【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、白血球を活性化して抗腫瘍免疫細胞
を誘導する機能を持つ抗腫瘍免疫細胞誘導材に関
する。
（従来の技術）
周知のように、生体の悪性腫瘍に対する免疫監
視機構を荷う抗腫瘍免疫細胞としては、キラーＴ
細胞、NK細胞、活性化マクロフアージ、Ｋ細胞
等が重要な役割をはたしていることが報告されて
いる〔福沢正洋：医学のあゆみ，126，420（′
83）〕。したがつて、悪性腫瘍に対する免疫学的療
法としては、癌患者免疫細胞（白血球）を活性化
して、これらの抗腫瘍免疫細胞を効率的に誘導活
性化することが考えられる。しかしながら、実際
の癌患者体内においては、このような悪性腫瘍に
対する免疫監視機構の存在にもかかわらず腫瘍細
胞が増殖する。
その主要なメカニズムの一つとして、腫瘍細胞
による免疫抑制性細胞（サプレツサーＴ細胞、サ
プレツサーマクロフアージ等）の誘導活性化が報
告されている。〔S.Fujimoto etal：J.Immunol，
116，791（′76）〕。かかる免疫抑制性細胞は、腫瘍
細胞を障害する機能を荷う種々の抗腫瘍免疫細胞
の誘導活性化を抑制し、ために腫瘍細胞の増殖を
許し、ますます腫瘍に対する免疫応答能の低下を
まねくと考えられる。また、その他のメカニズム
として、腫瘍細胞による免疫抑制性因子の産生に
より、腫瘍細胞に対する免疫応答が抑制されてい
る可能性も報告されており〔J.A.Rothetal：J.
Immunol，128，1955（′82）〕、かかる免疫抑制状
態下にある癌患者体内においては、効率的な抗腫
瘍免疫細胞の誘導活性化は困難であると言わなけ
ればならない。
したがつて、免疫抑制のない抗腫瘍免疫細胞誘
導活性化に最適な条件を体外に設定し、癌患者か
ら取り出した白血球を刺激活性化して、強力な抗
腫瘍免疫細胞を誘導し、これを元の癌患者にもど
すことによつて癌を治療しようとする方法は、効
果の高い新しい癌免疫療法となる可能性を有する
と考えられる。
（発明が解決しようとする問題点）
体外に取り出した白血球を刺激活性化して抗腫
瘍免疫細胞を誘導活性化し、これを担癌生体に投
与して癌を治療しようとする試みは、現在活発に
研究が行なわれているが、白血球の刺激活性化に
担癌生体より抽出した腫瘍細胞を用いており、非
常に操作が煩雑である。
（問題を解決するための手段）
本発明者らは、前記の問題を解決するために鋭
意研究した結果、驚くべきことに、オリゴ糖を不
溶性担体に共有結合で固定した誘導材で白血球を
刺激活性化することにより、強力な抗腫瘍免疫細
胞が誘導されることを見い出し、本発明を完成す
るに至つた。
すなわち、本発明は、表面にオリゴ糖部分を有
することを特徴とする抗腫瘍免疫細胞誘導材に係
る。
本発明の誘導材表面のオリゴ糖は、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、
ガラクトース、フコース、マンノース、グルコー
ス、シアル酸の中の三つ以上から構成される。た
とえば、シアル酸、ガラクトース、Ｎ−アセチル
グルコサミン、フコースから成るオリゴ糖、ある
いはガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、
フコースから成るオリゴ糖であり、たとえば、
の構造を有するオリゴ糖である。誘導材表面のオ
リゴ糖の分子量は１万以下のものを使用する。好
ましくは５千以下がよく、さらに好ましくは、分
子量２以下のオリゴ糖がよい。また、たとえば、
動物の粘膜より得られるオリゴ糖等を不溶性担体
に結合したものは、強力な誘導材として用いるこ
とができる。本発明の誘導材は、上記に限定され
るものではなく、オリゴ等を不溶性担体表面に有
する誘導材は、強力な誘導材として使用できる。
本発明における誘導材表面とは、不溶性担体にお
いて白血球が接触可能な部分である。
本発明で用いられる不溶性担体は、親水性担
体、疏水性担体いずれも使用できるが、疏水性担
体を用いる場合には、特に担体への血清成分の非
特異的吸着が生じるため、親水性担体方が好まし
い結果を与える。不溶性担体の形状は、粒子状、
繊維状、中空糸状、膜状等のいずれの公知の形状
も用いることができる。粒状もしくは球状不溶性
担体としては、粒径１ミクロン〜3000ミクロンの
ものが使用できる。粒径１ミクロン以下では活性
化白血球との分離が困難である。とくに粒径50ミ
クロン以上であれば、容易に活性化白血球との濾
過分離が可能であり、粒径3000ミクロン以上で
は、白血球との担体単位重量あたりの接触面積が
低下するため好ましくない。粒径80〜2000ミクロ
ンのものが本発明において最も良好である。ま
た、粒状もしくは球状不溶性担体の比重が1.07以
上であれば、容易に活性化白血球との遠心もしく
は静置による分離が可能である。また、平膜状あ
るいは中空糸状多孔性担体を使用する場合、その
孔径が、細胞は通過できないが培地成分は自由に
通過できる0.05〜10ミクロンのものを使用すれ
ば、膜の一方の面に結合した白血球に膜の他方の
面より栄養を補給でき、高濃度の白血球を刺激活
性化することが可能である。さらに好ましくは、
0.1〜５ミクロンの孔径の平膜状あるいは中空糸
状の多孔性担体が良好に使用できる。
不溶性担体の材質としては、リガンドを固定化
するために、担体が活性化でき、担体の活性化反
応、固定化反応などを含めた全工程を通じて物理
的に安定であればよい。具体的には、無機ベース
のものにあつては、活性炭、ガラス等およびその
誘導体であり、天然高分子由来担体には、セルロ
ース、セフアローズ、デキストラン、デンプン、
アルギン酸、キチン等の単純多等類およびその誘
導体、寒天、ペクチン、コンニヤク、アラビゴム
等の複合多等類およびその誘導体、羊毛、絹蛋白
等の蛋白質およびその誘導体があるが、これらは
必要に応じ、架橋反応等の不溶化処理をした後、
担体に用いる。
また、合成高分子にあつては、ビニル系高分子
には、スチレン、酢酸ビニル、メタクリル酸エス
テル、アクリル酸エステル、ハロゲン化ビニル、
ハロゲン化ビニリデン、アクリロニトリル、アク
リルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピロリ
ドン、２−ビニルピリジン、エチレン、プロピレ
ン、ブタジエン、イソプレン等およびその誘導体
の重合体およびその共重合体があり、環状化合物
の開環重合体には、ジメチルシクロプロパン、ス
ピロ−ジ−０−キシリレン、ノルボルネン、シク
ロブテン、トリオキサン、ラクチド、シクロポリ
シロキサン、塩化ホスホニトリル、Ｎ−カルボキ
シ−α−アミノ酸無水物等およびその誘導体の重
合体および共重合体、ポリホルムアルデヒド、ポ
リエチレンオキシド、ポリプロピレングリコー
ル、ポリ−３，３−ビス（クロルメチル）オキサ
シクロブタン、ポリテトラヒドロフラン、ポリカ
プロラクタン等およびその誘導体がある。
また、重縮合体には、ポリエステル、ポリアミ
ド、ポリアンヒドリド、ポリカーボネート、ポリ
尿素、ポリスルホンアミド、ポリイミド、ポリベ
ンゾイミダゾール等およびその誘導体があげられ
る。
樹脂その他のものにあつては、アクリル樹脂、
メタクリル樹脂、フツ素樹脂、エポキシ樹脂、尿
素樹脂、アミノ樹脂、スチレン樹脂、メラミン樹
脂、ポリウレタン、シリコン樹脂、アルキド樹脂
等およびその誘導体が例示できる。
また、たとえば活性炭等に、PHEMA等をコ
ートした多層構造の不溶性担体も使用できる。
オリゴ糖を不溶性担体の表面に固定する方法と
しては、共有結合、イオン結合、物理吸着等のあ
らゆる公知の方法を用いることができるが、オリ
ゴ糖の溶出性から考えると、共有結合で固定して
用いることが望ましい。そのためには通常固定化
酵素、アフイニテイクロマトグラフイで用いられ
る公知の方法を用いることができる。たとえば、
不溶性担体をエポキシ活性化し、これにオリゴ糖
を結合させる方法等を用いることができる。また
必要に応じて、不溶性担体とオリゴ糖の間に任意
の長さの分子（スペーサー）を導入して使用する
こともできる。
本発明の誘導材の製造方法は、上記方法に限定
されるものではなく、たとえばビニルモノマーに
オリゴ糖を結合させ、これを重合させる方法、ま
た、たとえばリガンドを活性化して担体に結合さ
せる方法等の方法を用いることができ、本発明
は、誘導材の製造方法に規定されるものではな
い。
本発明における白血球とは、血液細胞のうち赤
血球および血小板を除いた、いわゆる白血球を指
すが、この白血球より顆粒球あるいはＢ細胞を除
去した細胞分画も、本発明における白血球の概念
に含まれる。本発明において活性化を行なう白血
球は、公知の連続遠心分離法にて末梢血より採取
した白血球分画を用いてもよく、また公知のフイ
コールパーク重層遠心分離法にて分離した単核細
胞分画でもよく、あるいは末梢血単核細胞より公
知のノイラミニダーゼ処理羊赤血球とのロゼツト
形成で分離濃縮したＴ細胞分画を使用しても、強
力な腫瘍障害細胞の誘導が可能である。
本発明において誘導活性化する腫瘍障害性細胞
は、白血球の中で顆粒球、単球、マクロフアージ
を除くリンパ球分画に属し、とりわけＴ細胞の性
質を有している。
オリゴ糖結合不溶性担体による末梢血白血球の
活性化は、血清成分含有培地もしくはこれにイン
ターリユーキン２を添加した培地で行なうと強力
な腫瘍障害性細胞の誘導が可能である。すなわ
ち、牛胎児血清、牛血清、馬血清等の動物血清あ
るいはヒト血清を２〜20％含有した培地を調製す
る。好ましくはヒト血清を２〜20％含有した培地
を調製する。この場合の培地は、動物細胞培養に
一般的に用いられる培地、たとえば、RPMI1640
倍地、MEM培地等が使用できる。また、血清成
分たとえば、血清アルブミンを添加した
RPMI1640培地でも使用が可能である。
調製した培地中に、種々の方法で採取した末梢
血白血球を0.5〜３×106個／mlの細胞濃度で浮遊
させ、これに適当量のオリゴ糖結合不溶性担体を
添加し、濃度25〜45℃で培養を行なう。温度25℃
以下ではほとんど有効な白血球の活性化が起こら
ず、温度45℃以上では白血球の生存率が低下す
る。培養は市販の細胞培養用のプラスチツク製容
器を使用し、CO2インキユベーター中で行なえば
簡便である。１日ないし数日培養を行なつた後、
活性化白血球を回収する。
このようにして得た活性化白血球は、腫瘍細胞
を強力に殺すことが判明した。
（発明の効果）
本発明のオリゴ糖結合不溶性担体は、以上述べ
てきたように、白血球を刺激活性化して、安全か
つ操作性よく、強力な抗腫瘍免疫細胞を誘導する
ものであり、胃癌、肺癌、乳癌等の癌治療および
検査診断、研究等に用いようとするものである。
（実施例）
実施例 １
市販のぶた胃粘膜ムチン（シグマ）２ｇを
0.2N−NaOH（37℃、24時間）あるいはトリプシ
ン（37℃、24時間）で処理して分解し、60％の濃
度となるようにエタノールを加え、未分解のムチ
ンを沈澱させ、上清を濃縮乾固する。５mlの
0.2Mリン酸バツフアー（PH8.0）に溶解し、セフ
アデツクスＧ−50でゲルクロマトグラフイーを行
ない、各分画の糖濃度をフエノール硫酸法で測定
し、分子量500〜2000のオリゴ糖分画を集め濃縮
する。この操作により、ムチンからオリゴ糖20mg
を得た。このオリゴ糖10mgを公知の方法によつて
市販のエポキシ活性化セフアロース（フアルマシ
ア製）２mlに結合させ、誘導材を作成した。
ヒト白血球は次のようにして得た。すなわち、
採血したヒト末梢血をハンクス液で２倍希釈し、
フイコールパーク液（フアルマシア社製）に重層
し、2000rpmで20分間遠心分離した後、中間層の
白血球層を分離して、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清を10％添加したRPMI1640培地（ニ
ツスイ）に２×106／mlの細胞濃度で浮遊させる。
この細胞浮遊液を１mlずつ、細胞培養用の２mlウ
エル（フアルコンNo.3047）に分注し、これにオリ
ゴ糖結合不溶性担体を50μずつ添加し、CO2イ
ンキユベーター中で温度37℃で培養を行なう。３
日間培養を行なつた後、ピペツテイングを行なつ
て静置すると、担体は容器の底に沈澱するので、
上清細胞液をとり、これをハンクス液で洗つた
後、自己血清10％添加RPMI培地に５×106／ml
の細胞濃度で浮遊させる。
この活性化白血球が腫瘍細胞障害性を有するか
どうかは、次のようなキラー活性測定法を用いて
評価した。培養プレートに付着して増殖する種々
のヒト癌細胞株を標的細胞として、５×104／ml
の細胞濃度で10％牛胎児血清添加RPMI1640培地
に浮遊させ、これを10μずつ10μ容テラサキ
プレートに分注し、CO2インキユベーター中で温
度37℃で培養する。24時間培養を行なうと、癌細
胞は培養プレート底面に強く付着する。これを培
養液で洗つた後、活性化白血球浮遊液10μを添
加し、37℃で４時間、CO2インキユベーター中で
培養し、プレートに付着している癌細胞を障害さ
せる。障害を受けた癌細胞は、プレート底面への
付着性を喪失し、ハンクス液で洗うと活性化白血
球とともに除去される。生残してプレート体面に
付着している癌細胞をアセトンで固定し、ギムザ
液で染色した後、顕微鏡で計数する。キラー活性
は次式により計算する。
キラー活性＝（１−活性化白血球を添加した場合の生
残腫瘍細胞数／活性化白血球を添加しない場合の生残腫
瘍細胞数）×100（％）
このような方法を用いて、オリゴ糖結合不溶性
担体で活性化した免疫細胞の腫瘍細胞障害活性を
測定したところ、MKN−１ヒト胃癌細胞に対し
て50％の障害活性を示した。
実施例 ２
実施例１と同様にして作成したオリゴ糖結合担
体を、実施例１と同様にしてBALB／Ｃマウス
より採取した脾細胞（５×106／ml，10％FCS含
有RPMI培地に浮遊）に、培地１mlあたり50μ
添加し、４日間の培養を行なつた。活性化白血球
のBALB／Ｃ由来同系腫瘍colon26に対するキラ
ー活性を測定したところ、58％の障害活性を示し
た。
実施例 ３
なる構造のオリゴ糖を公知の方法〔A.Kobata
＆ V.Ginsburg，J.Biol.Chem.244，5496
（1969）〕によつて合成し、実施例１と同様にし
て、オリゴ糖10mgをエポキシ活性化セフアロース
２mlに結合させ誘導材を作成し、ヒト白血球を３
日間刺激した。得られた活性化白血球のPC−10
ヒト肺癌細胞に対するキラー活性を測定したとこ
ろ、62％の障害活性を示した。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION (Field of Industrial Application) The present invention relates to an anti-tumor immune cell inducing material that has the function of inducing anti-tumor immune cells by activating white blood cells. (Prior art) As is well known, killer T
It has been reported that cells such as NK cells, activated macrophages, and K cells play important roles [Masahiro Fukuzawa: History of Medicine, 126 , 420 ('
83)]. Therefore, as an immunological therapy for malignant tumors, it is possible to activate cancer patient immune cells (white blood cells) to efficiently induce and activate these anti-tumor immune cells. However, in actual cancer patients, tumor cells proliferate despite the existence of such an immune surveillance mechanism against malignant tumors. One of the main mechanisms has been reported to be induction and activation of immunosuppressive cells (suppressor T cells, suppressor macrophages, etc.) by tumor cells. [S.Fujimoto etal: J.Immunol,
116, 791 ('76)]. Such immunosuppressive cells suppress the induced activation of various anti-tumor immune cells that have the function of damaging tumor cells, thereby allowing tumor cells to proliferate, leading to a further decline in the ability to respond to tumors. it is conceivable that. In addition, as another mechanism, it has been reported that the immune response to tumor cells may be suppressed by the production of immunosuppressive factors by tumor cells [JARothetal: J.
Immunol, 128 , 1955 ('82)], it must be said that it is difficult to efficiently induce and activate antitumor immune cells in cancer patients under such immunosuppressive conditions. Therefore, optimal conditions for inducing and activating anti-tumor immune cells without immunosuppression are set outside the body, and white blood cells taken from cancer patients are stimulated and activated to induce strong anti-tumor immune cells, which can then be used as a base. A method of treating cancer by reintroducing cancer to cancer patients is considered to have the potential to become a highly effective new cancer immunotherapy. (Problems to be solved by the invention) There are currently active attempts to stimulate and activate white blood cells taken out of the body to induce and activate antitumor immune cells, and to administer this to cancer-bearing organisms to treat cancer. Although research is currently underway, tumor cells extracted from cancer-bearing organisms are used to stimulate and activate white blood cells, making the procedure extremely complicated. (Means for Solving the Problem) As a result of intensive research to solve the above problem, the present inventors surprisingly found that white blood cells were stimulated with an inducing material in which oligosaccharides were covalently immobilized on an insoluble carrier. The present inventors discovered that activation induces strong anti-tumor immune cells, leading to the completion of the present invention. That is, the present invention relates to an antitumor immune cell-inducing material characterized by having an oligosaccharide moiety on its surface. The oligosaccharides on the surface of the induction material of the present invention include N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine,
It is composed of three or more of galactose, fucose, mannose, glucose, and sialic acid. For example, oligosaccharides consisting of sialic acid, galactose, N-acetylglucosamine, fucose, or galactose, N-acetylglucosamine,
It is an oligosaccharide consisting of fucose, for example, It is an oligosaccharide with the structure. The oligosaccharide on the surface of the induction material used has a molecular weight of 10,000 or less. The molecular weight is preferably 5,000 or less, more preferably an oligosaccharide with a molecular weight of 2 or less. Also, for example,
Oligosaccharides etc. obtained from animal mucous membranes bound to insoluble carriers can be used as strong induction materials. The inducing material of the present invention is not limited to the above, and an inducing material having an oligo or the like on the surface of an insoluble carrier can be used as a strong inducing material.
In the present invention, the surface of the inducing material is the part of the insoluble carrier that can be contacted by leukocytes. The insoluble carrier used in the present invention can be either a hydrophilic carrier or a hydrophobic carrier, but when a hydrophobic carrier is used, nonspecific adsorption of serum components to the carrier occurs, so it is preferable to use a hydrophilic carrier. gives the desired result. The shape of the insoluble carrier is particulate,
Any known shape such as fibrous, hollow fiber, or membrane shape can be used. As the granular or spherical insoluble carrier, those having a particle size of 1 to 3000 microns can be used. If the particle size is 1 micron or less, it is difficult to separate it from activated leukocytes. In particular, if the particle size is 50 microns or more, it is possible to easily separate the activated leukocytes by filtration, whereas if the particle size is 3000 microns or more, the contact area per unit weight of the carrier with the leukocytes decreases, which is not preferable. A particle size of 80 to 2000 microns is most suitable for the present invention. Furthermore, if the specific gravity of the granular or spherical insoluble carrier is 1.07 or more, it can be easily separated from activated leukocytes by centrifugation or standing still. In addition, when using a porous carrier in the form of a flat membrane or hollow fiber, use one with a pore size of 0.05 to 10 microns that cannot pass through cells but allows medium components to freely pass through. Nutrition can be supplied to the leukocytes from the other side of the membrane, and it is possible to stimulate and activate a high concentration of leukocytes. More preferably,
Porous carriers in the form of flat membranes or hollow fibers with pore diameters of 0.1 to 5 microns can be used favorably. The material of the insoluble carrier may be any material as long as the carrier can be activated to immobilize the ligand and is physically stable throughout the entire process including carrier activation reaction, immobilization reaction, etc. Specifically, inorganic-based carriers include activated carbon, glass, etc. and their derivatives, and natural polymer-derived carriers include cellulose, Cephalose, dextran, starch,
There are simple polyesters and their derivatives such as alginic acid and chitin, complex polyesters and their derivatives such as agar, pectin, konjac, arabic gum, and proteins such as wool and silk proteins and their derivatives. After insolubilization treatment such as crosslinking reaction,
Used as a carrier. Regarding synthetic polymers, vinyl polymers include styrene, vinyl acetate, methacrylate ester, acrylate ester, vinyl halide,
There are polymers and copolymers of vinylidene halides, acrylonitrile, acrylamide, methyl vinyl ketone, vinyl pyrrolidone, 2-vinyl pyridine, ethylene, propylene, butadiene, isoprene, etc. and their derivatives, and ring-opening polymers of cyclic compounds. are polymers and copolymers of dimethylcyclopropane, spiro-di-0-xylylene, norbornene, cyclobutene, trioxane, lactide, cyclopolysiloxane, phosphonitrile chloride, N-carboxy-α-amino acid anhydride, etc., and their derivatives. , polyformaldehyde, polyethylene oxide, polypropylene glycol, poly-3,3-bis(chloromethyl)oxacyclobutane, polytetrahydrofuran, polycaprolactane, and derivatives thereof. Examples of the polycondensate include polyester, polyamide, polyanhydride, polycarbonate, polyurea, polysulfonamide, polyimide, polybenzimidazole, and derivatives thereof. For resins and other materials, acrylic resin,
Examples include methacrylic resin, fluororesin, epoxy resin, urea resin, amino resin, styrene resin, melamine resin, polyurethane, silicone resin, alkyd resin, and derivatives thereof. Furthermore, an insoluble carrier having a multilayer structure such as activated carbon coated with PHEMA or the like can also be used. All known methods such as covalent bonding, ionic bonding, and physical adsorption can be used to immobilize oligosaccharides on the surface of an insoluble carrier. It is desirable to use it. For this purpose, known methods commonly used in immobilized enzymes and affinity chromatography can be used. for example,
A method can be used in which an insoluble carrier is activated with epoxy and oligosaccharides are bonded thereto. Furthermore, if necessary, a molecule (spacer) of any length may be introduced between the insoluble carrier and the oligosaccharide. The method for producing the derivative material of the present invention is not limited to the above method, but includes, for example, a method in which an oligosaccharide is bonded to a vinyl monomer and polymerized, and a method in which a ligand is activated and bonded to a carrier. The present invention is not limited to the method for producing the induction material. In the present invention, leukocytes refer to so-called leukocytes, which are blood cells excluding red blood cells and platelets, but cell fractions obtained by removing granulocytes or B cells from these leukocytes are also included in the concept of leukocytes in the present invention. The leukocytes to be activated in the present invention may be a leukocyte fraction collected from peripheral blood by a known continuous centrifugation method, or a mononuclear cell fraction separated by a known Ficoll-Paque multilayer centrifugation method. It is possible to induce strong tumor-damaging cells by using T cell fractions separated from peripheral blood mononuclear cells or by forming rosettes with known neuraminidase-treated sheep erythrocytes from peripheral blood mononuclear cells. The tumor-toxic cells to be induced and activated in the present invention belong to the lymphocyte fraction among white blood cells, excluding granulocytes, monocytes, and macrophages, and particularly have T cell properties. Activation of peripheral blood leukocytes by oligosaccharide-bound insoluble carriers can strongly induce tumor-toxic cells when carried out in a medium containing serum components or in a medium to which interleukin-2 is added. That is, a medium containing 2 to 20% of animal serum such as fetal bovine serum, bovine serum, horse serum, or human serum is prepared. Preferably, a medium containing 2 to 20% human serum is prepared. The medium in this case is a medium commonly used for animal cell culture, such as RPMI1640.
Medium, MEM medium, etc. can be used. In addition, serum components such as serum albumin may be added.
RPMI1640 medium can also be used. Peripheral blood leukocytes collected by various methods are suspended in the prepared medium at a cell concentration of 0.5 to 3 x 10 6 cells/ml, and an appropriate amount of oligosaccharide-bound insoluble carrier is added to this to a concentration of 25 to 45 cells/ml. Culture at ℃. Temperature 25℃
At temperatures below 45°C, there is almost no effective activation of leukocytes, and at temperatures above 45°C, the survival rate of leukocytes decreases. Cultivation can be easily carried out in a CO 2 incubator using a commercially available plastic container for cell culture. After culturing for one to several days,
Collect activated leukocytes. The activated leukocytes obtained in this way were found to potently kill tumor cells. (Effects of the Invention) As described above, the oligosaccharide-bound insoluble carrier of the present invention stimulates and activates leukocytes to induce strong anti-tumor immune cells in a safe and easy-to-operate manner, and is effective against gastric cancer, It is intended to be used for cancer treatment such as lung cancer and breast cancer, testing and diagnosis, and research. (Example) Example 1 2 g of commercially available pig gastric mucosal mucin (Sigma)
Decompose by treating with 0.2N-NaOH (37℃, 24 hours) or trypsin (37℃, 24 hours), add ethanol to a concentration of 60% to precipitate undegraded mucin, and collect the supernatant. Concentrate to dryness. 5ml
Dissolve in 0.2M phosphate buffer (PH8.0), perform gel chromatography on Sephadex G-50, measure the sugar concentration of each fraction using the phenol sulfuric acid method, collect and concentrate oligosaccharide fractions with molecular weights of 500 to 2000. do. By this operation, 20mg of oligosaccharide is extracted from mucin.
I got it. 10 mg of this oligosaccharide was bonded to 2 ml of commercially available epoxy-activated Sepharose (manufactured by Pharmacia) by a known method to prepare an induction material. Human leukocytes were obtained as follows. That is,
The collected human peripheral blood was diluted 2 times with Hank's solution,
After layering with Ficoll-Paque solution (manufactured by Pharmacia) and centrifuging at 2000 rpm for 20 minutes, the white blood cell layer in the middle layer was separated and washed with Hank's solution, followed by RPMI1640 medium supplemented with 10% autologous serum. (Nitsui) at a cell concentration of 2 x 10 6 /ml.
Dispense 1 ml of this cell suspension into 2 ml wells for cell culture (Falcon No. 3047), add 50 μl of oligosaccharide-bound insoluble carrier, and culture at 37°C in a CO 2 incubator. Do this. 3
After culturing for one day, pipette and leave to stand, the carrier will settle to the bottom of the container.
After taking the supernatant cell solution and washing it with Hank's solution, it was added to RPMI medium supplemented with 10% autologous serum at 5×10 6 /ml.
Suspend at a cell concentration of . Whether or not these activated leukocytes have tumor cytotoxicity was evaluated using the following killer activity measurement method. Various human cancer cell lines that adhere to and proliferate on culture plates are used as target cells, and 5×10 4 /ml
The cells were suspended in RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum at a cell concentration of 10%, aliquoted into 10μ volume Terasaki plates, and cultured in a CO 2 incubator at a temperature of 37°C. When cultured for 24 hours, cancer cells strongly adhere to the bottom of the culture plate. After washing the plate with a culture solution, 10μ of an activated leukocyte suspension is added and cultured at 37°C for 4 hours in a CO 2 incubator to damage cancer cells adhering to the plate. Damaged cancer cells lose their adhesion to the bottom of the plate and are removed along with activated leukocytes when washed with Hank's salt solution. Cancer cells that survive and adhere to the plate surface are fixed with acetone, stained with Giemsa solution, and then counted using a microscope. Killer activity is calculated using the following formula. Killer activity = (1 - number of surviving tumor cells when activated leukocytes are added/number of surviving tumor cells when activated leukocytes are not added) x 100 (%) Using this method, oligosaccharide binding When the tumor cytotoxic activity of immune cells activated with the insoluble carrier was measured, it showed 50% of the cytotoxic activity against MKN-1 human gastric cancer cells. Example 2 An oligosaccharide-bound carrier prepared in the same manner as in Example 1 was suspended in splenocytes (5 × 10 6 /ml, RPMI medium containing 10% FCS) collected from BALB/C mice in the same manner as in Example 1. ), 50μ per ml of medium.
and cultured for 4 days. When the killer activity of activated leukocytes against BALB/C-derived syngeneic tumor colon26 was measured, it showed a 58% damaging activity. Example 3 A known method [A.Kobata
& V. Ginsburg, J. Biol. Chem. 244 , 5496
(1969)], and in the same manner as in Example 1, 10 mg of oligosaccharide was bound to 2 ml of epoxy-activated Sepharose to prepare an inducing material, and human leukocytes were
Stimulated for days. PC-10 of the obtained activated leukocytes
When the killer activity against human lung cancer cells was measured, it showed a 62% damaging activity.