JPH0253491A - ベクター及びその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ベクター及びその利用方法に関する。

［従来の技術］ 植物ウィルスの分野でサテライトと称されるものは、分
子量が０．１〜０．５Ｘ１０’ダルトンの比較的低分子
で、ヘルパーウィルス（親ウィルス）のゲノムＲＮＡと
ほとんどホモロジーがないことが知られている。

このような植物ウィルスのサテライトと称されるものは
、２種類ある。

１つは、サテライトＲＮＡが自らコードする外被タンパ
クによってコートされているサテライトウィルスで、例
えば、タバコネクロシスサテライトウイルス（ＳＴＮＶ
）　、バニカムモザイクサテライトウイルス（ＳＰＭＶ
）　、タバコモザイクサテライトウィルス（ＳＴＭＶ）
がこれに属する。

もう１つは、ヘルパーウィルス粒子中に含有されている
サテライトＲＮＡで、数多くの低分子ＲＮＡがこれに属
し、代表的なものにはキュウリモザイクウィルス（ＣＭ
Ｖ）サテライトＲＮＡやタバコ軸点ウィルス（ＳＴｏｂ
ＲＶ）サテライトＲＮＡ等があり、分子レベルの研究が
盛んに行なわれている。

特に、ＣＭＶサテライトＲＮＡでは、いくつかの系統の
塩基配列が決定され、報告されている［例えば、Ｈｉｄ
ａｋａ　ｅｔ　ａｌ、　：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ
　１７４．ｐ３８−４２（１９８４）；　Ｇａｒｃｉａ
−Ａｒｅｎａｌ　ｅｔ　ａｌ、：　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１
５８、ρ３３９−３４７（１９８７）］　　。

また、ＣＭＶサテライトＲＮＡの完全長ｃＤＮＡをＤＮ
Ａ転写ベクターに挿入し、ＲＮＡポリメラーゼによって
試験管内で感染性のある転写産物を作出することに成功
している［Ｃｏｌ１ｍｅｒ＆Ｋａｐｅｒ：ＢＢＲＣ１３
５，ｐ２９０−２９６（１９８６）；　Ｍａｓｕｔａ　
ｅｔ　ａｌ、　：Ｎｕｃｌ。

＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、１５．ｐ１０４８（１９８７）；
　Ｋｕｒａｔｈ＆ＰａｌｕｋａｉｔｉｓＶｉｒｏ１ｏｇ
ｙ　１５９．ｐ１９９−２０８（１９８７）コ　。

［発明が解決しようとする課題］ ところで、植物ＲＮＡウィルスをベクターとして改変す
ることによって植物細胞中に外来ＲＮＡ断片を導入しよ
うとする実際的な試みには、これまでブロモモザイクウ
ィルス（ＢＭＶ）ＲＮＡ３［Ｆｒｅｎｃｈ　ｅｔ　ａｌ
、　：５ｃｉｅｎｃｅ　２３１．　ｐ１２９４−１２９
７（１９８６＞　］と、タバコモザイクウィルス（ＴＭ
Ｖ）ＲＮＡ　［Ｔａｋａｍａｔｓｕ　ｅｔ　ａｌ、　：
ＥＭＢＯＪ、　６．　Ｐ２Ｏ３−３１，１＜１９８７）
　］の２例があり、いずれも、コートタンパク遺伝子領
域をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）遺伝子で置換した組換え転写ベクターを作出
している。

しかし、前者の場合には、プロトプラストへの接種にと
どまり、宿主である大麦を感染させるまでにはいたらな
かった。

また、後者においては、タバコに接種することには成功
したが、接種葉から全身移行しないことが判明している
。

さらに、どちらの場合にも複製能が天然のものに比べ１
０−２〜１０づに低下していた。

上述したような問題点は、実際上、ＲＮＡベクターを利
用して植物の形質転換をしたり有用タンパクを生産した
りする場合には致命的な欠点となる。

すなわち、植物ＲＮＡウィルスをベクターとして用いる
ためには、次の点を満足させる必要がある。

■　植物細胞において複製能が高い。

■　ウィルス核酸に外来ＤＮＡ断片を挿入しても生物活
性を維持できる。

■　全身感染することが望ましい。

■　なるべく広く宿主範囲をもつ２ 本発明の目的は、ベクターとして要求される条件を満足
し、形質転換や有用タンパクの生産を有効に行なうこと
ができるものを提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、植物ウィルスのサテライトＲＮＡからなるベ
クターに関するものである。

ベクターの横築は、サテライトの複製能をなるべく保持
したまま外来ＲＮＡ断片を挿入して、キメリックなＲＮ
Ａ分子に改変することであり、具体的にはサテライトの
５′末端配列と３°末端配列との間に外来ＲＮＡをメツ
センジャーセンスで複製されるように接続することによ
って達成される。

次に、本発明を宿主範囲の極めて広いＣＭ’Ｖのサテラ
イトＲＮＡ　（Ｙ系統）の改変を例に挙げて説明する。

第４図に塩基配列を、それぞれ示す。

ＣＭＶサテライトＲＮ　Ａ　４！　ＣＭ　Ｖの存在下旺
盛に複製し、ＣＭＶゲノムＲＮＡと複製酵素を競合して
ゲノムＲＮＡの増殖に拮抗し、多くの場合、ＣＭＶの磨
機を軽い方向に導く。

その塩基配列の解析からいくつかオーブンリーディング
フレーム（ＯＲＦ＞が推定されるが、これまで植物体か
ら実際にそれらＯＲＦからの産物〈タンパク）が検出さ
れたという実証例はない。

もし、ＣＭＶサテライトＲＮＡが機能タンパクを何もコ
ードしていないのであれば、外来ＲＮＡ断片の挿入によ
って破壊されるＯＲＦは存在しないことになり、ベクタ
ーとして改変するのに好都合といえる。

本発明のベクターは、ＣＭＶサテライトＲＮＡの複製能
をなるべく損なわないように外来ＲＮＡ断片を組み込む
ことによって作出できる。

以下、具体的工程を示す。

（１）ＣＭＶサテライトＦＬＮＡの完全長ｃＤＮＡを合
成する。

（２）そのｃＤＮＡをＤＮＡ転写ベクターに組み込む。

（３）試験管内転写によって感染性のあるＲＮＡを再生
する。

（４）ｃＤＮＡの中央部の配列を制限酵素で切除し、外
来ＤＮＡ断片を挿入する。

（５）ＦｔＮＡポリメラーゼによって試験管内転写反応
を行なう。

（６）上記転写産物とＣＭＶを植物葉に同時接種する。

ＣＭＶサテライトＲＮＡとｃＤＮＡから試験管内で感染
性転写産物を合成するには、天然サテライトが５′末端
に有しているキャップ構造を付加する必要はない。

しかし、転写産物の５′末端あるいは３′末端に転写ベ
クター由来の非ウィルス配列が付加された場合、転写産
物の感染性は著しく減少する。

５°末端になるべく余分な配列を付加しないために、転
写ベクターとしてｐＵＴ１１８やｐＵＴ１１８ＧＧを使
用することができる［薬用ら：昭和６３年度日本植物病
理学会大会講演要旨集（１９８８年４月）］。

ｐＵＴ１１８は、挿入されたサテライトの５゜末端に２
個の塩基を付加する。

また、市販の転写ベクターを使用するなど、長い余分な
塩基が付加された場合であっても、その非ウィルス配列
部分に相補的なデオキシオリゴヌクレオチドを合成し、
転写ＲＮＡとアニールさせた後、ＲＮａｓｅＨによって
感染性サテライトを得ることができる［Ｍａｓｕｔａ　
ｅｔ　ａ＋、　：Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ。

Ｒｅｓ、１５．ｐ１００４８（１９８７）コ　。

また、ＲＮＡの３′末端については、ＣＭＶサテライト
ＲＮＡが−ＣＣＣＯＨで終了することから転写ベクター
のＳｍａ１部位に挿入すると、ＳｍａＩの認識配列が保
存される。

したがって、Ｓｍａｌで線状化された組換転写ベクター
からのランオフ転写産物の３′末端には余分なヌクレチ
ドが全く付加されない。

他のサテライトを使用した場合でも、なるべく３°末端
に多くの非ウィルス塩基を付加し、ないようにｃＤＮＡ
の３′末端の直後に適当な制限酵素部位を設けるなどの
工夫をすることが望ましい。

本発明においてベクターとして使用するウィルスがサテ
ライトであるためヘルパーウィルスとの同時接種が必須
である。

植物に対して激しい磨機が生じないよう弱毒系を用いる
ことが望ましい。

ＣＭＶサテライトＲＮＡの完全長ｃＤＮＡは、（＋）鎖
及び（−）鎖の３°末端に相補的なオリゴヌクレオチド
プライマーを使用し、常法によって容易に合成すること
ができる。

このｃＤＮＡを例えば、市販の転写ベクターｐＩＢＩ３
１　（商品名：　ＩＢＩ社製）のＳｍａ　Ｉ部位に第１
図に示すようにクローニングした後、Ｔ３ＲＮＡポリメ
ラーゼで試験管内転写サテライトＲＮＡを合成すると５
゛末端に２４個の余分な塩基が付加される。

なお、第１図中、Ｔ３はＴファージのプロモータを表す
。

この非ウィルス配列部分をＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド
のみを認識するＲ　Ｎ　ａｓｅＨによって特異的に切除
し、感染性ＲＮ　Ａ分子を得ることができる。

さらに、第２図に示ずように適当な制限酵素を使用して
サテライトＲＮＡのｃＤＮＡの中央部を除去し、この部
分に所望の外来ＤＮＡ断片を転写ＲＮＡがメツセンジャ
ーセンスを持つような方向あるいはアンチセンスを持つ
ような方向に挿入する。

上述の組換ベクターの構築は、制限酵素による切断、ク
レノーフラグメントによる平滑末端化そしてライゲーシ
ョン反応という一連の操作によって容易に達成される。

本発明のベクターにより植物細胞中に外来ＤＮＡ断片を
導入し、増殖させることが可能である。

本発明のベクターは、ヘルパーウィルスの殻の中にサテ
ライトが組み込まれているという他のＲＮＡウィルスに
はないサテライトＲＮＡの特殊性を利用することで、植
物体全身に移行できる。

なお、ＣＭＶの場合の宿主範囲は広く、双子葉及び単子
葉の草本木本４５科　１９０種以上の植物が感染するの
で、本発明のベクターは極めて広範囲の植物において利
用できる。

次に、本発明のベクターの使用例について説明する。

ベクターを、ヘルパーウィルスと同時接種し、植物細胞
に外来遺伝子を組み込み、植物の形質転換を行なうこと
ができる。

例えば、植物ウィルスのアンチセンス配列を導入するこ
とで、植物の形質転換を行い、ウィルス抵抗性植物を作
出することができる。

また、ベクターを、ヘルパーウィルスと同時接種し、植
物細胞に外来遺伝子を組み込み、該遺伝子に基づく有用
遺伝子産物を生産することもできる。

例えば、生理活性ペプチドなど有用タンパクの遺伝子を
組み込むことで、植物体または培養細胞をそれらタンパ
クの生産の場として利用することができる。

なお、本発明のベクターは、従来のベクターが染色体上
の基本遺伝子に組み込んでいたのに対し、核外遺伝子に
作用するので、植物に悪影響を与えることかない。

また、本発明のベクターは、外来ＲＮＡ断片の挿入部位
を工夫さえすればかなり効率良く複製することが可能で
あり、しかもサテライトＲＮＡを改変した場合には、ヘ
ルパーウィルスの粒子中に含有されて、植物体全身への
移行が期待できる。

このことは、ウィルスその他に対するアンチセンスＲＮ
Ａの植物体全身への分布ならびにベクターを組み込んだ
有用タンパク、ペプチドの遺伝情報に基づくそれらの生
産が植物体全身で行なわれることを意味する。

［実施例］ ・ｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　３１−ＭＣの横築 ＣＭＶサテライトＲＮＡ　（Ｙ系統）の全長鎖ＣＤＮＡ
をｐＵＣ１３のＳｍａＩ部位にクローニングし、組換え
プラスミドｐＣ３を選択した。

このｐＣ３の３９０ｂＸｂａ　Ｉ／Ｓｕｃ　Ｉフラグメ
ントの５′末端と３′末端をそれぞれクレノ−フラグメ
ントとＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。

一方、ＤＮＡ転写ベクターｐＩＢＩ３１のポリリンカ一
部位をＥｃｏＲＩとＨｉ　ｎｄｌＩによって除去し、ク
レノーフラグメントによって平滑化し、上記のＸｂａＩ
／５ａｃＩフラグメントとＴ４ＤＮＡリガーゼによって
結合しｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　３１−ＭＣを構築した。

・感染性転写産物の生産 上記ｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　３　ｌ−ＭＣをＳｍａ　Ｉで切断
することによって線状化し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼの
鋳型として転写反応を行なわせると、転写産物の５′末
端に２４個の余分な塩基が付加され、感染性の極めて低
いものが得られた（天然サテライトの１０１〜１０−’
）。

５°末端の非ウィルス配列を切除するために、その部分
に相補的な２４マーのデオキシオリゴヌクレオチドを合
成し、転写ＲＮＡにアニールさせた後、ＲＮａｓｅＨに
よって特異的にＤＮＡ−ＲＮＡハイブリット部位を切除
した（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ７，５，７５ｍ
ＭＫＣＬ、３ｍＭＭｇＣ１２，１００ｍＭＤＴＴ、ＲＮ
Ａ／オリゴヌクレオチド＝１／１０（モル比）、ＩＵＦ
ｔＮａｓｅＨを含む反応液中、室温で４０分間反応）。

このＲＮ　ａｓｅＨ処理で得られた産物は天然のものと
同程度の感染性を示した。

・ｐＳＣ４の構築 上記ｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　３　ｌ−ＭＣから９０ｂＳｔｙＩ
／Ａｓｕｌ［フラグメントを切除し、プラスミドの末端
をクレノーフラグメントによって平滑化した。

この部分にＣＭＶＲＮＡ４の３°末端部分の１２０ｂＤ
ＮＡ断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでシスに連結した。

この組換プラスミドｐＳ０４を鋳型とした時の転写産物
を播種後４０日経過したタバコＣＭＶと同時接種した。

１週間後に上葉から核酸を抽出し、ニトロセルロースメ
ンブランに固定してドツトプロットハイブリダイゼーシ
ョンを行なったところ〜１０ｎｇＲＮ　Ａ　／　ｇ生葉
の収量でこのベクターの複製が確認された。

ＰＳＹ−Ｔの構築 ｐｓｃ４と同様に上記ｐ　Ｉ　Ｂ　Ｉ　３１−ＭＣの５
ｔｙＩ／ＡｓｕｌＩ領域にポテトウィルスＹ（Ｔ系統＞
（ＰＶＹ−Ｔ）の１２０ｂｃＤＮＡ断片を転写された時
に（−）センスを持つような方向で組み込み、ｐｓｙ−
’ｒを構築した。

このｐＳＹ−Ｔからの転写産物と弱毒系のＣＭＶをタバ
コに同時接種し、１週間後にドツトプロットハイブリダ
イゼーションによって〜１ｎｇＲＮＡ／ｇ生葉の収量で
ベクターを検出した。

次にこのタバコにＰＶＹ−Ｔを接種して３週間磨機の変
化を観察した結果、ベクターの増殖が確認されたタバコ
において、ＰＶＹ−Ｔによるえそ病状が軽減された。

［発明の効果］ 本発明によれば、ベクターとして必要とされる条件を満
足でき、植物の形質転換やタンパク質の合成等を有効に
行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、感染性サテライトＲＮＡを試験管内で再生す
るための組換え転写ベクターｐＩＢＩ３１−ＭＣの構築
と、ＲＮ　ａｓｅＨ処理による非ウィルス配列除去の概
略説明図を示す。 第２図は、転写ベクターの一例のｐＳＣ４構築の概略説
明図を示す。 第４図は、ＣＭＶのサテライトＲＮＡ　（Ｙ系統）の塩
基配列を示す。 特許出願人　日本たばこ産業株式会社 第 図 １ｉｎ　ｖｉ＋ｒｏ転写反応 １　　階旬ｓｅＨ処理 感染性転写産物 第 図 ２′７０ ４拍 よ迫 第 図 第 図 ＡＣＡＧＧＡＣＣＣ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　植物ウィルスのサテライトＲＮＡからなるベクター
   。 ２　上記サテライトＲＮＡがキュウリモザイクウィルス
   のサテライトＲＮＡである請求項１記載のベクター。 ３　上記キュウリモザイクウイルスのサテライトＲＮＡ
   （７）ｃＤＮＡが、第３図に示す制限酵素地図であり、
   ３６９ｂｐである請求項２記載のベクター。 ４　植物ウィルスのサテライトＲＮＡに外来遺伝子を組
   み込んだ組換ベクターをヘルパーウィルスと同時接種し
   、植物細胞に外来遺伝子を組み込むことを特徴とする植
   物形質転換方法。 ５　植物ウィルスのサテライトＲＮＡに外来遺伝子を組
   み込んだ組換えベクターをヘルパーウィルスと同時接種
   し、植物細胞に外来遺伝子を組み込み、該遺伝子に基づ
   く産物を生産せしめることを特徴とする有用遺伝子産物
   の生産方法。 ６　第４図に示される塩基配列を有する遺伝子。