JPH03200801A - アンヒドロマルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα―アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な３．６−アンヒドロマルトオリゴシト
誘導体、該誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性
測定用試薬及び該誘導体を用いてσ−アミラーゼ活性を
効率よく、かつ正確に測定する方法に関するものである
。

従来の技術 従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象とするα
−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要であ
り、特に急性や慢性の肝炎、膵臓ガン、流行性耳下腺炎
などの鑑別診断においては必須の測定項目となっている
。

このα−アミラーゼ活性の測定方法については、従来よ
り種々の方法、例えば（１）デンプン又は色素結合デン
プンを基質とし、還元力あるいは吸光度を測定する方法
、（２）マルトテトラオース、マルトペンタオースなど
の一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し、α−アミ
ラーゼにより切断したのち、共役酵素系を作用させ、生
成するマルトース、グルコース又はグルコース−６−リ
ン酸ヲ定量する方法、（３）各種置換フェニルマルトオ
リゴシト類を基質として利用し、σ−アミラーゼにより
切断したのち、共役酵素系を作用させ、生成する置換フ
ェノール類をそのままあるいは必要に応じてｐＨを変化
させたのち、あるいは縮合反応を行ったのち比色定量す
る方法、（４）非還元末端グルコースの６位及び／又は
４位をアリール基、アルキル基などで修飾した、各種置
換フェニルマルトオリゴシト類を基質として利用し、（
３）と同様に比色定量する方法などが知られている。

しかしながら、（１）の方法においては、基質に用いら
れるデンプンの品質により、測定値にバラツキが生じる
上、酵素切断部位が多数存在するため、ａ−アミラーゼ
反応を真に化学量論的反応として測定できないなどの欠
点を有している。これに対し、（２）の方法は、均一な
基質を使用するため（こ、前記（１）の欠点を補うこと
ができるが、あらかじめ試料中のマルトース、グルコー
スなどの糖質を完全に消去することが必要である上、酵
素反応で生成するグルコースをグルコースオキシダーゼ
、ペルオキシダーゼ、クロモゲン系を用いて測定する場
合に、試料中のグルコースの影響を補正する必要がある
とともに、多量のグルコースオキシダーゼを必要とし、
さらに、試料中に存在するアスコルビン酸、ビリルビン
などの還元物質の影響を免れないなどの欠点がある。

−４、（３）の方法、特に２−クロロ−４−二トロフェ
ニルーβ−マルトペンタオシドを基質として使用する方
法は、現在量も優れた方法として広く普及しているが、
基質が共役酵素に分解されるため、正の誤差を生じやす
く、また、共役酵素量を減らすとラグタイムが長くなる
という欠点を有している。そこで、（３）の方法におけ
る欠点を改良するために共役酵素で分解されない前記（
４）の方法が開発されている。

しかしながら、これらの基質は、水に対する溶解度が低
い、ａ−アミラーゼに対する親和性が低い、ａ−アミラ
ーゼによる分解速度が低い、化学的に不安定で長期間保
存することができないなどの多くの欠点を有している。

発明が解決しようとする課題 本発明は、このような従来のａ−アミラーゼ活性の測定
試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服し、
ａ−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定しうる
試薬として好適な新規化合物を提供するとともに、これ
を試薬とした新規なα−アミラーゼ活性の測定方法を提
供することを目的としてなされｔこものである。

課題を解決するための手段 本発明者らは、前記目的を達成するために種々研究を重
ねた結果、ａ−アミラーゼ活性測定用試薬として特定の
新規３，６−アンヒトロマルトオリゴシド誘導体が極め
て好適であり、これを用いてａ−アミラーゼ活性を測定
することにより、その目的を達成しうることを見出し、
この知見に基づいて本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、一般式 （式中のＲは芳香族発色性基であり、ｎは１〜６の整数
である） で表わされる３、６−アンヒトロマルトオリゴシド誘導
体、一般式（Ｉ）の化合物を有効成分とするσ−アミラ
ーゼ活性測定用試薬、及びα−アミラーゼ含有試料に、
一般式（Ｉ）の化合物のα−アノマーと、σ−グルコシ
ダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを添加して酵素反応
を行わせ、遊離する芳香族発色性化合物を定量するａ−
アミラーゼ活性の測定方法、及びａ−アミラーゼ含有試
料に、一般式（１）の化合物のβ−アノマー又はα−ア
ノマーとβ−アノマーとの混合物と、α−グルコシダー
ゼ及び／又はグルコアミラーゼ並びにβ−グルコシダー
ゼを添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性
化合物を定量することを特徴とするα−アミラーゼ活性
の測定方法を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の前記一般式（Ｉ）の３，６−アンヒトロマルト
オリゴシド誘導体における３、６−アンヒドロマルトオ
リゴ糖部としては、例えばａ−又はβ−３”、６”−ア
ンヒドロ−Ｄ−マルトトリオースからα又はβ−３’、
６’−アンヒドロ−Ｄ−マルトオクタオースまでに対応
するものが全て使用できる。これらの中でも特に３’、
６’−アンヒドロ−Ｄ−マルトペンタオース、３８．６
ローアンヒドローＤ−マルトヘキサオース及び３’、６
’−アンヒドロ−Ｄ−マルトヘプタオースが好適である
。なお、前記化合物におけるアンヒドロの前に付した記
号３”、６”−１３’、６ｓ−１３’、６’、３’、６
’−３’、６’−などは、それぞれマルトオリゴ糖を構
成する３個、５個、６個、７個、８個のグルコース単位
の非還元末端側のグルコースの３位及び６位で分子内エ
ーテルを形成していることを意味する。

前記一般式（１）で表わされる３、６−アンヒトロマル
トオリゴシド誘導体において、還元末端グルコースの１
位の水酸基に置換されるＲは、芳香族発色性基であって
、このようなものとしては、例えば以下のものが挙げら
れる。

（ＲＩ−Ｒ６は水素原子、アルキル基、アリル基、アリ
ール基、アシル基、カルボキシル基、シアノ基、ホルミ
ル基、アルコキシ基、ニトロ基、ニトロソ基、アミノ基
、アジド基、スルホン酸基、スルホキシル基、スルホニ
ル基、又はハロゲン原子であり、それぞれ同一であって
もよいし、また異なっていてもよく、またＲ１とＲ２、
又はＲ２とＲ３が結合して、縮合芳香環を形成してもよ
い）博 （Ｒ’は水素原子又はアルキル基である）（Ｒ７は水素
原子又はハロゲン原子である）（Ｒ８−Ｒ１６は水素原
子、アルキル基、アリル基、アリール基、アシル基、カ
ルボキシル基、シアノ基、ホルミル基、アルコキシ基、
ニトロ基、ニトロソ基、アミノ基、アジド基、スルホン
酸基、スルホキシル基、スルホニル基、又はハロゲン原
子であり、それぞれ同一であってもよいし、たがいに異
なっていてもよく、またＲａとＲ”、及び／又は１？Ｉ
ｏとＲ１１が結合して、縮合芳香環を形成してもよく、
さらにＲ９とＲＩＧ、及び／又はＲｌｍとＲ１４が共通
の酸素原子となって縮合エーテル環を形成してもよく、
またＺは窒素原子又はＮ→０である）そして、前記一般
式（Ｉ）で表わされる３、６−アンヒトロマルトオリゴ
シド誘導体はσ−アノマー又はβ−アノマーのいずれで
もよい。

したがって、前記一般式（Ｉ）で表わされる化合物とし
ては、例えば２−クロロ−４−二トロフェニル＝３％、
５ｍ−アンヒドロ−β−Ｄ−マルトペンタオシト、４−
ニトロフェニル＝３’、６’−アンヒドロ−α−Ｄ−マ
ルトペンタオシド、フェノールインド−３′−クロロフ
ェニル＝３’、６’−アンヒドロ−β−Ｄ−マルトペン
タオシド、４−ニトロフェニル＝３’、６’−アンヒド
ロ−β−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル−３’、６’−７ンヒＦｏ−β−Ｄ−マル
トヘプタオシド、メチルウンベリフエｏ＝ルー３’、６
’−アンヒドロ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、レザス
リニル＝３’、６’−アンヒドロ−β−Ｄ−マルトヘプ
タオシドなどが挙げられる。

本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる３、６−アンヒ
トロマルトオリゴンド誘導体は、いずれも文献未載の新
規化合物であって、例えば次に示す（Ａ）法及び（Ｂ）
法により製造することができる。

（Ａ）法 まず、一般式 （式中のＲ及びｎは前記と同じ意味をもつ）で表わされ
るマルトオリゴシト誘導体、例えば２−クロロ−４−二
トロフェニル＝β−Ｄ−マルトヘンタオシド、４−ニト
ロフェニルロα−Ｄ−マルトヘプタオシド、フェノール
インドフェニルＣβ−Ｄ−マルトペンタオシドなどに、
ベンズアルデヒドやベンズアルデヒドジメチルアセター
ルなどを反応させて、一般式 （式中のＲ及びｎは、前記と同じ意味をもつ）で表わさ
れる４、６−０−ベンジリデンマルトオリゴシド誘導体
、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル−４’、６５
−０−ベンジリデン−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４
−ニトロフェニル＝４’、６７−〇−ベンジリデン−α
−Ｄ−マルトヘプタオシド、フェノールインド−３′−
クロロフェニル＝４’、６’−０−ベンジリデン−β−
Ｄ−マルトテトラオシドなどを得る。

前記一般式（ＩＩ）で表わされるマルトオリゴシト誘導
体と、ベンズアルデヒドやベンズアルデヒドジメチルア
セタールなどとの反応は、例えばＮ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）　、エチレングリコールジメチルエーテルなどの非プ
ロトン性極性溶媒中において、硫酸、塩化水素、ｐ−＋
−ルエンスルホン酸、いでこのようにして得られた前記
一般式（［１）で表わされる４、６−０−ベンジリデン
マルトオリゴシド誘導体をアシル化して、アシル−４，
６−０−ベンジリデンマルトオリゴシド誘導体、例えば
２−クロロ−４−二トロフェニルーテトラデ力−〇−ア
セチル−４５，６’−０−ベンジリデン−β−Ｄ−マル
トペンタオシド、４−ニトロフェニル−エイコサ−０−
ベンゾイル−４’＋６’−ｏ−ベンジリデン−α−Ｄ−
マルトヘプタオンド、フェノールインド−３′−クロロ
フェニル−ウンデカ−Ｏ−ブチリル−４４，１３４−ｏ
−ベンジリデン−β−Ｄ−マルトテトラオシドなどを得
る。この際、アシル化剤としては、例えば酢酸、モノク
ロロ酢酸、プロピオン酸、σ−クロロプロピオン酸、β
−クロロプロピオン酸、ｎ酪酸、安息香酸などや、これ
らの酸無水物、酸クロリド、エステルなどの反応性誘導
体が用いられる。アシル化反応の条件については特に制
限はなく、従来アシル化において慣用されている条件を
用いることができる。

次に、このようにして得られたアシル−４，６−０−ベ
ンジリデンマルトオリゴシド誘導体に、Ｎ−ブロモコハ
ク酸イミド（ＮＢＳ）を用いて酸化的ブロム化反応を行
い、一般式 テトラオシドなどを得る。

前記のＮＢＳを用いた酸化的ブロム化反応は、例えば四
塩化炭素、１．１，２．２−テトラクロロエタン、ベン
ゼン、トルエンなどの無極性溶媒還流下において、硫酸
バリウムなどの臭化水素除去剤の存在下で行われる。

次に、このアシル−４−０−ベンゾイル−６−ブロモマ
ルトオリゴシド誘導体にアルカリを作用させて、分子内
エーテル形成反応を行わせ、一般式（式中のＲ１″はア
シル基、Ｂ２はベンゾイル基、Ｒ及びｎは前記と同じ意
味をもつ） で表わされるアシル−４−０−ベンゾイル−６−ブロモ
マルトオリゴシド誘導体、例えば２−クロロ−４−二ト
ロフェニルーテトラデ力−〇−アセチル−４％−ｏ−ベ
ンゾイル−６’−ブロモ−β−Ｄ−マルトペンタオシド
、４−ニトロフェニル＝ヘンエイコサ−０−ベンゾイル
−６フープロモーａ−Ｄ−マルトヘプタオシド、レゾル
フィニル−ウンデカ−〇−７’チリルー４４−Ｏ−ベン
ゾイル−６４−ブロモ−β−Ｄ−マルト（式中、Ｒ１、
Ｂ２、Ｒ及びｎは前記と同じ意味をもつ） で表わされるアシル−３，６−アンヒドロ−４−０−ベ
ンゾイル−マルトオリゴシド誘導体、例えば２−クロロ
−４−ニトロフェニル−トリデカ−〇−アセチルー３１
′、６’−アンヒドロ−４６−〇−ベンゾイルーβ−Ｄ
−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル＝エイコサ
ーＯ−ベンゾイル−３’、６’−アンヒドロ−α−Ｄ−
マルトヘプタオシド、フェノールインド−３’、５’−
ジフルオロフェニル＝デカー〇−７’チリル−３’、６
’−アンヒドロ−４４−Ｏ−ベンゾイル−β−り一マル
トテトラオシドなどを得る。

′上記の分子内エーテル形成反応の条件については特に
制限はないが、例えば、ヘキサメチルホスホリックトリ
アミド（ＨＭＰＡ）　、ＤＭＳＯ，ＤＭＦ、アセトン、
アセトニトリル、ニトロメタンなどの非プロトン性極性
溶媒中で５０〜８０℃の温度で炭酸カリウム、ＮａＢＨ
ａ、ＮａＢＨ，ＣＮなどのアルカリを１０〜５０倍モル
の割合で作用させることにより分子内エーテル形成反応
が行われる。

最後に前記アシル−３，６−アンヒドロ−４−０−ベン
ゾイルマルトオリゴシド誘導体を脱アシル化して、前記
一般式（Ｉ）で表わされる目的化合物３．６−アンヒト
ロマルトオリゴシド誘導体を得る。

この脱アシル化反応の条件についても特に制限はないが
、例えば、アシル基がアセチル基の場合、メタノールな
どのアルコール顔中で炭酸カリウムを０．５〜３倍モル
添加し、２０〜４０℃で１−１０時間反応させる方法な
どが用いられる〔「ジャーナル・オブ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティー（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、
）第９４巻、第８６１３ページ（１９７２）参照」〕。

なお、前記ベンズアルデヒドやベンズアルデヒドジメチ
ルアセタール ルアセタール及びアセトアルデヒドをそれぞれ用いて、
前記と同様にして対応するインプロピリデンマルトオリ
ゴシド誘導体及びエチリデンマルトオリゴシド誘導体を
得、以下同様にしてアシル化、酸化的ブロム化、分子内
エーテル形成、脱アシル化することにより、前記一般式
（Ｉ）で表わされる所望の３．６−アンヒトロマルトオ
リゴシド誘導体を得ることができる。

（Ｂ）法 一般式 （式中のＲは前記と同じ意味をもつ） で表わされる公知のアリールグルコシド誘導体に、一般
式 （式中のｎ′は４〜６の整数である） で表わされる３、６−アンヒドロシクロデキストリンを
加え、公知の酵素シクロデキストリングルコシルトラン
ス７エラーゼ（ＣＧＴ　−ａｓｅ）を作用させて、カッ
プリング−環開裂反応を行わせたのち、これにエキソ型
糖化酵素類を作用させて、３，６−アンヒドログルコー
スの残基が非還元末端となるように、非還元末端側のグ
ルコース残基を加水分解させると、一般式ＣＩ）で表わ
される所望の３，６−アンヒトロマルトオリゴシド誘導
体が得られる。

前記一般式（Ｖｌ）で表わされるアリールグルコシド誘
導体としては、例えば２−クロロ−４−ニトロフェニル
＝β−Ｄ−クルコシト、４−ニトロフェニルにａ−Ｄ−
グルコシド、フェノールインド−３’、５’−ジクロロ
フェニル＝β−Ｄ−グルコシドなどが挙げられる。

これらは市販品として入手することができるし、また公
知の方法により容易に製造することができる。

前記一般式（■）で表わされるシクロデキストリンは、
分岐体、修飾体などの誘導体なども包含するンクロデキ
ストリン骨格を有するシクロデキストリン類、例えば市
販のα−１β−１γ−シクロデキストリン（グルコース
重合度が各々６．７．８）などから公知の方法で得るこ
とができる。例えば、シクロデキストリンをピリジンな
どの溶媒に溶解し、トシルクロリドを７〜１４倍モル添
加して、１５〜３０°Ｃで４〜６時間反応させてトシル
化し、必要に応じ常法により精製して６−トシルシクロ
デキストリンを得たのち、水に溶解し、これに水酸化ナ
トリウム、炭酸カリウムなどのアルカリを２〜１０倍モ
ル加えて、４０〜６０℃で、５〜ｌＯ時間程度反応させ
て、分子内エーテル形成を行い、必要に応じて、常法に
より精製することにより３．６−アンヒドロシクロデキ
ストリンが得られる〔例えば「ケミストリー・レター（
Ｃｈｅｍ。

Ｌｅｔｔ、）Ｊ　、１９８Ｂ隼、第７０５−７０８ペー
ジ参照〕。

また、前記ＣＧＴ　−ａｓｅによるカップリング−開裂
反応は、通常水性媒体中において、緩衝剤の存在下で行
われる。この際の反応条件としては、使用するＣＧＴ　
−ａｓｅの起源によって、作用ｐＨや温度が適宜選ばれ
るが、通常ｐＨは５．０〜７．５、温度は３５〜４５°
Ｃ１反応時間は０．５〜１０時間の範囲で選ばれる。

そして、この際の前記一般式（Ｖｌ）で表わされる化合
物の濃度は、通常０．０１＝　ｌ　ｙ／　ｒａＱ、好ま
しくは０．０２〜０．２ｇ／ＩＩ＋１２の範囲で選ばれ
、一方一般式（■）で表わされる３、６−アンヒドロシ
クロデキストリン類の濃度は、通常１−２００１９９／
　ｍ１２、好ましくは１００〜２００ｍｇ／ＷＩＱの範
囲で選ばれる。また、ＣＧＴ　−ａｓｅの起源について
は特に制限はないが、例えばバチルス・マセランス、バ
チルス・メガテリウム、バチルス・サーキュランスなど
から得られたものが好ましい。その濃度は、通常０．３
〜３単位／ｍＱ。

好ましくは０．５〜１．５単位／ｍＱの範囲で選ばれる
。

また、前記のエキソ型糖化酵素類としては、例えば公知
のａ−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼなどを単独で
用いてもよいし、それらを組み合わせて用いてもよい。

このエキソ型糖化酵素類は、前記のＣＧＴ　−ａｓｅと
共存させて酵素反応を同時的に行わせてもよいが、出発
原料にＣＧＴ　−ａｓｅを作用させた後で、さらに作用
させるのが好ましい。特に好ましいのは、出発原料にＣ
ＧＴ　−ａｓｅを作用させて、例えば生成物が最大にな
った際に、酸又は熱処理などによりいったん反応を停止
させ、さらに例えばオクタデシル化シリカゲル（００５
）カラムに通液して未反応の原料を吸着除去するなどの
精製処理を施したのち、エキソ型糖化酵素類を作用させ
る方法である。ＣＧＴ　−ａｓｅとエキソ型糖化酵素類
を共存作用させる場合の反応条件としては、両酵素に共
通する作用９Ｈｓ温度範囲を適宜選択する必要があるが
、通常ｐＨ５，０〜７．５．３５〜４５℃で、０．５〜
４８時間の条件が用いられる。

また、前記のＣＧＴ　−ａｓｅの作用後、エキソ型糖化
酵素類を作用させる場合の反応条件としては、用いる酵
素の作用ｐＨｓ温度範囲の中から適宜選択されるが、通
常はｐＨ４，０〜７．５．３５〜４５℃で、０．５〜４
８時間の条件が用いられる。この際のエキソ型糖化酵素
類の使用量には特に制限はないが、通常３，６−アンヒ
ドロシクロデキストリンに対し１０〜１００単位／ｇの
範囲が用いられる。この酵素反応は、例えば酸又は熱処
理などによって停止される。

次に、このようにして得られた３、６−アンヒトロマル
トオリゴシド誘導体含有反応液から、目的化合物の前記
一般式（１）で表わされる３、６−アンヒトロマルトオ
リゴシド誘導体を得るには、通常のオリゴ糖分離方法、
例えば、反応液から未反応の３．６−アンヒドロシクロ
デキストリンを除き、さらに活性炭カラムクロマトグラ
フィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄層ク
ロマトグラフィーなどを用いて分画採取する方法によっ
て分離、精製する。また、未反応の３，６−アンヒドロ
シクロデキストリンの除去は、例えば冷却処理、有機溶
媒添加処理、吸着カラム処理などの公知の方法によって
行うことができる。

以上のように各種製法により得られた前記一般式（Ｉ）
で表わされる３、６−アンヒトロマルトオリゴシド誘導
体は、α−アミラーゼ活性の測定に極めて有用であり、
この３．６−アンヒトロマルトオリゴシド誘導体を用い
てα−アミラーゼ活性を測定することができる。

前記したように、一般式ＣＩ）で表される３、６−アン
ヒトロマルトオリゴシド誘導体には、α−アノマーとβ
−アノマーが存在するが、ａ−アミラーゼ活性の測定に
際して、σ−アノマーのみを用いる場合には、共役酵素
系としてα−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラー
ゼを用いることが必要であり、またβ−アノマーのみあ
るいはσ−アノマーとβ−アノマーの混合物を用いる場
合にはα−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ
に加えてさらにβ−グルコシダーゼを併用することが必
要である。また共役酵素として必要によりβ−アミラー
ゼを用いてもよい。

α−アミラーゼ活性を測定するための有利な系としては
、例えば一般式ＣＩ）で表わされるα−及び／又はβ−
３，６−アンヒトロマルトオリゴシド誘導体ｌ〜２０ｍ
Ｍ及び緩衝剤２〜１００ｍＭを含有し、かつ共役酵素と
して、α−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ
をそれぞれ１５〜１５０単位／ｍＱ、該誘導体がβ−ア
ノマーを含むときは、さらにβ−グルコシダーゼ３〜３
０単位／ＩＩＩＱとを含有するｐＨ４〜１０の系が挙げ
られる。この系に用いられる緩衝剤としては、例えばリ
ン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−（ヒドロキシメチル
）−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸塩、ジメチルグ
ルタル酸塩などが挙げられる。ａ−グルコシダーゼは動
物、植物、微生物などいかなる起源のものを用いてもよ
いが、特に酵母起源のものが基質特異性の点から好まし
い。また、グルコアミラーゼもいかなる起源のものを用
いてもよいが、例えばリゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　
ｓｐ）などに由来するものが好適である。

また、β−グルコシダーゼもいかなる起源のものを用い
てもよく、例えばアーモンドの種子から得たものが用い
られる。さらに、β−アミラーゼについてもいかなる起
源のものを用いてもよく、例えば細菌などに由来するも
のが好適である。

本発明においては、このような系に、前記成分以外に、
本発明の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じ
て慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤
としてグリセリン、牛血清アルブミン、α−又はβ−シ
クロデキストリン、トリトンＸ１００などを加えてもよ
い。さらに、σ−アミラーゼ活性剤として、ＮａＣＱ、
　ＭＨＣＯ３、Ｍｇ５Ｏ，。

ＣａＣＱ、、ＣａＣｌ２２・２Ｈ７Ｏなとの形で用いら
れるＣｆｆ−イオン、Ｃａ”＋イオン、Ｍｇ”＋イオン
などを加えてもよい。これらの添加成分は１種用いても
よいし、２種以上を組み合わせて用いてもよく、また、
前記系調製の適当な段階で加えてもよい。

本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で用いても
よいし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙など
に含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬を
用いることにより、各種の試料に含有されるα−アミラ
ーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定する
ことができる。

次に、本発明のα−アミラーゼ活性の測定方法の好適な
１例について説明すると、先ず、α−アミラーゼを含む
試料に、共役酵素としてのび一グルコンダーゼ及び／又
はグルコアミラーゼをそれぞれ１５〜１５０単位／ｍＱ
、好ましくは３０−７０単位／ｍＱ加え、前記一般式（
Ｉ）で表わされる３、６−アンヒトロマルトオリゴシド
誘導体がβ−アノマーを含む場合は、さらにβ−グルコ
シダーゼを３〜３０単位／ｍＱ、好ましくは５〜１５単
位／ｍＱ加え、同時又は順次に誘導体ｌ〜２０ｍＭ、好
ましくは２〜５ｍＭ及び緩衝剤を添加したのち、温度２
５〜５０°Ｃ，ｐＨ４〜１０の条件にて１分間以上、好
ましくは２〜６０分間酵素反応させ、次いで生成する芳
香族発色性化合物を常法によりそのままあるいは必要に
よりｐＨを変化させたのち、又は縮合反応を行ったのち
に、適当な吸光波長で連続的若しくは断続的に吸光度値
を測定し、あらかじめ測定したα−アミラーゼ標品の吸
光度値と対比させて試料中のα−アミラーゼ活性を算出
する。

本発明に用いられるα−アミラーゼ含有試料については
、α−アミラーゼを含有するものであれはよく、特に制
限はないが、具体的には微生物の培養液、植物の抽出液
、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液などを
用いることができる。

σ−アミラーゼ含有試料が固体の場合には、いったん緩
衝液に溶解又は懸濁させるのがよい。また必要に応じ、
ろ過して不溶物を除去してもよい。

この緩衝剤としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩
、トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ホウ
酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げら
れる。

発明の効果 本発明の前記一般式（１）で表わされる３、６−アンヒ
トロマルトオリゴシド誘導体は、新規な化合物であって
、α−アミラーゼ活性測定用試薬として極めて有用であ
り、このものを用いることにより、試料中に含まれるグ
ルコース、マルトース、ビリルビン、ヘモグロビンなど
の影響を受けることなく、α−アミラーゼ活性を自動分
析法、用手法なとにより、精度よく短時間で容易に測定
することができる上に、共役酵素を共存させても長期間
にわたって安定状態を維持しうるという利点がある。

実施例 次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。

市販の２−クロロ−４−二トロフェニル＝β−Ｄ−マル
トペンタオシド（第一化学薬品社製）　１５．ｈ（１５
，２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ２２５＋＋＋（２に溶解し
、ベンズアルデヒドジメチルアセタール１１．４ｍＱ（
７６，０ｍｍｏｌ）とトシル酸２．２５ｇ（１１，４ｍ
ｍｏｌ）を加え、４０°Ｃで４時間かきまぜなから反応
させた。次いで、この反応液を氷水１．２Ｑ中へかきま
ぜながらゆっくりと滴下した。

これに飽和重炭酸ナトリウム水溶液を水冷下かきまぜな
がらゆっくりと加えて中和し、次いでこの混合液をジク
ロロメタン３００ｍＱで３回洗浄したのち、水層部を濃
縮し、ＤＭＦと水を留去した。次いで残渣をＯＤＳカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、エタノール−水混
液（容量比２：３）で溶出した目的区分を濃縮し、イン
プロパノ−ルーメタノールから再結晶して２−クロロ−
４−ニトロフェニル−４’、６５−ベンジリデン−β−
Ｄ−マルトペンタオンド１１．２ｇ（１０，４ｍｍｏｌ
　、収率６８．３％）を得た。

融点（’Ｏ）　　：　１９６．０〜２００．０紫外部・
可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ：″”：’、’　　］　（ｎｍ）　＝
　２９２（ｌｏｇｔ　＝３．９０） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）　：　３４１０．２９
４０．１６３０゜１５８６、１５２０．１４８６．１３
５０．１２７４．１１５２．１０７４．１０２８　。

９３０．８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤｚＯ
）　：３．２０〜５−５−７０（，５，０５（２Ｈ，ｄ
、Ｊ−３，４Ｈｚ）、５．１２（ＩＨ，ｄ、Ｊ−４，４
Ｈｚ）、５．１３（ｌ　Ｈ，ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ）。

５．２５（ｌ　Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　７．６Ｈｚ）、５．５
６（ｌ　Ｈ，ｓ）、７．３３−７．５５（５Ｈ，ｍ）、
７．３５（ｌ　Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　９．０Ｈｚ）、８．１
４（Ｉ　Ｈ。

ｄｄ、Ｊ　−９，０Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８−２９（ｌ
　Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラ
フィー［束ンー（株）製ＴＳＫｇｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８
０カラム（４，６ｍｍ　ＩＤＸ　２５０＋＋＋ｍ）。

ＵＶ２ａＯ，、、検出、溶離液ニアセトニトリル／水−
３／１（Ｖ／Ｖ）　、流速：１．ＯｍＱ／ｍｉｎ］　：
　’Ｒ＝４．８ｍ１ｎ（１）で得た２−クロロ−４−二
トロンエニルー４５．６５−ベンジリデン−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド１３．３ｇ（１２，４ｍｍｏｌ）をピ
リジン２００ｍＱに溶解し、無水酢酸１００＋＋＋＜１
（１，２８ｍｏ＋）を加え、室温で２日間反応させた。

次いで、この反応液を減圧下濃縮し、ピリジン、無水酢
酸、酢酸を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、メタノール−ジクロロメ
タン混液（容量比２：９８）で溶出した目的区分を濃縮
し、エタノールから再結晶して２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−テトラゾカー０−アセチル−４″、６ｓ−ベ
ンジリデン−β−Ｄ−マルトペンタオシド１８．１ｇ（
１０，９ｍｍｏｌ　、収率８７．９％）を得た。

融点（°Ｏ）　：　１３０．０−１３５．０紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ：”：ｆ、’　］（ｎｍ）＝　２９２
（１０９ｔ　＝３．９０） 赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）　：　３４１０，２９
４０，１６３０゜１５８６．１５２０．１４８６．１３
５０，１２７４，１１５２．１０７４゜１０２８．９３
０，８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
Ｑ、）　：２．０Ｏ−２−２１（４２Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ
）、３．５５−４．９０（ｍ）。

５．１５−５．５０（ｍ）、７．３０（ＩＨ，ａ、Ｊ　
＝　９．２Ｈｚ）。

７．２６〜７．４１（５Ｈ，ｍ）、８．１７（ＩＨ，ｄ
ｄ、Ｊ　＝　９．２Ｈｚ。

２．７Ｈｚ）、８．３０（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝　２．７Ｈｚ
）高速液体クロマトグラフィー［ナカライテスクＣ株）
製Ｃ０５ＭＯ５Ｉ　ＬＣＩａカラムＣ４，６ｒｎｍ　Ｉ
ＤＸ　１５ｆ）ｍｍ）。

ＵＶ、、。１．検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝３
／ｌ（Ｖ／Ｖ）、流速：１．Ｏｍ＋２／ｍ１ｎｌ　：’
Ｒ＝７．７ｍ１ｎ比旋光度（［α］”）　：　（ｃ　Ｏ
，２５，１，４−ジオキサン）；＋８４゜ （２）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−テトラ
ゾカー〇−アセチル−４’、６’−ベンジリデン−β−
Ｄ−マルトペンタオシド２．９９９　（１，８０ｍｍｏ
ｌ）を四塩化炭素１２０ｍ（２と１．１，２．２−テト
ラクロロエタン１２０ｍ１２との混合溶媒に溶解し、炭
酸バリウム３．５６９　（１８，０ｍｍｏｌ）を加え、
かきまぜながら加温して還流させ、次いでこの還流液に
Ｎ−ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ）４２７ｍｇ（２，
４０ｍｍｏｌ）を加え、還流させながら１時間反応させ
る。この反応液を室温まで冷却したのち、不溶物をろ別
し、次いでろ液に含まれる四塩化炭素と１．１，２．２
−テトラクロロエタンを減圧留去した。

次にこの残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィによ
り精製し、ジクロロメタン−酢酸エチル−メタノール混
合液（容量比９９：２５：ｌ）で溶出した目的区分を濃
縮すると、２−クロロ−４−ニトロフェニル＝テトラゾ
カーＯ−アセチル−４５−Ｏ−ベンゾイル−６”プロモ
ーβ−Ｄ−マルトペンタオシドが２．７１ｇ（１，５６
ｍｍｏ　ｌ、収率８６．５％）得られた。このものの性
質は次のとおりである。

融点（°Ｃ）　：　１２１．５〜１２３．５紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ亭’、’　］（ｎｍ）＝２８０　（ｌ
ｏｇ＋＝４．０２）、　　２２９（Ｉｏｇｃ＝４．３７
）、　　２１３（ｓｈ）、２０３（ｌｏｇ＜＝４．３３
） 赤外吸収スペクトルＣｃｍ−１）：　３４７０，１７５
６，１５３２゜１３７２、　＋２３４．１０３４，８９
４，７１４，６０２核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨ
ｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣＩ２．）　：１．９０−２．２１（
４２８，ｅａｃｈ　ｓ）、３．４１（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝
１２．０Ｈｚ、５．５Ｈｚ）、３．５１（ＩＨ，ｄｄ、
Ｊ　＝　１２．０Ｈｚ。

２．３Ｈｚ）、３．８８−４．９５（ｍ）、５．１８−
５．６１（ｍ）、７．２９（ＬＨ，ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ
）、７．４６（２Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝７．５１（ｚ、７．５
Ｈｚ）、７．６０（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝　７．５Ｈｚ、７
．５Ｈｚ）、８．００（２Ｈ。

ｂｒｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ）、８．１７（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ
＝９．０Ｈｚ、２．８Ｈｚ）、８’、３０（ｌ）ｌ、ｄ
、Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィー〔デカ
ライテスク（株）製ＣＯ５ＭＯＳ　Ｉ　ＬＣｒ　ａカラ
ム（４，６ｍｍ１ＤＸ　１５０ｍｍ）。

ＵＶ２８゜ｎｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝７
：３（ｖ／ｖ）、流速：１．Ｏｍ４／ｍ１ｎ）　：’Ｒ
＝１６．３ｍ１ｎ比施光度Ｃ［ａ　］”）：（ｃ　Ｏ，
５０，１，４−ジオキサン）；＋　７５．４゜ （３）で得た２−クロロ−４−二トロフェニル＝テトラ
ゾカー０−アセチル−４６−Ｏ−ベンゾイル−６５−ブ
ロモ−β−Ｄ−マルトペンタオシド２．７１９（１，５
６ｍｍｏｌ）をＨＭＰＡ１００ｍ１２に溶解し、ＮａＢ
ＨｓＣＮ　１．８２ｇ（２９，０ｍｍｏｌ）を加え、７
０°Ｃで３時間、かきまぜながら反応させ、次いでこの
反応液をトルエン５００ｍＱ中へゆっくりと滴下したの
ち、この混合液を水３００ｍ１２で３回洗浄した。次い
でトルエン層部を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別した
のち、ろ液を減圧下濃縮し、トルエンを留去したのち、
この残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより
精製し、ジクロロメタン−酢酸エチル−メタノール混合
液（容量比９９：２５：ｌ）で溶出した目的区分を濃縮
すると、２−クロロ−４−二トロフェニルートリデ力−
〇−アセチル−３５，６’−アンヒドロ−４ｓ−０−ベ
ンゾイル−β−Ｄ−マルトペンタオシドが２．４３ｇ（
１，５０ｍｍｏｌ　、収率９６．５％）得られた。この
ものの性質は次のとおりである。

融点（’Ｃ）：１０９．０〜１１１．０紫外部・可視部
吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ：心”　］（ｎｆｆｉ）−２８１（ｌ
ｏｇε＝３．９９）、２２９（ｌｏｇ　ｔ　＝　４．３
１）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）：３４７０．１７
５２．１５３０゜１３７０．１２３４．１０３０．８９
８，７９２，７３８，７１４．６００核磁気共鳴スペク
トル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣｆｆｓ）：２．０
０−２．２１（３９Ｈ，ｍ）、３．６０−３．６３（２
Ｈ，ｍ）、３．８５−４．９５（ｍ）、５．０５−５．
６２（ｍ）、７．２８（ＩＨ，ｄ、Ｊ−９，０Ｈｚ）、
７．４６（２Ｈ，ｄｄ、Ｊ＝　７．６Ｈｚ、７．６Ｈｚ
）、７．６０（ＬＨ。

ｄｄ、Ｊ＝　７．６Ｈｚ、７．６Ｈｚ）、８．００（２
Ｈ，ｄ、Ｊ＝　７．６Ｈｚ）。

８．１７（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝　９．０Ｈｚ、２．７Ｈｚ
）、８．３０（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー〔デカライテスク（株）製
ＣＯ５ＭＯＳ　Ｉ　ＬＣｒ　ａカラム（４，６ｍｍ１Ｄ
ｘ　１５０ｍｍ）。

Ｕｖｚ、。ｎｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝７
：　３（ｖ／ｖ）、流速：１．Ｏｍ（Ｌ／ｍ１ｎ）　：
’Ｒ＝１５．３ｍ１ｎ比施光度（［α］”）：（ｃ　Ｏ
，５２，１，４−ジオキサン）；＋　７０．２゜ （４）で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル＝トリデ
カ−〇−アセチルー３’、６’−アンヒドロ−４Ｓ−０
−ベンゾイル−β−Ｄ−マルトペンタオシド２．２２ｇ
（１，３７ｍｍｏｌ）をメタノール７０ｍＱに溶解し、
炭酸カリウム３８０＋ｎｇ（２，７５ｍｍｏｌ）を加え
、２５°Ｃで５時間、かきまぜながら反応させたのち、
反応液を減圧下濃縮し、ここに含まれるメタノールを留
去した。次いでその残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフ
ィーにより精製し、エタノール−水混液（容量比ｌ：３
）で溶出した目的区分を濃縮すると、２−クロロ−４−
ニトロフェニル＝３’、６’−アンヒドロ−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシドが９３８＋ＩＩｇ（０，９７１ｍｍｏ
ｌ　、収率７０．９％）得られる。

このものの性質は次のとおりである。

融点（℃）：１８５〜１８７（分解） 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ：：ｇ’］（ｎｍ）−２９１（ｌｏｇ
ε−３，９６）、２２８（ｓｈ）、２０９（ｌｏｇε＝
４．１６）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）　：　３４
２０．２９２０．１６２８゜１５８６．１５２０．１４
８４．１３４８．１２７４．１１５０，１０２４核磁気
共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤｚＯ）：３
．４１〜４．１５（ｍ）、５．２９（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝　
７．６Ｈｚ）、５．３４〜５．３８（３Ｈ，ｍ）、５．
４１（ＩＨ，ｄ、Ｊ　−３，９Ｈｚ）、７．３９（ｌＨ
，ｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ）、８．２１（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ
　＝　９．３Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８．３７（ＩＨ，ｄ
、Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８０カラム（４，６ｍｍ１Ｄｘ　２
５０ｍｍ）。

ＵＶ２８゜ｎｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝　
３　：　ｌ（ｖ／　ｖ）、流速：１．ＯｍＱ／ｍ１ｎ）
　：’Ｒ＝７．５ｍ１ｎ元素分析値：　Ｃｓ＊ＨｓｚＣ
ＱＮＯ２ｒとしてＨ 理論値（％’）　　　４４．７５　５．４２　１．４５
実測値（％）　　　４４．７７　５．４８　１．４４比
施光度（［α］”）：（ｃ　Ｏ，５０８，Ｈ，０）；＋
９２．４゜市販の２１０ロー４−ニトロフェニル讃β−
Ｄ−マルトヘプタオシド（関東化学（株）製）５−Ｏｇ
（３，８２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ７５１１１Ｑに溶解
し、ベンズアルデヒドジメチルアセタール２．３０ｍ１
２（１５，３ｍｍｏｌ）及びトシル酸６２５＋＋＋ｇ（
３，６３ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で４時間、かきまぜ
ながら反応させたのち、この反応液を氷水４００ｍＱ中
へ、かきまぜながらゆっくりと滴下した。

ここへ飽和重炭酸ナトリウム水溶液を水冷下、かきまぜ
ながらゆっくりと加えて中和し、次いでこの混合液をジ
クロロメタン１００Ｉｌａで３回洗浄したのち、水層部
を濃縮し、ここに含まれるＤＭＦと水を留去した。この
残渣をＯＤＳカラムクロマトグラフィーにより精製し、
エタノール−水混液（容量比３ニア）で溶出した目的区
分を濃縮し、インプロパノ−ルーメタノールから再結晶
すると、２−クロロ−４−ニトロフェニル−４ｔ、６ｙ
−ベンジリチン−β−Ｄ−マルトヘプタオシドが２．３
５１？　（１，６８ｍｍｏｌ、収率４４．０％）得られ
た。このものの物性は次のとおりである。

融点（℃）　：　２０１〜２０２．５ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ：：（１８］　（ｎｍ）　−２９５（
ｌｏｇ　ｔ　＝３．９８）、２２９（ｓｈ）、２０８（
ｌｏｇ　ｔ　＝　４．３６）赤外吸収スペクトル（ｃｍ
−→：３４２０，２９３０，１６３０゜１５８６．１５
２２．１４ｇ６．１３４８，１２７６．１１５０，１０
７８．１０２６核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）
ｐｐｍ（Ｄ、Ｏ）：３．５０−４．４５（ｍ）、５．１
９〜５．３５（７Ｈ，ｍ）、５．６２（ｌＨ，ｓ）。

７．２９（ＩＨ，ｄ、Ｊ　−９，３Ｈｚ）、７．４１−
７．４６（５Ｈ，ｍ）。

８．１５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝９．３Ｈｚ、２．７Ｈｚ）
、８．２７（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８０カラム（４，６ｍｍ１ＤＸ　２
５０＋ｕ＋）。

ＵＶ２．。ｎｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝３
：　ｌ（ｖ／ｖ）、流速：１．ＯｍＱ／ｍ１ｎ）　：’
Ｒ−５，８ｍ１ｎ（１）で得た２−クロロ−４−ニトロ
フェニル−４’、６’−ベンジリデン−β−Ｄ−マルト
ヘプタオシド２．２０ｇ（１，５８ｍｍｏｌ）をピリジ
ン８０−に溶解し、無水酢酸４０　＋ａＫ５１２ｍｍｏ
ｌ）を加え、室温で２日間反応させたのち、次いで反応
液を減圧下濃縮し、ここに含まれるピリジン、無水酢酸
、酢酸を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーにより精製し、メタノール−ジクロロメタ
ン混液（容量比２：９８）で溶出した目的区分を濃縮し
、エタノールから再結晶とすると、２−クロロ−４−ニ
トロフェニル＝エイコサーＯ−アセチル−４’、６’−
ベンジリデン−β−Ｄ−マルトヘプタオシドが３．４８
９（１，５５ｍｍｏｌ、収率９８．８％）得られた。こ
のものの性質は次のとおりである。

融点（℃）：１３４．０〜１３６．０ 紫外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ手’、Ｎ］（ｎｍ）−２８３（ｌｏｇ
ｔ　−３，９８）、２２８（ｓｈ）、２０７（ｌｏｇ　
ｔ　−４，３９）赤外吸収スペクトル（ｃｍ””）：３
４６０．２９５０．１７５２゜１５８６．１５２８．１
４８４．１４３０．１３７０．１３４８．１２３６．１
０３４゜９００．７５０．７０２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
ａ、）：１．９８〜２．２０（６０Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ）
、３．５６−５．５５（ｍ）、７．２６−７．４５（６
Ｈ，ｍ）、８．１６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ　＝　９．１Ｈｚ
、２．７Ｈｚ）。

８．２９（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマ
トグラフィー〔デカライテスク（株）製Ｃ０５Ｍ０５Ｉ
Ｌ（＋　ｓカラム（４，６間ＩＤＸ１５０問）。

ＵＶ、、。ｎｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝３
：　ｌ（ｖ／ｖ）、流速：１．Ｏｓ＋１２／ｍ１ｎ）　
：Ｒ−１０，６ｍ１ｎ比施光度（［α］”）：（ｃ　１
．０３．１．４−ジオキサン）；＋　１０９．６゜ （２）テ得り２−クロロ−４−ニトロフェニル＝エイフ
サー〇−アセチルー４’、６’−ベンジリデン−β−Ｄ
−マルトヘプタオシド３．３８９　（１，５１ｍｍｏｌ
）を、四塩化炭素１４０＋１１７２と１．１，２．２−
テトラクロロエタン１４０ｍｆｆとの混合溶媒中に溶解
させ、炭酸バリウム２．９９ｇ（１５，１ｍｍｏｌ）を
加え、かきまぜながら加温して還流させ、次いでこの還
流液にＮ−ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ）３５１ｍ９
（２，２７ｍｍｏ４）を加え、還流させたまま１時間反
応させた。この反応液を室温まで冷却したのち、不溶物
をろ別し、次いでろ液に含まれる四塩化炭素と１．１，
２．２−テトラクロロエタンを減圧留去した。

次にこの残渣中に含まれる２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝エイコサーＯ−アセチル−４７−Ｏ−ペンソイル
−６フーブロモーβ−Ｄ−マルトヘプタオシドを単離す
ることなく、そのままＨＭＰＡＩＯ（ｈ＋＋ｆ２に溶解
し、ＮａＢＨｓＣＮｌ、９０ｇ（３０，３ｍｍｏｌ）を
加え、７０℃で３時間、かきまぜながら反応させ、次い
でこの反応液をトルエン５００ｍＱ中へ、ゆっくりと滴
下したのち、この混合液を水３００ｍＱで３回洗浄した
。次いでトルエン層部を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
ろ別したのち、ろ液を減圧下濃縮し、トルエンを留去し
た。この残渣中に含まれる２・クロロ−４−ニトロフェ
ニル＝ノナデカー〇−アセチル−３’、６’−アンヒド
ロ−４７−Ｏ−ベンゾイル−β−Ｄ−マルトヘプタオシ
ドを単離することなく、そのままメタノール６０ｒｔｒ
Ｑに溶解し、炭酸カリウム８４．６＋＋＋９（０，６１
３ｍｍｏｌ）を加え、２５°Ｃで５時間、かきまぜなが
ら反応させたのち、反応液を減圧下濃縮し、ここに含ま
れるメタノールを留去した。次いでその残渣をＯＤＳカ
ラムクロマトグラフィーにより精製し、エタノール−水
混液（容量比ｌ：３）で溶出した目的区分を濃縮すると
、２−クロロ−４−ニトロフェニル−３’、６’−７’
　ンヒトｏ−β−Ｄ−マルトヘプタオシドが５１７ｍ５
　（０，４０１ｍｍｏｌ、収率２６．５％）得られた。

このものの性質は次のとおりである。

融点（’Ｏ）：２０８〜２１０（分解）紫外部・可視部
吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ：：Ｃ：Ｈ］（ｎｍ）＝２９２（ｌｏ
ｇε＝３．９６）、２２９（ｓｈ）、２０９（ｌｏｇ　
ｔ　−４，１７）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）：３
４００．２９２０，１５８４゜１５２０．１４８４，１
３４８．１２７２．１１５０，１０２２核磁気共鳴スペ
クトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤｚＯ）　：　３．４
５−４．２０（ｍ）、５．３０−５．４３（７Ｈ，ｍ）
、７．４０（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝９．３Ｈｚ）、８−２２
（Ｉｎ、ｄｄ、Ｊ　＝　９−３Ｈｚ、２．４Ｈｚ）、８
．３９（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝２．４Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー〔東ソー（株）製ＴＳＫｇ
ｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８０カラム（４，６＋ｎ＋＋＋ＩＤ
Ｘ　１５０＋＋ｍ）。

ＵＶ２ｓｏｎｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水＝３
：　１（ｖ／ｖ）、流速：１．Ｏ＋ｎ１２／ｍ１ｎ）　
：’Ｒ＝２０．６ｍ１ｎ元素分析値：　Ｃ，、Ｈ，□Ｃ
ｌ２ＮＯ，，としてＨＮ 理論値（％）　　　４４．６７　５．６２　１．０９実
測値（％）４４．５９　５．６８　１．０７実８例１で
得た２−クロロ−４−二トロフェニル＝３Ｓ６５−アン
ヒドロ−β−Ｄ−マルトヘプタオシド１００ｍｇをとり
、５０　ｍＭＮａｃｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝７．０）を加えて全量を２５ｍ１２として基質液を調
製した。

（２）共役酵素液の調製 ５０　ｍＭＮａｃｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝
７．０）に市販の酵母由来のび一グルコシダーゼ、市販
のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼをそれぞれ１１
７００Ｕ及び１３７０ｕ加えて全量１００ｍ１２として
共役酵素液を調製した。

（３）試薬液の調製 基質液及び共役酵素液をそれぞれ容量比２：１で良く混
合し、試薬液を調製した。

（４）標品ａ−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来のσ−アミラーゼ（Ｐ：Ｓ＝１：１）を
５０　ｍＭＮａｃｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝
　７．０）に加え、０１２５．５０．１００．１５０．
２００．３００Ｕ／Ｑの濃度に溶解して標品アミラーゼ
液を調製しＩこ。

（５）試料液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とした。固体の場合は試料５００ｍｇを正確に秤
量し、５０　ｍＭＮａｃｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ＝　７．０）を加えて全量を５ｍ（ｔとして試料液
を調製した。

（６）検量線の作成 試薬液３．ＯｍＱを３７°Ｃで３分間加温したのち、標
品α−アミラーゼ液３００μＱを加えてかきまぜ、さら
に３７°Ｃで２分間加温後からの２分間の４００ｎｍに
おける吸光度の増加量を測定し、標品ａ−アミラーゼ液
活性と吸光度の増加量関係より検量線を作成した。国際
試薬（株）製標品σ−アミラーゼ（キャブリザイム・Ａ
ＭＹ）を使用した場合、検量線の式は Ｕ　＝３．６３　・ΔＡＸ１０２＋１．０Ｏ（Ｕ；酵素
活性Ｕ／Ｑ、ΔＡ；吸光度の増加量）となる。そのグラ
フを第１図に示す。

（７）試料液中のα−アミラーゼ活性の測定試薬液３．
ＯｍＱを３７°Ｃで３分間加温したのち、試料液３００
μＱを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温後からの２
分間の４００ｎｍにおける吸光度の増加量を測定した。

この測定値と（６）で作成した検量線から算出して試料
液中のａ−アミラーゼ活性を測定することができる。な
お、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（０〜
３００Ｕ／ｆｆ）を越えた場合は５０　ｍＭＮａｃＩ含
有５０ｍ含有５冫のち、再測定を行う。

実施例４ 本発明の化合物が測定系内で安定に存在することを実証
するために、非還元末端非修飾体を対照として下記の試
験方法に従って、共役酵素液との反応を行った。

［試験方法］ ＵユＬｉ藍０立１皇（本発明基質） 実施例１で得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−３’
，６５ーアンヒドロ−βーＤーマルトペンタオシド１０
０ｍｇをとり、５　０　ｍＭＮａｃｌ含有５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を加えて全量を２５ｍＱとし
て基質液■を調製した。

（２）基質液■の調製（対照基質） 市販（７）２−クロロ−４−ニトロフェニル士β−Ｄ−
マルトペンタオシド１００ｍｇをとり、５　０　ｍＭＮ
ａｃＩ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）を加
えて全量を２５＋＋＋１２として基質液■を調製した。

（３）共役酵素液の調製 ５　０　ｍＭＮａｃｌ含有５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝　７．０）に市販の酵母由来のａ−グルコシダーゼ、
市販のアーモンド由来のβ−グルコシダーゼをそれぞれ
１１７００Ｕ及び１３７Ｕ加えて全量をｌｏｍＱとして
共役酵素液を調製した。

（４）共役酵素反応 基質液の、■及び共役酵素液を３７°Ｃで３分間加温し
たのち、基質液■及び■をそれぞれ基質液：共役酵素液
＝２：ｌ（容量比）でよく混合し、さらに３７°Ｃで２
分間加温した後からの５分間、４００ｎｍにおける吸光
度の増加量（ΔＡ）を測定した。

その結果を第２図に示す。第２図において目印は基質液
の、△印は基質液■によるものである。

この第２図から、本発明基質は共役酵素と反応すること
なく、測定系内で安定に存在することが分かる。

実施例５　測定試薬 （１）試薬の構成 精製水に以下の成分を、以下の濃度で溶解することによ
り、試薬Ａ及び試薬Ｂを調製した。

アンヒドロ−β−Ｄ−マルトペンタオシド　２．０ｍＭ
σーグルコシダーゼ　　　　　　　　　　６００／＋＋
＋Ｉ２β−グルコシダーゼ　　　　　　　　　　１００
／ｍ１２β−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）　
　　１０ｍＭＮａＣ１　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４０ｍＭウシ血清アルブミン　　　　　　　　　
０．０５％成　　　分　　　　　　　　　　　摸二」黒
試薬Ｂ：βーグリセロリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．０）　
　　１０ｍＭウシ血清アルブミン　　　　　　　　　０
．０５％ＮａＣ１　　　　　　　　　　　　　　　　　
４０ｍＭ（２）測定法 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とした。固体
の場合は試料５０ｋを正確に秤量し、試薬Ｂを加えて全
量を５ｍＱとして試料液とした。次いで試薬Ａ３．Ｏｍ
Ｑを３７°Ｃで３分間加温したのち、試料液３００μａ
を加えてかきまぜ、さらに３７°０で２分間加温後から
の２分間の４００ｎｍにおける吸光度の増加量を測定し
た。この測定値とあらかじめ作成した検量線から算出し
て試料液中のａ−アミラーゼ活性を測定することができ
る。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲
（０〜３００Ｕ／ｆｆ）を越えた場合は試薬Ｂを用いて
相当する倍数の希釈を行ったのち、再測定を行う。

【図面の簡単な説明】

第１図は、σ−アミラーゼ活性の測定に用いる検量線を
示すグラフ、第２図は本発明基質と対照基質との測定系
内における安定性を示すグラフである。 第１図 吸光度増加量（ＪＡ） 第２図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲは芳香族発色性基であり、ｎは１〜６の整数
   である） で表わされる３，６−アンヒドロマルトオリゴシド誘導
   体。 ２　請求項１記載の３，６−アンヒドロマルトオリゴシ
   ド誘導体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試
   薬。 ３　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載の３，６
   −アンヒドロマルトオリゴシド誘導体のα−アノマーと
   、α−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを添
   加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化合物
   を定量することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定
   方法。 ４　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載の３，６
   −アンヒドロマルトオリゴシド誘導体のβ−アノマー又
   はα−アノマーとβ−アノマーとの混合物と、α−グル
   コシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼ並びにβ−グル
   コシダーゼを添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香
   族発色性化合物を定量することを特徴とするα−アミラ
   ーゼ活性の測定方法。