰＣＲの温度サイクルは、94℃で１分間
（変性）、55℃で１分間（アニーリング）及び72℃で３
分間（伸長）を１サイクルとして、計40サイクル繰り返
す。反応終了後、反応液 10 μl を採り、PCR 産物をア
ガロ−スゲル電気泳動により分析し、増幅された DNA断
片の有無及びその分子量を評価する。

【００３０】この増幅される DNA断片は、pGEM-Tプラス
ミドベクタ−（pGEM-T vector systems、Promega, Madi
son, WI, USA）にサブクロ−ニングする。該 DNA断片
は、その両端の塩基配列が増幅に用いたプライマ−と一
致する（相補的である）ので、この既知の塩基配列を基
にシ−クエンスプライマ−を調製し、常法に従い、該 D
NA断片の塩基配列を決定する。新たに解明された該 DNA
断片の塩基配列を基に、センス型塩基配列を持つプライ
マ−、アンチセンス型塩基配列を持つプライマ−を新た
に合成する。

【００３１】前記のDNA 断片の 3' 側下流に存在する p
oly(A)＋端までの間の塩基配列を再度解析するため、
3'-RACE法を適用する。先ず、 poly(A)＋鎖と相補的な
OligodT-アダプタ−プライマ−を逆転写プライマ−とし
て用いて、 poly(A)＋RNA 標品を鋳型として、新たに c
DNA を合成する。次いで、アダプタープライマーをアン
チセンス型プライマーとし、直前の解析で新たに塩基配
列が解明されたいわゆる“gene specific primer”をセ
ンス型プライマーとして用いて、該 cDNA を鋳型としＰ
ＣＲ法で 3' 側の DNA断片を増幅する。

【００３２】得られる増幅産物を一旦pGEM-Tプラスミド
ベクタ−（pGEM-T vector systems、Promega, Madison,
WI, USA）などにサブクロ−ニングした後、既に解明が
された塩基配列を基にシ−クエンスプライマ−を調製
し、常法に従い、残る DNA断片の塩基配列を決定する。
なお、この3'-RACE 法に用いたプライマ−は、下記のも
のである。

【００３３】 3'-RACE 法に用いたプライマ− 3' sense primer 5- CCCTGTGGAAACAGGACAT -3（配列番号６） oligo(dT) adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3（配 列番号７） adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGAC -3（配列番号８）

【００３４】次いで、前記のDNA 断片の 5' 側上流に存
在する部分の塩基配列を解析するため、 5'-RACE法を適
用する。先ず、解析が終わった塩基配列から作製したア
ンチセンス型プライマ−を逆転写プライマ−として用い
て、 poly(A)＋RNA 標品を鋳型として、新たに cDNA を
合成する。得られる cDNA の 3' 末端に、dATPと市販の
terminal deoxynucleotidyl transferase（宝酒造
(株)）を用いて、付加重合による dA 鎖を伸長する。次
いで、 anchored PCR 法を適用して、伸長されたdA 鎖
に相補的である Oligo dT-アダプタ−プライマ−を加え
て、二重鎖 DNAに変換する。この二重鎖 DNAから、アダ
プタ−プライマ−をセンス型プライマ−として、該 DNA
を鋳型としＰＣＲ法で DNA断片を更に増幅する。

【００３５】その結果、元の poly(A)＋RNA の 5'-端に
相当し、5'-末端に伸長されたポリT鎖とアダプタ−プラ
イマ−の塩基配列とが付加された DNA断片が得られる。
この DNA断片の両端は、それぞれ既知のアダプタ−プラ
イマ−及び逆転写プライマ−の塩基配列と一致する（相
補的である）。このＤＮＡ断片を、一旦pGEM-Tプラスミ
ドベクタ−（pGEM-T vector systems、Promega, Madiso
n, WI, USA）にサブクロ−ニングした後、この既知の塩
基配列を基にシ−クエンスプライマ−を調製し、常法に
従い、該 DNA断片の塩基配列を決定する。なお、この
５'-RACE法に用いたプライマ−は、下記のものである。

【００３６】 5'-RACE 法に用いたプライマ− 5' anti-sense primer 1 5- CTTGTAGTTTGGTATCTACA -3（配列番号９） 5' anti-sense primer 2 5- CGGAGTTGTGAGGTTACAGA -3（配列番号10） oligo(dT) adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3（配 列番号７） adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGAC -3（配列番号８）

【００３７】上記方法によりサブクロ−ニングされた複
数種のDNA 断片を、解明された部分塩基配列を重ね合わ
せて一連の塩基配列とすることにより、ラット好酸球由
来 ECPの前駆体ペプチドに対する cDNA を得ることがで
きる。かかるｃＤＮＡの塩基配列は、配列番号３及び図
２に示すものであることが判明する。配列番号３及び図
２で表される塩基配列において、5'-端には63塩基の上
流非翻訳域が含まれ、3'-端には、終端コドン（TAG ）
以降に187 塩基の下流非翻訳域が含まれており、その間
に155 アミノ酸をコ−ドする翻訳域（オープンリーディ
ングフレーム；配列番号２）が存在している。対応する
アミノ酸配列を既に報告されているヒト好酸球由来 ECP
と対比させ、相互に相同性を有するように配列すると、
顆粒体内への移行に用いられるシグナルペプチド配列
は、塩基性アミノ酸に富む成熟型蛋白質のＮ末側に存在
していることが判別される。ラット好酸球由来のECP前
駆体は、上記する配列番号１で表されるアミノ酸配列で
あることが判明する。更には、該アミノ酸配列は、配列
番号２で示される塩基配列を含むＤＮＡによりコ−ドさ
れていることが判明した。

【００３８】塩基配列が一旦決定されると、その後は、
化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合
成したプライマーを用いたＰＣＲによって、あるいは該
塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリ
ダイズさせることによって、所望のＤＮＡを得ることが
できる。

【００３９】配列番号２又は配列番号３にラット由来EC
P 前駆体をコードするＤＮＡの塩基配列を例示するが、
本質的にECP を発現する機能を保持する配列であればこ
の配列に限定されるものではなく、その翻訳領域にコド
ン単位での置換、付加、欠失、挿入などによってその塩
基配列に変異を導入することが可能である。同じく、そ
の非翻訳領域の塩基配列にも、置換、付加、欠失、挿入
などによって変異を導入することが可能である。なお、
変異の導入は、公知の突然変異導入法（例えば宝酒造社
のTAKARA LA PCR in vitro Mutagenesis kitを用いた方
法）等により行われる。

【００４０】本発明のラット好酸球由来 ECPの成熟型蛋
白質は、従来の ECPと同様に、寄生虫等に対する細胞傷
害性を示すので、治療用途等に利用できる。また、本発
明のラット好酸球由来 ECPの成熟型蛋白質、或いはその
前駆体ペプチドをコ−ドするＤＮＡは、その塩基配列を
利用して作製される核酸プロ−ブを用い、実験動物とし
て汎用されるラットの種々の組織における、ラット好酸
球由来の ECPの成熟型蛋白質の産出、具体的には、その
翻訳に用いられる mRNA の検出に利用できる。これらの
検出手段は、実験動物を用いる炎症症状の解析等を容易
にし、喘息などの慢性的な炎症性疾患に対する治療薬の
開発を促進することに大きく役立つ。また、前駆体ペプ
チドをコ−ドするＤＮＡを利用して、ヒト由来のECPに
おけると同様に（H. F. Rosenberg , J. Biol. Chem. 2
70, 7876-7881 (1995)などを参照）、組み換え蛋白質の
生産を行うこともできる。

【００４１】本発明のラット好酸球由来 ECPは、所謂成
熟型の ECPとして細胞外に分泌されることを特徴として
おり、更には、この成熟酵素 ECPの前駆体は、顆粒体内
への移行に用いられるシグナルペプチド配列を成熟型の
蛋白質のＮ末に有することを特徴とするものである。一
連となったものとして、遺伝子上にコ−ドされているこ
とを、以下実施例により具体的に説明する。加えて、ラ
ット好酸球由来 ECPを成熟蛋白質として分離・精製する
方法、この成熟酵素 ECPの前駆体をコ−ドするcDNA の
調製、及びその塩基配列の解明を、実施例により具体的
に説明する。

【００４２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明は、これら実施例にその技術的
範囲を限定するものではない。

【００４３】〔実施例１〕本発明のラット好酸球由来 E
CPは、以下の方法でラット好酸球を大量に採取し、その
好酸球顆粒から分離・精製した。また、好酸球に分化す
る過程にある、骨髄中の多能性造血幹細胞、或いはそれ
から分化誘導される前駆細胞（colony forming unit; C
FU-Eo）などを採取し、これらの細胞内に含まれる mRNA
からラット好酸球由来 ECPの前駆体をコ−ドする cDNA
を調製し、その塩基配列の解明を行なった。解明され
た塩基配列に基づき、ラット好酸球由来 ECPは、配列番
号１で表されるアミノ酸配列からなる前駆体ペプチドと
して翻訳された後、シグナル配列の切断を受け成熟蛋白
質となることが追認された。

【００４４】(1.1) ラット好酸球の採取 本発明者らが既に刊行物に掲載した論文（M. Watanabe
et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 11-18 (19
95)を参照）に報告するとおり、ラットを Ascaris suum
の抽出抗原で免疫感作した後、該免疫済ラットの腹腔
に Ascaris suum抗原溶液を注射接種することにより、
腹腔内に顕著な好酸球浸潤を誘発した。この際、腹腔内
に浸潤してくる好酸球を大量に含む腹腔内液から、下記
の手段でラット好酸球を分離・採取した。

【００４５】被免疫ラットとして、Sprague-Dawley系雄
性ラット４〜５週齢（specific pathogen-free, Charle
s River Japan Inc.より購入）を用いた。 Ascaris suu
m の抽出抗原は、 Greer Lab. 等より市販されている抽
出抗原を利用した。初回免疫の２日前に、0.5 ％(w/v)
sodium carboxymethylcellulose (CMC-Na)水溶液に溶解
した cyclophosphamide を、100mg/kgの用量でラットに
予め経口投与した。

【００４６】初回免疫の抗原液は、 Ascaris suum の抽
出抗原 4 mg protein 量に水酸化アルミニウム 10 mgを
加えて、生理食塩水に懸濁し全量 1 ml に調製した。こ
の懸濁液を、肩２ヵ所、腰３ヵ所の計５ヵ所に各 0.1 m
l ずつ皮内注射し、腹腔内に0.5 ml を注射して感作し
た。初回感作の10日後、追加免疫を施した。この追加免
疫の抗原液として、 Ascaris suum の抽出抗原 2 mg pr
otein 量に、水酸化アルミニウム 5 mg を加えて、生理
食塩水に懸濁し全量 0.5 ml に調製した懸濁液を用いた
（腹腔内投与を行った。）。

【００４７】前記追加免疫の７日後、 Ascaris suum の
抽出抗原 8 mg protein 量に生理食塩水を加えて全量 3
0 mlに調製した抗原溶液を、腹腔内に注射して抗原刺激
を行なった。この抗原刺激後、腹腔内への好酸球浸潤
は、約８時間経過した時点で最大に達し、約72時間経過
後まで持続するので、この期間内の抗原刺激後48時間経
過した時点で、当該抗原刺激したラットをエ−テル麻酔
下、頸動脈切断して脱血死させた。次いで、死後のラッ
ト腹腔に PBS(-) 20 ml を注入し、腹壁をよくマッサ−
ジした。しかる後、腹壁に小穴を穿ち、腹腔内液をプラ
ステックチュ−ブ（ファルコン製）に回収した。 PBS
(-) 8 mlを前記小穴から再度注入し、マッサ−ジした
後、別のプラステックチュ−ブ（ファルコン製）に回収
した。更に、同じ操作を繰り返し、残余する腹腔内細胞
を回収した。得られた腹腔内細胞を含むPBS(-) 液は、3
50 × g、４℃で３分間遠心し、上清と腹腔細胞を分離
し、これを回収した。これらの操作と並行して、脛骨及
び大腿骨を採取し、採取した骨の両端を切断し、一端か
らそれぞれ PBS 2 ml を注入し、骨髄細胞を別途回収し
た。

【００４８】採取された腹腔細胞を、一旦 RPMI-1640培
地 2 ml に懸濁させ、この細胞浮遊液を、比重 1.080の
Percoll-PBS溶液に重層し、1,000 × g、室温で30分間
遠心することにより、純化を進め、好酸球をペレットに
回収した。純化処理を施した後、ペレットに回収される
血球細胞の組成は、好酸球が主であり、おおよそ好酸球
92 ％、好中球 5.0％、単核球 3.1％から構成されてい
た。

【００４９】(1.2) ラット好酸球由来のECP の分離・精
製 純化された好酸球を破砕し、該細胞中の顆粒を４℃で遠
心により採取した。

【００５０】分離される顆粒からの ECPの分離・精製
は、既に報告されているヒト好酸球由来 ECPの分離・精
製法（B.L. Robert et al., J. Exp. Med.168, 1493-14
98 (1988)を参照）に準じて行なった。先ず、顆粒に含
まれる蛋白質を0.1 N 塩酸に溶解した後、この蛋白質溶
液を Sephadex G-50カラムに載せ、 150 mM NaCl, 20 m
M 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pH 4.3）にて溶出さ
せ、かかるゲル濾過により粗精製品を含む画分を分取し
た。得られる粗精製品を含む画分から、逆相クロマトグ
ラフィ−により更なる精製を行なった。すなわち、粗精
製の蛋白質を0.1 ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液
に溶解し、Vydac C-4 カラムにかけ、溶出は、溶媒Ａ
（0.1 ％ＴＦＡ水溶液）及び溶媒Ｂ（アセトニトリル：
0.1 ％ＴＦＡ水溶液＝９：１）を用いて、linear gradi
ent 法にて分離・精製を行なった。蛋白質の検出は、28
0nm における吸収により行った。

【００５１】なお、上記の各精製過程において、ラット
好酸球由来のECPの純度検定は、 SDS-PAGE 法におい
て、分子量(Mr)＝約19 kDaに見い出される該ECP のバン
ド密度を測定して、蛋白質量を見積ることにより行なっ
た。同時に、isoelectric focusing (IEF)法により等電
点を測定し、 pI 値は約11以上であることを確認した。
また、文献に報告されている方法（J. Biol. Chem. 27
0, 7876-7881 (1995)およびそれに記載の参考文献を参
照）でその生理的な活性を評価した。その結果、得られ
たタンパク質は、ラット好酸球由来のECPの成熟蛋白質
であることを確認した。なお、該成熟蛋白質のＮ末アミ
ノ酸はメチオニンでないことも確認した。

【００５２】(1.3) ラット好酸球由来 ECPの前駆体ペプ
チドをコ−ドする cDNA の採 取とその塩基配列の解析 好酸球は、骨髄中において多能性造血幹細胞から分化誘
導される前駆細胞（colony forming unit; CFU-Eo）を
経て、それぞれ特有の顆粒を持つ好酸球に成熟する。こ
の分化・成熟の過程において、顆粒に局在する蛋白質の
翻訳がなされるので、抗原刺激後、好酸球への分化増殖
が進行する間に、骨髄細胞においては、ラット好酸球由
来 ECPの前駆体ペプチドへの翻訳に利用される mRNA が
多量に転写される。この点を考慮に入れ、上記 (1.1)の
工程において、好酸球を主に含む腹腔細胞を採取するこ
とと期を同じくして、回収した骨髄細胞から mRNA を採
取した。

【００５３】骨髄細胞を、 5 mM クエン酸ナトリウム、
0.1 M β-メルカプトエタノ−ル、及び 0.5％ sodium
sarkosylを添加した 6 M guanidine-thiocyanate水溶液
（pH7.0）中で破砕し、懸濁液とした。この懸濁液を、
0.1 M EDTA を含むトリフルオロ酢酸セシウム水溶液（p
H 7.0、比重 1.51 ）上に重層し、85,000× g、 25℃で
約24時間遠心した。全 RNAは遠心チュ−ブの底に分離さ
れ、それを分取した。全 RNAからpoly(A)＋RNA を分離
し、poly(A)＋RNA 標品を得た。この poly(A)＋RNA 標
品 1μg を鋳型として、市販の cDNA 合成キットを用
い、逆転写して cDNA を合成した。また、 cDNA クロ−
ニングキット（λgt10ファ−ジベクタ−）を用いて、cD
NAライブラリ−を作製した。ラット好酸球由来 ECPの前
駆体ペプチドに対する cDNA 中、初めに成熟蛋白質ECP
をコ−ドする領域のＣ末部分の塩基配列を以下の方法で
解析した。

【００５４】先ず、既に報告されている、ヒト好酸球由
来ECP-1及びECP-2前駆体ペプチドに対する cDNA の塩基
配列と、これに対応するアミノ酸配列とを対比して、両
者の塩基配列と対応するアミノ酸配列中、相同な部分が
存在することを確認した。この部分は、哺乳動物の種間
においても保存されていると仮定し、相同な部分塩基配
列を基に、図１並びに配列番号４及び５に示す混合型プ
ライマ−を合成した。前記のプライマ−の塩基配列全て
は、目的とするラット好酸球由来 ECPの前駆体ペプチド
に対する cDNA の塩基配列と完全に一致する部分又は相
補的な部分が必ずしも存在するとは限らないが、これら
と類似性の高い部分塩基配列が存在するならば、ＰＣＲ
法により増幅される産物が得られる。具体的には、図１
にも示す下記のセンス型プライマー及びアンチセンス型
プライマーをそれぞれ合成し、これを用いて、 cDNAの
部分断片を増幅した。

【００５５】 アミノ酸部分配列を基にした cDNA の部分塩基配列ＰＣＲ増幅用プライマー mix primer sense 5- TGYAARGGNATHAAYACNTT -3（配列番号４） mix primer anti-sense 5- GGRTCNACNCCNACNGTRTA -3（配列番号５） 但し、 Y ＝ C or T R ＝ A or G H ＝ A or C or T N ＝ A or G or C or T を意味する。

【００５６】上述のpoly(A)＋RNA 標品を鋳型として調
製した cDNA に対して、前記のプライマ−、およびpoly
(A)領域と結合する汎用のアダプタ−プライマ−（Adapt
or primer）にオリゴ dT 配列を付加した Oligo dT-ア
ダプタ−プライマ−（Oligo dTアダプタ−プライマ−）
を用いて、ＰＣＲ法により増幅される cDNA 断片の有無
を検証した。

【００５７】ＰＣＲ反応では、 cDNA 0.2 μg、50 mM K
Cl、1.5 mM MgCl₂、dNTP(dATP, dGTP, dCTP 及びdTTP)
を各250 μM ずつ、センス型プライマ−及びアンチセン
ス型プライマ−各 0.2μM ずつ、並びに2.5 U の Taq D
NAポリメラ−ゼを10 mM Tris-HCl緩衝液 100μl （pH
8.3）に添加したものを反応液として用いた。ＰＣＲの
温度サイクルは、94℃１分間（変性）、55℃１分間（ア
ニーリング）、72℃３分間（伸長）を１サイクルとし
て、計40サイクル繰り返した。反応終了後、反応液10
μl を採り、PCR 産物をアガロ−スゲル電気泳動により
分析し、増幅されたDNA断片の有無、その分子量を評価
した。

【００５８】この増幅された DNA断片を、pGEM-Tプラス
ミドベクタ−（pGEM-T vector systems、Promega, Madi
son, WI, USA）にサブクロ−ニングした。この DNA断片
は、その両端の塩基配列が用いたプライマ−と一致した
（相補的である）ので、この既知の塩基配列を基にシ−
クエンスプライマ−を調製し、常法に従い、 DNA断片の
塩基配列を決定した。この解明された DNA断片の塩基配
列を基に、センス型塩基配列を持つプライマ−、及びア
ンチセンス型塩基配列を持つプライマ−を新たに合成し
た。加えて、anchored PCR法において汎用される、アダ
プタ−プライマ−（Adaptor primer）及びオリゴ dT 配
列を付加した Oligo dT-アダプタ−プライマ−（Oligo
dTアダプタ−プライマ−）を利用して、cDNAの上流の未
翻訳領域から下流の未翻訳領域までの全領域の塩基配列
を解明した。

【００５９】即ち、前記のDNA 断片の 3' 側下流に存在
する poly(A)＋端までの間の塩基配列を解析するため、
3'-RACE法を適用した。先ず、 poly(A)＋鎖と相補的な
Oligo dT-アダプタ−プライマ−を逆転写プライマ−と
して用いて、 poly(A)＋RNA標品を鋳型として、新たに
cDNA を合成した。次いで、アダプタープライマーをア
ンチセンス型プライマーとし、直前の解析で新たに塩基
配列が解明されたいわゆる“gene specific primer”を
センス型プライマーとして用いて、該 cDNA を鋳型とし
ＰＣＲ法で 3' 側の DNA断片を増幅した。

【００６０】得られた増幅産物を一旦pGEM-Tプラスミド
ベクタ−（pGEM-T vector systems、Promega, Madison,
WI, USA）にサブクロ−ニングした後、この既知の塩基
配列を基にシ−クエンスプライマ−を調製し、常法に従
い、 DNA断片の塩基配列を決定した。本実施例では、こ
の3'-RACE 法に用いたプライマ−は、下記のものであ
る。

【００６１】 3'-RACE 法に用いたプライマ− 3' sense primer 5- CCCTGTGGAAACAGGACAT -3（配列番号６） oligo(dT) adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3（配 列番号７） adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGAC -3（配列番号８）

【００６２】一方、解析済みの DNA断片の 5' 側上流に
存在する部分の塩基配列を解析するため、 5'-RACE法を
適用した。先ず、解明された塩基配列から作製したアン
チセンス型プライマ−を逆転写プライマ−として用い
て、 poly(A)＋RNA 標品を鋳型として、新たに cDNA を
合成した。得られる cDNA の 3' 末端に、dATPと市販の
terminal deoxynucleotidyl transferase（宝酒造
(株)）を用いて、付加重合による dA 鎖を伸長した。次
いで、伸長された dA 鎖に相補的である Oligo dT-アダ
プタ−プライマ−を加えて、二重鎖 DNAに変換した。こ
の二重鎖 DNAから、元の poly(A)＋RNA の 5'-端に相当
し、5'-末端に伸長されたポリ T鎖とアダプタ−プライ
マ−の塩基配列とが付加された DNA断片を得た。得られ
たＤＮＡ断片を一旦pGEM-Tプラスミドベクタ−（pGEM-T
vector systems、Promega, Madison,WI, USA）にサブ
クロ−ニングした後、この既知プライマ−の塩基配列を
基にシ−クエンスプライマ−を調製し、常法に従い、DN
A 断片の塩基配列を決定した。本実施例において、この
５'-RACE法に用いたプライマ−は、下記のものである。

【００６３】 5'-RACE 法に用いたプライマ− 5' anti-sense primer 1 5- CTTGTAGTTTGGTATCTACA -3（配列番号９） 5' anti-sense primer 1 5- CGGAGTTGTGAGGTTACAGA -3（配列番号10） oligo(dT) adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3（配 列番号７） adaptor primer 5-GTTTTCCCAGTCACGAC -3（配列番号８）

【００６４】上記方法により複数種の DNA断片として得
られるものを、解明された部分塩基配列を重ね合わせて
一連の塩基配列とすることにより、ラット好酸球由来 E
CPの前駆体ペプチドに対する cDNA を得た。該ｃＤＮＡ
は、配列番号３及び図２に示すものであることが判明し
た。なお、5'-端には、63塩基の上流非翻訳域が含ま
れ、3'-端には、終端コドン(TAG)以降に187 塩基の下流
非翻訳域が含まれており、その間に155 アミノ酸をコ−
ドする翻訳域（オープンリーディングフレーム）が存在
していた。対応するアミノ酸配列を、既に報告されてい
るヒト好酸球由来のECP-1又はECP-2の成熟型蛋白質のア
ミノ酸配列、更にはその前駆体ペプチドのアミノ酸配列
と対比させ、相互に相同性を有するように配列すること
により、配列番号３及び図２に示す塩基配列の結果が得
られた。即ち、顆粒体内への移行に用いられるシグナル
ペプチド配列；Met(1)−Met(21)の間の疎水性アミノ酸
を主とする部分配列と、そのＣ末に存在している塩基性
アミノ酸（アルギニン）に富む成熟型蛋白質の領域が、
それぞれ判別された。上記の結果より、ラット好酸球由
来のECP蛋白質前駆体は、配列番号１で表されるアミノ
酸配列を含むことが判明した。

【００６５】

【発明の効果】本発明により、ラット好酸球由来のECP
及び該ECP をコードするＤＮＡが提供される。本発明の
ラット好酸球由来のECP、或いはその前駆体ペプチドを
コ−ドするＤＮＡは、これらの組み換え蛋白質の生産に
利用することができる。得られる組み換え成熟蛋白質
は、天然の成熟蛋白質と同様に優れた寄生虫、細菌に対
する細胞傷害作用、生育阻害作用を有するものであるの
で、治療用途に利用することができる。

【００６６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１５５ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Gly Leu Lys Leu Leu Glu Ser Arg Leu Cys Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly Leu Val Leu Met Leu Ala Ser Cys Gln Pro Pro Thr Pro 20 25 30 Ser Gln Trp Phe Glu Ile Gln His Ile Tyr Asn Arg Ala Tyr Pro 35 40 45 Arg Cys Asn Asp Ala Met Arg His Arg Asn Arg Phe Thr Cys His 50 55 60 Cys Lys Asp Ile Asn Thr Phe Leu His Thr Ser Phe Ala Ser Val 65 70 75 Val Gly Val Cys Gly Asn Arg Asn Ile Pro Cys Gly Asn Arg Thr 80 85 90 Tyr Arg Asn Cys His Asn Ser Arg Val Arg Val Ser Ile Thr Phe 95 100 105 Cys Asn Leu Thr Thr Pro Ala Arg Ile Tyr Thr Gln Cys Arg Tyr 110 115 120 Gln Thr Thr Arg Ser Arg Lys Phe Tyr Thr Val Gly Cys Asp Pro 125 130 135 Arg Thr Pro Arg Asp Ser Pro Met Tyr Pro Val Val Pro Val His 140 145 150 Leu Asp Arg Ile Phe 155

【００６７】配列番号：２ 配列の長さ：４６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATG GGT CTG AAG CTG CTC GAG TCC AGA CTT TGT CTC CTT CTG TCG 45 Met Gly Leu Lys Leu Leu Glu Ser Arg Leu Cys Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 CTG GGA CTT GTC TTG ATG CTT GCC TCA TGC CAG CCA CCA ACC CCT 90 Leu Gly Leu Val Leu Met Leu Ala Ser Cys Gln Pro Pro Thr Pro 20 25 30 TCC CAG TGG TTT GGA ATC CAG CAC ATC TAT AAT AGG GCT TAT CCC 135 Ser Gln Trp Phe Glu Ile Gln His Ile Tyr Asn Arg Ala Tyr Pro 35 40 45 CGA TGT AAT GAT GCA ATG CGA CAC AGA AAC AGA TTC ACA GGA CAT 180 Arg Cys Asn Asp Ala Met Arg His Arg Asn Arg Phe Thr Cys His 50 55 60 TGT AAG GAC ATA AAT ACT TTT CTT CAT ACA AGT TTT GCT AGT GTT 225 Cys Lys Asp Ile Asn Thr Phe Leu His Thr Ser Phe Ala Ser Val 65 70 75 GTT GGT GTG TGT GGC AAT AGA AAC ATC CCC TGT GGA AAC AGG ACA 270 Val Gly Val Cys Gly Asn Arg Asn Ile Pro Cys Gly Asn Arg Thr 80 85 90 TAT AGA AAT TGT CAT AAC AGT CGA TAT CGG GTA TCT ATA ACT TTC 315 Tyr Arg Asn Cys His Asn Ser Arg Val Arg Val Ser Ile Thr Phe 95 100 105 TGT AAC CTC ACA ACT CCG GCA AGG ATT TAT ACC CAA TGT AGA TAC 360 Cys Asn Leu Thr Thr Pro Ala Arg Ile Tyr Thr Gln Cys Arg Tyr 110 115 120 CAA ACT ACA AGA TCC AGG AAG TTC TAC ACA GTT GGC TGT GAC CCG 405 Gln Thr Thr Arg Ser Arg Lys Phe Tyr Thr Val Gly Cys Asp Pro 125 130 135 AGG ACT CCA CGG GAC AGT CCC ATG TAT CCA GTG GTT CCG GTT CAC 450 Arg Thr Pro Arg Asp Ser Pro Met Tyr Pro Val Val Pro Val His 140 145 150 TTG GAT AGG ATA TTT TAG 468 Leu Asp Arg Ile Phe * 155

【００６８】配列番号：３ 配列の長さ：７１９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ACCTCTGATT 10 ATCCAGGACAG CCAGCACTCA GTTCCACAGG AGCCACAACG CACACTGGGA AAC 63 ATG GGT CTG AAG CTG CTC GAG TCC AGA CTT TGT CTC CTT CTG TCG 108 Met Gly Leu Lys Leu Leu Glu Ser Arg Leu Cys Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 CTG GGA CTT GTC TTG ATG CTT GCC TCA TGC CAG CCA CCA ACC CCT 153 Leu Gly Leu Val Leu Met Leu Ala Ser Cys Gln Pro Pro Thr Pro 20 25 30 TCC CAG TGG TTT GGA ATC CAG CAC ATC TAT AAT AGG GCT TAT CCC 198 Ser Gln Trp Phe Glu Ile Gln His Ile Tyr Asn Arg Ala Tyr Pro 35 40 45 CGA TGT AAT GAT GCA ATG CGA CAC AGA AAC AGA TTC ACA GGA CAT 243 Arg Cys Asn Asp Ala Met Arg His Arg Asn Arg Phe Thr Cys His 50 55 60 TGT AAG GAC ATA AAT ACT TTT CTT CAT ACA AGT TTT GCT AGT GTT 288 Cys Lys Asp Ile Asn Thr Phe Leu His Thr Ser Phe Ala Ser Val 65 70 75 GTT GGT GTG TGT GGC AAT AGA AAC ATC CCC TGT GGA AAC AGG ACA 333 Val Gly Val Cys Gly Asn Arg Asn Ile Pro Cys Gly Asn Arg Thr 80 85 90 TAT AGA AAT TGT CAT AAC AGT CGA TAT CGG GTA TCT ATA ACT TTC 378 Tyr Arg Asn Cys His Asn Ser Arg Val Arg Val Ser Ile Thr Phe 95 100 105 TGT AAC CTC ACA ACT CCG GCA AGG ATT TAT ACC CAA TGT AGA TAC 423 Cys Asn Leu Thr Thr Pro Ala Arg Ile Tyr Thr Gln Cys Arg Tyr 110 115 120 CAA ACT ACA AGA TCC AGG AAG TTC TAC ACA GTT GGC TGT GAC CCG 468 Gln Thr Thr Arg Ser Arg Lys Phe Tyr Thr Val Gly Cys Asp Pro 125 130 135 AGG ACT CCA CGG GAC AGT CCC ATG TAT CCA GTG GTT CCG GTT CAC 513 Arg Thr Pro Arg Asp Ser Pro Met Tyr Pro Val Val Pro Val His 140 145 150 TTG GAT AGG ATA TTT TAG CTCCGGTGCC AGCACTTTGT ACCTGAGCTC 561 Leu Asp Arg Ile Phe * 155 ATCGGCTCCT GCCAAGATCA CAGTAGTGAA GATCCAGTTC CTCTGTCTGC 611 ACTGCATATC AGCTCCTGTC CTCATGAAAC CTGTCCCTGA CTCCTTTTAG 661 TATAGCTTAA CAGATTTTTG TAATCAATAA ACACCTTTGC ATATGCATCT 711 AAAAAAAA (poly A) 719

【００６９】配列番号：４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGYAARGGNA THAAYACNTT 20

【００７０】配列番号：５ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGRTCNACNC CNACNGTRTA 20

【００７１】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CCCTGTGGAA ACAGGACAT 19

【００７２】配列番号：７ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGACTTT TTTTTTTTTT TTTTT 35

【００７３】配列番号：８ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17

【００７４】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CTTGTAGTTT GGTATCTACA ２０

【００７５】配列番号：１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CGGAGTTGTG AGGTTACAGA 20

【００７６】配列番号：１１ 配列の長さ：１３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Leu Ala Ser Cys Gln Pro Pro Thr Pro Ser Gln Trp Phe Glu Ile 1 5 10 15 Gln His Ile Tyr Asn Arg Ala Tyr Pro Arg Cys Asn Asp Ala Met 20 25 30 Arg His Arg Asn Arg Phe Thr Cys His Cys Lys Asp Ile Asn Thr 35 40 45 Phe Leu His Thr Ser Phe Ala Ser Val Val Gly Val Cys Gly Asn 50 55 60 Arg Asn Ile Pro Cys Gly Asn Arg Thr Tyr Arg Asn Cys His Asn 65 70 75 Ser Arg Val Arg Val Ser Ile Thr Phe Cys Asn Leu Thr Thr Pro 80 85 90 Ala Arg Ile Tyr Thr Gln Cys Arg Tyr Gln Thr Thr Arg Ser Arg 95 100 105 Lys Phe Tyr Thr Val Gly Cys Asp Pro Arg Thr Pro Arg Asp Ser 110 115 120 Pro Met Tyr Pro Val Val Pro Val His Leu Asp Arg Ile Phe 125 130

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＲ法によるラット好酸球由来の ECPの cDN
A の直接クロ−ニングに利用する各種プライマ−の設計
図である。

【図２】ラット好酸球由来の ECPの cDNA の塩基配列及
びそのオープンリーディングフレームのアミノ酸配列を
示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１１で表されるアミノ酸配列を
   実質的に含み、細胞傷害活性をもたらすラット由来エオ
   シノフィル・カチオニック・プロテイン。
2. 【請求項２】 配列番号１１で表されるアミノ酸配列を
   実質的に含むラット由来エオシノフィル・カチオニック
   ・プロテインをコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列番号１で表されるアミノ酸配列を実
   質的に含むラット由来エオシノフィル・カチオニック・
   プロテイン前駆体をコードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 エオシノフィル・カチオニック・プロテ
   イン前駆体をコードするＤＮＡが配列番号２で表される
   ものである請求項３記載のＤＮＡ。
5. 【請求項５】 配列番号３で表される塩基配列を実質的
   に含む、ラット由来エオシノフィル・カチオニック・プ
   ロテイン前駆体をコードするＤＮＡ。