JPH02500838A

JPH02500838A - 生物学的活性物質の動物の腸管部位へのデリバリーに有効なマイクロ顆粒状製剤

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Publication number: JPH02500838A
Application number: JP62505093A
Authority: JP
Inventors: イーング、トーマス、コ、サイ
Original assignee: コーテックス　リミテッド
Priority date: 1986-08-28
Filing date: 1987-08-17
Publication date: 1990-03-22
Anticipated expiration: 2013-09-17
Also published as: NO881755D0; ATE106242T1; WO1988001506A1; GR871332B; DK236388A; GR871331B; NO300252B1; EP0321481A4; JP2798248B2; HK85096A; KR950014441B1; NO944301L; EP0321481B1; NZ221575A; NO300991B1; DK236388D0; NO944301D0; CN1035801C; DE3789965D1; AU7858587A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的活性物質の動物の腸管部位へのデリバリ−に有効なマイクロ顆粒状製剤本発明は、生物学的活性物質の動物の腸管部位へのデリバリ−に有効なマイクロ顆粒状製剤に関する。本発明は、さらに該マイクロ顆粒状製剤の製造方法に関する。

消化管からの生物学的活性物質の吸収は、主として腸管において生じる。

多くの生物学的活性物質は、酸不安定性であり、酸性条件にされされると、該生物学的活性物質が活性を失うほどに変性または化学的に改質される。このことは、生物学的活性分子が動物に経口投与される場合、例えば胃を通過することを必要とする多くの製薬学的にかつ獣医学的に活性素イオンのために強酸性である。

該領域のｐＨは、おそら（ｐＨ１のオーダー程度であろう。したがって、多くの生物学的化合物は、該化合物が吸収の起こる腸管部位に到達する以前に不可逆的に変性、改質および／または破壊され数多（の有効治療化合物および必須ミネラルは、胃に対して刺激性である。特に、アスピリン、Ｆ　ｅ２”、Ｆ　ｅ３”。

Ｚｎ２＋Ｊ３よびに＋は、経口投与した際に胃痛を引き起こす。

この刺激は、胃内層の潰瘍を誘導し得る。このような不利益な点は、これらの治療的利益を相殺する。

遺伝子障害または膵臓疾患による動物における消化酵素の不足または平衡異常は、酵素の経口投与によって処置されうる。しかしながら、これらの酵素の多くは、酸不安定性であり、かつ該酵素が腸管部位に達する前に胃の酸性部位において不可逆的に酸性化される。したがって、高服用量の酵素を与えなければならず、この処置を非効率的で高価なものにしてしまう。

しばしば、生物学的活性物質は、アルカリｐＨ条件に遭遇する反すう動物の第− 胃を通って変性される。このことも、経口投与された治療剤の効果的使用に対する障害として働く。

胃の酸性条件または第−胃のアルカリ条件による生物学的活性の損失を排除または本質的に減じる製剤および生物学的活性物質を動物の腸管にデリバリ−する方法を提供することが本発明の目的である。

本発明の第１の態様によると、１以上の生物学的活性物質を固定してなるコアを有するマイクロ顆粒状製剤であって、該コアが水溶性フィルム内にカプセル被覆されかつ腸液に可溶化され得る脂肪酸または他の物質で置換されるかあるいは該窓を含有する構造を有するアルカリ可溶性酸不溶性ポリマーまたは高分子量ポリマーで被覆されたマイクロ顆粒状製剤が提供される。

生物学的活性物質とは、製薬学的かつ獣医学的化合物をいい、例えばβ−ガラクトシダーゼおよびブロメリン等のＺ　ｎ　２＋Ｐ５よびＫ　等の金属イオン類、抗生物質、消毒剤およびそれらの製薬学的に適合し得る塩類、タンパク質類、アミノ酸類および微生物類をいう。

用語「固定された形態」とは、ゲル状物質内に固定され、半透膜内に密封され、吸収剤に吸収されるかあるいはキレート剤に結合された生物学的活性物質をいう。

生物学的活性物質は、例えば以下の方法のいずれかにより固定することができる。

（ａ）取り込み（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）法ニゲル状物質のコア内への生物学的活性物質の挿入また半透膜内への密封；（ｂ）架橋法：架橋剤を利用する生物学的活性物質の分子内架橋；または（ｃ）キャリヤー結合法：イオン結合および／または共有結合による生物学的活性物質の水不溶性物質への物理的または化学的結合。

固定は、生物学的物質が固定されている間にまたは放出された際に活性を保持するように行なわれる。

コア内への生物学的物質の取り込みは、該生物学的活性物質が形成されたゲルマトリックス内に取り込まれるような一定の条件下、生物学的活性物質のゲル形成剤との混合によって行なわれる。ゲル形成剤の例としては、Ｋ−カラゲナン、アルギン酸、ゼラチン、セルロースまたはその誘導体またはポリアミド類またキトサン（Ｃｈｉｔｏｓａｎ）等の種々のゲル形成合成ポリマーがある。

吸収剤を用いる場合、微粉砕活性炭が好ましい。

キレート化剤を用いる場合、ＥＤＴＡ、その塩類または誘導体類、ポリアクリルアミド類等の高分子量親水性ポリマー類、または水溶液または／親水性溶媒において、そのイオン結合を解離することのできる高分子量塩類が挙げられる。

カプセル被膜は、薄膜の付着または各マイクロ顆粒のコアとその周囲の物理的分離をなし得るコアを覆う化学的障壁を含む。このフィルムまたは障壁は、水溶性である。好適な障壁を形成する化合物の例としては、ゼラチンが挙げられる。

腸液覆物は、好ましくはセルロースアセテートフタレートである。しかしながら、いずれの他の耐酸性アルカリ可溶性ポリマーも利用し得る。

ブチルメタクリレートまたは他の高分子量ポリマーは、ステアリン酸または他の脂肪酸誘導体あるいは胆汁により可溶化され得る他の物質の窓で置換されるかあるいは該窓を含有することができる。好ましくは、脂肪酸の炭素数は、１２〜２４である。

生物学的活性物質のゲル中への固定は、最も有効な特徴の１つである。特に、ゲルマトリックスは、腸液覆物の適用に用いられる有機溶媒（セルロースアセテートフタレート等の酸不溶性アルカリ可溶性被覆物）等の変性剤の受容性を制限する。したがって、著しい割合のゲルマトリックス内に固定された生物学的活性物質は、触媒活性あるいは他の活性に最終的には有効である。

生物学的活性物質を固定することができゲルマトリックスは、多孔性でありかつ透過性である。それ故、ゲルマトリックスが十二指腸の環境等の水性条件にさらされた際、ゲルは、ゲルマトリックス内への腸液の浸入により膨潤し、生物学的活性物質を放出し、ゲルを離れて触媒活性または他の活性として働くことができる。

粒径範囲５０μｍ〜５００μｍの超微粒子のマイクロ顆粒は、本発明の実施により製造することができる。特に、ゲル内またはゲルを形成することのできる溶液中に固定された生物学的活性物質は、操作および加工しやすく、また穏やかな方法により所望の微小粒径のマイクロ顆粒を製造することができる。例えば、生物学的活性物質を含有するゲルは、微小孔径のふるいを通して押し出すことができ、あるいは該ゲルを凍結乾燥して所望の大きさの粒子を得ることができる。他に、ゲルを形成することのできる溶液中の生物学的活性物質を好適なノズルにより噴霧して微小液滴を形成し、該液をゲル化する溶液中に通過させることによって、生物学的活性物質を形成されたゲル内に固定することができる。この方法で形成された顆粒の大きさは、ノズルの孔径および液体を噴霧する圧力によって決定される。

これに対して、このような結果は、従来技術法では得られない。従来技術においては、酵素等の生物学的活性物質は、所望の粒径のマイクロ顆粒を得るための上述の処理を受け入れる余地のない公知の結合剤と単に混合されるだけである。

微粒径のマイクロ顆粒は、該マイクロ顆粒がフィードにより均一に分配され、またこれらがマイクロ顆粒の表面積増加により腸管に到達した際に生物学的活性物質の迅速な放出を与え得るので、最も望ましい。

コアに関する水溶性障壁の供給は、腸液覆物の摘要の際に用いられる有機溶媒によって引き起こされる変性に対して保護をする。先に記載したゲルマトリックスの保護性のため、生物学的活性物質の生物学的活性をかなり維持する。

本発明のマイクロ顆粒製剤は、ｐＨ感応性生物学的活性物質を胃または第−胃における不活性化から保護されることを可能にし、さらには腸管、特に十二指腸における作用に対して有効化する。マイクロ顆粒製剤が単画性（ｍｏｎｏｇａｓｔｒｉｃ）動物の腸のアルカリ領域に達した際に、外側の被覆物は、溶解されまたは脂肪酸窓は、消化される。ついで、胃液は、水溶性被覆物に通すことができ、これを退化させる。これによりコアをさらし、膨潤し、生物学的活性物質を放出する。

反すう動物においては、脂肪酸窓を有するブチルメタクリレート等の高分子ポリマーが外とう被覆物として好適であり、第−胃および胃を通して該マイクロ顆粒状製剤の通過を与える。胃管部位、特に十二指腸において、脂肪酸窓は、リパーゼ類により消化され、したがって水溶性被覆物を退化させ、またコアをさらし、これにより膨潤し、生物学的活性物質を放出する。

当業者が直ちに理解するとおり、水溶性フィルムおよびアルカリ可溶性ポリマーまたは脂肪酸または同様の乳化性物質により遮断された高分子量ポリマーの厚さおよびコアの大きさは、生物学的活性物質が有効である割合および補足的に、生物学的活性物質が有効である腸内の部位に依る。

本発明の他の態様によると、コアがβ−ガラクトシダーゼを含有する上記マイクロ顆粒状製剤が提供される。このような製剤は、予め離乳された動物、特に予め離乳された小豚に対する成長促進剤（ｐｒｏｍｏｔａｎｔ）として有効である。

また、該製剤は、小豚における下痢を処置するのに有効である。

豚乳における炭水化物は、大部分ラクトースである。ラクトースは、腸管の低位部分からの吸収する単糖類、すなわちグルコースお表びガラクトースへの消化を必要とする。

上述のマイクロ顆粒状製剤を利用して腸管の初めに外部β−ガラクトシダーゼを補足することにより、豚乳は、より完全に消化することができ、小豚の体重増加をもたらす。

小豚、ヒト（ラクトース不耐症として表わされる）または他の動物におけるβ− ガラクトシダーゼ欠乏症は、β−ガラクトシダーゼを含有する前述のマイクロ顆粒状製剤の投与によって処理することができる。β−ガラクトシダーゼは、そのため腸から遊離され、これはラクトース消化を容易にする。

腸管の低位部分における未消化ラクトースは、クローン性バクテリアの理想的培地を形成し、増大および発酵し、ガスおよび乳酸を生成する。この結果、水性の酸性下痢となる。この状態は、腸内感染性下痢として知られる。過酷な下痢は、体液の損失および電解質平衡不全を誘導し、脱水を引き起し、致死させる。

本発明の範囲内で下痢を処置するさらなるアプローチは、ブロメリン等のプロテアーゼを含有する本発明のマイクロ顆粒状製剤を利用する。

ブロメリンは、小腸内に放出した状態で、腸管レセプターから病原性微生物を剥離することによって下痢を緩和する。

本発明の他の態様によると、コアが固定された形態でβ−ガラクトシダーゼを含有する有効量の前述のマイクロ顆粒製剤の投与を含む予め離乳された動物、特に豚における動物成長を増加する方法が提供される。

本発明のさらに別の態様によると、コアがβ−ガラクトシダーゼはまたブロメリン等のプロテアーゼを含有する治療学的有効量の上記マイクロ顆粒状製剤の投与からなる小豚における下痢の処理方法が提供される。

本発明は、ヒトを含む動物へのビタミンＢ１２およびリボフラビン等の酸不安定性物質の投与に特に有効である。

補足的に、アスピリンまたは鉄等の胃痛を引き起こす物質は、本発明のマイクロ顆粒状製剤を用いてヒトを含む動物に安全にデリバリ−することができる。このため、これらの物質は、これらが腸のアルカリ部位に達するまで、消化管にさらされない。

本発明のさらに別の態様によると、１以上の生物学的活性物質を固定してなるコアを有するマイクロ顆粒製剤であって、該コアが水溶性フィルム内にカプセル置換されかつ腸液に可溶化され得る脂肪酸または他の物質で置換されるかあるいは該窓を含有する構造を有するアルカリ可溶性酸不溶性ポリマーまたは高分子量ポリマーで被覆されたマイクロ顆粒状製剤を投与することからなる破壊および／または不活性化に対する酸感応性生物学的活性物質の保護方法が提供される。

本発明のマイクロ顆粒状製剤を、製薬学的受容性まはた獣医学的受容性キャリヤーまたは賦形剤と共同してヒトまたは動物に経口投与してもよい。例えば、該マイクロ顆粒状製剤を、水、カオリン、タルク、炭酸カルシウム、ラクトース、塩化ナトリウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸第二鉄、硫酸マグネシウム、ヨウ化カリウム、黄硫、塩化カリウム、セレンおよび／またはビオチン、塩化コリン、ニコチンアミド、葉酸またはビタミンＡ％　Ｄ３　、ＥｌＫｓ　Ｂｌ　、Ｂ２、Ｂ　およびＢ１２等のビタミン類とともに投与してもよい。

マイクロ顆粒状製剤を酸性水溶液または懸濁液として、錠剤またはカプセル形態でさらにはペーストとしであるいは食料または飼育原料とともに投与してもよい。

好適な飼育原料の例として、トウモロコシ、粗びきの小麦粉、大豆粉、魚粉、牧草粉、スキムミルク、リン酸トリカルシウム、麦芽、コーン、ライス、ミロ、乳漿またはα−ミールの１以上を含む。

本発明のさらに別の実施態様によると、（ａ）コア内に１以上の生物学的活性物質を固定し、（ｂ）該固定化された生物学的活性物質をマイクロ顆粒化し、（Ｃ）該マイクロ顆粒を水溶性物理的障壁でカプセル被覆し、かつ（ｄ）段階（Ｃ）のマイクロ顆粒を腸液により可溶化され得る脂肪酸または他の物質の窓で置換されるかあるいは該窓を含有する構造を有するアルカリ可溶性酸不溶性ポリマーまたは高分子量ポリマーで被覆する段階からなる上記のマイクロ顆粒状製剤の製造方法が提供される。

好ましくは、マイクロ顆粒は、段階（Ｃ）の水溶性物理的障壁および段階（ｄ）の被覆でスプレーコートされる。

以下、本発明を実施例および図面に基づ（例示として説明する。

第１図は、ブロメリン処置小豚における下痢苛酷性の散乱図であり、また第２図は、未処置小豚における下痢苛酷性の散乱図である。

（ａ）２％〜５％ｗ　／　ｖのに一カラゲナンをに一ガラゲナンの溶解が達せられるまで６５℃の温度で精製水と混合する。この溶液を５０℃まで冷却する。

（ｂ）１％ｗ　／　ｖの生物学的活性物質を５０℃でｐｌ（６にて等張リン酸緩衝液（４０％　０．０６７Ｍ　ＮａＨ２Ｐ０４＋６０％　０．０６７Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４）　に溶解する。この溶液を溶液（ａ）に加え、５００　Ｈ２で１５分間均質化する。ついで、２〜５％ｗ　／　ｖのイオン化カルシウム水溶液を該溶液に加え、得られた溶液をさらに１時間５０Ｈ２にて均質化し、ついで２０℃に冷却し、ゲル、液体セルビーズおよび水相を得る。

（Ｃ）得られたゲル、液体、セルビーズおよび水相を５℃まで冷却し、デカンテーションし、濾過し、そして凍結乾燥する。冷結乾燥物質を粉砕し粉砕２５〜１００ミクロンの顆粒を得、ついで２．５％ｗ　／　Ｗグルタルアルデヒドまたはホルマリン等の硬化剤で洗浄する。

別法として、段階（ｂ）のゲル相を押し出し、寸法５０ミクロンの孔より３ｋＰ／ｃＪでスプレーし、２．５％Ｗ／Ｗグルタルアルデヒドまたホルマリン中に、１〜５メートル落下させて、顆粒状にする。

（ｄ）ついで、該顆粒を濾過し、グリセロール等の軟化剤で洗浄する。

（ｅ）得られた顆粒を濾過し、流動化し、ついで４０℃にて加熱乾燥する。

（ｆ）前段階の顆粒を４０℃にて１〜２％ｗ　／　ｖゼラチン水溶液でスプレーコートする。

（ｇ）ついで、耐酸性アルカリ可溶性被覆物を顆粒上にスプレーコートする。被覆物は、６％Ｗ　／　Ｗセルロースアセテートフタレート、３％ｗ　／　ｗイソプロパツール、０．５％ｗ　／　ｗヒマシ油および１００％Ｗ　／　Ｗになるまでのアセトンよりなる。

（ｈ）段階（ｇ）の代わりとして、脂肪酸または同様の乳化性物質のフィルムにより阻害された構造を有する高分子量ポリマーを最終重量が１０５％ｗ　／　ｗになるまで顆粒上にスプレーコートする。被覆は、３％ｗ　／　ｗブチルメタクリレート、０．５％ｗ　／　ｗジブチルフタレート０．０５％ｗ　／　ｗステアリン酸および１００％Ｗ／Ｗまでのエチルアセテートよりなる。

段階（ａ）において、ｋ−カラゲナンは、アルギン酸、ゼラチン、セルロースまたはその誘導体等のいずれかのゲル形成剤で置き代え得る。

段階（ｂ）において、カルシウムは、Ｋ、Ｒｂ２”、Ｃｓ２÷ ＋　、Ｍｇ　またはＳｒ２＋等のいずれかの他のアルカリ金属３＋　２＋イオン、Ａｎ　、Ｍｎ　、Ｂａ””、Ｃ０２＋、Ｎｉ２”、Ｚｎ２＋＝たはＰｂ２＋ｖの二価または三価の金属イオンまはたＮＨ４イオンあるいはトリエチルアミン、メチレンジアミン、エチルアミンまたはへキサメチレンジアミン等の脂肪族または芳香族アミン類で置き代え得る。

１、英国薬局法級のリボフラビン７．５００ｍｇを０．３％無水酢酸溶液５．０００ｍ１と混合する。水浴上で加熱し、溶解するまで振盪する。

液を５０℃まで冷却し、ついでリボフラビン溶液と混合する。

３、ついで、得られるゲル／溶液を５００ｒｐｍで１５分間均質化する。

４．１０％塩化カルシウムの蒸溜水溶液５りをゲル／溶液に加え、ついで１時間５０ｒｐｍにて均質化する。５℃まで冷却し、ゲル相をデカンテーションする。

５（ａ）、デカンテーションされたゲル１００ｇを凍結乾燥し、顆粒化して、約１００Ｍμｇ顆粒を得る。

５（ｂ、）、ゲル相の残渣を濾過し、３　／　ｃｍにおいて寸法５０ミクロンの孔により高さ３メートルで２．５％グルタルアルデヒド中に噴霧乾燥する。

６．５　（ｂ）の顆粒を濾過し、０．５％グリセロール水溶液で洗浄する。得られる顆粒を濾過し、流動化し、ついで４０℃で加熱乾燥する。全顆粒を回収する。

７、前段階の顆粒を４０℃にて最終重量が１０４％ｗ　／　ｗになるまで２％ゼラチン水溶液でスプレーコートする。

８、ついで、顆粒を最終重量が１０５％ｗ　／　ｙになるまで３％ブチルメタクリレート、０．１５％ジブチルフタレートおよび０．０５％ステアリン酸の酢酸エチル溶液でスプレーコートする。

９、顆粒を顆粒の平均寸法が５００ミクロン未満になるようにふるい分けする。

試験顆粒：生体外試験：１８「試験顆粒Ｊ５ｇと「対照顆粒Ｊ５ｇとを別々の６ｃｍＸ６ｃｍナイロンクロスバッグに配置する。

２、該バッグを密封し、ｐＨ１を示す希塩酸中に２時間浸し、６０ｒｐｍで撹拌する。

３、ついで、該バッグを酸溶液から移し変え、流水下３０分間すすぎ、ドリップ乾燥する。

４、第１胃液２００ｍ１を痩孔雌牛の開口部より回収する。

５．２つの試験バッグを第１胃液中に懸濁し、３７℃にて２４時間インキュベートする。

６、両バッグを洗浄し、ついで４０℃にて乾燥する。

７、各バッグの内容物を秤量し、リボフラビン含曾を検定対照顆粒は、ナイロンクロスバッグ中に残らない。

試験顆粒４．５２ｇは、試験顆粒を含有するナイロンバッグから回収された。試験顆粒０．４８ｇの損失は、おそらく調製法の際に適切に形成されなかった顆粒の分解によるものであろう。

第一胃液処置試験顆粒１ｇの検定結果から、バッグ中の試験顆粒４．５２ｇが総量１１４＋ｎｇのリボフラビンを含むことが計算された。未処理顆粒４．５２ｇは、リボフラビン約１１４ｍｇを含有する。

試験顆粒２ｇをナイロンバッグに再び挿入し、畜殺場から回収された十二指腸液１００ｍ１に懸濁し、３７℃にてインキュベートした。顆粒は、２時間以内に分解した。

検定法：１、第一胃液処理試験顆粒を酢酸エチル５０％１５０％水溶液１００ｍ１中に注ぎ、１時間５００ｒｐｍにて均質化する。

２、溶媒相をデカンテーションし、水相を残す。

３、この操作を３回繰り返す。

４、ついで氷酢酸３ｍｌを最終水相に加える。混合物を、溶解するまで激しく振盪しながら水浴中で加熱する。Ｎｏ。

１ワットマン濾紙により濾過し、１，０００ｍ１に希釈する。

０．１Ｍ酢酸ナトリウム５ｍｌを加え、ついでこの溶液を水で５０ｍ１に希釈する。得られる溶液の吸光度を最大的４４４ｎｗで測定する。リボフラビンの含量を約４４４　ｎｍの最大でのへ〇値（１％１ｃｍ）として３２３を取り計算した。

ＤＬ−メチオニン、食品級、３０ｇを第１段階に用いる以外は、実施例２の方法を繰り返してメチオニンを含有するマイクロ顆粒を調製する。以下、メチオニンを含有するマイクロ顆粒を「試験顆粒」という。「対照顆粒」を実施例２の方法に従って調製する。

生体外試験：１、「試験顆粒Ｊ５ｇと「対照顆粒Ｊ５ｇとを別々の６ｃｍＸ６ｃｍナイロンクロスバッグに配置する。

６、両バッグを洗浄し、ついで４０℃にて乾燥する。

７、バッグの内容物を秤量し、メチオニン含量を検定する。

結果対照顆粒は、ナイロンクロスバッグ中に残らない。

試験顆粒４．４０ｇは、試験顆粒を含有するナイロンバッグから回収された。試験顆粒０．６ｇの損失は、おそらく不完全顆粒の分解によるものであろう。

第一胃液処置試験顆粒１ｇの検定結果から、バッグ中の試験顆粒４．４０ｇが総１５６３ｍｇのメチオニンを含むことが計算された。未処理顆粒４．４０ｇは、メチオニン約５６３ｍｇを含有する。

試験顆粒２ｇをナイロンバッグに再び挿入し、畜殺場がら回収された十二指腸液１００ｍ１に懸濁し、３７℃にてインキュベートした。顆粒は、２時間以内に分解した。

検定法：１、第一胃液処理試験顆粒を５００ｍ１のガラス栓付フラスコに注ぐ。酢酸エチル５０％１５０％水溶液２００ｍ１を加え、１時間５００ｒｐｍにて均質化する。

２、溶媒相をデカンテーションして水相を残す。

３、この方法を３回繰り返す。

４、最終水相を水で２０ｍ１にする。リン酸二水素カリウム１０ｇ５リン酸−水素カリウム４ｇおよびヨウ化カリウム４ｇを加えて、よく混合して溶解する。

５、Ｏ，ＩＮヨウ素１００ｍ１を正確に加え：フラスコに栓をし：よく混合し：そして３０分間放置して、ついで過剰ヨウ素を０．１Ｎチオ硫酸ナトリウムで滴定する。ブランク決定および必要な補正を行う。ブランク決定および必要な補正を行う。０．ＩＮヨウ素各ｔｎｌは、ＤＬ−メチオニン７．４６１ｍｇと当量である。

ビタミンＢ＋　５■ ビタミンＢ　２　２　ｍｇビタミンＢ６８１ｏｇビタミン８３　８　ｍｇおよびコアがβ−ガラクトシダーゼ（３００Ｆ、Ｃ。

Ｃ，ＬＵ）を含有する本発明のマイクロ顆粒状製剤を含むペースト２ｍｌを与えられた。

ペーストを出産日および分娩後第５日に投与した。

上記処理を受けた小豚は、未処理の小豚と比較した際に増大された体重を示した。補足的に、下痢の発生照度は、マイクロ顆粒状製剤を受けた小豚において著しく減少した。

Ｃｏ１１）は、多くの割合のブタにおける新生児および離乳後の下痢の原因である。これらのバクテリアは、これらが疾病を引き起こす前に腸のレセプターに結合しなければならない。

生体外実験は、プロテアーゼであるブロメリンが腸の（糖タンパク質）Ｋ８８レセプターのに８８結合活性を退化するのに特に有効であることが示されている。

このレセプターは、Ｋ８８感受性表現型の豚の腸の粘膜表面上のみに発現する。

以下に示す実験は、小豚における下痢の処理における本発明のマイクロ顆粒製剤の有効性を説明する。

３つがいのギルド（子を産んだことのない豚）をウェリビー、アニマル、リサーチ、インスティテユート（Ｗｅｒｒｉｂｅｅ　Ａｎｉｍａｌ　Ｒｅ５ｅｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）より購入した。該ギルドのに８８表現型をカプセルテスト［チャンドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）、１９８６年）により決定した。１匹のブタ（１６５Ｇ）は、強いに８８−付着性（感染感受性）、１匹は、弱い付着性（＃２６４Ｙ）　、そして１匹は、Ｋ２Ｓ−未付着性（＃２１９Ｙ）であることが見い出された。これらの雌豚からの一腹から生まれた数は、各々７．７および９匹であった。

ギルドは、各々３日以内に分娩し、小豚は、約第３週令で離乳した。各最初の二股から４匹の小豚および残りの一腹のうち５匹をアットランダムに選択し、ブロメリン（０゜０４％ｗ　／　ｗ　）を含有する本発明のマイクロ顆粒状製剤で毎日処置した。全ての他の小腸は、未処置のままにした。

処置：ブロメリン含有マイクロ顆粒は、１０ｍ１の注射器を用いて低ｐＨカルボキシメチルセルロース中投与した。ブロメリン処置を給食前１〜２時に行なった。ブロメリンの第１服用は、離乳前日に与えられ、その後連続８日間続けられた。

接種：各５菌株のに８８　イー、コリ　（Ｅ、Ｃｏ１１）の大量接種（約５Ｘ１０”堕二、三甚／日）は、毎日族された。４菌株は、Ｋ８８大腸菌（ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）の胎児症例から単離されている。該菌株は、全て血清グループ（ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）　０１４９であった。これらは、１〜５年前の単離以来凍結結乾燥貯蔵されていた。残りのに８８＋イー、コリは、一定地域の豚の小屋における下痢の非胎児症例から最近単離された（血清グループ０１区分別不能）。

バクテリアは、羊血寒天（５％　ｖ　／　ｖ　）からリン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７，２）に懸濁された。小腸は、給食直前にバクテリアで接種された。

下痢の評価：小腸の健康または感染の程度は、（ｉ）体重；給食前に測定された体重は、離乳から層殺までの３週間において各小腸につき１７回評価された。

（ｊｉ）下痢；動物の臨床状態は、次のように行った。

正　常：下痢または脱水の徴候なし。

下痢ぎみ：ふんは、正常より明らかにより液状、脱水の徴候なし。

下　痢：ふんは、液状であり、おびただしい下痢、苛酷下痢：さらに衰弱および脱水の徴候を伴う。

死：　− （ｉｉｉ）バクテリア感染；ふん状物質が羊血寒天上におおわれた際に明らかな溶血性（ｈｌｙ　”）バクテリアコロニーの割合を決定した。

により評価された。

Ｋ８８表現型の評価：腸中央の切屑を、ギルトをつがわせた雌豚から検死時にれた小腸に浴って５つの等距離部位の付着パターンを構成することによって表現型に関して評価された。

小腸を離乳後４週間で層殺した。腸切屑のに８８表現型は、酵素免疫法［ケペイア、チャンドラ−等（ＫＰＥＩＡ、Ｃｈａｎｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、）１９８６年コにより評価された。

生まれた小腸においてのみ明らかであった。この腹からの小腸は、これらが明らかであった。この腹からの小腸は、これらがおそらくヘテロ接合体（すなわちに８８レセプター発現に関する単一優性のみを支持する）であるが、同様なに８８ −付着性である。弱い付着性雌豚（１２６４Ｙ）からの小腸は、レセプター活性が変わりやすかったが、雌豚＃６５Ｇからのものほど活性でなかった。またに８８未付着性雄豚（＃２１９Ｙ）からの小腸は、Ｋ８８未付着性であった。

下痢の日々の評価および小腸が由来する腹を示す散乱図を第２ａ図（ブロメリン処置小豚）および第２ｂ図（未処置小腸）に示す。各グループからの１匹の小腸が離乳の２４時間以内に死亡したが、下痢の発生頻度と苛酷さの両方とも、ブロメリン処置小豚が低いらしかった。これらの小腸の両方とも雌豚＃６５Ｇより生まれた。１０回の「下痢」または苛酷な下痢の記録を処置／接種期間内に行ったが、そのうち９がブロメリンを受けていない小腸においてなされた。下痢は、接種／処置期間の終了後のみにブロメリン処理グループにおいて明らかになった。

直腸スワブのブレーティングにおけるＨΩｙ　コロニーの割合を概算することによる小腸（三おける感染の程度の評価は、おそらく多量の日々の接種が明らかに影響をうけていない小腸における高い割合のＨＵｙ＋コロニーを誘いたので、はとんど利用できないことが見い出された。該生物は、おそらくこれらが危害を与えない部位に該小腸の大腸をコロニー化していたであろう。

同様に、日々の体重の増加は、ブロメリンに起因する可能な利益を評価するのにほとんど利用できなかった。低い遺伝子感受性物の小腸（雌豚＃２６４Ｙおよび＃２１９Ｙからの腹の小腸）の間に観察された一時的下痢は、体重増加にほとんど影響しなかった。

予期したとおりに、感受性雌豚（１６５Ｇ）からの小腸は、バクテリアチャレンジによってより苛酷に影響された。

各処置のグループにおける１匹の小腸が死に、未処理グループにおいて２匹の小腸のみを残した。これらの豚のうち１匹の体重増加は、該チャレンジにより苛酷に影響され、他は影響されなかった。３匹のブロメリン処置小豚のうちの１匹もバクテリアチャレンジによる苛酷な影響は残らなかった。

この実験は、Ｋ８８レセプター活性が離乳の直前および感染が生じそうなすぐ次の週において、ブロメリンを含有する本発明のマイクロ顆粒の経口接種により生体内において改質し得ることを示す。このようなマイクロ顆粒製剤は、死亡の臨床学的徴候を減少したらしい。

さらに、本発明等により実施された実験は、ブロメリンを含有する本発明Φマイクロ顆粒状製剤で処置された小腸が未処置小腸に比較して２８％の下痢の徴候の減少を示す。

大腸菌（Ｃｏ１ｉｂａｅｉｌｌｏｓｉｓ）の抑制まはた処置へのアブローを提供し得る。年々約１０００万匹の豚が大腸菌（Ｃｏｌｉｂａｃｉｌｌｏｓｉｓ）により死亡するので［ワルターズおよびセルウッド（Ｗａｌｔｅｒｓ　ａｎｄ　Ｓｅｌｌｗｏｏｄ）、１９８４年］、プロテアーゼを含有するマイクロ顆粒での処置は、養豚業に対して最も利益があるのであろう。

上記実験は、プロテアーゼであるブロスリンを使用する。

本発明者等の実験がブロスリンかに８８レセプターを衰退するのに最も有効であることを示しているが、他のプロテアーゼもあり得ることも理解すべきである。

プロテアーゼまたは糖タンパク質を破壊または変性する作用を有する酵素の組み合せを本発明のこの態様に用いてもよい。利用され得る他のプロテアーゼ類の例としては、トリプシン、真菌性プロテアーゼｐ２３、サブチリシン、プロテアーゼにおよび他の真菌性およびバクテリア性プロテアーゼがある。

多くの他の病原性バクテリアが知られており、また腸レセプターに結合することが信じられている。このようなバクテリアの例は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）、赤痢菌族（Ｓｈｉｇｅｌ　ｌａ）および連鎖法菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）がある。本発明のマイクロ顆粒製状剤内にカプセル被覆されたプロテアーゼを、動物およびヒトにおけるこのようなバクテリアでの感染を処置するのに用いてもよい。

参考文献チャンドラ−、ディー、ニス、（１９８６年）、豚におけるに８８＋イー、コリに対する遺伝された耐性。哲学博士論文、ラ　トロベ　ユニバーシイテ（−［Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｄ、Ｓ、（１９８６）、Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｔｏ　Ｋ２Ｓ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ｉｎ　ｐｉｇｓ、　Ｔｈｅｓｉｓ　ａｃｃｅｐｔｅｄ　ｆｏｒ　ｄｏｃｔｏｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｈｉｌｏｓｏｐｈｙ、Ｌａ　Ｔｒｏｂｅ　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、］。

チャンドラ−、ディー、ニス１、チャンドラ−、エイチ。

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酵素免疫検定によるに８８−非付着性表現型に関するブタ腸のスフリーリング。

ベット、ミクロパイオル、］１：第１５３〜１６１頁［Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｄ、Ｓ、　、Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｈ，）ｔ、、　、Ｌｕｋｅ、Ｒ、に、Ｊ、、Ｔｚｉｐｏｒｉ、Ｓ、Ｒ，ａｎｄ　Ｃｒａｖｅｎ、Ｊ、Ａ、（１９８６）、Ｓｃｒｅｅｎｉｌｌｇｏｆ　ｐｉｇ　１ｎｔｅｓｔｉｎｅｓ　ｆｏｒ　Ｋ２Ｓ　ｎｏｎ−ａｄｈｅｓｉｖｅ　ｐｈｅｒｉｏｔｙｐｅ　ｂｙｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ。Ｖｅｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ！、１１：１５３−１６１．１゜キッタ′− ，ディー、イー、およびマナーズ、エイ、ジニイ、（１９７８年）。豚における消化。サイエンチク。二力、ブリストール、ニー、ケイ、［Ｋｊｄｄｃｒ、Ｄ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｍａｎｎｅｒｓ、Ｍ。

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ワルダ・−ズ、ジ、−イ、アール、およびセルウッド、アール、　（１９８４年）。Ｋ２Ｓ、イー、コリに対する豚の遺伝学的耐性の性能、ブロス、オブ　ブリティッシュ、ソサエティー、オブ、アニマル、プロダクション、スカラボロウ、ニー、ケイ、第７６巻、３月２６〜２８日［Ｗａｌｔｅｒｓ、Ｊ、Ｒ，ａｎｄ　Ｓｅｌｌｗｏｏｄ、Ｒ，（１９８４）、　Ｔｈｅ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｉｇｓ　ｇｅｎｅｔｉｃａｌｉｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｔｏ　Ｋ２Ｓ　Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｃ、ｏｆ　Ｂｒ１ｔｉｓｈ　５ｏｃｉｅｔｙｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ、Ｌｌ、に、Ｐａｐｅｒ　Ｎｏ、７６．２６ｔｈ−２８ｔｈ　Ｍａｒｃｈ、］　。

臨床　喧Ｋ　◆ 己　◆ Ｓ　◆ ぴ　◆ ル　ｆ、ｔに諷　φ ネ市正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成１年２月２７日特許庁長官　吉　１）　文　毅　殿１、国際出願番号ＰＣＴ／ＡＵ８７１００２７０２、発明の名称生物学的活性物質の動物の腸雪２１へのデリバリ−に有効なマイクロ顆粒状製剤３、特許出願人住　所　オーストラリア国、ビクトリア州、ロウビレ　３１７８、ブリッジウォーター　ウェイ　２氏　名　イーング、トーマス、コ、サイ４、代理人住　所　東京都千代田区二番町１１番地９ダイアパレス二番町（１）補正書の写しく翻訳文）　１　通訂正請求の範囲国際調査報告＝１−−―−１−−１−ＡＮ−ｂ、略、−−−ｓ、ＰＣＴ／ＡＵ８７１０○２７０に８正＝ＴＯフミ二打’１７りｆｉｃＸＩ己９スχΣｋＳＫア？ＧＪｙ＝じ二ＣＮＪＩＬＡＰＰＩごλコｌ叉、３υ醒−巨四腺匹

Claims

【特許請求の範囲】

１．１以上の生物学的活性物質を固定してなるコアを有するマイクロ顆粒状製剤であって、該コアが水溶性フィルム内にカプセル被覆されかつ腸液に可溶化され得る脂肪酸または他の物質で置換されるかあるいは該窓を含有する構造を有するアルカリ可溶性酸不溶性ポリマーまたは高分子量ポリマーで被覆されたマイク口過顆粒状製剤。
２．該コアがゲルマトリックス内に１以上の生物学的活性物質を固定してなる請求の範囲第１項に記載のマイクロ顆粒状製剤。
３．該ゲルマトリックスがｋ−カラゲナン、ゼラチン、アルギネート、セルロースまたはその誘導体またはゲル形成合成ポリマー類より形成される請求の範囲第２項に記載のマイクロ顆粒状製剤。
４．該マイクロ頬粒の大きさが２５〜５００μｍである請求の範囲１項、第２項まはた第３項に記載のマイクロ顆粒状製剤。
５．該顆粒の大きさが５０〜３５０μｍである請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤。
６．該生物学的活性物質が製薬学的かつ獣医学的化合物類、酵素類、ビタミン類、タンパク質類、ワクチン類またはアミノ酸類よりなる群から選ばれた請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤。
７．該生物学的活性物質が鉄、亜鉛、またはカリウムおよびこれらの金属の塩類、ビタミンＢ１２、リボフラビン、メチオニン、β−ガラクトシダーゼまたはブロメリンからなる請求の範囲第６項に記載のマイクロ顆粒状製剤。
８．脂肪酸のフィルムが炭素数１２〜２４の脂肪酸からなる請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤。
９．水溶性フィルムがゼラチンである請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１つの記載のマイクロ顆粒状製剤。
１０．該アルカリ可溶性酸不溶性ポリマーがセルロースアセテートフタレートである請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤。
１１．高分子量ポリマーがブチルメタクリレートである請求の範囲第１項ないし第１０項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤。
１２．（ａ）コア内に１以上の生物学的活性物質を固定し、（ｂ）該固定化された生物学的活性物質をマイクロ顆粒化し、（ｃ）該マイクロ顆粒を水溶性物理的障壁でカプセル被覆し、かつ（ｄ）段階（ｃ）のマイクロ顆粒を腸液により可溶化され得る脂肪酸または他の物質の窓で置換されるかあるいは該窓を含有する構造を有するアルカリ可溶性酸不溶性ポリマーまたは高分子量ポリマーで被覆する段階からなる請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤の製造方法。
１３．該コアが固定されたβ−ガラクトシダーゼを含有する有効量の請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤を投与することからなる予め離乳された動物、特に豚における動物成長を増加する方法。
１４．該コアが固定されたβ−ガラクトシダーゼまたはプロテアーゼを含有する治療学的有効量の請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれか１つに記載のマイクロ顆粒状製剤を投与することからなる小豚における下痢の処置方法。
１５．該プロテアーゼがブロメリンである請求の範囲第１４項に記載の下痢の処置方法。