JPH032195A - プロテアーゼ阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬、免疫グロブリン作製用のハプテン等と
して有用な新規ペプチドおよび当該ペプチドをはじめと
する後天性免疫不全症候群の病原ウィルス（ＨＩＶ）の
外膜蛋白関連ペプチド及びその誘導体を有効成分とする
プロテアーゼ阻害剤に関するものである。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕プロテアー
ゼ阻害剤は生体内において幅広い酵素系に影響を与え、
たとえば２．性膵炎、ショック、出血時の止血等の治療
等に使用されている。

現在用いられている、蛋白性のプロテアーゼ阻害剤では
抗体産生の可能性などの問題点があった。

従って、低分子性で抗体産生による副作用の少ないプロ
テアーゼ阻害剤の出現が待望されているのが実情である
。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、ＨＩＶの外被蛋白質（ｇｐ１２０）のア
ミノ酸配列からなるペプチド等のＨＩＶの外膜蛋白関連
ペプチドについて研究をコメた結果、ペプチドにおいて
、後記の式（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列部位を有し
さえすれば、優れたプロテアーゼ阻害作用を存すること
を見出した。

即ち、ＨＩＶに対する中和抗体誘導における抗原決定基
としてすでに公知のアミノ酸配列（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　ＦＪ４
．３１９８〜３２０２　（１９８８））の中に、タンパ
ク質性トリプシンインヒビターとして広く知られている
ダイズのトリプシンインヒビターおよびボーマン−バー
クインヒビターのそれぞれの反応部位である一Ａｒｇ−
Ｉｌｅ−および−Ｌｙｓ−３ｅｒ−というアミノ酸配列
、並びに哺乳類の血清中に存在するプロテアーゼインヒ
ビターの一種であるインター−α−トリプシンインヒビ
クーの反応部位のアミノ酸配列と高い相同性を示すアミ
ノ酸配列を有することを見出し、この部分を含む合成ペ
プチドが生理活性物質として有効ではないかと考えるに
至った。

そこで、この部分を含む新規ペプチドを合成するととも
に、当該ペプチドをはじめとしてＨＩＶの外膜蛋白関連
ペプチドのプロテアーゼ阻害効果を検討し、先に （１）下式（Ａ）のアミノ酸配列を有するペプチドまた
はその薬理学的に許容される塩。

Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ａｓｎ−＾
５ｎ−Ｔｈｒ−＾ｙｇ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒ
ｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ロｅ−Ｇ
ｌｙ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−＾ｓｎＭｅｔ−Ａｒｇ
−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−（：ｙｓ　　　　　　　（
Ａ　）（２）少なくとも下式（Ｂ）のアミノ酸配列を有
するペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効
成分とするプロテアーゼ阻害剤。

Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｉ
ｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ４１ｅ−Ｇｉｙ　　　　　　
　　　　　（Ｂ　）を提案している（特願昭６３−３１
０６３４号）。

本発明者らはこのような状況下に、さらに研究を重ねた
ところ、式（Ｂ）のアミノ酸配列の一部である後記式（
ＩＶ）で表される、極めて少ないアミノ酸よりなるアミ
ノ酸配列部位を有すれば、プロテアーゼ、就中トリプシ
ンおよびキモトリプシンの活性を極めて有為に阻害する
ことを見出すとともに、後記の式（１）、（ｎ）および
（ＩＩＩ）で表される新規ペプチドを創製した。

本発明はかかる新知見に基づいて完成されたものであり
、その第一番目の発明は下式（１）、（ｎ）〜（Ｉ［［
）から選ばれるアミノ酸配列を有する新規ペプチド〔以
下、各々ペプチド（Ｉ）、ペプチド（ｎ）およびペプチ
ド（Ｉ［［）という〕またはその薬理学的に許容される
塩（以下、単に塩ともいう）である。

１ｉｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　　　
’　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１）＋１ｅ
−１１ｉｓ−１１ｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ　　（［１）Ｖａｌ−Ｐｈｅ
−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
Ｇｌｎ−ｌｉｅＡｒｇ−ＩＩｓ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）第二番目の本発明は、
少なくとも下式（ＩＶ）のアミノ酸配列部位を有し、か
つ下式（Ｖ）のアミノ酸配列を有しないペプチド〔以下
、このペプチドをペプチド（ＩＶ）誘導体という〕また
はその塩を有効成分とするプロテアーゼ阻害剤である。

Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（■）＾ｓｎ−Ａｓ
ｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ
−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ八ｒへ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ａｌａ−（Ｖ　）本明細書において、薬理学的に
許容される塩は、低毒性であれば特に制限されるもので
はなく、塩酸塩、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、コハ
ク酸塩等の有機酸塩、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、
カリウム塩等）等の無機酸塩があげられる。

本発明において式（ＩＶ）で表されるアミノ酸配列はＨ
ＩＶの外被蛍白質（ｇＰ１２０）における一部のアミノ
酸配列に該当するものである。しかして、ペプチド（Ｉ
Ｖ）誘導体は少なくとも上記の式（ＩＶ）で表されるア
ミノ酸配列部位を有するペプチドであれば特に制限はな
く、当該アミノ酸配列に付加的に１種以上のアミノ酸が
ペプチド結合したもの、その抗原性を減するためにこれ
らペプチドをポリエチレングリコールまたはそのＦａＲ
体（ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレ
ングリコール等）にて修飾したペプチド、その末端ｒ−
ＧＩｙＪまたは／およびｒＡｒｇ−，１部位に水素が付
加されて、当該部分が各々末端アミノ酸となっているも
の等が例示され、上記ペプチド（１）、（ＩＩ）および
（Ｉ［［）、ＨＩＶの外膜蛋白由来のもの、これらの修
飾化合物等のＨＩＶＯ外被蛋白質関連ペプチドが例示さ
れる。

本願発明におけるペプチド（１）、（ＩＩ）および（Ｉ
［［）を含むペプチド（ｒＶ）　誘導体はｇｐ１２０の
分解、通常のペプチド化学において使用されるペプチド
合成法、修飾法等によって製造される。

ペプチド合成法としては、固相法、液相法のいずれでも
よい。固相法は、たとえば次のようにして行われる。即
ち、まずアミノ基が保護されたＣ末端アミノ酸をカルボ
キシル基によって不溶性担体に結合させる。不溶性担体
としては自体既知のものを使用すればよい０次にアミノ
保護基を除去した後、アミノ酸配列に従って順次アミノ
基の保護されたアミノ酸をペプチド結合させて一段ずつ
反応させ全アミノ酸配列を合成した後、不溶性担体を除
去することによって製造される。この際、反応性の官能
基はペプチド合成において既知の保護基によって保護し
ておくことが好ましい。

かくして製造されたペプチドは、たとえばイオン交換樹
脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー
、逆相クロマトグラフィー等のペプチド化学において通
常使用される精製方法によって任意の純度のものとして
精製することができる。

上記のようにして製造されたペプチドは自体既知の方法
によって塩とすることができ、また塩を自体既知の方法
によって加水分解することによって遊離のペプチドが製
造される。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基等に関
して略号で表示する場合、それらはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
　Ｃｏ＋ｕ＋１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該
分野における慣用略号に基づくものであり、その例を次
にあげる。

Ｔｈｒ：スレオニン　　　＾「ｇ：アルギニンＰｒｏ　
ニブロリン　　　　Ｌｙｓ　：　リジン■ｅ：イソロイ
シン　　Ｇｌｎ：　グルタミンＧｌｙニゲリシン　　　
　Ａｌａ：アラニンＰｈｅ：フェニルアラニン Ｖａｌ：バリン　　　　　　旧Ｓ：ヒスチジンｔ−ＢＯ
Ｃ：　ｔ−ブチルオキシカルボニル〔作用・効果〕 ペプチド（１）、（ＩＩ）および（Ｉｌｌ）を包含する
ペプチド（ＩＶ）誘導体およびその塩はヒト、イヌ、ウ
シ、ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物に対して優れた
プロテアーゼ阻害活性、特にトリプシン阻害活性、キモ
トリプシン阻害活性を有するものであり、抗炎症剤、抗
腫瘍剤、発癌抑制剤等として、また免疫グロブリン療法
用の抗体作製のハブテン等として有用なものである。

本発明のプロテアーゼ阻害剤は、通常ペプチド（ｒＶ）
誘導体、その塩の凍結乾燥品として製剤化されて経口的
または非経口的に投与され、その剤型は投与経路等によ
って異なる。

本発明のプロテアーゼ阻害剤の好ましい剤型としては、
たとえば注射剤、カプセル剤、錠剤、クリーム、軟膏剤
、貼付剤、うめこみ剤等が例示され、これらは自体既知
の方法によって製造される。

たとえば、ペプチド（ｒｖ）　誘導体およびその塩を抗
炎症の治療削として使用する場合、その投与量は、たと
えば注射剤の場合、ペプチド（ＩＶ）誘導体またはその
塩として１日０．１〜１０００ｓ＋ｇ／人が一般的であ
り、これを１日１〜数回に分けて投与される。

実験例１ トリプシン活性に対するペプチド（１）の阻害効果を、
酵素反応の速度論的解析により示した。

市販の精製トリプシンｔｐｇ、５０ｇ＋Ｍ）リス−塩酸
塩緩衝液ｐＨ８，０，０，１５Ｍ塩化ナトリウムおよび
基質であるｔ−ブチルオキシカルボニル−し−フェニル
アラニル−Ｌ−セリル−Ｌ−アルギニン４−メチル−ク
マリル−７−アミドからなる反応液中に、ペプチド（Ｉ
）、または対照として蒸留水を添加し、螢光セル内で２
５°Ｃで反応させ、励起波長３８０ｎｓ＋　、発光波長
４４０ｎ−の螢光強度を測定することによって酵素活性
を算出した。５０μＨのペプチド（１）の存在下でのラ
インライ−バー・パークプロットのパターンを第１図に
示した。ラインライ−バー・パークプロットは、上記の
反応液中で基［１度２５．３３．３．５０．１００μＭ
における酵素活性を、１秒間に酵素が基質と反応し７−
アミノ−４−メチルクマリンを１ピコモル生成させる酵
素単位を１ｐＫａｔとして算出し、各々の基質濃度の逆
数に対して、算出した酵素活性の逆数をプロットするこ
とにより得た。

この結果からペプチド（１）によるトリプシン活性の阻
害が拮抗型であることがわかる。第１図中、Ｏはコント
ロール、・は５０μＭのペプチド（＋）存在下での結果
である。

実験例２ α−キモトリプシン活性に対するペプチド（１）の阻害
効果を、酵素反応の速度論的解析により示した。

市販の精製α−キモトリプシン２０μｇ、　５０ｍＭト
リス−塩酸塩ｐＨ８，０，１０ｍＭ塩化ナトリウムおよ
び基質であるサクシニル−Ｌ−アラニル−し−アラニル
−し−プロリル−し−フェニルアラニル４−メチル−ク
マリル−７−アミドからなる反応液中にペプチド（Ｉ）
、または対照として蒸留水を添刺し、実験例１と同様の
方法にてラインライ−バー・バークプロントを得た。５
０μＭのペフ。

チド（１）の存在下でのラインライ−バー・パークプロ
ットのパターンを第２図に示した。

この結果からペプチド（１）によるα−キモトリプシン
活性の阻害が不拮抗型であることがわかる。第２図中、
○はコントロール、・は５０μＭのペプチド（１）存在
下での結果である。

実験例３ ペプチド（Ｉ）、ペプチド（１）のアミノ酸配列の一部
から成るペプチドおよびペプチド（Ｉ）のアミノ酸配列
と異なる配列から成るペプチドについて、トリプシンお
よびα−キモトリプシンに対する阻害定数を求めた。

阻害定数は、拮抗阻害を示すトリプシンに対してはデイ
クソンプロント、不拮抗阻害を示すαキモトリプシンに
対してはラインライ−バー・パークプロットから算出し
た。デイクソンプロットは、実験例２と同様の反応液中
で、濃度が０．２０．４０，６０Ｉ！Ｍのペプチドを添
加した場合の酵素活性を算出し、各ペプチド濃度に対し
て酵素活性の逆数をプロットすることにより得た。

トリプシンおよびα−キモトリプシンに対する阻害定数
を第１表に示した。この結果から、ペプチド（１）のみ
がトリプシン及びα−キモトリプシンの両方に対して著
しい阻害効果を持つことが示された。また、トリプシン
に対しては、アルギニンとリジンの数に依存した阻害で
あるのに対し、α−キモトリプシンに対しては、ペプチ
ド（１）が特異的に阻害していることがわかる。

第１表 夏　：イソロイシン　　　　　Ｒ：アルギニン０　：グ
ルタミン　　　　　　Ｇ　ニゲリシンＰ　ニブロリン　
　　　　　　Ａ　：アラニンＦ　：フェニルアラニン　
　　Ｖ　：バリン実験例４ ペプチド（■）、ペプチド（■）、ペプチド（ＩＩＩ）
の、キモトリプシン活性に対する阻害効果を調べた。

実験例１と同様の方法にて基質濃度を１００μＭとした
場合のキモトリプシン活性を、ペプチドを加えないコン
トロールの活性を１００％とした相対活性で表わした。

ペプチド（１）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の濃度依存
性を第３図に示した。

この結果からペプチド（ＴＶ）誘導体であるペプチド（
ＩＩ）および（ＩＩ［）は、ペプチド（Ｉ）と類偵のト
リプシン阻害効果を示すことがゎがる。第３図中、・は
ペプチド（Ｉ）、ムはペプチド（ｎ）閣はペプチド（［
［Ｉ）存在下での結果である。

実験例５ ペプチド（■）、ペプチド（ＩＩ）および（ＩＩＩ）の
α−キモトリプシン活性に対する阻害効果を調べた。

実験例２と同様の方法にて基質濃度を１００μＭとした
場合のα−キモトリプシン活性を、ペプチドを加えない
コントロールの活性を１００％とした相対活性で表わし
た。ペプチド（［）、（Ｕ）および（Ｉ［ｌ）の濃度依
存性を第４図に示した。

この結果からペプチド（Ｕ）および（ＩＩＩ）は、ペプ
チド（＋）と類似のキモトリプシン阻害効果を示すこと
がわかる。第４図中、・はペプチド（■）、ムはペプチ
ド（■）、■はペプチド（ＩＩＩ）存在下での結果であ
る。

比較例１ ペプチド（ｒ）の阻害効果を、α−キモトリプシンを特
異的に阻害する市販のプロテアーゼ合成阻害剤であるＬ
−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチル
ケトン（ＴＰＣＫ）の効果と比較した。

実験例２と同様の方法にて、基質濃度を５０μＭとし、
ペプチド（１）の代わりにＴＰＣＫを添ｊｌｔｌ　した
ものとの相対活性を比較した。

ペプチド（１）およびＴＰＣＫの濃度依存性を第５図に
示した。

この結果からペプチド（１）の方がＴＰＣＫよりも阻害
効果が大きいことがわかる。第５図中、・はペプチド（
１）、ＯはＴＰＣＫ存在下での結果である。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが
、これらは本発明を何ら限定するものではない。

なお、以下の実施例で使用されるアミノ酸は、特に言及
しない限り何れもＬ一体である。

合成例１ ペプチド（１）の合成を行なった。

ペプチド合成は、アプライド・バイオシステムズ社製ペ
プチドシンセサイザー４３ＯＡを用い、固相法により行
なった。即ち、０．５ミリモルのＬ−Ｂｏｃ−Ｌ−バリ
ン結合フェニルアセトアミドメチル樹脂（スチレン−１
％ジビニルベンゼン共重合体）に、Ｎ末端をｔ−Ｂｏｃ
で保護した２ミリモルのｔ−Ｂｏｃアミノ酸をＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド中、１ミリモルＮ、Ｎ−ジシクロ
へキシルカルボジイミドを用いた対称アミノ酸無水物法
で縮合し、ペプチド結合を１個ずつ延長させる逐次延長
法にて行なった。ただし、Ｇｌｎ、Ａｒｇの縮合につい
ては、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中、１ミリモルの
ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いた活性エステル法
で２回縮合した。

ｔ−ＢＯ（、アミノ酸の側鎖の保護基としては、Ａｒｇ
では２，４．６−トリメチルベンゼンスルホニル基、Ｌ
ｙｓではＮ　　−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｎ−２−ク
ロロベンジルオキシカルボニル基、ＳｅｒおよびＴｈｒ
ではベンジル基をそれぞれ用いた。

ペプチドの標準合成プログラムは、脱保護として６０％
トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンで１分または１５分
間、洗浄としてジクロロメタンで１分間を３回、中和と
して１０％Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンで１分
間を２回、洗浄としてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで
１分間を６回、縮合としてＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド中でＮ。

Ｎ−ジシクロヘキシカルボジイミドを用いた対称アミノ
酸無水物法を２０分間、洗浄としてＮ、　Ｎ−ジメチル
ホルムアミドで１分間を２回およびジクロロメタンで４
回行う、これらの標準合成プログラムは、各アミノ酸に
対して、反応温度および反応時間等が詳細にマイクロコ
ンピュータにより制御されている。

ペプチド自動合成装置により得られたペプチド樹脂は、
トリフルオロメタンスルホン酸により支持体樹脂および
アミノ酸側鎖の保護基を切断した。

即ち、合成ペプチド樹脂１ｇおよびチオアニソールｌＩ
ｄ、エタンジチオール５００μｌを室温で１０分間撹拌
し、フラスコを氷水で冷却しながらトリフルオロ酢酸を
１０−加え、１０分間攪拌する。

次に１ｊｌｌｌのトリフルオロメタンスルホン酸を加え
、フラスコを氷水から取り出し室温で３０分間攪拌する
。冷ジエチルエーテルをペプチドの沈澱が出なくなるま
でフラスコに加え、１分間攪拌しテフロンフィルターで
結晶を濾過し、これをさらに少量のトリフルオロ酢酸で
溶解し、冷ジエチルエーテル中に移送し、再びテフロン
フィルターで濾過し、これを２Ｎ酢酸等にて溶解し粗精
製ペプチドを得た。

粗精製ペプチドは、オクタデシル基を結合させたシリカ
ゲル充填剤から成る逆相カラム（直径２１、長さ２５Ｃ
１１）による高速液体クロマトグラフィー（カラム：　
ＹＭＣＲ−ＯＤＳ−５）により精製を行なった。溶出は
移動相としてＯ，１％トリフルオロ酢酸を用い９０％ア
セトニトリルを３０％〜７０％直線濃度勾配させること
により行なった（流速５ｄ／ｓｉｎ、）　、精製標品の
クロマトグラムは第６図（２２０ｎｍの紫外吸収で検出
）に示した通りである。

精製したペプチドは、１ナノモルを気相シーケンサ−に
より分析した。その結果、分析サイクル１〜１２で検出
されたアミノ酸残基は、順に、ＩＩｅ＋Ａｒｇ、　ｒｌ
ｅ、　Ｇｌｎ＋Ａｒｇ＋　Ｇｌｙ＋　Ｐｒｏ＋　ＧＩｙ
＋Ａｒｇ、　Ａｌａ。

Ｐｈｅ、　Ｖａｔであり、目的とするペプチド（１）が
得られたことカミ１認された。精製後のペプチドの収量
は１１０■であった。

合成例２ ペプチド（ＩＩ）の合成を行なった。

ペプチド合成は、合成例１と同様の方法で行なった。加
えて、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸側鎖の保護基は、Ｈｉ　ｓで
はジニトロフヱニル基を用いた。

合成したペプチド樹脂は、Ｈｌｓを含むので合成例１と
同様のトリフルオロメタンスルホン酸による切断を行う
前に、次の前処理を行なった。ペプチド樹脂にＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド２４ｔｅｌ、チオフェノールＩｄ
を加え、室温で１時間攪拌後、テフロンフィルターにて
吸引濾過し、１〇−ジクロロメタンで３回洗浄および乾
燥させた。

さらに、この樹脂を０°Ｃに保ちながら、ｍ−フレソー
ル１ｒＩｄ１１　ジメチルスルフィド３ｆｆｉｉ！、ト
リフルオロ酢酸５ｄ、トリフルオロメタンスルホン酸１
ｄ中で３時間反応させ、テフロンフィルター上で冷ジエ
チルエーテルで洗浄、乾燥後、合成例１と同様の方法に
て切断した。

合成例１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィーに
よって精製した。精製標品のクロマトグラムは第７図（
２２０ｎｍの紫外吸収で検出）に示した通りである。

合成例１と同様の方法で分析した結果分析サイクル１〜
１１で検出されたアミノ酸残基はＩｌｅ。

Ｈｉｓ、　ｌｉｅ、　Ｇｌｙ、　Ｐｒｏ、　Ｇｌｙ、Ａ
ｒｇ、　Ａｌａ、　Ｐｈｅ、　Ｖａｔ。

Ｔｈｒであり、目的とするペプチド（ｎ）が得られたこ
とが確認された。精製後のペプチドの収量は１８０１ｇ
であった。

合成例３ ペプチド（Ｉｌｌ）の合成を行なった。

ペプチド合成は、合成例１と同様の方法で行った。

合成例１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィーに
よって精製した。当１亥クロマトグラムは第８図（２２
０ｎｍの紫外吸収で検出）に示した通りである。

合成例１と同様の方法で分析した結果、分析サイクルｌ
〜１２で検出されたアミノ酸残基は、Ｖａｌ。

Ｐｈｅ、Ａｌａ、　　Ａｒｇ、　　Ｇｌｙ、　　Ｐｒｏ
＋　　ＧＩｙ＋　　Ａｒｇ、　　Ｇｉｎ、　　Ｉｌｅ。

＾ｒＬ　Ｉｌｅであり、目的とするペプチド（１）が得
られたことが確認された。

製剤例１ ペプチド（１）を精製した後、アンプルに注入し凍結乾
燥させ封入して、１００■／アンプルの注射用製剤を得
た。

製剤例２ マクロゴール軟膏（第８改正日本薬局方）（マクロゴー
ル４０００　５０ｇ、マクロゴール４００５０ｇを混合
したもの）に１ｇの凍結乾燥ペプチド（１）を混合よく
練り均一として１％軟膏製剤を得た。

製剤例３ 製剤例１において、ペプチド（Ｉ）に代えてペプチド（
ＩＩ）を用いて注射用製剤を得た。

製剤例４ 製剤例２において、ペプチド（１）に代えてペプチド（
Ｉｆ）を用いて軟膏剤を得た。

製剤例４ 製剤例２において、ペプチド（１）に代えてペプチド（
ＩＩＩ）を用いて軟膏剤を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はラインライ−バー・パークプロットによる、本
発明のプロテアーゼ阻害剤〔ペプチド（■）〕のトトリ
シンに対する阻害効果を示すグラフである。 第２図は、ラインライ−バー・パークプロットによる、
本発明のプロテアーゼ阻害剤〔ペプチド（■）〕の〕α
−キモトリプシに対する阻害効果を示すグラフである。 第３図は、ペプチド（１）、（Ｉ［Ｉ）および（ＴＶ）
のトリプシンに対する濃度依存性の阻害効果を示すグラ
フである。 第４図は、ペプチド（１）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）
のα−キモトリプシンに対する濃度依存性の阻害効果を
示すグラフである。 第５図は、本発明のプロテアーゼ阻害剤〔ペプチド（Ｉ
）〕と、市販の合成プロテアーゼ阻害剤（ＴＰＣＫ）の
α−キモトリプシンに対する阻害効果を比較したグラフ
である。 第６閲は、精製したペプチド（１）の高速液体クロマト
グラフィーのチャートである。 第７図は、精製したペプチド（ＩＩ）の高速液体クロマ
トグラフィーのチャートである。 第８図は、精製したペプチド（ＩＩ）の高速液体クロマ
トグラフィーのチャートである。 第８図 １／（５１（ｒｎＭ）−１ １／（Ｓ）　（ｒ！ＩＭ）−１ 第３図 Ａｏ７０４　トｉ／ｌ　Ｉｆｉ　Ｍ＋ 第４図 へ〇７°子ド゛ｉ／盲（μＭ） 第６図 第７図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記式（ I ）〜（III）から選ばれるアミノ酸配
   列を有するペプチドまたはその薬理学的に許容される塩
   。 Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐ
   ｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（ I
   ） Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａ
   ｒｇ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（II）Ｖａｌ−Ｐｈｅ−
   Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇ
   ｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ（III）
2. （２）少なくとも式 −Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−（IV）のアミノ酸
   配列部位を有し、かつ式 −Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−
   Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｐ
   ｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ａｌａ−（Ｖ）のアミノ酸配列
   部位を有しないペプチドまたはその薬理学的に許容され
   る塩を有効成分とするプロテアーゼ阻害剤。