JPH0387181A - 変異ヒトプロウロキナーゼ、その製法、ｄｎａ配列、プラスミド、宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトプロウロキナーゼ（以下ヒトＰＵＫ）を
分子構造的に修飾してなる変異ヒ）ＰＵＫ、その製造方
法、該変異ヒ）ＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮ
Ａ配列の組み込まれたプラスミド、および該プラスミド
によって形質転換された形質転換体に関する。さらに詳
しくは、遺伝子レヘルにおいて特定遺伝子の一部領域を
欠失さセ、該遺伝子を組め換えＤＮＡ技術を応用して発
現させることからなる変異ヒトＰＵＫを提（Ｊｊする一
連の技術に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕線維素溶解
に係わるプラスミノーゲン活性化因子（以下ＰＡ）とし
ては、血管内皮細胞の産生ずる組織性のｔ−ＰＡ、ウロ
キナーゼ（以下ＵＫ）の２種類が知られており、従来、
線維素溶解酵素としてはＵＫが著名である。このものは
、従来人尿および人腎細胞等のｉ８養液等から＋＋’／
製されていたが、近年ＤＮＡ組め換え技術による生産も
可能となった（特開昭６０−１８０５９１号明細書）。

ＵＫは大量に用いると、凝固・線溶諸因子の分解並びに
活性化を惹起し、出血傾向を誘起する欠点を有している
。他方、本発明者らは、人腎細胞によって産生されるヒ
Ｉ−Ｕ　Ｋの不活性型前駆物質（ＰＵＫ）（特開昭６０
−６２９８１号明細書、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０．１２３７７（１９
８５）　）が、Ｕ　Ｋと異なり出血傾向を惹起すること
なく血栓を溶解することを既に見出している（Ｃｅｌｌ
　５ｔｒｕｃ、　Ｆｕｎｃ、、１０１５Ｈ１９８５）　
　）。

ヒトＰＵＫは、３つの機能ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、
すなわちエピダーマルグロースファクター（ｅｐｉｄｅ
ｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ、以下ＥＧＦと
略称する。）１゛メイン、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ
）　　）メイン、酵素活性ドメインから構成されている
（Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’　ｓＺ、　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３６３．１１５５　（１９８２）
　〕。

また、以下に示す３つの理由から肝細胞上にＰＵＫ特異
レセプターが存在し、血中半減期を左右すると仮定され
ている。即ち、第１にラット静脈に投与されたＰＵＫが
、主として肝臓で代謝され（Ｓｕｙａｍａ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、”Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　：　ｃｕｒｒｅｎ
ｔ　ｐｒ。

５ｐｅｃｔｓ”、　Ｊｏｈｎ　Ｌｉｂｂｅｙ　＆　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ、、　Ｌｏｎｄｏｎｐｐ３５〜４３
（１９８Ｂ）　）　、第２に構造的に似ているＬＰＡが
ＥＧＦ領域を除去することにより血中半減期の増大が見
られ（Ｂｏｗｎｅ、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃ
ｈｅｍ。

垣、　１５９９　（１９８８）　）　、第３にヒ１−単
球株化細胞Ｕ９３７上にはＵＫ特異的なレセプターが存
在し、ＵＫとレセプターの結合には、ＵＫのＥＧＦ領域
が関与している（Ａｐｐｅｌｌａ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

坐２．４４３７（１９８７）　）　　。

ところで、ＥＧＦ全領域除去ヒトＰＵＫは、ラットでの
血中半減期試験において除去前のＰＵＫよりも約３倍長
い半減期を示すことを本発明者らは見出している（特開
昭６３−１４６７８９号明細書）。

しかし、天然のタンパク質に大きな欠失を与えることは
もとの構造に大きな変化を与え、新たな抗原性の付与、
諸性質の変化をきたす恐れがある。

従って、本発明の目的はＥＧＦ領域における欠失をより
小さくすることにより、ＥＧＦ全領域除去ヒト変異ＰＵ
Ｋの血中半減期の増加を維持しながら、他の性質におい
てはヒトＰＵＫと実質的に変わりない変異ヒｌ−Ｐ　Ｕ
　Ｋ、即ち血栓溶解能が高く、しかもヒｈ　Ｐ　Ｕ　Ｋ
やＥＧＦ全領域除去変異ヒトＰＵＫと同様出血傾向の極
めて低い変異ヒ１−ＰＵＫ、その製造方法、当該変異ヒ
Ｉ−Ｐ　Ｕ　ＫをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列
の組み込まれたプラスごド、形質転換体を提供すること
である。

〔課題を解決するための手段〕

かかる目的を達成するために本発明者らは種々研究を重
ねて来たところ、ヒトＰＵＫのＥＧＦドメインの一部領
域が欠失している３、■み換え変異ヒトＰＵＫは血中半
減期が長く、ＥＧＦ全領域除去変異ヒｌ−Ｐ　Ｕ　Ｋと
同様の血中半減期をもち、かつフィブリンへの親和性が
高く、しかもヒＩ−Ｐ　Ｕ　ＫやＥＧＦ全領域除去変異
ＰＵＫと同様出血傾向の極めて低い等の特性を有するこ
とを見出した。

即ち、本発明はヒトプロプラスミノーゲン活性化因子の
ＥＧＦドメイン中、少なくとも第１ループの一部領域ま
たは全領域を欠失してなる、あるいは第３ループの１部
領域または全領域を欠失してなる変異ヒトＰＵＫ、当該
変異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、当該ＤＮＡ配
列が組み込まれたプラス旦ド、当該プラスミドによって
形質転換された宿主および前記変異ヒ）ＰＵＫの製造方
法に関する。

ところで、ヒトＰＵＫの４１１ア主ノ酸残基のうち、成
熟タンパクのＮ末のセリンより４９番目のスレオニンま
でがＥＧＦドメインと報告されている（Ｒ４ｃｃｉｏ、
ハ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　　Ｒ
ｅｓ。

１３、２７５９−２７７１　（１９８５））。そこで本
発明は、このＥＧＦドメインの一部領域が欠失した変異
ヒＩ−ＰＵＫを生産する一連の技術を提供するものであ
る。

ＰＵＫのＥ　Ｇ　Ｆ　ｎＴＪ域（Ａｓ　ｎ−１０−Ｃｙ
　５４２）は３つのループからなる構造を持ち、その第
１ループはＡｓｎ−１０〜Ｃｙｓ−１９であり、第２ル
ープはＶａ　ｌ−２０〜Ｃｙｓ−３１であり、第３ルー
プはＣｙｓ−３３〜Ｃｙｓ−４２である。（図１） 本発明の変異ＰＵＫにおいては、ＥＧＦドメイン中の少
なくとも第１ループの一部領域または全領域あるいは第
３ループの１部領域または全領域が欠失されていればよ
く、第２ループはその全領域または一部領域が残存また
は欠失されていてもよい。

ここで、Ｄ　Ｎ　Ａ、組み換え技術を用いることにより
ＥＧＦドメインのうちどの一部をも除去することが可能
である。

ＥＧＦとＥＧＦレセプターの系、及びＵＫとＵＫレセプ
ターを用いた系で、ＥＧＦ領域とレセプターとの結合に
は、ＥＧＦの第１、第２ループが主として働いており、
第２ループが結合の特異性に、第１ループが結合の安定
化に寄与しているとの知見がある。以上のことから、Ｅ
ＧＦ領域の第１・第２ループ（Ａｓｎ−１０〜Ｃｙｓ−
３１）を除去するか、あるいは第３ループを除去するこ
とにより第１、第２ループに歪みを生しさせたＰＵＫが
特に好ましい。

欠失処理には、プロティンエンジニアリングとして知ら
れる方法が広く利用できるが、たとえば５ｉｔｅ−ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　（部位指定削除）法
（Ｎｕｃｌ、　　八ｃｉｄｓ　　Ｒｅｓ、＋　　１１、
１６４５　　（１９８３）　　］　　、　５ｉｔｅｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　（部位特異的
変異）法、制限酵素処理と合成遺伝子の利用による方法
等がある。具体的にはヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配
列を用いて欠失処理を行う。このＤＮＡ配列は図１で示
される。また、このＤＮＡ配列は特開昭６３１８０５９
１号明細書、特開昭６３−１４６７８９号明細書等で開
示された方法により調製することができる。

このヒＩ−Ｐ　Ｕ　ＫをコードするＤＮＡ配列を担持す
るプラスミドとしてｐ　５Ｖ−Ｇ、　　−ｐｒｅ　ＵＫ
　（図４、特開昭６０−１８０５９１号明細書）が例示
される。

欠失処理された変異ＰＵＫは、発現ベクター系に挿入し
て、発現用宿主・ベクター系を構築する。

宿主・ベクター系は一般に宿主細胞とコンバーチプルな
種から由来するレプリコンと制御配列を有するプラスミ
ドベクターと、この宿主を組め合わせて使用する。ベク
ターは一般に複製部位を有しており、また形質転換細胞
中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有して
いる。例えば大腸菌は通常ｐ［ｌＩ？３２２を用いて形
質転換されるが、このプラスごドは大腸菌株由来である
［Ｂｏｌｉｖａｒ　ｅｔａｌ、　Ｇｅｎｅ、　　２．９
５（１９７７）］　、　ｐＢＲ３２２はアンピシリン耐
性及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を持っているので
形質転換した細胞を検出する簡単な方法を与える。ｐＢ
Ｉ１３２２プラスミドや、他の微生物プラスミドは微生
物体が利用できて、それが支配する蛋白質を発現させる
ことが可能なプロモータを自するか、ちるいはプＩ：Ｊ
モーター配列をＪｉｌｔ人しである。組み換えＤＮＡの
構成に通常使われるプロモーターとしてはβ−ラクタマ
ーゼ（ペニシリナーゼ）やラクトースプロモーター系［
Ｃｈａｎｇ　ｅｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、　２１ｆｉ、　
６１５　　（１９７Ｂ）　；　Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔａ
ｌ。

５ｃｉｅｎｃｅ、　　１９８．１０５６　　（１９７７
）　；　Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２８１．５４４　（１９７９）　］あ
るいはトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系１：Ｇ
ｏｅｄｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　８．４０５７　
　（１９７９）　：　ヨーロッパ特許出願公開第００３
６７７６号明細書〕がある。これらは最も一般的に使わ
れているが、他の微生物プロモーターも発見され、使用
されている。それらの塩基配列の詳細も発表されており
、それらをプラス旦ドベクターに機能的に導入すること
が可能である（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ　ｅｔ　ａｌ、　
Ｃｅ１１＋　２０．２６９　　（１９８０）　］。そし
て宿主としては、大腸菌Ｈ８１０１株、Ｃ６００株、Ｗ
３１１０株などが用いられる。酵母ベクターにおける適
当なプロモーターとして３−ホスホグリセレートキナー
ゼ（ＰＧＫ）のプロモーター（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、　Ｊ、旧ｏ１．　Ｃｈｅｍ、。

２５５、２０７３　　（１９６Ｂ）　］や他の解糖系　
酵素〔■ｅｓｓｅｔ　ａｌ、　Ｊ、＾ｄｖ、、　Ｅｎｚ
ｙｍｅ−Ｒｅｇ、、　７．　１４９　（１９６Ｂ）；ｔ
ｌｏｌｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、旧ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
、　１７．４９００　（１９７８）　〕であるエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
（ＧＡＰ−ＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカル
ボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−
６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセルリン酸ム
ターゼ、ピルビン酸キナーゼ、）・リオースリン酸イン
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナ
ーゼの様な酵素のプロモーターである。これらの中でも
、小型化Ｇ　Ａ　Ｐ　−Ｄ　Ｈプロモーター（特開昭６
２−１７５１８０号明細書）、ＰＧＫプロモーター（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１０（８）、　
２６２５（１９８２））は有用である。適当な発現ベク
ターを作製する場合、これらの遺伝子に存在する転写終
結配列も又発現したい遺伝子の３“側に挿入し、ｍＲＮ
ＡのポリＡ化と転写終結が生しる様にする。増殖条件に
より、転写の制御ができる様な利点を有するプロモータ
ーとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトク
ロムＣ１酸性ボスフアターゼ、あるいは窒素代謝に関連
した分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３−リン酸
デヒドロゲナーゼ、あるいはマルトースやガラクトース
を使用するのに関連した酵素のプロモーターも使える。

酵母のコンバーチプルプロモーター、複製起点及び転写
終結配列を含むすべてのプラスミドベクターが使える。

そして宿主としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＲＦ１８株（特開昭５１４８０８
２号明細書）、ＡＨ２２株（Ａ　Ｔ　ＣＣＮｏ、　３８
６２６）などを用いる。

さらに枯草菌の分泌発現ベクターとしては、プラスミド
ｐＵＢ１１０の複製起点をもち、かつ、α−アミラーゼ
遺伝子のプロモーター、シグナルペプチド、ターξ−ネ
ーターを有するプラス果ドが利用でき、この宿主として
はＢ、　ｎａｔｔｏ　、Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓなどが使用できる。近年を椎動物の細
胞を培養して（組織培養）増やすことがルーチン化して
いる。［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＫｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒ
ｓｏｎ、　ｅｄｉｔｏｒｓ　（１９７３）　］宿主細胞
株として有用な例としてＶ［１ＲＯ１ＨｅＬａ細胞、Ｃ
ｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　（ＣＩＩ
Ｏ）　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ、　Ｗ１３８ＢＨＫ、ＣＯ３
−７，ＭＤＣＫ　ｃａｌｌ　Ｌｉｎｅ、　Ｃ１２７，１
（ＫＧ、　ｈｕｍａｎ２ ｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅなどがある。これら
の細胞の発現ベクターは通常、複製起点、発現する予定
の遺伝子上流に位置するプロモーター、リポソーム結合
部位、ＲＮＡスプライス部位、ボＩＪ　Ａ付加部位、転
写終結配列を有する。

哺乳動物細胞を使用する場合、発現ベクター上の制御機
能はウィルス由来であることが多い。例えば、−船釣に
使われるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス、
２、あるいは最も多用されているシミアンウィルス４０
　（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期及
び後期プロモーターは特に有用である。というのはこれ
らはＳＶ４０の複製起点を含む断片として容易にウィル
スから得られるからである。［Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ
、　Ｎａｔｕｒｅ２７３　１１３　（１９７Ｂ）　］ウ
ィルスの１ｌｉｎｄｌ１１部位から複製起点中のｈｌ　
１部位までの約２５０ｂｐを含む断片も使用できる。更
に目的とする遺伝子に関連したプロモーターや制御配列
（エンハンサ−）も宿主とコンバーチプルならば使用で
きる。

動物細胞発現ベクターに用いるプロモーター・エンハン
サ−としては、ＳＶ４０初期遺伝子又は後期遺伝子のプ
ロモーター・エンハンサ−やアデノウィルスメジャーレ
ート・プロモーター領域、グロブリンエンハンサ−・プ
ロモーター領域、ＲＮＡウィルスのＬＴＲ，メタロチオ
ネインプロモーター領域、β−アクチンプロモーターな
どが使用できる。複製起点はＳＶ４０や他のウィルス（
ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）由来のものを
ベクターに組み込んでもよいし、宿主細胞染色体の複製
機構を用いてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組
み込まれるならば後者で十分である。また、これ以外の
高生産系として、ＤＨＦＲ遺伝子を利用した遺伝子の増
幅系を用いることが可能である。以上、具体的な例を挙
げて説明した本発明は、以上に例として述べた宿主細胞
・ベクター・発現系に限定して解釈されるべきではない
。

本発明においては、例えば好適な具体例として、ＳＶ４
０初期プロモーター領域の下流に変異ヒトＰＵＫをコー
ドする遺伝子を挿入して、動物細胞用発現ヘクターを横
築した。これらをＣＨＯＫ　ｌ細胞に導入して形質転換
させた。本実験系では、４０．８．８８．６　＋１／ｍ
ｌ／　３日の変異ヒトＰ　Ｕ　Ｋを産生ずるクローンを
得た。

変異ヒトＰＵＫの精製は、既知のヒ）ＰＵＫの精製法に
準しておこなうことができる（特開昭６０６２９８１号
公報）。本発明では、精製にばＣｈｅｌａｔｉｎｇ　５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ、　ａｎｔｉ−ＵＫ　ＩｇＧ４
ｏｒｍｙｌＣｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ、　ｂｅｎｚａｍｉ
ｄｉｎｅ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂのカラムクロマト
グラフィーを併用したが、特にＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂは粗精製に、ａｎｔｉ−１１Ｋ　
Ｉ（ＨＧ−ｆｏｒｍｙｌＣｅｌｌｕｌｏｆ　ｉｎｅは高
度精製に、さらにｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅＳｅｐｈａｒ
ｏｓｅ　６Ｂは滌人活性型ウロキナーゼ（ＵＫ）の除去
に各々有効である。

かくして得られた産生物を解析したところ、ＰＵＫ活性
においては変異型および非変異型で全く差はなく、変異
ヒ）ＰＵＫは、分子置駒４８，０００〜４９．０００の
一本鎖型のプロエンザイムであり、プラスミン処理によ
り完全に活性型に変換した。さらにこの変異ヒトＰＵＫ
の血中半減期を人腎細胞由来Ｐ　Ｕ　Ｋ　（Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０．１２３７７　（１９８
５）　）のそれと比較したところ、変異ヒトＰＵＫの血
中半減期のほうが有意に長かった。本発明の変異し）Ｐ
ＵＫのうち、第１．第２ループ除去型の好ましい例とし
てＣｙｓ−１１＝Ａｓｕ−３２を除去した第３ループ除
去型の好ましい例としてＣｙｓ−３３〜Ｃｙｓ−４２を
除去した変異ヒトＰＵＫ　（ｐＭＲ３０５由来）のアミ
ノ酸配列および塩基配列を表１および表２に示す。

［以下余白］ ５ ６ 〔実施例〕 実施例１ （ＥＧＦドメインの第１・第２ループ、または第３ルー
プを欠失させた変異ヒ）ＰＵＫの動物細胞での発現） ＥＧＦドメイン内の第１・第２ループ（Ｃｙｓ−１１〜
＾５ｎ−３２）、または第３ループ（Ｃｙｓ−３３〜Ｃ
ｙｓ−４２）を除去したヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋの発現ベクタ
ーを作製した。

ヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋ遺伝子からのＥＧＦドメインコーディ
ング領域の除去方法、およびそれらの動物細胞における
発現ベクターの構築方法の概略を図２と図３に示した。

これら発現ベクター作製の詳細を以下に述べる。

なお、本実施例において、台底ＤＮＡは変成ポリアクリ
ルアミドゲルでｔＩｌ？製した。制限酵素、Ｔ４　　Ｄ
ＮＡポリメレース、Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース、
バクテリア由来アルカリフオスファテース（ＢＡＰ）、
Ｍ１３シークエンスキット、ライゲーションキットなど
の酵素・キット類、大１１ｉ菌ＪＭ１０９コンビテンＩ
・セルは宝酒造製のものを用いた。また、リコンビナン
ト１．）　Ｎ　Ａテクニックは’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　
ＣＩｏｎｉｎｇ’　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌｌａｒ
ｂｏｒＮｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　
ｌ１ａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）］
に記載の方法に準した。

（イ）オリゴヌクレオチドの台底 自動ＤＮＡ合或合成３８１Ａ、アプライド　バイオシス
テム社）を用いて、−水制ＤＮＡ４個（ＳＤ７、ＳＤ８
、ＳＤ９およびＳＤ　１０）を作成した。各々の塩基配
列を以下に示す。

ＳＤ７　４０塩基 ５’−ＣＧＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＧＧ
ＡＧＧＣＣＡ（１；ＣＡＣＴＧＴＧＡＡＴ−３ ＳＤ８　４０塩基 ５’　−ＣＧＡＴＴＴＣＡＣＡ　　ＧＴＧＣＴＧＣＣＣ
Ｔ　　ＣＣＧＡＡＴＴＴＣＴ　　ＴＴＣ；ＧＧＣＡＧＴ
Ｔ−３″ ＳＤ９　７６塩基 ５”−ＣＧＡＡＣＴＣＴＧＡ　　ＣＴＣ，ＴＣＴＡＡ八
Ｔ　　へＧＡＧＧＴ八ＣＣＴ　へＧＴＧＴＧＴＣＣＡＡ
　　ＣＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＴＣＡＣＴ
ＧＧＴＧＣＡＡ　　ＣＧＡＡＡＴ−３ＳＤＩＯ７６塩基 ５’　　−ＣＣＡＴＴＴＣＧＴＴ　　ＧＣＡＣＣＡＧＴ
ＧＡ　　ＡＴＧＴＴＧＧＡＧＡ　　ＡＧＴＡＣ′ＦＴＧ
ＴＴ　　ＧＧＡＣＡＣＡＣＡＧ　　ＧＴＡＣＣＴＣＣＡ
Ｔ　　ＴＴＡＧＡＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴ’ｌ”−３ＳＤ
７とＳＤ８、ＳＤ９と５ＤＩＯは各々相補的な関係にあ
る。また各ＤＮＡ　（ＳＤ７〜１０）とＰＩＪＫの関係
を表３および表４に示す。

〔以下余白〕

１つ ０ 台底したＤＮＡをアンモニアでカラムから溶出し、−夜
加熱してさらに乾燥後、蒸留水に溶かした。この時点で
の収量は、ＳＤ７　；　１．７５ｍｇ、、ＳＤ８　；　
］、６１ｍｇ、　ＳＤ９　；　２．８１■、５ＤＩＯ；
２．６１　ｍｇであった。各々１１５量を変性ポリアク
リルア旦ドゲルで精製した。最終的な収量は、ＳＤ７　
；１０．２ｄｇ、、５Ｄ８ｉ９．０１μｇ、５Ｄ９ｉ７
．７ｄｇ、５ＤＩＯ；７．０μｇであった。ＳＤ７とＳ
Ｄ８、及びＳＤ９と５ＤＩＯをカイネーション、アニー
ルし、以下に述べるプラスくド構築に使用した。

（ロ）プラスごドの作製 構築手順の概略を図２と図３に示した。

ＭＲ３０４３０５の　ｔ ＥＧＦ様ドメイン内の第１および第２ループを除去した
変異ヒトＰＵＫ発現ヘクターをｐＭＲ３０４〔これは、
財団法人発酵研究所（あて名二大阪市淀用区十三本町２
丁目１７番８５号）へ、平底１年４月２８日に、菌株名
：　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ１１ＢＩＯＩ／
ｐＭＲ３０４、受入番号：　Ｉ　Ｆ　０１４８７２号と
して受託されている。〕、同しく第３ループを除去した
ものをｐＭＲ３０５（これは財団法人醗酵研究所へ、平
成１年ＩＯ月２５０に菌株名：　ｌ１ｓｃ１１ａｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ　　ｌｌＢ１０１／ｐＭＲ３０５、受
入番号：ＩＦＯ］４９６４号として受託されている。〕
、これらのヘクター構築の中間体をそれぞれｐＭＲ３０
２、ｐＭＲ３０３と命名した。台底ＤＮＡ、ＳＤ７とＳ
Ｄ８はｐＭＲ３０２の、ＳＤ９と５ＤＩＯはｐＭＲ３０
３の構築にそれぞれ用いた。

ｐＴＴＯ３をＣ１ａ　　Ｉで消化しく得られるＤＮＡ断
片の大きさ３．９ｋｂ）、ＢＡＰで脱リン酸化した後、
リニアーＤＮＡをＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　　ｐａｐｅｒ法で精
製した。これと、台底ＤＮＡをアニールして得られた２
本鎖ＤＮＡとをライゲーションし、ＪＭＩＯ９コンピテ
ントセルにトランスフオームした。

Ｂａｍ１ｌｌとＣ１ａ　　Ｉとで消化すると、ｐＭＲ３
０２の場合には約３００　ｂｐ、　ｐＭＲ３０３では約
３４０ｂｐのＤＮＡ断片が生しる。このことを指標にス
クリーニングして、それぞれ８個ずつのｐＭＲ３０２と
ｐＭＲ３０３とを得た。邦人ＤＮＡ部公理５合成ＤＮＡ
部分の塩基配列については、ダイデオキシ法による２本
領ＤＮＡシークエンスで確認した。シーフェンスを確認
したクローンからプラスミドを調製してｐＭＲ３０２を
５８２μｇ、ｐＭＲ３０３を５２２μｇ得た。

ｐＭＲ３０２、ｐＭＲ３０３を旧ｎｄｌｌｌで消化し、
Ｔ４　　ＤＮＡポリメレースで末端を平滑化してから、
Ｃ１ａ　　Ｉで消化した。Ｄ　Ｅ　Ａ　Ｅ　　ｐａｐｅ
ｒにより、ｐＭＲ３０２からは７８０ｂｐの、ｐＭＲ３
０３からは８２０ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。

ｐＵＨ７をＳａｌ　　ｌで消化し、Ｔ４　　ＤＮＡポリ
メレースで末端を平滑化した。さらに、Ｃ１ａ　　Ｉで
消化後、４．　ＯｋｂｐのＤＮＡ断片をＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ
　ｐａｐｅｒ法で精製した。このＤＮＡ断片とｐＭＲ３
０２または、ｐＭＲ３０３から切り出したＤＮＡ断片と
をライゲーションし、ＪＭ１０９コンピテントセルをト
ランスフオームした。目的のプラスミドは、Ｃ１ａ　　
Ｔで一箇所切断され、Ｃ１ａ　　ＩとＸｈｏ　　Ｉとの
両制限酵素で消化すると、９ＭＲ３０４の場合、４．９
ｋｂ、１．４ｋｂ及び約３６０ｂｐの、ｐＭＲ３０５で
は３ ４、９　ｋｂ、１．４　ｋｂ及び約３９０ｂｐのＤＮＡ
断片を生ずる。これらを指標にスクリーニングを行い、
目的のプラスくドを調製して、９ＭＲ３０４を３８４μ
ｇ、ｐＭＲ３０５を４０８μｇ得た。

−り工１」二Ｂ月枚築 Ｓ■４０由来のエンハンザ−・プロモーター領域と、Ｐ
ＵＫのシグナル配列並びにＰＵＫのＮ末端４アミノ酸を
コードする遺伝子を含んだプラスミドｐＴＴＯ３を構築
した。ＳＶ４０のエンハンサ−・プロモーターのｌｌａ
ｍｌｌ　Ｔ認識部位の５′領域を得るために、ｐＵＨ７
をｌ１ｉｎｄｌ［ｌとＢａｍＨ１で消化し、４２０ｂｐ
の断片をアガロースゲル電気泳動により単離・精製した
。一方、ｐ　Ｕ　Ｈ３も旧ｎｄｌｌｌとＢａｍＨＩで消
化し、直線状になった３、５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動により単離・精製し、これを先の４２
０ｂｐの断片とＤＮＡリガーゼで連結した。旧ｎｄｎｌ
とＢａｍ１ｌｌで消化して、３．５ｋｂ及び４２０ｂｐ
の断片を与えたプラスミドをｐＴＴ０３とした。１２個
の形質転換体について確認を行ったが、全てｐＴＴＯ３
の形質転換体であった。

４ なお、ｐＴＴＯ３の構築に必要なプラスミドＰＵＨシリ
ーズの調製方法を以下に述べる。

−り旦」５仁九二１遼ｌ距染 ＰＵＫ　　ｃＤＮＡのクローニングおよびその塩基配列
、またｐ　５Ｖ−Ｇ＋　−ｐ　ｒ　ｅ　ＵＫプラスミド
の作製方法等については先の特許出願（特開昭６Ｏ−１
８０５９Ｌ欧州特許出願公開第１５４２７２号）に準し
た。

ヒトＰＵＫ遺伝子からのＥＧＦドメインコーディング領
域の近傍にあるＮｃｏＴとＴａｑ　１部位を利用し、こ
れらの領域の除去を試みた。まずヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋ発現
ベクターｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫをｌ１ｉｎｄｎｌと
ＴａｑＩで消化し、Ｎ末から１０番目のＡｓｎまでのコ
ーディング領域を含む部分ヒトＰＵＫ遺伝子フラグメン
トを取り出し、これをプラスミドｐＢＲ３２２に挿入し
てプラスくドｐＵ１１１を作製した。次に、ヒトＰＵＫ
のＡｓｎ５４からＭｅｔ−６７の領域をコードし、かつ
両末端がＣ１ａｌ及びＥｃｏＲＴ部位である合成遺伝子
を作り、これをプラスミドｐＵＩ＋１に挿入することに
より、プラス短ドｐＵＨ２を作製した。また、この合或
遺伝子上には特異的な制限酵素であるＳｆ　Ｈ部位を設
しノた。

合成遺伝子上の５ｆｉｌ部位だＵを含むＢａｍ１ｌｌ−
ＥｃｏＲＩフラグメントをＢＬＵＥＳＣＲＴＢＥプラス
ミド（ＶＥＣＴＯＩＩＣＬＯＮＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭＳ
）に押入して、プラスごドｐ　Ｕ　Ｉ＋　３を作製した
。このｐ　Ｕ　Ｈ３の５ｆｉｌ−Ｃｌａｌ部位に、Ｇｌ
ｕ−４３〜Ｇｌｙ−５３をコードし、かつ両末端がＣ１
ａ　ｌおよび５ｆｉｌ部位である合成遺伝子を挿入する
ことにより、ＥＧＦドメイン領域が除去された部分ヒト
ＰＵＫ（Ｎ末〜Ｍｅｔ−６７）遺伝子を有するプラスミ
ド１１１１１１４を作製した。次にこれらのＥＣＦドメ
インを除去した領域を発現ヘクターに組み込むため、ま
ずｐｕｔ＋　４のＢａｍｔｌｌ−Ｎｃｏｌフラグメント
とｐｓＶ−Ｇｌ−ｐｒｅｌｌＭのｔｌｉｎｄ　ＩＩＩ−
Ｂａｍ旧を連結した。その後、これらのフラグメントを
ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫのｌ１ｉｎｄ　Ｉｎ−Ｎｃｏ
ｌ領域に挿入して、ＥＧＦドメイン欠失変異ヒトＰ　Ｕ
　Ｋ用発現ベクターｐＨｌ＋７を作製した。これら発現
ヘクター作製の詳細を以下に述べる（図３）。

（１）プラスミドｐ　Ｕ　Ｈ１〜３の作製プラスミドｐ
ＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫ上には、Ｔａｑ　１部位が多数
存在し、１回の制限酵素処理では、ＥＧＦドメイン近傍
のＴａｑＴ部位だけを切断することは困難である。そこ
でまずこのＴａｑＴ部位を含むＤＮＡフラグメントを取
り出した。ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫを制限酵素１１ｉ
ｎｄｌｌｌとｈｌｌで消化し、アガロースゲル電気泳動
によりそのＤＮＡを調べた。泳動後ゲルよりＥＧＦドメ
インコーディング領域を含む１．１ｋｂのＤＮＡフラグ
メントをゲルから切り出し、そのＤＮＡを回収した。次
に、このフラグメントをＴａｑｌで部分消化し、ポリア
クリルア旦ドゲル電気泳動にかけた。目的の７６０ｂｐ
のハンドの存在を確認した後、このＤＮＡフラグメント
を回収した。

一方、プラスミドｐＨ１１３２２を１ＩｉｎｄＩＩＩと
Ｃ１ａｌで消化し、４．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを
得た。そしてこのＤＮＡと先に調製した７６０ｂｐ　ｌ
１ｉｎｄｌｌｔ−Ｔａｑｌ　ＤＮＡフラグメントをリゲ
ーションした。このリゲーションにより、７６０ｂｐフ
ラグメントの３”末端上に存在するＴａｑ　１部位は、
ＣＩａＩ部位へと変換した。

反応後、この溶液を用いて大腸Ｗ　Ｉ−Ｔ　Ｂ　１０１
株をトランスフオームした。得られたトランスフォーマ
ント２４株より調製したＤＮＡをそれぞれＣｏａ＋及び
７ Ｎｃｏｌで消化した。目的のプラスくドｐＵＩ＋１であ
れば、Ｃ１ａ＋及びＮｃｏＴで共に−か所でのみ切断さ
れる。電気泳動にかｚノ調べたところ、６クローンが目
的のプラスミドであった。

このｐＵＩｌｌをＥｃｏＲＩ　とＣ１ａｌで消化し、ア
ガロースゲル電気泳動にかけた。ゲルより約５．Ｏｋｂ
のＤＮＡフラグメントを回収し、このＤＮＡとヒトＰＵ
ＫのＡｓｎ−５４からＮｅｔ−６７の領域をコードし、
かつ両末端がＣＩａＴ及びＥｃｏＲ１部位となるように
作られた５６−ｍａｒと５４−ｍａｒの合成オリゴヌク
レオチドのアニーリング産物とをリゲーションした。

そして、この反応液を用い、大腸菌１１ＢＩＯＩをトラ
ンスフオームした。得られたトランスフォーマント２０
株よりＤＮＡを調製して、このＤＮＡをＮｃｏｌ及びＥ
ｃｏＲＩ　と１ｌｉｎｄＨＩで消化した。目的プラスご
ドｐＵＨ２であれば、Ｎｃｏ＋消化により約７００ｂｐ
のＤＮＡフラグメントが、またＥｃｏＲＩ　とｌ１ｉｎ
ｄｌｌｌの消化により、約８１０ｂｐのＤＮＡフラグメ
ント・が生しる。泳動の結果、４クローンが目的のプラ
スミドであった。

８ 次にｐ［ＩＩＩ２には５ｆｉｌ部位が２か所隣接して存
在することから、合成遺伝子由来の５ｆｉｌ部位を含む
Ｂａｍ旧−ＥｃｏＲＩフラグメントを他のへフタ−へ移
した。まず、ｐＬＩＨ２をＢａｍ１ｌｌ　とＥｃｏＲＩ
を用いて消化した。これをポリアクリルア多ドゲル電気
泳動にかけ、ゲルより３３０ｂｐのＤＮＡフラグメント
を切取り、エレクトロエリューションにてＤＮＡを回収
した。

一方、プラスＳドＢＬＵＥＳＣＲＩＢＥ　（ＶＥＣＴＯ
ＲＣＬＯＮＩＮＧＳＹＳＴ［ｉＭＳ製）をＢａｍ１ｌｌ
　とＥｃｏＲＩで消化し、得られた約３．１ｋｂのＤＮ
Ａフラグメントと先に調製した３３０ｂｐのＢａｍ１ｌ
Ｔ−ＥｃｏＲＩ　フラグメントとをリゲーションした。

そして、この反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０５株をト
ランスフオームした。得られたトランスフォーマンＩ・
より１２株を選びそのＤＮＡを調製しＳｆｉ＋及びＣ１
ａｒで消化した。目的のプラスごドｐＵＨ３であれば、
５ｆｉｌ及びＣ１ａｌで共に−か所でのみ切断される。

電気泳動の結果、８クローンが目的のプラスミドを有し
ていた。

（２）プラスミドｐ　Ｕ　Ｈ４およびｐＵＨｌの作製プ
ラスミドｐ　Ｕ　Ｉｔ　３のＣ１ａｌ−５ｆｉｌ領域に
合成遺伝子を挿入することにより、ＥＧＦドメインを除
去したヒトＰＵＫの部分遺伝子を有するプラスミＦ　ｐ
Ｕｌ（４の作製を試みた。先ず、ｐＵＩ＋３をＣＩａＴ
と５ｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかＬ）
、エレクトロエリューションにて約３．１ｋｂのＤＮＡ
フラグメント・を回収した。このフラグメントと合成遺
伝子とをリゲーションした。これらの反応液を用いて、
大腸菌ＪＭ１０５株をトランスフオームした。得られた
トランスフォーマントからそれぞれ１０株ずつ選び、Ｄ
ＮＡを調製した後、Ｉｌａｍｌｌｌ　とｌ１ｃｏｌｌ＋
で消化した。目的のプラスミドｐＵ１１４であれば、制
限酵素消化により、３６０ｂｐのフラグメントが生しる
。

アクリルアミドゲル電気泳動の結果、ｐＨｌ１４を２ク
ローン得ることができた。

そこで、このプラスミドを用いて、ＥＧＦドメイン領域
のＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、予定していた
領域が除去されており、またその他のアミノ酸配列には
変化がなかった。

次に、このｐｕｐ４よりＳＶ４０初期遺伝子プロモー１ ター領域−ＥＧＦドメイン欠失変異ヒトＰＵＫの部分遺
伝子を切り出し、動物細胞用ヒトＰＵＫ発現ヘクターｐ
ＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫへの導入を試みた。ｐｕｌ＋４
をＮｃｏＴで切断後ＣＩＰ処理をおこない、５°末端を
脱リン酸化した。次に、このＤＮＡをＢａｍ１ｌ＋で消
化した後ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかげ、３６
０ｂｐのＤＮＡフラグメントを切り出し、エレクトロエ
リューションにてＤＮＡを回収した。

さらにこのＤＮＡと別途調製したプラスミドｐＳＶ−Ｇ
ｌ−ｐｒｅＵＫの４００ｂｐ　Ｂａｍ１ｌｌ−Ｈｉｎｄ
　ＩＩＩフラグメントとをリゲーションし、反応終了後
エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

一方、ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫを旧ｎｄｎＩとＮｃｏ
Ｉで消化し、電気泳動にかけた。ゲルから約４．２ｋｂ
のＤＮＡフラグメントを切り出し、エレク１〜ロエリュ
ーションにてＤＮＡを回収した。そして、上述のリゲー
ションサンプルそれぞれと、この４．２ｋｂ　Ｈ４ｎｄ
ｌｌＩ−ＮｃｏｌＤＮＡフラグメントを再びリゲーショ
ンし、大腸菌１１Ｂ１０１株をトランスフオームした。

得られたトランスフォーマントより１６株を選んでＤＮ
Ａ２ を抽出し、ｌ１ｉｎｄｌｌｌ及び旧ｎｄｌｌｌとＢｇｌ
ＩＩで消化した。

目的のプラスミドｐＵＩ＋７であれば、ｔｌｉｎｄＩＩ
Ｉ消化からは約４．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが、ま
た１ｌｉｎｄ■とＢｇｌＩｌとの消化からは約１．０ｋ
ｂのフラグメントが得られる。電気泳動の結果、目的と
するｐＵｌ＋７が３クローン得られた。そこで１クロー
ンを選んで、プラスミドを大量調製した。

（ハ’）ＥＧＦドメイン一部欠失変異ヒトＰＵＫ発現ヘ
ククーのＣＨＯ細胞への導入 ２種類の変異ヒトＰＵＫ発現ヘクターｐＭＲ３０４／３
０５をＣＨ○　Ｋ１細胞に導入した。

び− 細胞培養には下記の培地を用いた。Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２
（日永製薬）、牛胎児血清（三菱化成、以下ＦＣ３と略
す）　、ｌ１ａｎｋ’ｓ　　溶液（日永製薬）、リラシ
リン（合成ペニシリン、成田薬品）、ストレプトマイシ
ン（明治製菓）、トリプシン（ヘーリンガー・マンハイ
ム）、Ｇ４１Ｂ（シグマ）。１００■／乏リラシリン、
１’０＋ｎｇ／ｊ２ストレプトマイシン入りＩｌａｍ’
ｓ　Ｆ１２を調製しく以下、Ｆ１２培地と略す）、フィ
ルター除菌後、１１ずつ分注して４°Ｃで保存した。

゛　　ヒ　　　ＰＵＫゝ　　・のゞ１ 培養上清中の変異ヒ）ＰＵＫ活性は天然型ウロキナーゼ
（ＵＫ）活性に相関していると見做した。

培地交換３日後に上清を採取し、そのプラスミノーゲン
アクチヘーター（ＰＡ）活性をＵＫ検定標品（ミドリ十
字）を検量基準としてフィブリン寒天平板法［Ａｒｃｈ
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４０　３４６−３５０１９５２
）：１で測定した。

へのＤＮＡ　　　　エレクトロポレーション法） 対数増殖期にあるＣＨＯ−に１細胞をトリプシン処理に
て分散させ、Ｈａｎｋ’ｓ？Ｓ液で２回洗い、細胞密度
が１０７個／　ｍｌとなるように同波に懸濁した。電極
の付いたキュベツト内で、この細胞懸濁液０．５　ｍｌ
にｐＳＶ−Ｇｌ−Ｎｅｏ　（図５．特開昭６０−１８０
５９１号明細書）、１１００ｎと、目的プラスミド１０
μｇ、または１００　μｇとを混ぜた。１０００Ｖのパ
ルス電場を２回かけ、５分間静置した。この細胞懸濁液
を１０％ＦＣ３人Ｆ］２培地５０ｍ１で希釈し、９６穴
マイクロプレートへ１００μ乏ずつ植えこんだ。

旦１ユｎ１ｌ）Ｊ□選釈 エレクトロポレーションの４８時間後に、８００１ｔｇ
／ｍｆｔのＧ４１８を含む１０％ＦＣ３入りＦ１２培地
を名入に１００μｌずつ加えた。以後、週２回、４００
　ｕｇ／ｍＱのＧ４１８を含む１０％ＦＣ３入りＦ１２
培地による培地交換を行った。

扁−・のスフ１−ニング 約２週間後、コロニーが成長じた段階でＰＡ活性を測定
し活性の高いものをスケールアンプした。

１　’Ｏｃｍ培養皿５たり、ｌＸｌ０６細胞となるよう
に植え込み、３日後に細胞数とＰＡ活性とを測定し、単
位細胞当たりのＰＡ活性を算出した。

対数増殖期にあるＣ　ＨＯ−Ｋ　１細胞にエレクトロポ
レーション法を用いて、ｐＭＲ３０４または９ＭＲ３０
５と、ｐｓＶ−Ｇｌ Ｎｅｏとをコト ５ ランスフェクションした。約２週間後から０４１８耐性
株のコロニーが形成され始めた。それらの９６穴マイク
ロプレ一ト時のＰＡ活性値を表５または表６に示した。

［以下余白］ ６ 表５ ｐＭｌ？３０４を導入したＣｌｌ０−Ｋｌ細胞のＰＡ活
性の分布ＰＡ活性（ＩＵ／ｍｆｆ１） 〈５ ＜１０　　　＜１５ ＜２０　　　＞２０ 計 合計 ３ １ 表６ ９ＭＲ３０５を導入したＣｌｌ０−Ｋｌ細胞のＰＡ活性
の分布ＰＡ活性（ＩＵ／ｍｆｆ） 〈５ ＜１０　　＜１５　　＜２０　　＞２０計 合計 ２２２１０１０２に れらのうち、最も高いＰＡ活性を示す株についてスケー
ルアップし、高産生株の分離を試みた。

スケールアップ時、および、１０ｃｍ培養皿当たり１０
６個の細胞を植えたときのＰＡ活性は表７のとおりであ
った。

（ニ）変異ヒｌ−Ｐ　Ｕ　Ｋ 変量−ヒ　ト　Ｐ　　ｔＪ　　ぢ二（ともｔ１嗟ｐＭＲ
３０／ｌを導入したＣＩ（Ｏ−Ｋｌ　ｉｌｌ＋胞（△Ｅ
、Ｅ２−ＰＵＫ産生細胞）、ｐＭＲ３０５を悪天したＣ
ＯＯ−に、細胞（△Ｅ、、−ＰＵＫ産生細胞）の２種の
トランスフェクタントを用いた。

トランスフエククントの培養」二清をＣｈｅｌａｔｉｎ
ｇＳｅｐｈａｒｏｓｅ　６　Ｂ　（ファルマシア社製）
に亜鉛イオンを固定化したものに吸着させた後に、アプ
ロチニンｌ０ＫＩＵ／ｍｆｆ１および１Ｍ塩化ナトリウ
ｌ、含有２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）
で洗浄し、さらに５０ｍＭイξダヅール、アプロチニン
Ｉ　ＯＫ　Ｉ　Ｕ／ｍｆｆおよび１Ｍ塩化ナトリウム含
有２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝？＆、（ｐＨ７，５）で溶
出した。

ヘンザミジンーセファロース６Ｂ（ファルマシア製）を
０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１　Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，５）で平衡化したものに上記の溶出画分をアプ
ライした後にアプロチニンｌ０ＫＩＵ　／　ｍｆｌおよ
び０．５　Ｍ塩化すトリウｌ、含有０．１　Ｍす９ ン酸緩衝液（ｐＨ６，５）で洗浄し、バス画分を回収し
た。

セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に尿由来ウロキ
ナーゼ抗体を結合したものを予め０．５　Ｍ塩化すトリ
ウム含有０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋６．５）で平
衡化しておき上記バス画分をアプライし、同緩衝液で洗
浄した後に０．５　Ｍ塩化ナトリウム含有０、２　Ｍグ
リシン、塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ２，５）で溶出した。

さらにヘンザ旦ジンーセファロース６Ｂを用いて精製を
行い、バス画分を回収した。

バス画分を０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，２）で透
析した。

比活性は、ｐＭＲ３０４に由来する変異ヒトＰＵＫ（以
下ΔＥＩ　Ｒ２ＰＵＫ）およびＰＭＲ３０５に由来する
変異ヒ）ＰＵＫ　（以下△Ｅ３−ＰＵＫ）ともに１５万
ＩＵ／ｍｇ蛋白（プラスごン処理時）であった。

変選よ」Ｊ旦Ｕ色妃ｉ扱 （１）分子量 ０ Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　
Ｐ、６８０−（１９７０）に基づき、以下の条件で泳動
５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ
ｒｄｅ　ｇｅＩｅｌｅｃｔｒｏｐ＋＋ｒａｓｉｓ）を行
った。

〕 １．８Ｏ−３５０１ＬＪの各種変異ヒｌ−Ｐ　Ｕ　Ｋを
２％２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏ＋＋　２％５Ｄ
Ｓ１１０％ｇ　Ｉ　ｙｃｅｒ　ｔ　ｎ５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓｌｌＣＬ（ｐ！（６，８）の還元溶液中１００°Ｃで
１０分間薫沸後、１０〜２０％のグラジェントゲル（第
−化学薬品製）に重層し、３０ｍＡの定電流で２時間泳
動した。なお、分子量マーカーは低分子マーカー（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　ｂ　９４０００．　ｂｏｖｉ
ｎｅ　ｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ　６７０００．　ｏｖ
ａｌｂｕｍｉｎ　４３０００．　ｃａｒｈｏｎｉｃ　ａ
ｎｈｙｄｒａｓｅ　３００００＋　ｔｒｙｐｓｉｎ　１
ｎｈｉｂｉｔｏｒ　２０１００．　　αｌａｃｔａｌｂ
ｕｍｉｎ　１４４００　、ファルマシア社製）を使用し
た。

ゲル上のハンドはＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａ
ｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ２５０で染色した。

その結果、ΔＥ、Ｅ２−ＰＵＫで４８にのバンドが、Δ
Ｅ３　　ＰＵＫで４９にのバンドが認められた。

以上の結果から、本発明変異ヒ１−ＰＵＫは一本鎖の分
子構造を有することが示された。

（１１）酵素動力学的検討 試薬類 Ｇｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（以下ＭＣＡと略す。

）、７−ａｍｉｎ。

４−ｍｅｔｈｙＩ−Ｃｏｕｍａｒ＋ｎ（以下Ａ、ＭＣと
略す。）はペプチド研究所より購入した。ＵＫ標準品、
ｐｌａｓｍｉｎはミドリ十字社製を用いた。

（初期反応速度の測定） 以下の方法の概略を示した。

２００μｐ、／成の変異ヒトＰＵＫ１００μ℃と０．２
ＣＵ／ｍ１！のプラスミン１００μｌとを混合。

↓ ３７°Ｃで１０分間インキュヘート。

↓ 前もって３７°Ｃに加温した１、０．０．５．０．２５
．０．１２５０．０６２５ｍＦのＭＣＡ溶液０．８成を
添加。

↓ ３７℃で３分間インキュヘート。

↓ １５％酢酸溶液を２　ｍｆｔ添加（反応停止）螢光強度
測定。１０μＭのＡＭＣの螢光強度を１００とし、酵素
反応にまり生成したＡＭＣの濃度を算出した。

（Ｋｍ値とｋｃａｌ値の導出） Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔ法（Ｓｅｇ
ｅｌ、　１．Ｈ，（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃａ１ｃｕｌａｔｉｏｎｓ、　２ｎｄ　ｅｄ、　Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、）によりＫｍ値と、■、、、、値を導出し
た。ＵＫの１１０は、１．３３Ｘ　１０−７μｍｏｌｅ
に相当するから、ｋｃａｌは下記の式に代入して算出し
た。

１．３３Ｘ１０−’ 結果 各変異ヒ）ＰＵＫの酵素動力学定数を表８に示した。

〔以下余白〕

３ 表８ 各変異ヒトＰＵＫの酵素動力学定数 表中の数値は、平均信士標準偏差。ｎ−ＰＵＫについて
は１回、その他の変異ヒトＰＵＫについては２回測定し
た。

上表に示したように、各変異ヒトＰＵＫの酵素動力学定
数に顕著な差はなかった。

（ｉｉｉ　）血中半減期 実験方法 １）投与動物 ラットはウィスター系雄性ラット（６週令）を使用した
。

２）投与薬剤 ａ　）　ｎ−ＰＵＫ　　（天然）　ＩｆＧＫ細胞由来天
然型ＰＵＫ。

ｂ　）　ｎ−ＰＵＫ　　（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、
組み換えＣｌ０−Ｋｌ細胞により産生されたＰＵＫ。

Ｃ）ΔＥ＋ＥＪｈ−ＰＵＫ、　ＥＧＦ全領域除去変異Ｐ
ＵＫ４ ｄ）ΔＥ、Ｅ２−ＰＵＫ、　ＥＧＦ領域の第一ループと
第二ルプを除去した変異ヒトＰＵＫ ｅ）△Ｅ３−ＰｔＬＫ、　ＥＧＦ　Ｓｉ域の第三ループ
を除去した変異ＰＵＫ。

３　）　”Ｊ−ＰＰＡ調製法 上記５薬剤をＩａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｂｅａｄｓ　（ＢＩＯＲＡＤ）法により＋２５１
で標識した。得られた１２ＳＩ−１’ＵＫの放射化学的
比活性は２８０ｎｍでの吸光度から求めた蛋白含量及び
放射活性より算出した。各薬剤の比活性は１１０００〜
５６０００ｃｐｍ／ＩＵであった。

４）投与量及び投与方法 投与液は各薬剤共非標識の薬剤で２　Ｘ　１０　’ＮＪ
／ｍｌ（ヒトアルブミン濃度：５％）に調製し、尾静脈
より投与した。投与容量はｌ　ｍｌ　／　ｋｇとした。

５）採血法 動物をケクラール（三共）　３５　ｍｇ／ｋｇ　ｉ、ｍ
、と、ウレタン（牛丼化学）　１．５　ｇ　／ｋｇ　ｉ
、ｍ、の併用で麻酔し、背位に固定した。左頚動脈に３
，８％クエン酸ナトリウム水溶液（チトラート、ξトリ
＋字）を満たしたアトム静脈カテーテル（３Ｆｒ）を挿
入した。

薬物投与１．２．３．５．７．１０．１５．２０分後に
チトラート３０　ｍｆｌを入れたＪＭＳ１ｄディスポー
ザブル・シリンジで３３０ｄのの目盛りまで（血液３０
０ｍｆｉ）採血した。シリンジ内で混和後金血の放射活
性をγ−カウンターで測定した。全血の放射活性測定後
、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して得られた血漿を１
００ｍ１！採取し、ドライアイス上で急速に凍結し、フ
ィブリン溶解活性を測定するまで一２０°Ｃで保存した
。

６）血漿中の放射活性の測定 γ−カウンター（ＣＯＭＰＵＧＡＭＭＡ１２８２型、Ｌ
ＫＢ　ＷＡＬＬＡＣ）で測定した。

７）血中濃度推移の解析 血中放射活性は％ｏｆ　ｄｏｓｅとして算出した。血中
半減期は、市販のソフトにより算出した。

実験結果 血中半減期の結果は表９に示した。今回新たにスクリー
ニングされた変異ヒトＰＵＫの放射活性からみた血中半
減期はｎ−ＰＵＫと比較して２〜３倍延長し有意な差を
認めた。

表９ Ｔ１／２α （単位二分） 各値は平均値±Ｓ、Ｄ、　（ｎ・８）である。

全ての変異ヒＩ−Ｐ　Ｕ　ＫグループのＴ１／２αはｎ
ＰＵＫグループ（ｐ＜０．０５）のＴ１／２αと比べて
著しい差を示した。△ＩＥ、Ｅ２Ｅ３−　Ｐ　Ｕ　Ｋグ
ループ以外のずべての変異ヒトＰＵＫグループのＴ　Ｉ
／２αには、△Ｅ＋Ｅ２Ｅ３Ｐ　ｔＪ　ＫグループのＴ
１／２αと比較して顕著な差はみられなかった。

〔作用・効果〕

本発明により、ＰＡの＋１ｉ１駆体型の生理的意義を有
した変異ヒトＰＵＫを提供可能にし、しかも該変異ヒＩ
−Ｐ　Ｕ　Ｋは、既知ヒトＰＵＫ、ウロキナゼに比して
より有意に長い、またＥＧＦ全領域欠失変異ヒ）ＰＵＫ
に比して同程度の血中半減期を有するものである。しか
も、本発明の変異しトＰＵＫは大きな欠失がないので元
の構造に大きな変化がなく、従って新たな抗原性の生起
、その他諸性質の変化が極めて少ないものである。

このため本発明は、より理想的な線維素溶解酵素を提供
するものであり医療分野への大きな効果が期待される。

特に、本発明により、ＥＧＦドメインの第１・第２ルー
プは肝細胞上のレセプターと相互作用し、その欠失は血
中率Ｍ＃ＪＩ（主として肝細胞による取り込み）を増加
させることが示唆された。また、第３ループの除去によ
ってもＥＧＦ領域の構造が変わり、肝細胞による代謝を
免れ血中半減期が増加することが示唆された。

【図面の簡単な説明】

図１は天然型ヒ）ＰＵＫのアミノ酸配列およびＤＮＡ配
列を示す。 １ 図２はｐＭＲ３０４／３０５の調製工程を示す。 図３はｐ　Ｕ　Ｈ１〜４および７の調製工程を示す。 図４は天然型ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列を担持
するプラスミドｐＳＶ−Ｇ、−ｐｒｅＵＫの制限酵素地
図を示す。 図５はプラスミドｐＳＶ−ＧＩ−Ｎｅｏの制限酵素地図
を示す。 ８ １２１ １３（ ） ４０ ４１ ＴＧＴ ＧＣ：Ｔ　　ＧにＴ　　ＧＡに　　ＣＣＡＡＧ ＧＧ 八ＡＡ 図 ］ （２） し ６１ ７０ ら ＣＣ ＴＣ ＧＡ ８０ （１）から！、乾く ↓ 図３（２） 工ＬＥ　ＡＳＰ　　ＬＹＳ ＡＴＣＧＡＴ　ＡＡＧ ＴＡＧ　ＣＴＡ　ＴＴＣ Ｃ１ａ工 ３ ＳＥＲＬＹＳ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＹＲＧＬＵ　ＧＬＹＴ
ＣＡ　ＡＸＡ　ＡＣＣＴＧＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＧＧＡ
ＧＴ　ＴＴＴ　ＴＧＧ　ＡＣＧ　ＡＴＡ　ＣＴＣＣＣＣ
ａ２（Ｂ）＋４先く 一！ＵＦ ；のＨｉｎｄエエエーＮＣＯエフラフ゛ｔ″／ト（４，
２Ｋｂ） 図４ 図５ ＳＶ−４０、Ａ（ｎ）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   アクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏ
   ｒ）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）中、少なくとも第１ルー
   プの一部領域または全領域を欠失してなるか、あるいは
   第３ループの一部領域または全領域を欠失してなる変異
   ヒトプロウロキナーゼ。 （２）エピダーマルグロースファクタードメイン中、第
   １ループの全領域および第２ループの全領域又は一部領
   域を欠失してなる変異ヒトプロウロキナーゼ。 （３）請求項１記載の変異ヒトプロウロキナーゼをコー
   ドするＤＮＡ配列。 （４）請求項１記載の変異ヒトプロウロキナーゼをコー
   ドするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミ（５）請求項
   ４記載のプラスミドによって形質転換された宿主。 （６）宿主が動物細胞である請求項５記載の宿主。 （７）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   ァクタードメイン中、少なくとも第１ループの一部領域
   または全領域を欠失してなる、あるいは第３ループの一
   部領域または全領域を欠失してなる変異ヒトプロウロキ
   ナーゼをコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミ
   ドによって形質転換された宿主を発現させることからな
   る変異ヒトプロウロキナーゼの製造方法。