JPH02502008A - 形質転換成長因子‐β - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 形　転　成　−β １口」 本発明は成長因子、そして特に形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−１３）　、即ち 多くの型の細胞における増殖、分化、及びその他の機能の調節に関与する多官能 性ペプチドに関する。

茨１とｊ一旦 β型形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）は多くの型の細胞により合成される、多官 能性の、ホルモン作用を有するポリペプチドである。一般的な参照：　Ｍ、　Ｂ 、　５ｐｏｒｎ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−β ：　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＦｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｔ ｒｕｃｔｕｒｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２３３゜ｐ、５３２−５３４（ １９８６）：　Ｊ、Ｍａｓｓａｇｕｅ、　Ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　 Ｇｒｏ−ｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、ＩＯ，ｐ　２３９−２４０（１９８５ａ）　、　Ｔ　Ｇ　 Ｆ−βは、最初はラットの繊維芽細胞の形質転換を引き起こす能力により認めら れたが、今では正常細胞と悪性細胞の両方の広範囲の種類における調整作用を有 するものとして認められている。ＴＧＦ−βは、成長抑制因子として作用し、さ らに脂肪形成、胚形成、軟骨形成、骨形成、上皮細胞分化及び免疫細胞機能の過 程を調整して、多くの型の細胞の増殖速度に影響を与える。フィブロネクチン、 １型コラーゲン及び恐らくは他の細胞外マトリックス成分の増加した発現は、細 胞のＴＧＦ−βに対する広く広がった早い応答である。

ＴＧＦ−βにより誘導された細胞外マトリックスの構築における変化は、この因 子による特定の形質の発現の調節に影響し、細胞増殖に対するＴＧＦ−βのある 種の効果は、有糸分裂生殖的に活性なポリペプチドの高められた発現に対して二 次的なものでありうる。

最近、ＴＧＦ−βが人間からショウジヨウバエにいたる生物の組織の発達を調節 する同種のポリペプチドの群のプロトタイプであることが発見された。この群は 、培養された下垂体細胞の能力を調節して、卵胞刺激ホルモンを放出させる種々 のインヒビン及びアクチビン（参照：例えばＡ、　Ｍａｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、 、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｔｗｏ　ＨｕｍａｎＯｖａｒｉａｎ　Ｉｎｈｉ ｂｉｎｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、 。

Ｖｏｌ、１３５．　ｐ　９５？−９６４（１９８６））　、哺乳類の雄の胎児の ミュラー管の発達を抑制するミュラー抑制物質　（Ｍ　ｌ５）（Ｉ照：　Ｒ，Ｃ ａｔｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｍｉｉｌｌｅｒｉａｎ　Ｉｎｈｉｂ ｉｔｉｎｇ　５ｕｂｓｔａｎｃｅａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ 　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ。

（：ｅｌｌ、　Ｖｏｌ、　４５．　ｐ　６８５−６９８（１９８６））　、及び ショウジヨウバエの発達に重要なデカペンタブレシック遺伝子複合体の転写物（ 参照：　Ｒ，Ｐａｄｇｅｔｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａ　ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＦ ｒｏｍ　ａ　Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｐａｔｔｅｒｎ　Ｇｅｎｅ　Ｐｒｅｄｉｃ ｔｓ　ａ　ＰｒｏｔｅｉｎＨｏｍｏ−１ｏｇｏｕｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓ ｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　ＦａｃｔｏｒβＦａｍｉｌｙ、　Ｎａｔｕｒｅ 、　Ｖｏｌ、　３２５．　ｐ、８ｌ−８４（１９８６））を含む。

インヒビン、アクチビン、ＭＩＳ及びＤＰＰ−Ｃ転写物に対応する生物活性ドメ インは、ＴＧＦ−βと同じアミノ酸配列約２５ないし３５％しか有しない。

構造的に異なる３個の細胞表面グリコプロティンがＴＧＦ−βをアフィニティー によりピコモル範囲で特異的に結合することが確認された。Ｊ、νａｓｓａｇｕ ｅ、　ＴｈｅＴｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、　Ｔ ｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、１０．　ｐ、２３９−４０（１９８５）、多くの細胞系は 、これらの全ての型の推定されているＴＧＦ−βレセプターを示しているので、 この群のＴＧＦ−β受容体は、他の群のホルモン的に活性な物質のための受容体 において存在するのと似ているシチュエーションで、ＴＧＦ−β関ＴＧＦ−βは 哺乳類の中ではかなりの程度一定である。ヒトのＴＧＦ−βとマウスのＴＧＦ− βとではアミノ酸列において１個のアミノ酸が異なる。今のところ、ＴＧＦ−β の２５ｋＤａタンパク質は、哺乳類においてシングルフオーム、即ちジスルフィ ド結合で結合した２個の１２．５ｋ　Ｄ　ａ鎖のホモタイマーとして存在すると 考えられている。しかしながら、下記の文献を参照：　ＥＰＯ出願８５３０４８ ４８．６．　Ｐｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃａｒｔｉｌａｇｅ−Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｆｏｕｎｄ　ｉｎ　Ｂｏｎｅｌ′（Ｉｎｖｅｎｔｏｒ：　Ｓ、 ・５ｅｙｅｄｏｎ　ｅ゛ｔａ１．）（２ツの型の軟骨誘導因子ＣＩＦ−Ａ及びＣ ＩＦ−Ｂが記載されてあり、そのうちの一つはホモタイマーであり、２つの型は 異なるアミノ酸配列を有する〕、及びＳ、　５ｅｙｅｄｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　 ”Ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇＦａｃｔｏｒ　−β”　、　Ｊ、ｏｆ 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　Ｖｏｌ、２６１．　ｐ、５６９３−９５（１９８６ ）。

ＬＪＬ公す 本発明は豚の血小板に見出されたＴＧＦ−βの独特な型に関する。ＴＧＦ−β３ として定められた因子は、約２５、０００グルトンの分子量を有するヘテロタイ マーである。タイマーの一つの鎖はヒト血小板ＴＧＦ−βの、及び豚のＴＧＦ− βのホモタイマーの優勢な型であ゛る豚血小板ＴＧＦ−β１の部分的なＮ−末端 配列と同じ部分的なＮ−末端アミノ酸配列を有する。ダイマーの他方の鎖は、Ｔ ＧＦ−βとは全く異なるアミノ酸配列を有する豚ＴＧＦ−βのホモタイマーの二 番目に優勢な型であるＴＧＦ−β２と同じ部分的なＮ−末端アミノ酸配列を有す る。

区１０囚阪１１１里 第１図は、２３０ｎｍ及び２４０ｎｒｎにおける吸収をプロットしてなる、アセ トニトリル勾配上のＴＧＦ−βの溶離に対する溶離曲線であり； 第２図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるＴＧＦ−βの１．２ 及び３型の銀色の染色を示し； 第３ａ−３ｃ図は各々ＴＧＦ−βの１．２及び３型の部分的アミノ酸配列のプロ ットである。

第４ａ−４ｃ図は、ヒトＴＧＦ−βと豚ＴＧＦ−Ｂ　ｌを比較した第１図と同様 の溶離曲線である。

日を　るためのベストモード 血小板からのＴＧＦ−βの最初の抽出は、細胞を溶解し、その後、不溶物質を除 去するために遠心分離にかけることにより行なわれる。その後、上清液を例えば エタノール−エーテルを用いて沈殿させ、再懸濁させ、　Ｂｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ− ６０カラムを通すようなゲルｆ過により分画する。

それ以上の精製は逆相ＨＰＬＣにより、好ましくは吸引Ｃ−４及びＣ−１８カラ ム上で行なわれる。

５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　Ｃ−４カラム上での続いての分画は、ＴＧＦ−βをアセ トニトリル約３２％、３４％及び３６％における三つのピークに分析する（第１ 図参照）、最も疎水性の少ないピークは、知られている限りではヒトＴＧＦ−β と同一のＮ末端アミノ酸配列を有するホモダイマーであるＴＧＦ−β１に相当す る。最も疎水性のピークは、ＴＧＦ−β１とは実質的に異なるＮ−末端アミノ酸 配列を有するＴＧＦ−βの別のホモダイマー型であるＴＧＦ−β２に相当する。

真中のピークは、今まで報告されていない１型と２型の各々の一重鎖のへテロタ イマーであるＴＧＦ−β３に対応する。各々の型は、約２５キロタルトンの分子 量を有し、ＴＧＦ−β−アッセーにおいてほぼ等価の活性を有し、即ち半固体の 培地中の未固定のＮＨＫ細胞の成長をほぼ同等に促進する。

の血ハ　からのＴＧＦ−の　゛ 屠殺場から豚の新鮮な血を手に入れ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０，２Ｍ （７）　Ｅ　Ｇ　Ｔ　Ａの溶液を１　ｍ　１２７　Ｈの割合で添加し、−２０℃ への凍結及び解凍を５回行ない、不溶物を除去するために５５−１Ｏｘで３０分 間遠心分離にかけることにより、血小板を抽出した。遠心分離からの上溝液を、 　Ａ、Ｂ、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ　Ｇ ｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒｓ：　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｌ　ｅ　ｔｉｄ ｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｖｉｒａｌｌａｎｄ　（：ｈｅｍｉｃａｌｌ　Ｔｒａｎｓｆｏ ｒｒｎｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂ　Ａｃ１ｄ　ＥｔｈａｎｏｌＥｘｔｒａｃユｉｏｎ 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　Ｖｏｌ、　７？ 。

Ｐ、　３４９４−９８　（１９８０）に記載された方法に従って酸性エタノール ４部、９５％エタノール５０部、蒸留水１４部、濃塩酸１部と混合し、その後濃 水酸化アンモニウムでｐＨ５，２に合わせた。

タンパク質を２容量の冷たい無水エタノール及び４容量の冷たい無水エーテルで 沈殿させ、約２０分間放置した。沈澱物を遠心分離またはＷｈａｔｍａｎ　Ｎｏ 、　１紙を通しての急速−過により集め、ＩＭの酢酸中に再懸濁した（組織１部 当たり約３〜４ｍρ）、不溶物を約５−１０ｘ　ｇで１０−３０分間の遠心分離 により除去し、その後、上溝液を、例えばＩＭの酢酸溶液への再懸濁を伴う凍結 乾燥により、濃縮した。

その後、この懸濁液を、Ｒ，に、　Ａｓ５ｏｉａｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｒａ ｎｓｆｏｒｍｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｐｌａｔ ｅｌｅｔｓ　：　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｍａ’ｏｒ　５ｔ ｏｒａ　ｅ　５ｉｔｅ、Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｃｈ且ｒａｃｔｅｒ ｉｚａｔｉｏｎ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、Ｖｏｌ、２５８゜ｐ、　７１５５ −７１６０　（１９８３）に記載されたように、吸引Ｂ１ｏ−Ｇｅ１Ｐ−６０ゲ ル−過カラム（１００−２００メツシユ）により、尿素の存在下または不存在下 で分画した。最初の溶離は、５、Ｏｃ＋ｎＸ　１００ｃｍのカラムで、約４０ｍ ｆｌ／ｈの流速で、カラムをＩＭの酢酸中で平衡状態にして行なわれた。　１０ ｍ２のフラクションが集められ、ＴＧＦ−β活性を有する（下記に示す）これら のフラクションを溜め、さらに精製するために凍結乾燥により！縮した。

最初のカラムからの活性フラクションを８Ｍの超純粋尿素を含有するＩＭ酢酸５ ｍβに溶解し、第二のＢｉ。

−Ｇｅｌ　Ｐ−６０カラム（５ＣｎＸ　８０ｃｍ）で、約２０ｍ　Ａ　７時間の 流速で、カラムをサンプル溶媒で平衡にしてゲルー過を行なう、１０ｍβのフラ クションが集められた。（溶媒中でのシアンの形成を防ぐために、超純粋尿素を ＩＭの酢酸中にｐＨ２で溶解し、得られた溶液を氷酢酸及び水の添加により最終 条件に合わせても良い、）選ばれたカラムのフラクションのアリコートのＴＧＦ −β活性を再び試験した（下記に示す）、ＴＧＦ−β活性のピークを含むフラク ションを溜め、例えばＡｍ１ｃｏｎ　Ｙ　Ｍ　５メンプランを通しての加圧−過 により濃縮した。

溜められたＴＧＦ−βフラクションを室温で、２個の吸引逆相ＨＰＬＣカラムで さらに精製した。最初のカラムにおいては、５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　Ｃ−４カラ ム（１０ｍｍＸ　２５０ｍ＋ａ）、ＨａＯ中の１５〜３０％ｎ−プロパツール１ ０．１％トリフルオロ酢酸の線状勾配を、１ｍｊ２／分の流速で、０．１％／分 の勾配変化率で使用した。ＴＧＦ−βは約２２％のプロパツールで溶離した。Ｔ ＧＦ−β活性を有するフラクションは溜められ、１Ｍ酢酸で１＝１に希釈されて プロパツール濃度を減少させ、その後、第２のカラムである５ｙｎｃｈｒｏｐａ ｋ　Ｃ１８カラム（１０ｍｍＸ　２５０ｍｍ）にかけた、’Ｈ＊０中のｎ−プロ パツール２０−３０％１０．１％トリフルオロ酢酸の線状勾配をこのカラムに１ ｍ２／分の流速で、０．０５”％／分の勾配変化率で用いた。ＴＧＦ−βはｎ− プロパツール約２４％で始まる広いピークとして溶離した。

第二のＨＰＬＣ工程からのＴＧＦ−βを、再び、５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　Ｃ−４ カラム（１０ｍｎ＋Ｘ　２５０ｍ５ａ）のクロマトグラフィーにかけ、ＨｉＯ中 のアセトニトリル２５−４０％１０．１％トリフルオロ酢酸の線状勾配を用い、 １ｍ２／分の流速で、０．１％／分の勾配変化率で溶離した。第１図は、ＴＧＦ −βを含有するフラクションの２３０ｎｍ及び２４０ｎｍの吸光度溶離プロフィ ールを示す、三つの明らかなプロティンピークがアセトニトリル約３２％、３４ ％及び３６％のところで現われる。最も疎水性の少ないピークはＴＧＦ−βｌを 示し、最も疎水性の多いピークはＴＧＦ−β２を示し、真中のピークはＴＧＦ− β３を示す。

これらの３つの明らかなピークの存在を確認するために、三つの異なるランから の型１．２及び３を別々に溜めた。これらのプールの各々からのサンプル（クン バク質約１０ｕｇ）を混合し、上記のように５ｙｎｃｈｒｏｐａｋＣ−４カラム を用いて再びクロマトグラフィーにかけた。吸光物質の三つの分離したピークが 再び作られた。

吸光物質のプロフィールを通したフラクションのアリコートを、５ＤＳ−ポリア クリルアミドゲル電気泳動にかけ、銀染色法で、第２図に示すように可視化した 。矢印は三つのピークの全てからのフラクションに存在する２５ｋ　Ｄ　ａバン ドを示す、２９ｋＤａと１８ｋ　Ｄ　ａの分子量マーカーの位置も示されている 。

上記の方法により、実質的に純粋なＴＧＦ−βが典型的には血小板１μ当たり約 ２μｇの範囲の量で得られ、これは約ｓｏｏ、　ｏｏｏ倍に精製されたことの意 味を表わす。

非還元ＳＤＳゲル上で電気泳動したサンプルの銀染色法、アミノ酸組成物分析及 びＮ−末端シーケンシングで調べられるように、９５〜９７％の純度が再生可能 に達成さ上記の精製から回収されるＴＧＦ−βの総量のうち、１型がＴＧＦ−β の優勢型（約６５〜８０％）として存在する。２型及び３型の量は３型の製剤に よって異なるが、典型的には３型がより少ない量（通常は回収されたＴＧＦ−β の約５〜１０％）で存在する。おおよその定量は溶離ピークを切り出し、切り出 された紙を秤量することによって確定することもできる。

ヒトＴＧＦ−に・　る 上記の方法により製造され１分析されたヒト血小板ＴＧＦ−βは豚ＴＧＦ−βに 見出された３つのピークを与えなかつた。第４ａ−４ｃ図は、各々ｌＯμｇの豚 ＴＧＦ−ｆｌｌ　（第４ａ図）、ｌＯｕｇのヒトＴＧＦ−β（第４ｂ図）、及び ５μｇのｐＴＧＦ−βｌ及び５μｇのｈＴＧＦ−βの混合物（Ｆ　ｉ　ｇ　４ｃ ）の溶離ビークを示す、ヒトＴＧＦ−βのシングルピークは、豚ＴＧＦ−β１、 即ち豚血小板ＴＧＦ−βの最も疎水性の小さなピークとコミグレートした。

ＴＧＦ−ｆ 三つのピークの各々の物質を、活性を調べるために、いわゆるＴＧＦ−βアッセ ーにかける。このアッセーは、非悪性ＮＨＫ繊維芽細胞における基質独立性成長 を引き起こすポリペプチドの能力を、ソフト寒天中のコロニーを測定することに より調べる。

試験材料は、殺菌用の管内のＩＭの酢酸溶液の凍結乾燥により殺菌される。その 後、残渣を結合緩衝液中に、分析使用される最終濃度の１０倍の濃度で再溶解し 、遠心分離にかけて透明にした。試験すべきサンプルを、１０％コウシ血清（Ｇ ＩＢＣＯ）ペニシリン（１００ＬＬニツト／ｍＪ２）、ストレプトマイシン（１ ００μｇ／ｍ！２）及び５μｇ／ｍＪ２のＥＧＦを加えたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ 　ｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ　ｍｅｄｉｕｍ　（Ｇ　Ｉ　Ｂ　ＣＯ）中の０． ３％寒天（Ｄｉｆｃｏ。

Ｎｏｂｌｅ　ａｇａｒ）に懸濁した。１部（３５００個の細胞を含有する得られ た混合物０．７ｍβ）を、各々３個の３５μｍのベトリ皿中の０．７ｍｆｆの塩 基層（追加培地中の０．５％寒天）上にとベットで移した。その後、プレートを ３７℃で、高湿の１０％Ｃ０２の雰囲気下で、それ以上栄養を与えることなく７ 日間培養する。

分析は、１週間、固定せず、染色せずに読まれつる。

さもなければ、プレートは、寒天上に層積された２−（ｐ−ヨードフェニル）− ３−（ｐ−二トロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロウ１′ド（０， ５ｍｇ／ｍ　Ｉ２．水中）で染色され、２４時間培養されつる。過剰の染料溶液 を除去した後、プレートをブライトフィールド顕微鏡（スクリーン上に映写して 、または映写せずに）で、単位フィールド内のコロニーの数を数えることにより 計測しつる。

ＴＧＦ−β活性は、Ｅ　Ｇ　Ｆ　（２，５μｇ／　ｍ　Ｉ２）の存在下で最大コ ロニー形成（３０００μｍ２より大きいコロニーサイズ）の５０％となる有効投 与量（ＥＤ）として定義される０分析の最大の応答は約２５００コロニーである 。三つのＴＧＦ−β型の各々は、この分析において活性がほぼ同等であり、約０ ．１〜０．４　ｎｇ／　ｍ　４２のＥＤｓｏ（ＥＤｓ。は最大応答の５０％を与 える有効投与量である）を示した。

豚ＴＧＦ−のアミノ　ダの ２５ｋ　Ｄ　ａのＴＧＦ−β１　（１８０ｐｍｏｌ）　、ＴＧＦ−β２　（１３ ０ｐｍｏｌ）及びＴＧＦ−β３　（４００ｐｍｏｌ）の非還元サンプルを、ポリ ブレンの存在下、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ−ｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ　４７０ Ａガス相シークエネークーを用いて、Ｎ−末端自動エドマン（Ｅｄｍａｎ）アミ ノ酸減成を行なった。

フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体をＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃ ｋａｒｄ　３３９０Ａインチグレーターで定量した。収量を第３ａ−ｃ図に示す 、これは各々ＴＧＦ−βの１−３型に対応する。各サイクルで固定されたアミノ 酸が示される。第３ｃ図のオーブンシンボルは、推定された配列の最後の列に挙 げられたアミノ酸残基に対応するＰＴＨアミノ酸の収量を示す、第３図はＴＧＦ −β３の最初の４３個の残基を示し、さらに研究によりアミノ酸タンパク質の最 初の５０個の残基が固定されている（ヒトＴＧＦ−βは１１２個のアミノ酸を有 し、そして２５ｋＤａの分子量を有するので、及びＰＴＧＦ−β３は１型及び２ 型のヘテロダイマーであるので、２型及び３型はさらに１１２個のアミノ酸を有 すると信じられている。）。

豚ＴＧＦ−βｌのＮ−末端５０アミノ酸の配列は、ヒトＴＧＦ−βのＮ−末端配 列と同じであり、下記のものであることが見出された： Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−Ａ　５ｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−５ｅ ｒ−５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ　−Ｌｙｓ−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ− Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｌｙ ｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｉ　ｌ　ｅ−Ｈｉ　５ −Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｈｉ　５−Ａｌ　ａ−Ａｓｎ− Ｐｈｅ−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−。

対照的に、ＴＧＦ−β２の分析はＴＧＦ−β−１の配列とは著しく異なるＮ−末 端アミノ酸配列を与えた＝Ａ　ｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａ　ｌ　ａ−Ａ　ｌａ− Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ−Ａｓｎ 　−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ−Ａ ｓｐ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔ ｒｐ−Ｉ　１　ｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ −Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　−Ｐｒ ｏ−Ｔｙｒ−。

ＴＧＦ−β３のＮ−末端アミノ配列は、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２が結合した 配列と同じ、混合した配列を与えた。ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２とで異なる残 基に対応する。３型のこれらのサイクルは、両方のアミノ酸誘導体をほぼ等量で 与える。全ての他のサイクルは、その位置においてＴＧＦ−β１とＴＧＦ−β２ に共有される残基に対応するシングルアミノ酸誘導体を提供し、これは、ＴＧＦ −β３がＴＧＦ−β２の一つの鎖に結合したＴＧＦ−β１の１つの鎖からなるヘ テロタイマーに対応することを示している。

現在のところ、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２と比較してのＴＧＦ−β３の機 能についての研究は完了していない、しかしながら、全ての型はＴＧＦ−βアッ セーにおいて活性であり、従って、ＴＧＦ−β３がＴＧＦ−βの分子機能の少な くとも一部を有することが明らかである。従って、ＴＧＦ−β３は、ＴＧＦ−β に期待されている治療用途に類似した用途を有すると考えられる。

そのような用途は、外傷、火傷、手術、または老人の衰弱による組織の傷の修復 、骨粗髪症のような代謝状態の調節、及び特に抗炎症剤または免疫抑制剤として の使用に適している。一般的な参照：　Ｍ、Ｂ、　５ｐｏｒｎ、　ｅｔ　ａｌ、 。

Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−：　Ｂｉｏｌｏ　１ｃ ａｌ　Ｆｕｎｃｔｉ−ｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　 ５ｃｉｅｎｃｅ　Ｖｏｌ、２３３　．５３２−３４１９８６　；Ｓ、　Ｓｅ　ｅ ｄｉｎ　Ｃａｒｔｉｌａ　ｅ−Ｉｎｄｕｃｉｎ　Ｆａｃｔｏｒ−Ａ：Ａ　ａｒｅ ｎｔ　Ｉｄｅｎｔｉｔ　ｔｏ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ ｔｏｒ−Ｂ　、　Ｊ、’　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅａｐ、、　Ｖｏｌ、　２６ １．　ｐ、５６９３−９５（１９８６）。

％　ア亡トニトリル １２３４５６７５１９１０１＋　１２１３１４１５１６フラクン、二／ナンバー 国際調査報告 １＋ｌｍ５−ｍｍ　Ａ−一τＮ＠ＰＣＴ　／ＵＳ１００２７２

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ．哺乳類の血小板に見出され、ｂ．ＴＧＦ−βアッセーにおいて活性で あり、ｃ．約２５，０００ダルトンの分子量を有することを特徴とするポリプペ チド成長因子。
2. （２）ダイマーの鎖の一方が下記のＮ末端配列：【配列があります】 を有することを特徴とする請求項１記載の因子。
3. （３）ダイマーの鎖の一方が下記のＮ末端配列：【配列があります】 を有することを特徴とする請求項１記載の因子。
4. （４）血小板が豚の血小板であることを特徴とする請求項１記載の因子。
5. （５）哺乳類の血小板に見出され、ＴＧＦ−βアッセーにおいて活性を有し、約 ２５，０００ダルトンの分子量を有するヘテロダイマーであり、該ダイマーの一 方の鎖が下記のＮ−末端アミノ酸配列： 【配列があります】 を有し、ダイマーの他方の鎖が下記のＮ−末端配列：：【配列があります】 を有することを特徴とする実質的に純粋なポリぺプチド成長因子。
6. （６）請求項１記載の成長因子が少なくとも約５−１０％の量で存在する実質的 に純粋な豚ＴＧＦ−βを含む組成物。