JPH022338A - 真核細肪中での同時発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は一般に蛋白質の製造に関し、さらに詳しくは生
物学的に活性な形の蛋白質を商業的に実施可能な量で製
造することに関する。

（従来の技術） 組換ＤＮＡ技法は、療法的あるいは経済的に価値ある種
々の蛋白質、例えば酵素、増殖因子及びペプチドホルモ
ンの製造のために使用されている。

これらの蛋白質は細菌又は真菌細胞において、そして−
層最近では培養された哺乳類細胞において生産される。

単細胞生物は多くのヒト蛋白質を正しくプロセシングす
ることができないので、これらの蛋白質を製造するため
には培養された哺乳類細胞を使用することがしばしば必
要である。

哺乳類細胞は、クローン化されたＤＮＡの発現のため、
よく確立された研究室的手法によりトランスフェクト（
Ｌｒａｎｓｆｅｃｔ）され得る。しかしながら、すべて
のタイプの哺乳類細胞がトランスフェクトされたＤＮＡ
配列を効率的に発現するわけではなく、そしてトランス
フェクトされた配列を効率的に発現することが示されて
いる細胞は、他の場合には、異る遺伝子産物を低レベル
でのみ生産するであろう。トランスフェクトされた遺伝
子の低い発現レベルは、蛋白質生成物の細胞内及び／又
は細胞外での分解、不活性形蛋白質の生成、又は毒性を
有する形態の蛋白質の生産に起因するであろう。低レベ
ルの蛋白質又は活性はまた、不安定なｍＲＮＡ配列、蛋
白質分解的活性化、又は宿主細胞による不適当な、不十
分なもしくは正しくないプロセシングに起因するであろ
う。新たに合成された蛋白質の活性又は分泌のために必
要であるかもしれないプロセシング段階には、特異的蛋
白質分解性開裂、サブユニッＩ・の重合、ジスルフエド
結合の形成、ある種のアミノ酸の翻訳後又は翻訳中の修
飾、及びグリコジル化が含まれる。

蛋白質生産におけるこれらの問題は高等生物に由来する
細胞の特殊化された性質を反映する。特定の組織に由来
する哺乳類細胞は、その組織によって通常作られない蛋
白質を適切には生産しないであろう。さらに、培養にお
いて増殖するように馴化された哺乳類細胞系は腫瘍又は
他の異常Ｍ１織に由来し、しばしば予想不可能な蛋白質
のプロセシングを導くであろう。　　゛ 例えば、多くの研究グループが培養された哺乳類細胞中
でヒト凝固因子■を生産している（にａｕｆｍａｎ等、
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　　２６１　：　９６２２−
９６２８．１９８６；八ｎ５ｏｎ　　等、　Ｎａｔｕｒ
ｅ　　　３１５　　：　　６８３−６８５．　１９８５
；　　ｌｌａｇｅｎ等、ＥＰ　２００．４２１；　Ｂｕ
ｓｂｙ等、Ｎａｔｕｒｅ　　３１６　：　２７１２７３
、１９８５）。強力なプロモーター、エンハンサ−増加
した遺伝子コピー数の使用により生物学的に活性な蛋白
質の生産を最大にする努力にもかかわらず、そして観宿
されるファクターＩＸ　ｍＲＮＡの比較的高いレベルに
もかかわらず、これらのトランスフェクトされた細胞系
により生産される活性ファクター■のレベルは細胞培養
培地当り約５μｇ／ｍｌを超えない。幾つかの場合には
、前駆体形のファクター■が生産されるが、成熟蛋白質
は宿主細胞から効果的に分泌されない。

蛋白質の生産に伴う問題点は従来、多数の異る細胞タイ
プを試験することにより、そして特定のトランスフォー
ムされ又はトランスフェクトされた株又はセルラインの
多数の単離体を選択及びスクリーニングすることにより
扱われてきた。この様な方法は非常に労働力を要し、そ
して必ずしも成功するとは限らない。従って、活性形の
目的蛋白質を経済的に実施可能な量で発現することがで
きる組換細胞を３■織的且つ予見可能に作り出す方法が
当業界において必要とされている。本発明はこの様な系
を提供し、そしてさらに他の関連する利点を提供する。

（発明の概要） 要約すれば、本発明は目的蛋白質を製造する方法を提供
し、この方法は、（ａ）目的蛋白質をコードする第一Ｄ
ＮＡ配列、及び該目的蛋白質をプロセシングし又は安定
化する蛋白質をコードする追加のＤＮＡ配列を咄乳類檜
主細胞に導入し；（ｂ）前記第一ＤＮＡ配列及び追加の
ＤＮＡ配列の発現が許容される条件下で前記宿主細胞を
培養し；そして（ｃ）目的蛋白質を宿主細胞から単離す
る、ことを含んで成る。ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入す
る段階は、（ａ）それぞれが別個の発現ユニットを含有
する複数のベクターによるコトランスフェクション又は
コトランスフォーメーション；又は複数の発現ユニット
を含有する単一のベクターによるトランスフェクション
又はトランスフォーメーションによることができる。宿
主細胞が哺乳類細胞である場合、導入段階はポリシスト
ロン性メツセージ（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎｉｃ　ｍｅ
ｓｓａｇｅ）に転写される単一の発現ユニットを含有す
る単一のベクターによるトランスフェクションを介する
ことができる。酵母宿主細胞が使用される場合、ＤＮＡ
配列を導入するための好ましい方法は、（ａ）追加のＤ
ＮＡ配列を含有する単一発現ユニットにより酵母宿主細
胞をトランスフォームし；　（ｂ）プロセシング活性又
は安定化活性を安定してもたらす宿主細胞を単離し；そ
して（ｃ）この単離された宿主細胞を、目的蛋白質を含
有する第一ＤＮＡ配列によりトランスフォームする、こ
とを含んで成る。好ましくは、最初のトランスフォーメ
ーション段階が酵母宿主細胞ゲノムへの単一の発現ユニ
ットの組み込みをもたらす。

好ましい第一ＤＮＡ配列には、Ｌ−ＰＡのごとき血漿セ
リンプロテアーゼ、ファクター■、ファクター■、ファ
クターＸ、プロティンＣ１及びプラスミノーゲンをコー
ドするＤＮＡ配列が含まれる。好ましい追加のＤＮＡ配
列には、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害物質、Ｔ−カ
ルボキシラーゼ、及び目的蛋白質に結合する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列が含まれる。

本発明の他の観点において、前記の目的蛋白質をコード
するＤＮＡ配列、及び該目的蛋白質プロセシング（又は
安定化せしめる１又は複数の蛋白質をコードする１又は
複数の追加のＤＮＡ配列が導入されている真核宿主細胞
が開示される。好ましい真核宿主細胞には咄乳類宿主細
胞及び酵母宿主細胞が含まれる。

（具体的な説明） 本発明を説明する前に、後に使用される幾つかの用語を
説明するのが本発明の理解のために有用であろう。

支足化工支 「安定化する」という用語は、変性からの蛋白質の保護
を記述するために使用される。安定化は多くの機構によ
り行われ、それには目的蛋白質を分解するかも知れない
蛋白質分解酵素の阻害、蛋白質分解酵素から目的蛋白質
を保護するための該蛋白質への結合、及びプロテアーゼ
の活性のために必要なコファクター又は他の分子の作用
の阻害又はそれへの結合、が含まれる。

プロセシング この明細書において使用する場合、「プロセシング」は
蛋白質の構造を変更する（ｍｏｄｉｆｙ）ことを意味す
る。蛋白質のプロセシングには、特異的蛋白質分解性開
裂による複数積蛋白質の生成又は蛋白質前駆体からのペ
プチドの除去；カルボキシル化及びヒドロキシル化を含
むアミノ酸の修飾；並びに特定の部位への炭水化物の付
加、が含まれる。

プロセシングは、蛋白質の十分な生物学的活性のために
必要な場合があり、又は細胞からの蛋白質の分泌を可能
にするために必要な場合もある。

これらは、クローン化されたＤＮＡを宿主細胞に導入す
る過程である。トランスフェクションは咄乳類細胞系へ
のＤＮＡの挿入を意味する。真菌細胞又は細菌細胞への
ＤＮＡの挿入の過程はトランスフォーメーションとして
知られている。多数のトランスフェクション法及びトラ
ンスフォーメーション法が当業界において知られている
。

前記のごとく、クローン化されたＤＮＡ配列を含有する
細胞が、該クローン化された配列によりコードされてい
る蛋白質を常に経済的に実施可能なレベルで又は生物学
的に活性な形態で生産するとは限らない。これはしばし
ば、細胞の由来又はその異常な性質のためである。多く
の場合、特定の蛋白質を所望のレベルで生産することを
可能にするために必要な特性を有する培養細胞系又は宿
主細胞株を得ることができない。ともかく、多数の可能
性ある宿主細胞系をスクリーニングすることは不可能で
あり、そして必ずしも成功するとは限らない。

本発明は、目的蛋白質をコードする遺伝子又はｃＤＮＡ
を該目的蛋白質をプロセシングし又は安定化する１又は
複数の蛋白質をコードする１又は複数の追加のＤＮＡ配
列と共に真核性宿主細胞に導入する方法を提供すること
により、入手可能な細胞の欠点を克服する。プロセシン
グ蛋白質には、特定の部位で前駆体蛋白質を開裂せしめ
ることにより成熟形及び／又は活性形の蛋白質をもたら
すプロテアーゼ、例えばペプチドもしくはプロペプチド
を除去し、又は単鎖ポリペプチドを開裂せしめて複数積
形にするペプチダーゼが含まれる。プロセシング蛋白質
の他の例は、アミノ酸を修飾する酵素、例えばＴ−カル
ボキシラーゼ、すなわちある種の凝固因子及び他のカル
シウム含有蛋白質の特定のグルタミン酸残基を修飾する
酵素、である。

他のプロセシング蛋白質には、プロティンＣの活性のた
めに必要な修飾であるアスパラギン酸のβ−ヒドロキシ
アスパラギン酸への転換を担当する酵素；糖蛋白質への
炭水化物鎖の付加を担当する酵素；並びにミリストイル
化、Ｃ−末端アミノ酸の［、プロリン残基のヒドロキシ
ル化、サルファ化及びＣ−末端アミド化を担当する蛋白
質が含まれる。安定化蛋白質には、目的蛋白質の蛋白質
分解性分解をブロンクするプロテアーゼ阻害物質：目的
蛋白質に結合してそれを基質として利用できなくする蛋
白質；プロテアーゼによって要求される蛋白質コファク
ター、イオン又は他の分子に結合する蛋白質；並びにコ
ファクターを不活性化する蛋白質が含まれる。幾つかの
プロセシング蛋白質、幾つかの安定化蛋白質、又は安定
化蛋白質とプロセシング蛋白質との組み合わせを生産す
るように特定の真核宿主細胞をトランスフェクト又はト
ランスフォームすることができる。

本発明は、種々のプロセシング蛋白質がそれらの本来の
環境の外で機能するという予想外の発見に一部基く。例
えば、通常は血液中で機能する酵素であるファクター■
が細胞内でファクター■を活性化することができること
を本明細書において開示する。あるいは、酵母ＫｒＥＸ
２遺伝子の生成物が哺乳類細胞内で正常に機能すること
が見出された。

観察されたプロセシングが示すところによれば、予想外
にも目的蛋白質及びプロセシング蛋白質の両者が同し細
胞成分に向けられる。これらのプロセシング蛋白質の観
察される機能はまた、目的蛋白質が組換細胞中で大量に
又は無傷のもしくは活性な形態で生産されないという観
点から驚くべきことである。

目的の天然蛍白質、及び必要により、それをコードする
遺伝子又はｃＤＮＡを特徴付けることにより、その生合
成に関与するプロセシング段階の性質を（１Ｆ定するこ
とができる。組換形蛋白質の特徴付けにより、これが正
しくプロセシングされているか、及びもしそうでなけれ
ばどのプロセシング段階が略されているかが明らかとな
ろう。本発明に従えば、失われた活性を補充し又は限定
的な活性を増強することにより適切なプロセシングが提
供される。この活性は目的蛋白質を通常プロセシングす
る蛋白質として、又は他の情況においで類似の機能を通
常行う関連蛋白、例えば異る細胞型からの蛋白質、とし
て補給される。後者の場合の例は、プロティンＣ又は活
性化されたプロティンＣ＠駆体を二本鎖形に開裂せしめ
るプロセシング蛋白質を提供する酵ｉＩ）■兵遺伝子の
使用である。目的蛋白質の分泌のブロツクは組換蛋白質
の細胞内形及び分泌された形を特徴付けることにより決
定することができる。この方法により欠落したプロセシ
ング段階又は制限的プロセシング段階が決定される。

幾つかの場合には、欠落した活性を提供する蛋白質正体
を知るであろう。この場合、所望の遺伝子又はｃＤＮＡ
がクローン化され、そして選択された宿主細胞中に導入
される。

欠落した活性を担当する蛋白質が未知の場合、目的蛋白
質が分析され、欠落したプロセシング段階の性質が決定
され、そしてその機能を行うことが知られている蛋白質
が選択される。適切な蛋白質が、類似の活性を有する蛋
白質をコードする既知の及び利用可能なりＮＡ配列から
選択され得る。

例えば、Ｋｅｔｔｎｅｒ及びＳｈａｗ　（ＭｅＬｈ、ｉ
ｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

朋：　　８２６−８４２．１９８１）は多数のプロテア
ーゼの特異性を特徴付けた。あるいは、咄乳類発現ライ
ブラリーにより細胞をトランスフェクトし、そして必要
な活性を示ず細胞を選択することにより、必要なプロセ
シング蛋白質をコートするＤＮＡ配列を同定することが
できる。

蛋白質の安定化が所望される場合、目的蛋白質を生産す
るようにトランスフェクト又は！・ランスフオームされ
た細胞を種々の安定化蛋白質の存在下で増殖せしめ、そ
して無傷の目的蛋白質の生産についてアッセイする。一
般に、細胞を放射性同位元素で標識し、そして蛋白質を
放射免疫沈澱及びゲル電気泳動により、又は他の常法に
より分析する。無傷の目的細胞の培養液中での存在は、
安定化蛋白質が目的蛋白質を分解から保護していること
を示す。安定化はまた、宿主細胞の表現型変化を導く場
合がある。例えば、プロテアーゼ活性は細胞の肌着を惹
起する場合があり、これはこの決定を阻害することによ
り修正され得る。この修正は正常な（付着性）表現型の
存在により示される。

所望の安定化又はプロセシング蛋白質が同定された場合
、それをコードするＤＮＡ配列及び目的蛋白質をコード
するＤＮＡ配列が下記のようにして選（Ｒされた宿主細
胞に導入される。導入された配列を発現する細胞を選択
し、そして所望の形態の目的蛋白質の所望のレベルでの
生産についてスクリーニングする。次に、これらの基準
を満たす細胞をクローン化し、そして生産のためにスケ
ールアツブする。

本発明の方法によって生産され得る目的蛋白質には、種
々の血漿セリンプロテアーゼ、例えば凝固因子であるフ
ァクター■、■及びＸ、活性化されたファクター■（フ
ァクター■ａと称する）、活性化されたファクターＸ（
ファクターＸａ）、プロティンＣ１活性化されたプロテ
ィンＣ，プロティンｓ、Ｍｉ織プラスミノーゲン活性化
因子（ｔＰＡ）　、プラスミノーゲン、並びにこれらの
類似体及び誘導体が含まれる。但し、実質的にあらゆる
目的蛋白質を製造することができる。これらの方法はこ
れらのセリンプロテアーゼの製造に特に適する。これら
の活性及び／又は宿主細胞による分泌のために必要な翻
訳後プロセシングのためである。

本発明によれば、生物学的活性のために特定のグルタミ
ン酸残基のＴ−カルボキシル化を必要とする凝固因子を
、Ｔ−カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列が導入
された細胞に高レベルで発現せしめることができる。Ｔ
−カルボキシル化段階が、組換凝固因子の生産のために
一般に使用される哺乳類細胞において制限定であること
が本発明者等により見出された。さらに、本発明は酵母
細胞のごとき非咄乳類細胞での生物学的に活性なＴ−カ
ルボキシル化蛋白質の生産を可能にする。

ファクター■をコードするＤＮＡ配列及びファクター■
をコードするＤＮＡ配列により細胞をトランスフェクト
することにより活性化形の凝固因子■を生産することが
できる。ファクター■の前駆体形がファクター■により
活性化され、そしてファクター■ａが細胞により分泌さ
れる。あるいは、ファクター■の誘導体又はＴｈ’Ｑ（
身体をコードするＤＮＡ配列及びファクター■をコート
するＤＮＡ配列を同時発現せしめることにより、ファク
ター■ａの生物学的活性を有する蛋白質を生産すること
ができる。ファクター■の類似体及び誘導体をコードす
るＤＮＡ配列は米国特許出願Ｎｏ、７２１，３１１及び
Ｎｏ、８１０，００２　、並びに公開されたヨーロッパ
特許出願ＥＰ　２００．４２１に記載されている。ファ
クター■の活性化形が療法的に価値を有することが示さ
れているため、活成化形を直接生産することが望ましい
。直接生産は収量を増加せしめ、そして製造工程の数を
減少せしめ、そして血液製剤を活性化することに伴う問
題点を除去する。

他の態様において、プロティンＣ１活性化されたプロテ
ィンＣ１修飾されたプロティンＣ又は活性化されたプロ
ティンＣ前駆体をコードするＤＮＡ配列が、酵母皿遺伝
子を発現するようにトランスフェクトされた細胞系に挿
入される。この遺伝子は、二塩基性アミノ酸配列の後を
開裂せしめるエンドペプチダーゼをコードする　（Ｆｕ
ｌｌｅｒ等、ｉｎ　Ｌｅｉｖｅｌｉ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏ　　、　１９８７．　２７３　２７８゜１９８６）
。プロティンＣ軽鎖のＣ−末端から塩基性アミノ酸を除
去する酵素をコードする酵母■■遺伝子（Ｄ＋ｎｏｃｈ
ｏｗｓｋａ等、並置＋’　５０　：　５７３−５８４．
１９８７）により細胞をさらにトランスフェクトするこ
とにより、プロセシングはさらに増強されよう。変形さ
れたプロティンＣ前駆体は米国特許出願Ｎα９２４．４
６２及びＮα１３０，３７０　、並びに公開されたヨー
ロッパ特許用１９１ＥＰ　２６６．１９０に記載されて
いる。好ましいプロティンＣ及び活性化されたプロティ
ンＣ前駆体は、軽鎖と重鎖との間の開裂部位にアミノ酸
配列Ｒ，−Ｒｔ−Ｒ３−１１４−ＸＲ５−Ｒ，−Ｒヮー
Ｒ８を包み、ここでＲ，−Ｒ，はＬｙｓ又はＡｒｇであ
り、そしてＸはペプチド結合又は１〜１２個、好ましく
は２〜８個のアミノ酸から成るスペーサーアームである
。

活性化されたプロティンＣはまた、活性化されたプロテ
ィンＣ前駆体、トロンビン及びトロンボモジュリンをコ
ードするＤＮＡ配列によりトランスフェクトされた細胞
系においても生産され得る。

トロンヒンはトロンボモジュリンの存在下で活性化され
たプロティンＣ前駆体（プロティンＣの二本鎖型）を開
裂せしめ、そして活性化されたプロティンＣは細胞によ
り分泌される。活性化されたプロティンＣ前駆体は米国
特許出願Ｎｏ、９２４，４６２及びＮｏ、１３０，３７
０　、並びに公開されたヨーロッパ特許出願ＵＰ　２６
６．１９０に記載されている。

ファクター■ａ及びファクターＩＸａはファクターＸを
同時発現するようにトランスフェクトされた細胞系にお
いて生産され得る。ファクターＸはファクター■又はフ
ァクター■を開裂せしめ、活性化された凝固因子の分泌
をもたらす。

他の態様において、ｔ−ＰＡ又はｔ、ＰＡｉ似体もしく
は誘導体とプロテアーゼ阻害物質との両者を生産するよ
うに宿主細胞系をトランスフェクトすることにより、ｔ
−ＰＡ又はｔ−ＰＡ類似体もしくは誘導体の生産が増強
される。これに関して適当なプロテアーゼ阻害物質には
ＴＩＭＰ　（メタロプロテアーゼの組織阻害物質）、ト
リプシン阻害物質及びアプロチニンが含まれ、アプロチ
ニンが特に好ましい。ｊ−ＰＡの類似体又は誘導体は米
国特許出願Ｎｏ、８２２．００５　（対応する公開され
た日本特許出願Ｎｏ、６３−１３３．９８８）、ＮＱＯ
Ｏ４，９９５、Ｎｏ、０５３，４１２、Ｎｏ、０５３，
４１１　、Ｎｏ、０５８，０６１　、Ｎｏ、０５８．２
１？　、及びＮ。

１２５．６２９　、並びにヨーロンパ特許出願公開Ｎ。

１９６．９２０　、Ｎｏ、２０１，１５３　、及びＮｏ
、２４０，３３４に記載されている。商業的に実施可能
なレベルでのＬ　−ＰＡの発現は今まで困難であった。

なぜなら、ＬＰＡのセリンプロテアーゼ活性は支持表面
からの細胞の脱着をもたらすからである。このため、増
殖培地中にアプロチニンのごとき薬物を使用することが
必要となる。培地中でのアプロチニンの使用はまた、好
ましい療法物質であるｔ−ＰＡの単鎖形の生産を可能に
する。しかしながら、アプロチニンは高価であり且つ入
手可能性に限界がある。

プラスミノーゲン及びプロテアーゼ阻害物質の両者を生
産する様にトランスフェクトされた細胞を用いて、プラ
スミノーゲンを無傷の形で生産することができる。プラ
スミノーゲンの変形体（米国特許出１ｔＪＩＮｏ、０５
３，４１２に記載されているような）を生産することも
できる。これに関して特に好ましいプロテアーゼ阻害物
質はα−１−アンチトリプシンである。但し、α−１−
アンチトリプシンの変形体（米国特許Ｎｏ、４，７１１
，８４８）及び他のプロテアーゼ阻害物質を使用するこ
ともできる。プラスミノーゲンの細胞内活性化及びこれ
に続く分解が合理的なレベルで組換プラスミノーゲンを
生産する可能性を制限してきた。ＡＡＴによるプラスミ
ノーゲン活性の阻害がこの問題を改善するかもしれない
。

蛋白質安定化物質の組み合わせの他の例はプロティンＳ
の同時発現によるプロティンＣの安定化、フォノ・ウィ
ルブランド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子の同
時発現によるファクター■の安定化、及び組織因子の同
時発現によるファクター■の安定化を包含する。Ｂｉｐ
（Ｂａａｓ及び−ａｂｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　　３０６　
：　３８７−３８９、１９８３）もまた種々の蛋白質を
安定化するために使用され得る。Ｂｉｐをコードするｃ
ＤＮＡはＭｕｎｒ。

及びＰｅｌｈａｍ（Ｃｅｌｌ　４６　：　　２９１−３
００．１９８６）により記載されている。

本発明を実施するために有用なりＮＡ配列は当業界にお
いて知られている標準的方法によりクローン化すること
ができる。ゲノム配列又はｃＤＮＡ配列を使用すること
ができる。多くのこの様なりローン、ｔ−ＰＡをコード
するＤＮＡ　（Ｐｅｎｎｉｃａ等、Ｎａｔｕｒｅ、　３
（狭：　２１４−２２１．１９８３）、ファクター■を
コードするＤＮＡ（ｌｌａｇｅｎ等、前掲；　　ｌｌａ
ｇｅｎ等、Ｐｒｏｃ。

アクター−■をコードするＤＮＡ（Ｋｕｒａｃｈｉ及び
Ｄａｖｉｅ。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　　
７９　　：　　６４６１−６４６４．　１９８２）、プ
ラスミノーゲンをコードするＤＮＡ（Ｍａｌｉｎｏｗｓ
ｋｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　２３　：　４２４
３　４２５０．１９８４　；　Ｆｏｒｓｇｒｅｎ等、Ｆ
ＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　２１３　：　２５４．１９８７）
、α−１−アンチトリプシンをコート′するＤＮＡ　（
Ｌｏｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉ旦■、　２３　：　４８
２８−４８３７．１９８４　；　Ｋａｗａｓａｋｉ、米
国特許Ｎｏ、４，５５９，３１１）、プロティアＣをコ
ードするＤＮＡ（Ｆｏｓ　ｔｅｒ及びＤａｖｉｅ、　　
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬＩｓＡ８１
　：　４７６６−４７７０．１９８４　；　Ｆｏｓｔｅ
ｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａ目。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＬＩｓＡ、　８２、：　４６７３−
４６７７、１９８５）　、プロトロンビンをコードする
ＤＮＡ（Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇａｎ等、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒ　、　２２　：　２０８７−２０９７．１
９８３）　、ファクター■をコードするＤＮＡ　（Ｔｏ
ｏｌｅ等、Ｎａｔｕｒｅ、　３１２：３４２−３４７．
１９８４）、フォノ・ウィルブランド（ｖｏｎＷｉｌｌ
ｅｂｒａｎｄ）因子をコードするＤＮＡ　（Ｌｙｎｃｈ
等、子をコードするＤＮＡ（Ｓｐｉｃｅｒ等、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８４　：　５１４８　５１５２．１
９８７）、及びファクタ−ＸをコードするＤＮＡ　（Ｌ
ｅｙ　ｔｕｓ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ２５　：　５
０９８−５１０２．１９８６）が文献に記載されている
。

アミノ酸配列データーに基いて設計されたオリゴヌクレ
オチドプローブ又はクローン化されたＤＮＡ断片を用い
てコスミド、ゲノム又はｃＤＮＡライフラリ−をスクリ
ーニングすることにより、あるいは目的蛋白質に対する
抗体を用いて（Ｙｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ、　　Ｐｒｏ
ｃ、ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＬＩＳＡ、　８０　
；　１１９４１１９８、１９８３）を用いて、リガンド
フ゛ロンティングにより　（Ｓｉｋｅｌａ及び１ｌａｈ
ｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ、　８４　：　３０３Ｂ−３０４２，１９８７
）又は活性についてアッセイすることによりスクリーニ
ングされる発現ライブラリーから、追加のクローンを得
ることができる。

クローン化されたＤＮＡ配列を適当な発現ベクターに挿
入し、これを用いて適当な真核性宿主をトランスフェク
トし又はトランスフォームする。

哺乳類細胞において本発明を実施するために使用される
発現ベクターは、哺乳類細胞に導入されたｃＤＮＡ又は
クローン化された遺伝子の転写を指令することができる
プロモーターを含んで成る。転写を指令する効率のため
ウィルスプロモーターが好ましい。特に好ましいプロモ
ーターはアデノウィルス２からの主要後期（ｍａｊｏｒ
　１ａｔｅ）プロモーターである。他の適当なプロモー
ターにはＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ等
、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、土：８５４８６４、１
９８１）及びＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロ
モーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ＋　２
２２：８０９−８１４．１９８４）が含まれる。この様
な発現ベクターはさらに１セントのＲＮＡスプライス部
位をを含有することができ、これらの部位はプロモータ
ーから下流であってクローン化されたＤＮＡ配列のため
の挿入部位から上流に、又はクローン化された配列自体
内に位置することができる。好ましいＲＮＡスプライス
部位はアデノウィルス及び／又は免疫グロブリン遺伝子
から得ることができる。さらに発現ベクター中には挿入
部位の下流に位置するポリアデニル化シグナルを含有す
る。ウィルスポリアデニル化シグナル、例えばＳＶ４０
からの前期又は後期ポリアデニル化シグナル、又はアデ
ノウィルス５Ｅ＋ｔｌＪｉ域からのポリアデニル化シグ
ナルが好ましい。本発明の実施において有用な発現ベク
ターはまた非コードウィルスリーダー配列、例えばプロ
モーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置するアデ
ノウィルス２トリパルタイト（ｔｒｉｐａｒｔｉ　ｔｅ
）リーダーを含むことができる。好ましいベクターはま
た転写エンハンサ−配列、例えばＳＶ４０エンハンサ、
及び翻訳エンハンサ−配列、例えばアデノウィルスＵＡ
　ＲＮ＾をコードする配列を含有することができる。

クローン化されたＤＮＡ配列を含有するベクターは次に
、例えばリン酸カルシウム介在トランスフェクション（
Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　　７
　：　６０３＋１９８１　；　Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎ
　ｄｅｒ　Ｅｂ、　ｕ匹旦■、　、５２　：　４５６＋
１９７３）又はエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎ
ｎ。

ＥＭＢＯＪ、、土：８４１−８４５．１９８２）により
、培養された哺乳類細胞に導入され得る。細胞集団の小
部分がＤＮＡをゲノムに組み込み、又はＤＮＡを非染色
体積構造に維持する。これらの組込み体を同定するため
、選択可能な表現型（選択マーカー）を付与する遺伝子
が目的遺伝子と共に細胞に導入される。好ましい選択マ
ーカーには゛、薬物、例えばネオマイシン、ハイグロマ
イシン、及びメトトレキセートに対する耐性を付与する
遺伝子が含まれる。リン酸カルシウム−介在トランスフ
ェクションが用いられる場合、選択マーカーは目的遺伝
子と同時に別個のプラスミド−トで細胞に導入され、あ
るいはそれらは同じプラスミド上に導入される。

同一プラスミド上の場合、選択マーカー及び目的遺伝子
を異るプロモーター又は同一のプロモーターの制御のも
とに置くことができる。後者の配置はニジストロン又は
多シストロンメッセージとして知られるものをもたらす
。このタイプの構成物は当業界において知られている（
例えば、ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ、１１７．０５８
；米国特許Ｎｏ、４．７１３．３３９）。

細胞がＤＮＡを取り込んだ後、これらと一定期間、典型
的には１〜２日間増殖せしめることにより目的遺伝子の
発現を開始せしめる。次に、選択マーカーを発現しつつ
ある細胞の増殖について選択するために薬物選択を適用
する。メトトレキセート選択を用いる場合、薬物濃度の
段階的増加がクローン化された配列の増加したコピー数
の選択を可能にし、上昇した発現レベルをもたらす。こ
れらの細胞のクローンは目的蛋白質の生産についてスク
リーニングすることができる。通常のスクリーニング法
には免疫学的アッセイ及び活性測定が含まれる。

本発明において使用するために好ましい哺乳頚セルライ
ンにはＣＯ５（八ＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、　［１Ｉ
ＩＫ（八ＴＣＣＣＣＬ　１０）及び２９３（ＡＴＣＣ１
５７３）細胞系並びにこれらの細胞系の誘導体及び単離
体が含まれる。但し、特定の蛋白質の生産のためには他
の細胞系も好ましい。好ましい細胞系はｔｋ−ｔｓ　１
３　ＢＩＩＫ細胞系（Ｗａｅｃｈ　Ｌｅｒ及びＢａｓｅ
ｒｇａ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｉ
ＪＳＡ及：　１１０６−１１１０．１９８２）であり、
これを以後Ｌｋ−ＢＩＩＫ細胞と称する。他の有用な付
着性細胞系にはＲａｔｌｌｅｐ　　［（八ＴＣＣＣＲＬ
　　１６００）、　　Ｒａｔ　　ｌ１ｅｐＨ（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ　　１５４８）ＴＣ門Ｋ（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３
９）、ヒト肺細胞系（ＡＴＣＣＣＣＬ７５．１）　、ヒ
ト−肝癌（八ＴＣＣＨＴ８−５２）　、ｌ１ｅｐ　Ｇ２
（ＡＴＣＣＩＩＢ　８０６５）、マウス肝細胞（ＡＴＣ
ＣＣＣ２９，１）、及びＤＵＫＸ細胞（Ｕｒｌａｕｂ及
びＣｈａｓｉｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

八ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　７７　：　４２６６　４
２２０．１９８０）が含まれる。有用な発現細胞系には
八ｔｐ−２０（ＡＴＣＣＣＣＬ　８９）。

ＭＯＬＴ−，１（ＡＴＣＣＣＩ？Ｌ　１５８２）、　［
３Ｗ５１４７．Ｇ、１．４．０ＩＪＡＲ，１（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ　　１５８８）、　　　５１９４１５．ＸＸＯ，
ＩＩＵ、１（ＡＴＣＣＴｌＢ２０）、　ＥＬ４．ＢＵ、
１．０ＵＡｒ１．１（ＡＴＣＣＴＩＢ　４１）、　Ｓｐ
　２１０八ｇ１４（ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５８１）、　
　Ｊ５５８Ｌ（Ｏｉ等、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　８０　：　８２５　８２
９．１９８３）、及びＲａｊｉ（八ＴＣＣＣＣＬ　８６
）が含まれる。

一般に、宿主細胞系は、目的蛋白質を高レベルで生産す
るその能力、及び該蛋白質の生物学的活性のために必要
なプロセシング段階の少なくとも幾つかを行うその能力
に基いて選択されるであろう。この方法において、宿主
細胞にトランスフェクトされなければならないクローン
化されたＤＮＡ配列の数が最小にされ、そして生物学的
に活性な蛋白質の全体収率が最大にされるであろう。し
かしながら、本発明は実質的にあらゆる蛋白質を、生体
外で培養することができる実際上あらゆる細胞系におい
て生産することを可能にする。

目的蛋白質をコードするＤＮＡ配列、並びにプロセシン
グ及び／又は安定化蛋白質をコードするＤＮＡ配列を同
一ベクター上又は異るベクター上で細胞に導入すること
ができる。選択マーカーの不安定性から生ずる可能性が
ある問題を最小にするため、１個の選択マーカーを有す
る単一ベクターを用いるのが好ましい。１つのベクター
上の複数の遺伝子又はｃＤＮＡは別個のプロモーター又
は単一のプロモーターにより制御することができる。

ポリシストロンメソセージを生じさせる後者の配置にお
いては、複数の遺伝子又はｃＤＮＡは翻訳終止シグナル
及び開始シグナルにより分離されるであろう。多数のＤ
ＮＡ配列を用いるトランスフェクションの場合、ベクタ
ーのサイズの実際的な制限のために、それぞれが自らの
選択マーカーを有する複数のベクターを使用することが
必要となろう。

言うまでもなく、目的蛋白質及び安定化又はプロセシン
グ蛋白質の同時発現の場合はいつでも複数のベクターを
使用することができる。

他の真核性細胞、例えば酵母及び糸状菌もまた本発明に
おいて使用することができる。これらの下等真核性宿主
は哺乳類細胞系に勝る幾かの利点を提供し、この利点に
は培養の容易さ及び既存の工業的発酵能力を用いる経済
性が含まれる。この明細書に記載するようにして細胞を
操作することにより、クローン化されたＤＮＡ配列を発
現することができる真核細胞又は他の真核性細胞を用い
て実質的にあらゆる蛋白質を製造することができる。

例えば、パン酵母〔サツカロミセス・セレビシェ−（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
細胞をクローン化された外来ＤＮＡ配列によりトランス
フォームし、そして高細胞密度に培養することができ、
そしてクローン化されたＤＮＡを発現せしめそして外来
蛋白質を分泌するであろう。しかしながら、幾つかの場
合には外来蛋白質は分泌されず、又は適切なプロセシン
グの欠如もしくは蛋白質分解のために不活性である。例
えば、酵母細胞は蛋白質をＴ−カルボキシル化すること
ができず、又は糖蛋白質に哺乳類型の複雑な炭水化物鎖
を付加することができない。本発明に従えば、欠失した
蛋白質（例えば、Ｔ−カルボキシラーゼ、又はグリコジ
ル化酵素）をコードするＤＮＡ配列により酵母宿主細胞
をトランスフォームすることにより前記プロセシングの
欠如を克服することができる。プロテアーゼ阻害物質又
は目的蛋白質に結合する蛋白質を生産するように細胞を
トランスフォームすることにより外来蛋白質の分解を克
服することができる。適切な結合蛋白質の例としてＢｉ
ｐが挙げられる。結合蛋白質はまた、外来蛋白質のコン
ホーメーションを変えることによりその分泌を増強する
ことができる。さらに、外来プロテアーゼを生産するよ
うに酵母細胞をトランスフォームすることにより、分泌
及び／又は生物学的活性のために特異的開裂を必要とす
る外来蛋白質（例えば、哺乳類セリンプロテアーゼ）の
゛活性形を前記酵母細胞が生産しそして分泌することが
できるようにすることができる。分泌ペプチドと成熟蛋
白質との連結点はを操作することにより、同時発現され
たプロテアーゼ（例えばトロンビン）によって成Ｗ１蛋
白質が放出されるようにすることができる。

真核性微生物、例えば酵母サツカロミセス・セレビシェ
−１又はアスペルギルス　（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ）
の種のごとき糸状菌を既知の方法によりトランスフォー
ムすることができる。アスペルギルスの種は、例えばＹ
ｅｌｔｏｎ等の方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　８１　：　１７４０−１７４７．１９８４）
に従ってトランスフォームすることができる。アスペル
ギルスの特に好ましい種にはＡ、ニガー（Ａ−恒Ｊｕ）
、Ａ、ニドランス（Ａ、　　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）　、Ａ
、　オリゼー（八。

■ｕ匹）　、及びＡ、テレウス（Ａ、　　ｔｅｒｒｅｕ
ｓ）が含まれる。酵母をトランスフォームするための方
法は、例えばＢｅｇｇ（Ｎａｔｕｒｅ、　２７５　：　
１０４−１０８．１９７８）により記載されている。酵
母において使用するための発現ベクターには、ＹＲｐ７
　（Ｓ　ｔｒｕｈ　Ｉ等、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　７６　　：
　　１０３５　　１０３９．　１９７９）。

ＹＥｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈ等、Ｇｅｎｅ、　　８　：
　１２１　１３３．１９７９）。

ｐＪＤＢ２４８及びｐＪＤＢ２１９　（Ｂｅｇｇｓ、前
掲）、並びにこれらの誘導体が含まれる。この様なベク
ターは一般に選択マーカー、例えばに飢変異を有する宿
主株において選択を可能にする栄養マーカーエ、又は冨
培地増殖するｔｐｉ−株における選択を可能にするＰＯ
ＴＩ選択マーカー（Ｋａｗａｓａｋｉ及びＢｅ１ｌ、　
ＥＰ１７１、１４２）を含有するであろう。酵母発現ベ
クター中で使用される好ましいプロモーターには、酵母
解糖系遺伝子からのプロモーター（ＩＩ　ｉ　ｔｚｅｍ
ａｙ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５５　：　１
２０７３−１２０８０．１９８０；　Ａｌｂｅｒ及びＫ
ａｉｎａｓａｋｉ、　Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　　１．Ｇｅｎｅ
ｔ、、１．４１９−４３４゜１９Ｂ２　；にａｗａｓａ
ｋｉ、米国特許Ｎｏ、４，５９９，３１１）、又はアル
コールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇ等、Ｇｅｎ
ｅｔｉｃ　　Ｅｎ　　１ｎｅｅｒｉｎ　　ｏｆ　　Ｍｉ
ｃｒｏｏ　　ａｎｉｓｍｓ　　ｆｏｒ　　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ１１ｏ１１ａｅｎｄｅｒ等編集、３３５頁、Ｐｌ
ｅｎｕｍ、ニューヨーク、１９８２　；及び八ｍｍｅｒ
ｅｒ＋　Ｍｅｔｈ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

１０１　：　１９２−２０１．１９８３）が含まれる。

酵母トランスフォーマント中で生産された目的蛋白質の
分泌を促進し、そして適切なプロセシングを得るため、
一般にシグナル配列を設けることができる。好ましくは
、シグナル配列は分泌される蛋白質をコートする酵母遺
伝子から得られるであろう。特に好ましいシグナル配列
は肚αｌ遺伝子のプレープロ領域（Ｋｕｒｊａｎ及びＨ
ｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚ、　Ｃｅ旦、３０：９３３９４３
、１９８２　：　Ｋｕｒｊａｎ等、米国特許Ｎｏ、４．
５４６．０８２　；及びＳｉｎｇｈ、　ＥＰ　１２３，
５４４）である。

酵母における複数のＤＮＡ配列の同時発現は幾つかの方
法で達成することができる。好ましくは、プロセシング
又は安定化蛋白質のための発現ユニットは宿主細胞ゲノ
ムに組み込まれ、そしてプロセシング又は安定化活性を
安定に生成する単離体が選択される。次に、目的蛋白質
をコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクターを宿主
株にトランスフォームする。あるいは、２個の発現ユニ
ットが異る選択マーカーを有する自律複製する異る発現
ベクター上に置くことができ、又は単一の発現ベクター
上に置くことができる。

好ましい態様においては、外来プロセシング蛋白質をコ
ードするＤＮＡ配列を、類似の機能を有する酵母蛋白質
をコードするＤＮ、Ａ配列中に挿入する。この挿入は、
酵母蛋白質のプロセシング機能をコードする酵母配列を
外来配列で置き換えるように設計される。特に好ましい
この様な酵母蛋白質はＫＥＸ２遺伝子産物である。この
蛋白質は分析されており、そしてその触媒ドメイン及び
他のドメインは特徴付けられている　（Ｆｕｌｌｅｒ等
、Ｙｅａｓ　ＬＣｅｌｌ　Ｂｉｏｉｏ　　、　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙコールド・スプリング・バーバー、ニューヨーク。

１９８７、１８１頁）。次に、外来ＤＮＡ配列並びに輸
送ドメイン及び細胞局在化（ｃｅｌｌｕｌａｒ　１ｏｃ
ｏｌｉｚａｔｉｏｎ）ドメインをコードする酵母配列を
含んで成る、得られるバイブリド配列を酵母プロモータ
ー及びターミネータ−に連結する。好ましくは、プロモ
ーターは強力なプロモーター、例えばＴＰＩＩプロモー
ターである。この構成物はさらに、発現ユニットを宿主
細胞ゲノム中の特定の組み込み部位に向けるためのフラ
ンキング配列を含有することができる。

本発明に従って生産された蛋白質は細胞条件化（ｃｅｌ
ｌ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）培地から、当業界におい
て知られている種々の方法により精製することができ、
この方法は特定の蛋白質の物理化学的特性に従って選択
することができる。適当な方法にはアフィニティークロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過、高速液体クロマトグラフィー、及びこれらの方法
の組み合わせが含まれる。

本発明に従って製造された蛋白質は、医薬工業、研究及
び他の目的のために組成物として用いることができる。

医薬用途のため、蛋白質は一般に生理的に許容されるキ
ャリヤー又は稀釈剤、例えば無閉水又は無菌塩溶液と混
合され、そして無菌バイアル中に個々の投与量で包装さ
れる。あるいは、蛋白質は凍結乾燥形で凍結乾燥し、そ
して投与、前に再熔解することができる。投与は一般に
注射又は注入によるであろう。医薬組成物はさらに、医
療的価値がある追加の蛋白質又は他の化合物、助剤、局
所麻酔薬等を含有することができる。

次に例により本発明をさらに具体的に説明するが、これ
により本発明の範囲を限宿するものではない。

■ 特にことわらない限り、常用の分子生物学技法を用いた
。制限エンドヌクレアーゼ及び他のＤＮＡ修飾酵素（例
えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、ウシアルカリホス
ファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼｌ　Ｋｌｅｎｏ−断片
、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）はベセスダ・リサー
チ・ラボラトリースニューイングランドバイオラブス又
はベーリンガー・マンハイムから入手し、そして供給者
の指示に従って、又はＭ　ａ　ｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ
　”Ｊ　’ｆｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　
：八ＬａｂｏｒａｔｏｒＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇｌｌａｒｂｏｒＬａｂ。

ｒａｔｏｒｙ＋　コールド・スプリング・ハーバ−３ニ
ユーヨーク、　１９８２に記載されている様にして使用
した。オリゴヌクレオチドはアプライド・ハイオシステ
ムス・モデル３８０＾ＤＮＡ合成機で合成し１、そして
変性ゲル上でのポリアクリルアミドゲル電気泳動により
精製した。

炎上　　　プースミノーゲン　　　　　の組繊プラスミ
ノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は文献に記載されてい
る。例えば、Ｐｅｎｎ１ｃａ等（前掲）、Ｋａｕｆｍａ
ｎ等（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　　５　：１７
５０−１７５９．１９８５）、及びＶｅｒｈｅｉｊｅｎ
等（ＥＭＢＯＪ、。

五が３５２５−３５３０．１９８６）を参照のこと。成
熟しＰＡのためのコード配列を含んで成るｃＤＮＡクロ
ーンを、Ｂｏｉｖｅｓ黒色腫細胞系（Ｒｉｊｋｅｎ及び
Ｃｏ１１ｅｎＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５６　：
　７０３５　７０４１．１９８１）からのｍＲＮＡを出
発材料として用いて本発明者の研究室において作製した
。次に、このｃＤＮＡを用いてプラスミドｐＤＲ１２９
６を作製した。ｐＤＲ１２９６によりトランスフォーム
されたＥ、コリＪＭ８３株は、アメリカン・タイプ・カ
ルチュアー・コレクションにＡＴＣＣ５３３４７として
寄託されている。

ｐＤＲ１２９６中のｃＤＮＡを合成されたオリゴヌクレ
オチドから作製された断片に連結することにより、む−
ＰＡのブレープロ・ペプチドをコードする配列を含む様
に該ｃＤＮＡを延長した。合成されたプレプロ断片をＢ
ａｍ１ｌ　ｌで消化されたｐＵｃ８に挿入した。

プラスミドｐｉ（Ｊ９Ｒ（Ｍａｒｓｈ等、Ｇｅｎｅ、　
３２　：　４８１　４８６１９８４）をＳｍａ　Ｉ及び
１Ｉｉｎｄ［ｌにより消化した。次に、？　７ブ位置２
７０　（Ｐｖｕ　ＩＩ　）から５１７１位（Ｉｌｉｎｄ
ｌｌｌ）までのＳＶ４０のｏｒｉ領域を線状化されたｐ
ｌｃ１９Ｒに連結してプラスミドＺｅｍ６７を作製した
。次に、このプラスミドをＢｇｌ　ＩＩにより開裂せし
め、そしてヒト成長ホルモン遺伝子（Ｄｅ　Ｎｏｔｏ等
、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　　９　：　３７１９
　３７３０．１９８１）からのターミネークー領域をＢ
ｇｌ　［１−ＢａｍＨＩ断片として挿入し、プラスミド
Ｚｅｍ８６　（第１図）を作製した。合成されたｔ−Ｐ
Ａプレープロ配列をＢａｍｔｌ　Ｉ及びＸｈｏ　ＩＩに
よる消化によってｐＵｃ８から取り出した。この断片を
Ｂｇｌ　ＩＩで消化したＺｅｍ８６に挿入してプラスミ
ドＺｅｍ８８を作製した。プラスミドｐＤＲ１２９６を
Ｂｇｌｌｌ及びＢａｍＨＩで消化し、そしてｔ−ＰＡ　
ｃＤＮ八断へを１し、そしてＢｇｌＴＩで切断したＺｅ
ｍ８８に挿入した。得られるプラスミドをＺｅｍ９４と
命名した。

ＭＴ−１プロモーター、完全なｔ−ＰＡコード配列及び
ヒト成長ホルモン（ｈ　Ｇ　Ｈ）ターミネータ−を含ん
で成るベクターＺｅｍ９９を次に第１図に示すように組
み立てた。ＭＴ−１プロモーターを含んで成るＫｐｎ　
Ｉ　　ＢａｍＨＩ断片をＴＴｈＧＨｌｌｌ　（Ｐａｌｍ
ｉｔｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ、　２２２　：　８０９−
８１４．１９８３）から単離し、そしてｐＵｃｌＢに挿
入してＺｅｍ９３を作製した。

ｐＢＲ３２２誘導体ｐＢＸ３２２　（ＰａｌｍｉＬｅｒ
等、前掲）中にＭＴ−１及びｈＧＨ配列を含んで成るプ
ラスミドＥＶ１４２をＥｃｏＲＩで消化し、そしてＭＴ
−１プロモーター及びｈＧＨターミネータ−配列を含ん
で成る断片を単離した。この断片をＥｃａＲＩにより消
化されたｐＵｃ１３中にクローン化してプラスミドＺｅ
ｍ４を作製した。次に、Ｚｅｍ９３をＢａｍ１（Ｉ及び
Ｓａｌ　Ｉにより消化して線状化した。Ｚｅｍ４をＢｇ
ｌ　ＩＩ及び５ａｌｌにより消化し、そしてｈＧＨター
ミネータ−を精製した。ｔ、−ＰＡプレープロ配列を５
ａｕ３Ａ断片としてｐＵｃ９ヘクターから取り出した。

次に、３つのＤＮＡ断片を連結し、そしてＺｅｍ９７　
（第２図）の構造を有するプラスミドを選択した。Ｚｅ
ｍ９７をＢｇｌＩＩにより切断し、そしてｐＤＩ？１２
９６からのＢｇｌ　ＩＩ　−Ｂａｍｌｌ　Ｉ　　ｔ−Ｐ
Ａ％片を挿入した。得られたベクターをＺｅｍ９９と命
名した。

プラスミドｐＳＶ２−ＤＩＩＦＲ（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ
等、前掲）をＣｆｏ　Ｉで消化し、そしてＤＩＩＦＲｃ
ＤＮＡ及び３′付付加ＳＶ４０列を含んで成る断片を単
離し、修復し、そしてＢａｍ１ｌ　Ｉリンカ−に連結し
た。ＢａｍＨＩで消化した後、全ｃＤＮＡ及びＳＶ４０
ターミネータ−領域を含有する約８００ｂｐ断片を精製
し、そしてＢａｍＨＩで消化したｐＵｃ８に連結した。

第２図に示すように、Ｚｅｍ６７をＢｇｌＩ［で消化し
、そしてＢａｍＨＩ　　ＤＩＩＦＲ−ｓｖ４０１！Ｆｒ
片と連結してプラスミドＺｅｍ１７６を生成せしめる。

プラスミドＺｅｍ９３を５ｓｔｌで消化し、そしてＭＴ
Ｉへの５′側の約６００ｂｐの配列が除去されたプラス
ミドＺｅｍ１０６を生じさせた。プラスミドＺｅｍ１０
６をＥｃｏＲＩで消化し、そしてプラスミドＺｅｍ１７
６からのＤ　Ｉｔ　Ｐ　Ｒ遺伝子を含有する１ＥｃｏＲ
！断片に連結した。得られたプラスミドをＺｔｓ１３と
命名した。プラスミドＺｔｓ１３をＲａｍ）ｌ　ｆで消
化し、そして全ｔ、−ＰＡコード領域及びｈ　Ｇ　Ｈタ
ーミネータ−配列を含有するプラスミドＺｅｍ９９から
のＢａｍｔｌ　Ｉ断片に連結した。

得られるプラスミドをＺｔｓ１５と命名した。

Ｚｔｓ１５をＢａｍｔｌ　Ｉにより部分消化し、修復し
、そして再連結することにより３′のＢａｍ１ｌ　１部
位が破壊されたプラスミドＺｅｍ２１９を生成せしめた
（第２図）。

次にＺｅｍ２１９をＸｈｏ　［により部分消化し、修復
し、そして再連結することにより３′のＸｈｏ　１部位
が破壊されたプラスミドＺｅｍ２１９ａを生成せしめた
（第５図）。

次に、アプロチニンをコードするＤＮＡ配列を、成ｐ　
ｊ　−ｐ　Ａをコードする配列の代りにＺｅｍ２１９ａ
に挿入した。Ｚｅｍ２１９ａをＢｇｌ　Ｉ［及びＸｂａ
　Ｉで消化し、そしてベクター断片を回収した。合成ア
プロチニン遺伝子を含有するｐＵＣ系プラスミドである
プラスミドｐＫＦＮ−４１４を＾ｖａＩ［及びＸｈａ　
Ｔで消化し、そして約１５０ｂｐのアプロチニン断片を
回収した。（合成アプロチニン遺伝子の配列は第１５図
に示される。）この断片は、アプロチニンコード配列の
５′末端を欠く。オリゴヌクレオチドＺＣ１９０８（セ
ンス鎖：　５　’　−ＣＡＴ　ＣＴＡ　ＧＧＣＣＴＧ　
ＡＴＴＴＣＴ　　ＧＴＴ　　ＴＧＧ　　ＡＡＣＣＴＣＣ
ＡＴ　　ＡＣＡ　　ＣＴＧ−３”）及びＺＣ１９０９（
アンチ−センス鎖：　５　’　−ＧＡＣＣＡＧ　ＴＧＴ
ＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＴＴ　　ＣＣＡ　　ＡＡＣＡＧ
Ａ　　ＡＡＴ　　ＣＡＧ　　ＧＣＣＴＡ−３’　　）を
アニールしてアプロチニン配列の５′末端及びこのアプ
ロチニン配列をｔ−ＰＡプレープロ配列とフレームを合
わせて連結するためのＢＩｌ！ｌ■部位を得た。次に、
約ｔｓｏｂｐのアプロチニン断片、アニールしたオリゴ
ヌクレオチド及びＺｅｍ２１９ａ断片を連結してＺｅｍ
２５２を作製した。

プラスミドＺｅｍ２１９ａ及びＺｅｍ２５２をリン酸カ
ルシウム法によりｔｋ−１３＋ＩＫ細胞に同時トランス
フェクトした。トランスフェクトされた細胞をメトトレ
キセートを用いて選択し、そしてＬ−ＰＡの生産につい
てスクリーニングした。陽性クローンを放射能ラベルし
、そして培地をラビット抗−アプロチニン抗体を用いて
アプロチニン生産についてスクリーニングした。アプロ
チニン生産クローンを選択した。

ノブ ヒトα−１−アンチトリプシン（ＡＡ′Ｆ）の主要形を
コートするｃＤＮＡをヒト肝ｃＤＮパライブラリ−から
、バルーン配列（Ｋｕｒａｃｈｉ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Δｃａｄ。

Ｓｃｉ、ｆｌｓＡ、　７８　：　６８２６　６８３０．
１９８０　；及びＣｈａｎｄｒａ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍ、、　１０３．７５
１　７５８１９８１）をＤＮＡハイブリダイゼーション
プローブとして用いる常法により単離した。このライブ
ラリーはヒト肝ｃＤＮＡライブラリーをプラスミドｐＢ
Ｒ３２２（Ｂｏｌｉｖｅｒ等、Ｇｅｎｅ、　　２　：　
９５　１１３．１９７？）のＰｓｔ１部位に挿入するこ
とによって作製した。

へへＴ　ｃＤＮ八をこのライブラリー６Ｐｓｔｌ断片と
して単離した。この断片をｐＵｃ１３のＰｓｔ１部位に
挿入してプラスミドｐＵｃα１を生成せしめた。ｐＵｃ
αｌ中で、ＡＡＴ配列はその３′末端にポリリンカー中
のＸｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲ１部位を有する。第４図に示
すように、このｃＤＮＡ配列を用いてプラスミドｐＦＡ
ＴＰＯＴをイ乍１凋した。プラスミドｐＦＡＴＰＯＴは
、サツカロミセス・セレビシェ−２１８株トランスフォ
ーマントＡＴＣＣ２０６９９としてＡＴＣＣに寄託され
ている。

次に、ＡＡＴ　ｃＤＮＡをプラスミドｐＭＶＩ１１　中
のＴＰＩＩ（トリオース・ボスフェート・イソメラーゼ
遺伝子）ターミネータ−に連結した。このプラスミドは
さらにＴＰＩＩプロモーターを含んで成り、そして次の
様にして組み立てた。プラスミドｐｌｃ７（Ｍａｒｓｈ
等、Ｇｅｎｅ、　３２　：　４８１　４８６．１９８４
）をＥｃｏＲＩで消化し、この断片の末端をＤＮＡポリ
メラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）により平滑化し、そし
てこの線状ＤＮＡをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて再環
化した。生ずるプラスミドを用いてＥ、コリＲＲＩをト
ランスフォームした。プラスミドＤＮＡを形質転換体か
ら調製し、そしてＥｃｏＲ１部位の喪失についてスクリ
ーニングした。正しい制限パターンを有するプラスミド
をｐｌｃ７ＲＩ”　と命名した。ＴＰＩＩプロモーター
断片を、第４図に示すようにしてプラスミドｐＴＰＩｃ
１０　（八１ｂｅｒ及びＫａｗａｓａｋｉ、　Ｊ、Ｍｏ
１ｅｃ、工＾」）］λ」ユＧｅｎｅｔ、　、土：　４１
９−４３４．１９８２）から得た。このプラスミドを、
韮遺伝子内のユニークにｐｎ１部位において切断し、Ｂ
ａ１３１エキソヌクレアーゼによりＴＰ１１コード領域
を除去し、そしてＩＥｃｏＲ［リンカ−（配列：　ＧＧ
ＡＡＴＴＣＣ）をプロモーターの３′末端に付加した。

Ｂｇｌ　ＩＩ及びＥｃｏＲ１による消化によりＢｇｌ　
ＩＩ及びＥｃｏＲＩ接着末端を有する韮プロモーター断
片を得た。次にこの断片を、ｈｌＩＩ及びＥｃｏＲＩに
より切断されたプラスミドＹＲｐ７’　（Ｓｔｉｎ−ｃ
ｈｃｏｍｂ等、Ｎａｔｕｒｅ、　２８２　：　３９４３
．１９７９）に連結した。

得られるプラスミドＴＥ３２を［！ｃｏＲ１及びＢａｍ
１ｌ　ｌで開裂せしめることによりテトラサイクリン耐
性遺伝子の部分を除去した。次に、線状化されたプラス
ミドを前記のＥｃｏＲ［−Ｂａｍｌｌ　Ｉリンカ−の付
加により再環化してプラスミドＴＥＡ３２を生成せしめ
た。

プラスミドＴＥへ３２をＢｇｌＩｌ及びＥｃｏＲＩによ
り消化し、そして約９００ｂｐの部分的用具プロモータ
ー断片をゲル精製した。プラスミドｐｌｃ１’１ｌｌ（
にａｒｓｈ等、前掲）をＢｇｌ［Ｉ及びＥｃｏＲＩで切
断し、そしてベクター断片をゲル精製した。次に、ＴＩ
’１１プロモーター断片を線状化されたｐｌｃ１９１１
に連結し、そしてこの混合物を用いてＥ、コリＲＲＩを
トランスフォームした。プラスミドＤＮＡを調製し、そ
して約ｑｏｏｂｐのＢｇｌ　ＩＩ　−４ｃｏＲＩ断片の
存在についてスクリーニングした。正しいプラスミドを
選択し、そしてｐｌｃＴＰ［Ｐを命名した。プラスミド
ρＩＣ７１？Ｉ“を１１ｉｎｄｌｌｌ及びＮａｒ　ｒに
より消化し、そして２５００ｂｐ断片をゲル精製した。

Ｎａｒ　Ｉ及びＳｐｈ　Ｉを用いてｐｌｃＴＰＩｒ’か
ら部分的韮プロモーター断片（約９００ｂｐ）から取り
出し、そしてゲル精製した。ｐＦＡＴＰＯＴをｓｐｈ　
１及び１ｌｉｎｄｌｌにより消化し、そしてＴＰＩＩブ
ロモーター、八ＡＴ　ｃＤＮＡ及びＴＰＴＩターミネー
タ−を含んで成る１７５０ｂｐ断片をゲル精製した。次
に、１？Ｉｃ７ＲＩ”断片、乳プロモーター断片、及び
ＰＦＡＴＰＯＴからの罪プロモーターーＡＡＴ７ＴＰ１
１ターミネータ−断片を三元連結で結合せしめてｐＭν
Ｒ１を生成せしめた（第４図）。

ン トランスフェクトされだ補乳類細胞によるα１−アンチ
トリプシンの発現及び分泌のため、アミノ酸番号２から
のＡＡＴの全コード領域を含有するプラスミドｐＭνＲ
１からの［ｌａｍＨＩ　−Ｘｂａ　Ｉ断片を単離し、そ
してＢａｍ１ｌ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化された２６ｍ
２１９ａ（例１）に挿入した。

ＡＡＴ発現発現ツクター製するため、２６ｍ２１９ａを
ＢｇｌＩＩ及びＸｂａ　Ｉで消化し、そしてｔ−ＰＡコ
ード領域を除去した。オリゴヌクレオチドＺＣ１１７３
（５’　−ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡ−３’　）及びＺＣ１
１７４（５’ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＡ−３’・）をアニー
ルせしめてＢｇｌ　ＩＩ　−Ｘｈｏ　ＩＩアダプターを
形成した。次に、ＡＡＴ断片、アダプター及び綿状化さ
れたベクターを三方連結によって連結してＺｅｍ２３５
を作製した（第５図）。

アダプターがＬ−ＰＡプレープロ配列及びＡＡＴ配列の
リーディングフレームを正しい配列し、そしてＡＡＴ配
列の５′末端から失われたｇｌｕコドンを回復した。

プラスミドＺｅｍ２３５をエレクトロポレーションによ
りｔｋ−ＢＩＩＫ細胞にトランスフェクトした。４８時
間後にメトトレキセート選択を適用し、そして２週間後
に多数のクローンを拾い上げ、そして拡げ、そして培地
に分泌されたα−１−アンチトリプシンのレベルについ
て特徴付けた。約２０μｇ／ｍＩｌ／口の速度でＡＡＴ
を分泌する１つのクローンを選択し、そして２３５−６
と命名した。

プラスミノーゲンをコードするｃＤＮＡをワシントン大
学、シアトル、ワシントン、のＭａｒｋ　Ｍａｒｋｓｏ
ｎ博士から入手した。Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉ等（前掲）
により記載された部分的ｃＤＮＡクローンを用いてスク
リーニングしてλフアージライブラリーからクローンを
単離した。ｃＤＮＡの配列を第６図に示す。

常法に従って、陽性クローンからλフアージＤＮＡを３
１１製した。λファージをＥｃｏＲ［部分消化にかけ、
そして全コード配列を含有する約２８００ｂｐのＥｃｏ
ＲＩ断片を回収し、そしてｐＵｃ、１９のＥｃｏＲＩ部
位にクローン化してプラスミドｐＵｃ１９−Ｐ１ｇを作
製した。

コード配列の５′末端を含有する１８３ｂｐのＢａ１ｌ
ＥｃｏＲＩ断片をｐＨｃ１９−Ｐ！ｇから単離し、そし
てＳｍａ　Ｉ及び［１ｃｏｎ　Ｉで消化したｐＵｃ１８
中にクローン化して５′末端にＢａｍ１ｌ　［部位を付
加した。生ずるプラスミドをＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲｒ
で消化し、そして１９０ｂｐｌｊＩｒ片を単離した。

プラスミドｐＵｃ１９−Ｐ１ｇをＥｃｏＲＩ及びＥｃｏ
Ｒｖテ消化し、そしてｃＤＮＡの中央領域を含有する断
片を単離した。

プラスミノーゲンｃＤＮＡの３′部分を得るため、アミ
ノ酸５４１をコードするコドンから始まる断片をｐｌＪ
ｃ１１８にサブクローニングした。生ずるプラスミドを
ＥｃｏＲＶ及びＸ’ｂａｌで消化し、そして約６６０ｂ
ｐの３′プラスミノ一ゲン断片を単離した。

３つのプラスミノーゲンｃＤＮＡ断片（Ｂａｍｌｌ　Ｉ
−ＥｃｏＲＩ　、　ＥｃｏＲ［−ＥｃｏＲＶ、及びＩＥ
ｃｏＲＶ　−Ｘｂａ　ｌ　）を［ｌａｍｌｌ　１及びＸ
ｂａ　Ｉにより消化されたＺｅｍ２１９ｂと連結してプ
ラスミド２１９ｂ　−Ｐｌｇを生成甘めした。

（２６ｍ２１９ａをＢａｍ１ｌ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消
イヒし、　１−ＰＡｃＤＮ八配列をへ去し、そしてベク
ター断片を［ｌａｍｌｌ　ＩＸｂａ　Ｉアダプターによ
り連結することによりＺｅｍ２１９ｂが誘導された。）
次に、Ｂａｍｔｌ　１プラスミノ一ゲン断片をＺｅｍ２
１９ｂ　−Ｐｉｇから取り出し、そしてＢａｍ１ｌ　Ｉ
で消化されたＺｅｍ２２８に挿入した。Ｚｅｍ２２８を
作製するため、Ｚｅｍ６７をｌ１ｉｎｄｌＩＩ及びＢｇ
ｌＴＩにより消化し、ｐＳＶ２ｎｅｏ　（Ｓｏｕ　ｔｈ
ｅｒｎ及びＢｅｒｇ＋　Ｊ。

Ｍｏ１．Ａ　　１．Ｇｅｎｅｔ、、　　１　：　３２７
−３４１．１９８２）からのＨ４ｎｄ　ＩＩＩ　　Ｂａ
ｍＨＩ　　ｎｅｏ＋５Ｖ４０ターミネータ−断片を挿入
した。生ずるベクターを２０ｍ２２０と命名した。

プラスミドＺｅｍ９３を５ｓｔｌで消化して上流ＭＴ−
１配列を除去し、そしてベクターを再環化してＺｅｍ１
０６を作製した。Ｚｅｍ２２０をＥｃｏＲ［で消化し、
そしてＳＶ４０プロモーターｎｅｏ　−ＳＶ４０ターミ
ネータ−の発現ユニットを含有する断片を回収し、そし
てＥｃｏＲｌで消化されたＺｅｍ１０６に連結した。Ｚ
ｅｍ２２３と称する得られたヘクターはＳＶ４０プロモ
ーター及びＭＴ−１プロモーターを反対の方向に含有し
ていた。Ｚｅｍ２２３をＢａｍＨＩで消化し、そして２
３７ｂｐのＢｃｌ　Ｉ　−Ｒａｍ）Ｉ　Ｉ　　ＳＶ４０
ターミネータ−断片を挿入した。生じるプラスミドをＺ
ｅｍ２２８　（第３図）と命名した。Ｚｅｍ２２８由来
のプラスミノーゲン発現ヘクターをＺｅｍ２２８　　Ｐ
ｌｇと命名した。

Ｚｅｍ２２８−　Ｐｉｇを、本質的にＮｅｕｍａｎｎ　
（前掲）により記載されているようにして、エレクトロ
ポレーション法によりＡＡＴ発現細胞系２３５−６にト
ランスフェクトした。エンザイム・リンクド・イムノソ
ルヘント・アッセイ（ＥＬ［ＳＡ）によりプラスミノー
ゲンの生産についてコロニーを選択しそして測定した。

この測定においては、捕捉抗体としてヒトプラスミノー
ゲンに対するヤギポリクローナル抗血清（アメリカン・
ダイアグノスチ力）を使用した。ヒトプラスミノーゲン
に対するビオチン化ラビットポリクローナル抗体及びア
ビジン接合ホースラデイツシュパーオキシダーゼにより
免疫反応物質を検出した。

１０個の陽性クローンを６−ウェルＭｉ織培養皿に入れ
た。細胞が８０〜９０％コンフルエントになった時、こ
れらをシスティン欠損培地に１時間置いた。各ウェル（
１ｍｌ培養体積／ウェル）に５０マイクロキユリーの３
５３−システィンを添加し、細胞を一夜インキユベート
し、そして測定のために培地を採取した。

細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、そして細胞質プラスミノーゲ
ンを測定するために抽出物を調製した。

細胞をｌｄのＲＩＰ　Ａ　１ｕｌｌ衝液（１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ７，４）１％デオキシコレート、１％トリ
トン Ｏ．　１％ＳＤＳ，　　５ｍＭ　ＥＤＴＡ，　０．７Ｍ
　　ＮａＣｆ）中に）懸濁した。細胞溶解物をドライア
イス上で２回凍結−解糖し、そして１０．００Ｏｒｐｍ
にて１５分間冷却しながら遠心分離した。次に、上清を
用いて放射免疫沈澱を行った。

培地及び細胞抽出サンプルを放射免疫沈澱によりプラス
ミノーゲンについて測定した。サンプル（０．　１　〜
１．　０　ｍｌの体積で）を５〜１０μｌの免疫部属・
清と混合し、氷上で１時間インキュへ一トシ、そして次
に５０〜ｔｏｏｙのスタフィロコッカス・アウレウス（
Ｓｔａ　ｈ　ｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｕｒｅｕｓ）（パ
ンソルビン、シグマ・ケミカル社，セントルイス、Ｍｏ
）と混合し、そして氷上で１時間インキュベートした。

遠心分離の後、上清をヒトプラスミノーゲンに対するラ
ビットポリクローナル抗血清（ヘーリンガーーマンハイ
ム）５Ｉと混合し、そして氷上で１時間インキュベート
した。５０μ！のスタフィロコッカス・アウレウスを添
加し、そして混合物を氷上で１時間インキュベートした
。細胞をペレット化し、そしてこのペレットを、０．５
％ＮＰ　−　４０及び０．　１％ＳＤＳを含有する１ｍ
ｌのＰＢＳにより洗浄した。洗浄された細胞をペレット
化し、そして５０μｌのＰＢＳ　＋５０μｌの２Ｘロー
デイング緩衝液（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐ！１６．８）
、　１６％グリセロール、３．２％ＳＯＳ，　８％β−
メルカプトエタノール、０．００２％ブロモフェノール
ブルー）中に再）懸濁し、５分間煮沸し、１０％ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動した。蛋白質を銀染色に
より可視化し、そしてオートラジオグラフィーにかけた
。

測定結果が示すところによれば、ＡＡＴ生産細胞は全長
プラスミノーゲンを培地に分泌した。これに対して、対
照ＢＨＫ細胞（すなわち、２１９ｂＰ１ｇでトランスフ
ェクトされているがＺｅｍ２３５によってはトランスフ
ェクトされていない細胞）は検出可能な量のプラスミノ
ーゲンを分泌せず、そして細胞質中に分解されたプラス
ミノーゲンを含有していた（第７図）。

ヒトプロティンＣの部分をコードするｃＯＮＡを、Ｆｏ
ｓ　Ｌｅｒ及びＤａｖｉｅ（前掲）により記載されたよ
うにして調製した。要約すると、λｇｔｌｌ　ｃＤＮＡ
　ライブラリーをヒト肝臓ｍＲＮＡから常法に従って調
製した。

ヒトプロティンＣに対する抗体であってアフィニティー
精製され１２Ｓ１−標識されたものを用いてクローンを
スクリーニングし、そしてプレート・ライセード法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ等、前掲）及びこれに続く塩化セシウム
勾配上でのハンド形成により、陽性クローンからファー
ジを調装した。ＥｃｏＲＩを用いてｃＤＮＡＤＮＡ挿入
数種出し、そしてプラスミドｐＵｃ９　（Ｖｉｅｉｒａ
及びＭｅｓｓｉｎｇ、　　Ｇｅｎｅ、　１９．２５９　
２６８゜１９８２）中にサブクローニングした。制限断
片をファージヘクターＭ１３＋ｙ＋ｐｌＯ及びＭ１３ｍ
ｐＨ（Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　［ｎｚ　ｍｏｌｏ　　、　１０１　
：２０−７７、１９８３）にサブクローニングし、そし
てジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ、　７４　：　５４６３　
５４６７１９７７）により配列決定した。ヒトプロティ
ンＣの既知部分配列（Ｋｉｓｉｅｌ、　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、
ＩｎｖｅｓＬ、、　Ｇ４　：　７６１７６９、１９７９
）に対応するＤＮＡを含有しそして軽鎖のアミノ酸６４
から始まりそして重鎖を通って３′−非コート領域に延
びるプロティンＣをコードするクローンを選Ｉ尺した。

このクローンをλ１ｌｃ１３７５と命名した。プロティ
ンＣをアミノ酸２４からコードする第二ｃＤＮＡクロー
ンを同定した。

このクローンからの挿入部をｐＵｃ９にサブクロ一二ソ
グし、そしてこのプラスミドをｐＨｃλ６Ｌと命名した
。このクローンは、プロティンＣの大部分をコートし、
重鎖コード領域、ターミネーションコドン及び３′−非
コード領域を含む。

λｌＩＣ１３７５からのｃＤＮＡをα−３２Ｐ　ｄＮＴ
Ｐを用いてニックトランスレーションし、そしてこれを
用いて、ファージスシャロン４Ａ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ
等、釦旦、　１５゜６８７−７０２．１９７８）中のヒ
トゲノムライブラリーを、Ｂｅｎ　ｔｏｎ及びＤａｖｉ
ｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６　：　１８１−１８２．１
９７７）のプラークハイブリダイゼーション法のＷｏｏ
　ＣＭｅ±Ｌ江」旦り坦ｙｉ＋則：３８１−３９５．１
９７９）の変法によりプローブした。陽性クローンを単
離し、そしてプラーク１青製した　（Ｆｏｓ　ｔｅｒ等
、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　ｌ　、八ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２　：　４６７３　４６７７、１
９８５）。陽性クローンから工周袈したファージＤＮＡ
　（Ｓｉｌｔ＋ａｖｙ等、上≧ｙＬρコ）１：ｊ−ｍｅ
ｎｔｓ　ｗｉｔｈ　Ｇｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎ、　　コー
ルド・スプリング・バーバー・ラボラトリ−１１９８４
）を１ＥｃｏＲＩ又はＢｇＩｎにより消化し、そしてゲ
ノム挿入部を精製し、そしてｐＵｃ９にサブクローニン
グした。挿入制限断片をＭ１３ベクター中にサブクロー
ニングし、そして配列決定してそれらの由来を確認し、
そして完全な遺伝子のＤＮＡ配列を確立した。

プロティンＣのプレープロペプチドのアミノ酸４２〜−
１９に対応するエクソンを含有するゲノム断片を単離し
、そしてニックトランスレーションし、そして１ｌｅｐ
　Ｇ２細胞からのｍＲＮ八を用いてＧｕｂｌｅｒ及びＨ
ｏｆｆｍａｎ　（Ｇｅｎｅ、　２５　：　２６３　２６
９．１９８３）の方法によりイ乍製されたｃＤＮパライ
フ゛ラリ−をスクリーニングするためのプローブとして
使用した。この細胞系はヒト肝細胞に由来し、そしてプ
ロティンＣを合成することがあらかじめ示されている（
Ｆａｉｒ及びＢａｈｎａｋ、　Ｂｌｏｏｄ、　６４　：
　１９４−２０４．１９８４）。ファンλｇｔｌｌのＥ
ｃｏＲ１部位に挿入されたｃＤＮＡを含んで成る１０個
の陽性クローンを単離し、そしてプロティンＣ遺伝子の
５′−非コード領域に対応するオリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いてスクリーニングした。１つのクローンがこ
のプローブを用いても陽性であり、そしてその全ヌクレ
オチド配列が決定された。このｃＤＮＡは７０ｂｐの５
′−非翻訳配列、ヒトプレプロ−プロティンＣの全コー
ド配列、及び第二のポリアデニル化部位に対応する全３
′−非コード領域を含有していた。

Ｂ、ベクター　Ｄ５の乍−１１ 第８図に示すように、ｐＤＨＦＲＩＩＩからベクターｐ
Ｄ５を誘導した。ｐＤＨＦＲｍ　（Ｂｅｒｋｎｅｒ及び
５ｈａｒｐ＋Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３：
　　８４１　８５７．１９８５）中のＤＩＩＰＲ配列か
らすぐ上流のＰｓｔ１部位を次の様にしてＢａｍ１１１
部位に転換した。１０μｇのプラスミドを５ユニントの
Ｐｓｔｌにより３７°Ｃにて１０分間、１００μｌの緩
衝液Ａ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、　１０ｍＭ
　Ｍｇｃｇ、。

６ｍＭ　ＮａＣ１，、７ｍＭ　β−ＭＳＩ＋）中で消化
した。ＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈澱し、
そして１０ｍＭ　ｄＣＴＰ及び１６ユー’−７トのＴ４
　ＤＮＡを含有する４０ｐｌの緩衝液Ｂ　（５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、　７ｍＭ　ＭｇＣｆｚ。

７ｍＭβ−ＭＳＩ＋　）中に再懸濁し、そして１２°Ｃ
にて６０分間インキユヘートした。ＥＬＯＩＩ沈澱の後
、ＤＮＡを、４００ユニツトのＴ４ポリヌクレオチドリ
ガーゼを含有する１４ｕの緩衝液Ｃ（１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ（ｐＨ８）　１０ｍＭ　ＭｇＣｌ！、ｚ、　１ｍＭ　
ＤＴＴ、　１．４．ｍＭ　ＡＴＰ）中で２．５μｇのキ
ナーゼ処理されたＢａｍｔｌ　［リンカ−とｌ２°Ｃに
て１２時間連結した。フェノール抽出及びＥｔ０１１沈
澱の後、ＤＮＡを１２０Ｉの緩１１ｉ液Ｄ〔７５ｔｎＭ
　ＫＣＩ！、　６ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ７，５）、　
１０ｍＭ　ＭｇＣ１，ｚ、　１ｍＭＤＴＴ　）に再懸濁
し、１００ニー’−ントのＢａｍ１（Ｉで５０°Ｃにて
６０分間消化し、次にアガロースを通して電気泳動した
。ｐ８Ｒ３２２及びヘクター配列を含有する４、　９　
ｋｂ　　ＤＮＡ断片（１０バｇ）をゲルから単離し、５
０ユニントのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含有する
ｒＯｔｔｌの緩衝液Ｃ中で１２°Ｃにて２時間連結し、
そしてこれを用いてＥ、コリＨ［１１０１をトランスフ
ォームした。陽性コロニーを迅速ＤＮＡ調製分析により
同定し、そしてプラスミドＤＮＡ（ｐＤＩＩＰＲ’　と
称する）を３周製した。

次に、下記の様にしてプラスミ）”　Ｐ　Ｄ　１を作製
した。まず２５ｔｔｔｒのｐｓＶ４０　　ＣｐＭＬ　　
１　（Ｌｕｓｋｙ及びＢｏＬｃｈａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ
、　２９３　：　７９−８１．１９８１）のＢａｍ１１
１部位に、Ｂａｍ１（Ｉで消化され゛たＳＶ４０　ＤＮ
Ａがクローン化されている〕を１００μノの緩衝液り中
で２５ユニントのＢｏｉｌにより５０°Ｃにて６０分間
開裂せしめ、次に５０ユニツトのＢａｍＨｌを加えてさ
らに３７°Ｃにて６０分間インキュベートした。プラス
ミドｐＤＩＩＦＲ’をＢａｍＨＩにより線状化し、そし
てウシ腸ホスファターゼにより処理した。ＤＮＡ断片を
アガロースゲル電気泳動により分離し、そして４、９　
ｋｂ（７）　ｐＤｌ（ＦＲ’断片及び０．２ｋｂ　ＳＶ
４０断片を単離した。これらの断片（２００ｎｇのｐＤ
ＨＦＲ’　ＤＮＡ及び１１００ｎのＳＶ４０　ＤＮＡ）
をｌＯＯユニットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを含
有する１０４の緩衝液Ｃ中に１２°Ｃにて４時間インキ
ュベートし、そして生成する構成物（ｐＤｌ）を用いて
Ｅ、コリＲＲＩをトランスフォームした。

第８図に示すようにして、ｐＢＲ３２２ｉＪｔ域中の″
“毒性（ｐｏｉｓｏｎ）　”配列（Ｌｕｓｋｙ及びＢｏ
ｓｋｙ　、前掲）を除去することによりプラスミドｐＤ
１を変形した。

プラスミドｐＤｌ　（６，６μｇ）及びｐＭＬ−１（Ｌ
ｕｓｋｙ及びＢｏｔｃｈａｎ　、前掲）（４μｇ）を５
０μ！の援衝液Ａ中で１０ユニントずつのＥｃｏＲＩ及
びＮｒｕ　Ｉと共に３７°Ｃにて２時間インキュベート
し、次にアガロースゲル電気泳動にかけた。１．７　ｋ
ｂのｐＤ１１！Ｆｒ片及び１．８ｋｂのｐｌ’ｌＬ　−
１断片を単離し、そして１００ユニントのＴ４ポリヌク
レオチドリガーゼを含有する２０バの緩衝液Ｃ中で１２
°Ｃにて２時間連結し、次にＥ、コリＩＩＢＩＯＩにト
ランスフォームした。所望の構成物（ｐｐＤｌと称する
）を含有するコロニを迅速調製分析により同定した。次
に、１０バｇのｐｐＤｌを２０ユニツトずつのＥｃｏＲ
Ｉ及びＢｇｌｌｌにより５０μノの緩衝液Ａ中で３７°
Ｃにて２時間消化した。ＤＮＡをアガロースを通して電
気泳動し、そしてｐＭＬ−１，３′スプライス部位及び
ポリＡ配列を含んで成る目的の２．８ｋｂ断片（断片Ｃ
）を単離した。

ｐＨ５の作製に使用される残りの断片を生じさせるため
、ｐＤＨＦＲＩＩＩを変形してＳａｃ　ＩＩ　（Ｓｓｔ
　ＩＩ　）部位をｌ１ｉｎｄＩ［［又はＫｐｎ　１部位
のいずれかに転換した。

１０バｇのｐＤｌｌＦＲＩ［Ｉを２０ユニントの５ｓｔ
ＩＩにより３７°Ｃにて２時間消化し、次にフェノール
抽出及びエタノール沈澱を行った。再懸濁したＤＮＡを
１０ｍＭ　ｄＣＴＰ及び１６ユニ・ントのＴ４　ＤＮ八
へリメラーゼを含有する１００ｐ７の緩衝液Ｂ中で１２
°Ｃにて６０分間インキュベートし、フェノール抽出し
、透析し、そしてエタノール沈澱した。ＤＮＡ　（５鱈
）を５０ｎｇのキナーゼ処理されたｌｌ１ｎｄ［Ｉリン
カ−又はＫｐｎ　Ｉリンカ−と、４００ユニツトのＴ４
　ＤＮＡリガーゼを含有する２０Ｉ１１の緩衝液Ｃ中で
１２°Ｃにて１０時間連結し、フェノール抽出し、そし
てエタノール沈澱した。５０μ！の緩衝液Ａに再懸濁し
た後、生じたプラスミドを５０ユニツトの旧ｎｄ■又は
Ｋｐｎｌ（適当な場合）により消化し、そしてアガロー
スを通して電気泳動した。ゲルにより小月１されたＤ　
Ｎ　Ａ　（２５０ｎｇ）を４００ユニントのＴ４’ＤＮ
Ａ　リガーゼを含有する３０μｌの緩衝？ｌ、中で１２
°Ｃにて４時間連結し、そしてＥ、コリＲＲＩをトラン
スフォームするために使用した。生ずるプラスミドをｐ
ＤＨＦＲＩ［Ｉ　（Ｉｌｉｎｄｌ［）及びｐＤｌｌＦＲ
ＵＩ（にｐｎ　Ｉ　）と命名した。次に、ｐＤＩＩＩ’
Ｒｍ　（Ｋｐｎ　Ｉ　）をＩＥｃｏＲＩ及びＫｐｎ　Ｉ
により消化し、そしてアガロースゲル電気泳動にかける
ことにより０．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩＫｐｎ　Ｉ断片（断
片Ａ）を精製した。

ＳＶ４０エンハンサ−配列を次の様にしてｐＤＩ［’Ｒ
［［（ｌｌｉｎｄ　ｍ　）に挿入した。５０バｇのＳＶ
４０　ＤＮＡを１２０ｄの緩衝液Ａ中で５０ユニントの
旧ｎｄＩ［Ｉと共に３７°Ｃにて２時間インキユヘート
し、そしてｌ１ｉｎｄＩＩＩ　ＣＳＶ４０断片（５１７
１−１０４６ｂｐ）をゲル精製した。

プラスミドｐＤＩＩＦＩＩ　ＩＩＩ　　（Ｈｉｎｄ　ｎ
Ｉ　）　（１０ｐｇ）を２５０ｎｇのウシ腸ホスファタ
ーゼにより３７゛Ｃにて１時間処理し、フェノール抽出
し、そしてエタノール沈澱せしめた。線状化したプラス
ミド（５０ｎｇ）を２５０ｎｇの旧ｎｄｌｌｌ　ＣＳＶ
４０断片と、Ｌ６ｐｌの緩衝液Ｃ中で１２°Ｃにて３時
間、２００ユニットのＴ４ポリヌクレオチドリガーゼを
用いて連結し、そしてＥ　コ１月１８１０１にトランス
フォームした。０．９ｋｂのＫｐｎ　Ｉ　−Ｂｇｌ　Ｉ
Ｉ断片（断片Ｂ）をこのプラスミドから単離した。

ｐＤ５の最終構成のため、断片Ａ及びＢ（各５０ｎｇ）
並びにｌｏｎｇの断片Ｃを２００ユニツトのＴ４ポリヌ
クレオチドリガーゼを用いて１２°Ｃにて４時間連結し
、そしてこの混合物をＥ、コリＲＲｔに１−ランスフエ
クトした。迅速調製分析により陽性コロニーを検出し、
そしてｐＤ５（第８図）の大規模調製を行った。

Ｃ，エベク　−５９４の一説 プロチインＣｃＤＮＡの発現をベクターｐＤＸにより達
成した。このベクターをｐＤｌｌ及びｐＤ５　’から誘
導した。プラスミドｐＤ５’　は、ＳＶ４０ポリアゾニ
レ−ジョンシグナル（すなわち５ＶｔＯＢａｍＨＩ　（
２５３３ｂｐ）　−Ｂｃｌ４（２７７０ｂｐ）断片）が
後方向（ｌａｔｅ　ｏｒｉｅｎｔａＬｉｏｎ）にある点
を除き、ｐＤ５と同一である。

すなわち、ｐＤ５　’は遺伝子挿入部位としてＢａｍ１
ｌ　Ｉ部位を含有する。プラスミドｐｉｌｌは、エンハ
ンサ−配列を含有する旧ｎｄ　ＩＩＩ　（ＳＶ４０ゲノ
ム中の５１７１ｂｐ）Ｋｐｎ［（ＳＶ４０中の２９４ｂ
ｐ）断片が逆向きになっている点において、ｐＤ５と異
る。

ｐＤＸを作製するため、ＥｃｏＲＩ開裂、Ｓ１ヌクレア
ーゼとのインキュベーション及びｌ１ｃｌ　Ｉリンカ−
による連結により、ｐＤｌｌ中のＩＥｃｏＲ１部位をＢ
ｃｌ　１部位に変換した。陽性に同定されたコロニーか
らＤＮＡを調製し、そして変更された制限部位を含有す
る１、　９ｋｂ　Ｘｈｏ　Ｉ　−ＰｓＬ　Ｉ断片をアガ
ロース電気泳動により調製した。第二の変形において、
Ｒｃｌｌで開裂したｐＤ５　’をキナーゼ処理したＥｃ
ｏＲＩ　−Ｂｃｌ　Ｉアダプター（オリゴヌクレオチド
ＺＣ５２５：　　５　’　−ＧＧＡＡＴＴＣＴ　−３’
　、及びＺＣ５２６：　５　’ＧＡＴＣＡＧＡＡＴＴＣ
Ｃ−３’から作製したもの）と連結して、発現ベクター
に遺伝子を挿入するための部位としてε（ｏＲ１部位を
生じさせた。陽性コロニーを含有する２、３ｋｂのＸｈ
ｏ　Ｉ　−Ｐｓｔ　Ｉ断片を単離した。上記２つのＤＮ
Ａ断片をＴ４　ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートし
、そしてＥ、コリＨＢＩＯＩにトランスフォームし、そ
して制限分析により陽性コロニーを同定した。次に、ｐ
ＤＸ（第９図）と称するＤＮＡを調製した。このプラス
ミドは外来遺伝子の挿入のためのユニークＥｃｏＲ１部
位を含有する。

次に、プロティンＣのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ断片として
ｐＤＸ中に挿入した。組換プラスミドを制限分析により
スクリーニングして、プロモーター要素に対して正しい
方向にプロティンＣ挿入部を有するプラスミドを同定し
、このプラスミド（ｐＤＸ／ＰＣと称する）を正しいク
ローンから調製した。　ｐＤＸ／ｐｃ中のｃＤＮ＾挿入
部は５′−非コード領域中にＡＴＧコドンを含有するた
め、トランスフェクション及び発現実験の前にこのｃＤ
ＮＡに対して欠失変異を行った。オリゴヌクレオチド指
令変異誘発の標準的方法に従って３塩基対の除去を行っ
た。変形されたｃＤＮＡを含有する、ｐＤＸに基礎を置
くベクターをｐ５９４と命名した。

適当な試験細胞のラウン上でのα−ファクターのハロー
の生成についてトランスフォームされた回変異細胞をス
クリーニングすることにより、酵母ゲノムライブラリー
からサツカロミセス・セレビシェ−ＸＥＸ２遺伝子を単
離した。１ｅｘ２変異（メイティング、α−ファクター
生産、キラートキシンの成熟、及びｋｅｘ２ホモ接合二
倍体株での胞子形成）の報告されているすべての欠損を
補完する１つのクローンが得られた。この遺伝子をｐＵ
Ｃヘクター中に酵母ＧＡＬＬプロモーターの制御のもと
にサブクローニングした。ｐ１５１５と称する生じたプ
ラスミドはアメリカン・タイプ・カルチュアー・コレク
ションにＡＴＣＣ６７５６９に寄託された。第１０図に
示すように、ｐ１５１５をｌｌ１ｎｄｌＩＩで消化し、
そして２．１ｋｂ断片を回収した。この断片を旧ｎｄｌ
ｌで切断したｐＵｃ１８　ニ連結してプラスミドｐＵｃ
１Ｂ／ＫＥＸ２を作製した。次に、■程断片（２，１ｋ
ｂ）をｐｔｌｃ１８／にεｘ２から、これを旧ｎｄｌＩ
［により部分消化し、そしてＢａｍＨＩにより完全消化
することにより単離した。次に、■程配列の残りを、ｐ
１５１５のＢａｍ１目＋１１ｉｎｄｌｌｌ消化物からの
０．４３ｋｂ断片として単離した。

次に、２つのＫＩＥＸ２断片をベクターＺｅｍ２２８及
びＺｅｍ２２９（第１０図）のＢａｍＨＩ部位に連結し
た。（Ｚｅｍ２９９はＺｅｍ２２８に類似するが、ネオ
マイシン耐性遺伝子の代りにＤＩＩＰＲ遺伝子を含有す
る。クローニング部位の両側にＭＴ−１プロモーター及
びＳν４０ターミネータ−が存在する。）得られるプラ
スミドをそれぞれＫＥＸ２　／　Ｚｅｍ２２８、及びＫ
ＥＸ２　／　Ｚｅｍ２２９と命名した。

ＢＨＫ細胞系ｔｋ−ｔｓ１３を、リン酸カルシウム法に
より、プラスミドｐ５９４及びｐＳＶ２−ＤＩＩＰＲテ
）　’／　７スフエクトした。トランスフェクトされた
細胞を２５０ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）により選
択し、そしてクローン性細胞系を単１皿した。プロティ
ンＣを培地中に１．５ｐｇ／細胞／日で分泌するクロー
ン性細胞系を選択し、そしてＰＣ５９４−２０４／ＢＩ
ＩＫと命名した。

１０ｐｇのＫＩＥＸ２　／　Ｚｅｍ２２Ｂをリン酸カル
シウム法によりＰＣ５９４−２０４／ＩＩＨＫ細胞系に
トランスフェクトした。細胞を常に２５０ｎＭ　ＭＴＸ
の存在下で培養した。クローンを５００　ｇ／ｒｒｄｌ
　Ｇ４１）３により選択し、そして１２のクローン性細
胞系を選択した。

’Ｍ　ｔＲ，されたクローンを、１％ウシ胎児血清を含
有するソステイン不含有ＭＥＭ　（ジブコ）中の３５３
−システィンにより２４時間パルスーラヘルした。培地
を集め、そしてプロティンＣに対するモノクローナル抗
体を用いる免疫沈澱により単鎖プロティンＣ及び開裂さ
れた二本鎖プロティンＣの存在について試験した。２５
０μｌの培地を１０８ｇの抗体と混合し、そしてこの混
合物を３７゛Ｃにて１時間インキュベートした。Ｉ００
＃の５ｔａｐｈ　Ａ細胞懸濁液（ファルマシア、ビス力
夕ウエイ、ＮＪ）を添加し、そしてインキュベーション
を３７°Ｃにて１時間続けた。細胞を遠心によりペレッ
ト化し、そしてこのベレットをＴＢＳ中に再懸濁した。

細胞を再度ペレット化し、そしてこのペレットを１％β
−メルカプトエタノールを含有する６０μｌのゲル緩衝
液に再懸濁した。懸濁液をｔｏｏ”ｃば３分間加熱し、
次に５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動した
。蛋白質をオートラジオグラフィーにより可視化した。

親細胞系ｐｃ５９４−２０４　／ＢＨＫは約７０％の一
本鎖形のプロティンＣを示し、残りの３０％は二本鎖形
であった。Ｇ４１８で選択された社程細胞系の１つＰＣ
５９４−２０４／ＫＥＸ２−１は９５％の二本鎖プロテ
ィンＣを生産し、残りの５％が一本鎖形であった。

Ｅ、ブローインＣプロセシング　　の −本積プロチインＣの二本鎖形へのプロセシングを増強
するため、この蛋白質に２個の追加のアルギニン残基を
導入して４個の塩基性アミノ酸から成る開裂部位を得た
。プロティンＣの得られる変異体前駆体をＰＣ９６２と
命名した。このものは軽鎖と重鎖との間の開裂部位に配
列Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−ＬｅｕＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Δ
ｒｇ−八ｓｐへ含有する。＾ｒｇ−Ａｓｐ結合における
プロセシングが二本鎖プロティンＣ分子をもたらす。

クローン化されたｃＤＮＡを、変異誘発オリゴヌクレオ
チドＺＣ９６２（５’　−ＡＧＴ　ＣＡＣＣＴＧ　ＡＧ
Ａ　ＡＧＡ　ＡＡＡＣＧＡ　ＧＡＣＡ−３’　）を用い
て、部位特定変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ、
　ＤＮＡ　３　：４７９　４Ｂ８．１９８４により本質
的に記載されている）により、変形することにより変異
体分子を生成せしめた。プラスミドｐ５９４を５ｓｔｌ
により消化し、約８７ｂｐの断片をＭ１３ｍｐＨにクロ
ーン化し、そして単鎖鋳型ＤＮＡを単離した。変異誘発
の後、配列決定により正しいクローンを同定した。複製
型ＤＮＡを単離し、そして５ｓｔｌで消化して変異した
断片を単離し、これを三部分連結によって、Ｓｓｔで切
断されたｐ５９４と連結した。望ましい方向に挿入され
た５ｓｔｌ断片を有するクローンを制限酵素地図の作成
により同定した。得られた発現ベクターをｐＤＸ／ＰＣ
９６２と命名した。

プラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２をｐＳＶ２−　ＤＩＩＦ
ＩＩ　（Ｓｕｂｒａｍａｎ　ｉ等、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　
Ｂｉｏｌ、、上：　　８５４−８６４．１９８１）と共
に、ｔｋ−ｔｓ１３　ＢＩＩＫ細胞に、リン酸カルシウ
ム法（Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、前掲、
により本質的に記載されている）により同時トランスフ
ェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０％ウ
シ胎児血゛清、ＩＸＰｓＮ抗生物質混合物（Ｇｉｂｃｏ
　６００５６４０）　、２．　ＯｍＭ　Ｌ−グルタミン
及びビタミンＫ（５μｇ　／　ｍｌ　）を含有するダル
ベコの改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で増強せしめた。

細胞を２５０ｎＭメトトレキセート（ＭＴＸ）中で１４
日間選択し、そして得られたコロニーをイムノフィルタ
ー・アッセイ（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ及びＢｒｏｗｎ、　
ＢｉｏＴｅｃｃｈｉ　ｕｅｓ、　８２−８７．１９８４
年３月／り月）によりスクリーニングした。プレートを
ＰＢＳ又は非血清培地（ダルベコ＋ペニシリンーストレ
プトマイシン、５μｇ　／　ｍｆｌビタミンＫ）により
すすいだ。次に、テフロン・メツシュ（スペクトラム・
メディカル・インダストリース、ロサンゼルス、ＣＡ）
を細胞上に置いた。３７°Ｃにて４時間のインキュベー
ションの後、フィルターを取り出し、そして５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）。

５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０５％ＮＰ　−４０，１５０
ｍＭ　ＮａＣｆｆ１．０．２５％ゼラチン中に室温にて
３０分分間−た。フィルターを、プロティンＣに対する
ヒツジポリクローナル抗体であってビオチン標識された
もの（同じ緩衝液中１μｇ　／　ｒｎｌ）中にて、振う
うしながら室温で１時間インキュベートした。次に、フ
ィルターをこの緩衝液中で洗浄し、そしてアビジン接合
ホースラデイツシュ・パーオキシダーゼ（ヘーリンガー
マンハイム）（同じ緩衝液中１　：　１０００）中で振
とうしながら室温で１時間インキュベートした。

フィルターを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ２　（ｐＨ
７，４）、　５ｍＭ　ＥＤＴＡｌ　ｍＭ　ＮａＣ１、０
，２５％ゼラチン、０．４％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓ
ｙｌ）、０．０５％　ＮＰ−４０中でそして次に水中で
洗浄し、そして発色試薬（６０ｍｇ　！ＩＲＰ発色剤〔
ビオ−ラド〕、２０ｍｔｌメタノール、１ｏｏｙ過酸化
水素／　１００ｍｊ！　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐ）１７
．４）、　１８０ｍＭ　ＮａＣｆ　）中でインキュベー
トした。フィルターを水に移すことにより反応を停止せ
しめた。最も強く反応するコロニー６個をシリンダーク
ローニングにより拾い、そして別々に１０ｃｍプレート
中で増殖せしめた。

はぼコンフルエントな培養物からのプロティンＣ生産レ
ベルをエンザイム・リンクド・イムノソルヘント・アッ
セイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ヒト−プロティン
Ｃに対するアフィニティー精製されたポリクローナル抗
体又は重鎖特異的モノクローナル抗体（０，１Ｍ　Ｎ８
２ＣＯ，Ｊ（ｐＨ９，６）中１　ｐｚ　／　ｍｌの？８
液１ＯＯｊ！！〕を９６−ウェルミクロタイタープレー
トの各ウェルに添加し、そしてプレートを４　’Ｃにて
一夜インキユベートした。次に、ウェルを、０．０５％
Ｔｗｅｅｎ　−２０を含有するＰＢＳ（５ｎ＋Ｍ　　リ
ン酸緩衝Ｍ（ｐＨ７，５）、０．１５Ｍ　ＮａＣｆ　）
により３回洗浄し、そして次にＰＢＳ中１％ウシ血′清
アルブミン、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　−２０の溶液１０
０ｍと共にインキュベートした。次にこのプレートをＰ
ＢＳで数回すすぎ、空気乾燥し、そして４°Ｃにて貯蔵
した。サンプルを測定するため、１００μ！づつのサン
プルを前記のコートされたウェル中で３７゛ｃにて１時
間インキュベートし、そしてウェルをＰＢＳ中０．０５
％Ｔｗｅｅｎ　−２０によりすすいだ。次にプレートを
、１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　
−２０を含有するＰＢＳ中で、プロティンＣに対するヒ
ツジポリクローナル抗体であってビオチン接合されもア
フィニティー精製されたものと共に、３７°Ｃにて１時
間インキュベートした。ウェルをＰＢＳによりすすぎ、
そして１％ウシ血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅ
ｎ　−２０を含有するＰＢＳ中で、アビジン接合アルカ
リホスファターゼと共に３７°Ｃにて１時間再度インキ
ユヘートした。次に、ウェルをＰＢＳですすぎ、そして
０．３ｍＭ　Ｍｇ（１！２を含有する１０％ジェタノー
ルアミン（ｐＨ９，８）中ホスファターゼ基質（シグマ
１０４；　６００μｇ／　ｍｆ）１００ｍの添加により
、アルカリホスファターゼ活性を測定した。４０５ｎｍ
における吸光度をミクロタイタープレートリーダー上で
読み取った。結果を第１表に示す。

辺」−友 ９６２＝１　　　　　１．１　　　　　２５００　　　
　　　２．２０２　　　　　０．８　　　　　１２５０
　　　　　　１．５６３　　　　　１．２　　　　　１
３５０　　　　　　１．１２４　　　　　１．２　　　
　　　５５０　　　　　　０．４６−５　　　　　１．
２　　　　　１５５０　　　　　　１．３０−６　　　
　　１．２　　　　　　９５０　　　　　　０．８０ク
ローンＢＩＩＫ／　９６２−１を大規模培養において増
殖せしめ、そしてヒト−プロティンＣに対するヒツジポ
リクローナル抗体７１Ｔ１ｇを２　ｍｇのＣＮＢｒ−活
性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社、ビス力夕ウエ
イ、ＮＪ）に連結することにより調製したカラム上での
アフィニティークロマトグラフィーにより数百ミリグラ
ムのプロティンＣを精製した。

細胞培養培地をカラムに適用し、カラムをｌｏｏｍＲの
ＴＢＳ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，５）、　１５
０ｍＭ　ＮａＣ１）で洗浄し、そして３Ｍ　ＫＳＣＮを
含有するＴＢＳ又はｐＨＬＬ、５の）１ｆＪｉ？＆　（
２５ｍＭ　　リン酸カルシウム（ｐＨ１１，５）、０．
２Ｍ　ＮａＣｌ、２％Ｔｗｅｅｎ　　８０．０．５％Ｎ
ａＮｆｆ〕によりプロティンＣを？８出した。ウエスタ
ンフ゛ロット分析が示すところによれば、変異体プロテ
ィンＣにおいては約９５％が二本鎖形であり、これに対
してもとの配列によりトランスフェクトされたＢＨＫ細
胞から得られたプロティンＣにおいては約２０％が二本
鎖であった。

ＰＣ９６２変異体蛋白質を発現する安定なりＨＫ細胞ク
ローン、又は野性形プロティンＣを発現する安定な２９
３細胞クローン（ｐ５９．４−　トランスフェクト細胞
）から、プロティンＣのカルシウム−３Ａ　Ｊ’コンホ
ーメーションに対して特異的なモノクローナル抗体カラ
ムを用いて、ミリグラム量のプロティンＣを精製した。

細胞培養培地を５ｍＭＣａ（、ｅ。

の存在下でカラムに適用した。　１０ｍＭ　ＥＤＴＡを
含有するＴＢＳによりカラムからプロティンＣを？８出
した。この精製方法の使用により、変性条件にかけるこ
となく完全に活性なプロティンＣを精製することが可能
であった。精製されたプロティンＣを、ＳＤＳ／ＰＡＧ
Ｅ及びそれに続く銀染色により分析し、そして９５％よ
り高い純度が示された。

Ｂ　ＨＫにより生産されたＰＣ９６２蛋白質を、アミト
リシス活性及び抗凝固活性を示す形に活性化されるその
能力について測定した。アフィニティー精製された蛋白
質サンプルをＴＢＳに対して十分に透析し、そして０．
１容量の１ユニツト／ｄのＰｒｏｔａｃ　Ｃ（アメルシ
ャム・ダイアグノスチ力）と共に３７°Ｃにて１時間活
性化した。マイクロタイターウェル中１００Ｉｌｌの１
ｍＭプロティンＣ基質（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ　ＰＣ
ａ、アメルシャム・ダイアグノスチ力）に前記活性化混
合物のアリコートを添加し、そしてマイクロタイターリ
ーダーを用いて■仮の変化を経時的に測定することによ
り、アミトリシス活性を測定した。活性化された蛋白質
の抗凝固活性をＳｕｇｏ等（前掲）により記載されてい
るようにして測定した。アフィニティ精製されたＰＣ９
６２蛋白質はアミトリシス測定及び抗凝固測定の両方に
おいて十分に活性であることが示された。ｐＨ１１，５
緩衝液による抗体カラムからの溶出は３Ｍ　ＫＳＣＮ溶
出を用いて得られる活性よりも高い活性を有する蛋白質
をもたらすことが示された。

Ｂ　Ｉ（Ｋ細胞へのｐＤＸ／ＰＣ９６２のトランスフェ
クションから得られたクローン性細胞系を限界稀釈法に
より単離した。ＭＴＸで選択されたコロニ（約３００コ
ロニー）ｌプレートをトリプシン処理し、計数し、そし
てマイクロタイターウェルに平均０．５細胞／ウエルで
再プレートした。これらを２５０ｎＭ　ＭＴＸを含有す
る選択培地中で増殖せしめた。

約５０％のウェルがコロニーを含有した。認識可能なコ
ロニー（１〜２　ｍｍの直径）を含有するウェルを、培
地中のプロティンＣレベルについてＥＬＩＳＡにより測
定した。この測定のため、新鮮な培地をすべてのウェル
に加え、プレートを７５分間インキユヘートし、次に培
地を取り出しそして測定した。５０ｎｇ／ｍ以上の７５
−分間蓄積（１０００ｎｇ／ｍｌ／日以上に相当する）
を与える５個のコロニを１０ｃｍプレートに分割して大
規模培養を行った。

これらのコロニーのプロティンＣ生産レベルは１、１〜
２．８　ｐｇ／細胞／日であった。

プラスミドＺｅｍ２２９にＰＣ９６２ｃＤＮＡを挿入す
ることによりＰＣ２２９／９６２と称する第二のプラス
ミドを作製した。ｐＤＸ／ＰＣ９６２からのＰＣ９６２
ｃＤＮＡを含有するＥｃｏＲＩ断片を、ＥｃｏＲＩ　　
Ｂａｍ１ｌ　Ｉ合成オリゴヌクレオチドアダプターと共
に、ＢａｍＨＩにより切断されそしてホスファターゼで
処理されたＺｅｍ２２９に連結した。生ずるベクターが
ＰＣ２２９／９６２である。

プラスミドＰＣ２２９／９６２をリン酸カルシウム法に
よりＢＨＫ細胞にトランスフェクトした。この細胞を、
１０％ウシ脂児血清及び５尾／　ｍｌビタミンＫを含有
するダルベコＭ’ＥＭ中で培養した。このトランスフェ
クションからの４８時間過渡的発現レベルは約２５ｎｇ
／ｍｌであった。２日の後、トランスフェクトされた細
胞を２５０ｎＭ　ＭＴＸを含有する選択培地に分割し、
そしてさらに１４日間培養した。それぞれが約２００コ
ロニーを含む、このトランスフェクションからの３枚の
プレートをイムノフィルターアンセイによりスクリーニ
ングし、そして２４個の最も強く反応するコロニーをシ
リンダークローニングにより拾った。これらを別々に１
０ｃｍプレート中で増殖せしめ、そしてこれらのプロテ
ィンＣ生産レベルを測定した。１．１〜２．３ｐｇ／細
胞７日を生産するコロニを、安定なプロティンＣ生産細
胞系の調製のために用いた。

発現ベクターｐＤＸ／ＰＣ９６２及びプラスミドｐに０
ｎｅｏをリン酸カルシウム法により２９３１１Ｉ胞に同
時トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞
を４８時間後に５００　ｐｇ　／　ｍｌｌのＧ４１８を
含有する培地に分割した。選択培地にて１０日接解ムノ
フィルターアッセイを行い、そしてシリンダークローニ
ングにより２個のクローンを拾った。プロティンＣ生産
は１〜２ｐｇ／細胞／日であるこ七が見出された。培養
をスケールアップし、そしてプロティンＣをイムノアフ
ィニティー・クロマトグラフィーにより精製した。９５
％より多くのプロティンＣが二本鎖型であることが見出
された。

ＢＨＫ及び２９３細胞から調製された９６２変異体蛋白
質の構造を２９３細胞及び血漿からの野性型プロティン
Ｃの構造と比較した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥによる分析及び
それに続く銀染色は、すべての組換蛋白質が重鎖及び軽
鎖を含有し、これらは血漿蛋白質のそれらと同時泳動さ
せた。２９３細胞で合成された野性型プロティンＣ有意
量（約２０％）の−末鎖のプロセシングされていない蛋
白質（分子量６６．０００）を含有したが、いずれかの
細胞型で生産された変異体蛋白質は実質的に完全に二本
鎖にプロセシングされた。Ｎ−末端配列分析により、組
換野性型蛋白質及びＢＩＩＫ／ＰＣ９６２変異体蛋白質
の軽鎖及び重鎖の両者が適切にプロセシングされたこと
を示した。組換蛋白質のＴ−カルボキシル化の程度を２
つの異るＥＬＩＳＡ系により測定した。第一の系は蛋白
質のγ−カルボキシル化形及び非−カルボキシル形の両
者を認識し、そして第一の系はカルシウムの存在下でｇ
ｌａ−誘導コンホーメーション変化を受けたプロティン
Ｃのみを認識する特異的抗体を用いる。分析が示すとこ
ろによれば、ＢＨＫ細胞において生産された組換プロテ
ィンＣの６０％、及び２９３細胞で生産されたそれの９
０〜９５％が、特異的抗体により認識されるのに十分な
程度にＴ−カルボキシル化された。

３Ｍ！頚の組換蛋白質はまたアミドリシル活性及び抗凝
固活性について分析し、その結果を血漿プロティンＣの
活性と比較した。ＢＨＫ細胞からのＰＣ９Ｇ２及び２９
３細胞からの野性型プロティンＣの両者が十分なアミド
分解活性を示した。抗疑固測定において、ＢＨＫ細胞か
らのプロティンＣは血り？プロティンＣと実質的に同じ
比活性を有し、他方２９３１．１１１胞からの野性型蛋
白質及びＰＣ９６２変異体蛋白質の両者は約１５％高い
比活性を示した。プロティンＣ活性の１ユニツトは、１
　ｍ１当り４ＨのプロティンＣを含有する、正常ヒト血
ｆ、　１　、ｐ、中の量として定義される　（Ｇａｒｄ
ｉｎｅｒ及びＧｒｉｆｆｉｎ、　−ヒ射ユ１１ｅｍａｔ
ｏ１．　１３：　　２６５　２７８．１９８３）　（比
活性＝２５０ユニット／ＩＩ１ｇ）。２９３細胞中で生
産された野生型プロティンＣは一貫して３００ユニツ）
　／　ｍｇを超えた。

Ｆ、　　　　れたプロティンＣの 活性化ペプチド（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｐｅｐｔｉｄ
ｅ）をコードする部分を除去するために部位特異的変異
誘発によりプロティンＣのｃＤＮＡ配列を変更した。次
に、変更された配列をＢＨＫ及び２９３細胞にトランス
フェクトし、そして安定にトランスフェクトされた細胞
を選択した。両細胞系からの培養液サンプル中で活性プ
ロティンＣが検出された。

活性化ペプチドコード配列を除去するため、プラスミド
ｐ５９４をＳｓＬ［で消化し、そして約８８０ｂｐ断片
を精製し、そしてＭ１３ｍｐｌＯ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、　
Ｍｅｔｈｏｄｓ岡互匹シ１０１　：　２０−７７、１９
８３）のＳｓＬ１部位に挿入した。１２の活性化ペプチ
ドコドンを、変異誘発オリゴヌクレオチドＺＣ８２９（
５’　−ＣＴＧ　ＡＡＡ　ＣＧＡＣＴＣＡＴＴ　ＧＡＴ
　−３’　）を用いてオリゴヌクレオチド指令欠失変異
誘発（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉ　ｔｈ、　ＤＮＡ　３　
：４７９−”４８８．１９８４）により除去した。変異
体ファージクローンから複酸形ＤＮＡを調製し、そして
５ｓｔｌにより消化した。プロティンＣ断片（約８４０
ｂｐ）を単離し、そして５ｓｔｌで消化されたｐ５９４
に挿入した。得られたプラスミドを、Ｂｇｌ　ＩＩを用
いる制限地図により５ｓｔｌ断片の正しい方向について
スクリーニングした。正しいプラスミドを選択し、そし
てｐＰｃ８２９と命名した。プラスミドρＰＣ８２９を
配列決定して、目的とするコード配列の存在を確認した
。

プラスミドｐＰＣ８２９を、プラスミドｐｓＶＤＩＩＦ
ＲＴ　（Ｌｅｅ等、Ｎａｔｕｒｅ、　２９４　：　　２
２８　２３２．１９８２）と共にｔｋ−Ｂ１１に細胞に
、及びｐＫｏ　−ｎｅｏ　（Ｓｏｕ　ｔｈｅｒｎ及びＢ
ｅｒｇ、　Ｊ、Ｍｏｌ。

幻」↓匹迫μ已ユ、上：　３２７−３４１．１９８２）
と共に２９３細胞に、リン酸カルシウム共沈法（Ｇｒａ
ｈａｍ及びｖａｎｄｅｒ　Ｅｂ、前掲）により同時トラ
ンスフェクトした。

４８時間後、培地を収得し、そしてＥＬＩＳＡによりプ
ロティンＣについて測定した。結果を第２表に示す。同
時に、培養物を１：５で５００μｇ　／　ｍｌの６４１
８（２９３細胞）を含有する培地又は２５０ｎＭのメト
トレキセート（Ｌｋ−Ｂ１１に細胞）を含有する培地に
分割した。選択培地の存在下で１０日後、安定にトラン
スフェクトされたコロニーをイムノフィルターアンセイ
によりプロティンＣ生産についてスクリーニングした。

陽性コロニーを拾い、そして選択培地（５００ｘ／ｍ！
のＧ４１８又は２５０ｎＭメトトレキセートを含有する
）中で１０日間増殖せしめた。培養液を発色法によりＡ
ＰＣ活性について測定した。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐ
Ｈ７、５）、　１５０１１１Ｍ　ＮａＣＱ中０．２ｍＭ
スペクトロチーム（Ｓｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ）　　Ｐ　
Ｃａ　（アメルシャム・ダイアグノスチカ＃３３６）　
Ｌｏｏｍを含むミクロタイターウェルに培地サンプルを
加えた。プレートを３７°Ｃにてインキュベートし、そ
して種々の時点でＡ４゜。

を測定した。１つのトランスフェクトされた２９３細胞
系（８２９−２０と称する）からの代表的な結果を第１
１図に示す。細胞系８２９−２０の陽性コロニからの培
地は一貫して、同じ期間（１０日間）にわたり非−トラ
ンスフェクト２９３細胞と共にインキュベートされた対
照培地に比べて、ＡＰＣのための発色基質を用いて高い
活性を示した。

第１表 活性化されたプロティンＣの過渡的発現（ＥＬＩＳＡ）
ＢＨＫ ２．７ プロセシング部位配列Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ
を有する活性化されたプロティンＣをコードするＤＮＡ
配列を野性形プロティンＣ配列の変異誘発により作製し
た。得られた配列（１０５８と称する）はＰＣ９６２を
コードするそれに類似していたが、しかし活性化ペプチ
ドをコードする領域に欠けていた。

プラスミドル５９４中に存在するプロティンＣ配列を単
一の変異誘発により変えて活性化ペプチドのコドンを除
去しそしてプロセシング部位にＡｒｇ−Ａｒｇコドンを
挿入した。オリゴヌクレオチドＺＣ１０５８（５’　　
−ＣＧＣＡＧＴ　　ＣＡＣＣＴＧ　　ＡＧＡ　　ＡＧ八
　八＾Δ　ＣＧＡ　　ＣＴＣＡＴＴＧＡＴ　ＧＧＧ−３
’　）を用いて、実質上前記のようにしてｐ５９４から
の８７０ｂｐ　Ｓｓｔ　Ｅ断片上に変異誘発を行った。

変異誘発された配列を用いて発現ベクターｐＤＸ／　Ｐ
Ｃ１０５８（ｐＤＸ　／　Ｉ’Ｃ９６２に類似する）を
作製し、そしてこのベクターを上記のようにしてＢＨＫ
細胞に同時トランスフェクトした。蛋白質をポリクロー
ナル抗体カラム上で、ｐＨ１１、５１１衝液による溶出
により精製した。

ＰＣ１０５Ｂ蛋白質の活性を活性化された血漿プロティ
ンＣ及び活性化されたＰＣ９６２のそれと比較した。

血漿プロティンＣ及びＰＣ９６２（５ｎ／Ｉｎ１）を１
／１０容１のＰｒｏｔａｃ　Ｃ（アメルシャム・ダイア
グノスチ力）により２時間処理して活性化した。５０４
のヒト血漿を５０ｐ１の活性化されたプロティンＣと混
合し、そしてこの混合物を３７°Ｃにて１５０秒間イン
キュベートすることにより、抗凝固活性を測定した。こ
の混合物に５０μｌの活性化されたセファロプラスチン
（アメルシャム・サイエンチフィツク・プロダクツ、マ
クガラパーク、ＩＬ）を添加し、そしてこの混合物を３
７°Ｃにて３００秒間インキュベートした。　１００Ｊ
ｌ！の２０ｍＭ　ＣａＣＱ　２を加え、そして凝固時間
を記録した。データーを第１２図に示す。

Ｇ、　　　　　　たプローインＣびＫＥＸ２のプロティ
ンＣ高生産性の、ｐＤＸ　／　ＰＣ１０５８でトランス
フェクトされたＢＨＫりｏ−７（ｐＤＸ／ＰＣ１０５８
３／／ＢＩＩＫ）を同定し、そしてリン酸カルシウム法
によりＫＥＸ２／　Ｚｅｍ２２９でトランスフェクトし
た。

トランスフェクトされた細胞を５００μｇ　／　ｍｌの
Ｇ４１８及び２５０ｎＭメトトレキセー１・により選択
した。

ＫＥＸ２−１０５８／／ＢＩＩＫ　と称する選）Ｊ？　
サｈ　タ’）　ｏ　−ンを、１％ウシ胎児血清を含有す
るシステインー不合ＤＭＥＭ中３５３−システィンによ
り２４時間パルスラベルした。培地を集め、そしてプロ
ティンＣに対するモノクローナル抗体を用いる免疫沈澱
により、単鎖の及び開裂された二本鎖の活性化されたプ
ロティンＣの存在について試験した。２５０　Ｉ！１の
培地を１０μｇの抗体と一諸にし、そしてこの混合物を
３７°Ｃにて１時間インキュベートした。１００μ！の
５ｔａｐｈ　Ａ細胞Ｆ＝’ｉ？ｆｆｌ　（ファルマシア
、ビス力夕ウエイ、ＮＪ）を添加し、そしてこの混合物
を３７°Ｃにて１時間インキュベートした。細胞を遠心
分離によりペレット化し、そしてペレ・ノドを１％β−
メルカプトエタノールを含有するゲル緩衝ン夜６０μｌ
に再）懸濁した。この懸濁液を１００°Ｃに３分間加熱
し、そして５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳
動した。蛋白質をオートラジオグラフ　イー　ニより可
視化した。ＫＥＸ２−１０５８／／ＢＩＩＫクローンは
蛋白質の二本鎖への約１００％の開裂を示した。

１０％ウシ胎児血清、２５０ｎＭメトトレキセート及び
５００ｉ／ｍｌのＧ４１８が補充されたダルベコＭＥＭ
中でコンフルエンシーに増殖したＫＥＸ２−１０５８／
／ＢＨＫクローンから活性化されたプロティンＣを生産
した。コンフルエント細胞を、１μｇ　／　ｍｌフェブ
ロネクチン、２μｇ　／　ｍｌインシュリン、５　ｎ　
／　ｍＱトランスフェリン、５μｇ　／　ｍｌビタミン
に、ＩＸＰＳＮ抗生物質混合物（キプコ６００−５６４
０）　、２．０ｍＭ　Ｌ−グルタミン、２５０ｎＭメト
トレキセート及び５００μｇ　／　ｍＱ　Ｇ４１８が補
充されたダルベコのＭＥＭに切り替えた。培地を７日間
にわたり１〜２日ごとに集め、そして−２０″Ｃに凍結
した。凍結された培地サンプルを解凍し、そして０．４
５／ＩＴｒｌのフィルターを通してすべての細胞片を除
去した。固体塩化カルシウムを５ｍＭの最終濃度に加え
、そして固体ナトリウムアジドを０．０２％（ｗ／ｖ）
の最終濃度に加えた。プロティンＣのカルシウム−誘導
形に対して特異的なモノクローナル抗体カラムを用いて
培地から活性化されたプロティンＣを取り出した。処理
された培地をカラムに適用し、そして１０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａを含有するＴＢＳにより活性化されたプロティンＣを
）岩田した。プロティンＣの濃度を、２８０ｎｍでの吸
収及びＥＬＩＳＡにより測定した。

プロティンＣ活性を凝固測定により測定した。

アフィニティー精製された血漿プロティンＣを、５０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ＋　１００ｍＭ　ＮａＣ１及び０．１％ウ
シ血清アルブミン中に５００　：　１　（ＡＰＣ：八Ｃ
Ｃ−Ｃ）の比率で１希釈された、ＡＣＣ−Ｃにューメキ
シコ大学、アルブクアーク、　Ｎ、Ｍ、　Ｗ、Ｋ１５ｉ
ｅｌから人手したアゲキストロトン・コントルトリクス
・コントルトリクス（ｋ世山迩匹ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ
　　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ）プロテアーゼと共に３７°
Ｃにて２時間インキュベートした。ＫＥＸ２−１０５８
／／ＢＩＩＫ細胞からノアフイニテイー精製され活性化
されたプロティンＣを３７°Ｃにて２時間インキュベー
トした。ＭＬＡ　Ｅｌｅｃｔｒａ　８００Ｃｏａｇｕｌ
ａｔｉｏｎ　Ｔｉｍｅｒ（メディカル・ラボラトリ−・
オートメーション社、プレーザントビル、ＮＹ）中で凝
固形成を４！ＩＩ定した。１００１１１の活性化された
血漿プロティンＣ又はＫＥＸ２−１０５８活性化プロテ
インＣをＭ　Ｌ　Ａキュベツトに加え、そして５０秒間
加温して温度を３７°Ｃに上げた。１００μｌのＤａｄ
ｅ八ｃｔへｎ　ＦＳ　（アメルシャム・サイエンティフ
ィ・ンク。

プロダクツ）を加え、そして試験溶液を１００秒間イン
キユヘートした。凝固形成のために必要な時間を測定し
た。凝固測定の結果は、ＫＥＸ２−１０５８／／Ｂ１１
に細胞により生産された活性化されたプロティンＣが、
活性化された血漿プロティンＣに比べて約１００％活性
であることを示した。

にＥＸ２−１０５８プロテインＣの軽１’＋のカルボキ
シ末端配列と市販のプロティンＣ（アメルシャム・タイ
アグノスチ力）の軽鎖のカルボキシ末端配列とを、軽鎖
のユニークメチオニン残基においてＣＮＢｒ開裂せしめ
ることによりＮ−末端配列分析により完全に配列決定さ
れ得るペプチドを遊離せしめることにより比較した。１
％ウシ胎児血清、２５０ｎＭメトトレキセート及び５０
０μｇ　／　ｍｌの６４１８を補充したダルヘ−ｙＭＥ
Ｍ中に増殖したＫＨＸ２−１０５８／／ＢＩＩＫ細胞か
らアフィニティー精製したプロティンＣをまず、０．２
Ｍ　Ｔｒｉｓ−１１Ｃｊ２　（ｐＨ１８，３）中１０倍
モル過剰（ＣｙｓｒＡ基に対して）のジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、及び最終濃度６．０Ｍのグアニジン＋１
Ｃｆの添加により還元した。この混合物を６５℃にて４
〜６時間インキュベートした。ヨード酢酸（ｐＨ１７，
０）又はヨード酢酸アミドを前記の還元された蛋白質に
、ＤＴＴのモル濃度に対して４倍モル過剰で加え、そし
てこの混合物を３７°Ｃにて３０分間インキュベートし
た。溶液をＱ、　ＩＭ　Ｎ１１４）ＩＣＯｚ（ｐＨ８，
５）に対して２２°Ｃにて２４時間透析した。

透析された溶液をＩＩＰＬＣＰｏ１ｙ−Ｆカラム　（デ
ュポン）に適用し、軽鎖を単離した。メチオニン残基当
り５００倍モル過剰のＣＮＢｒを７０％蟻酸中精製され
た軽鎖に、窒素のもとて暗中室温にて３０分間加えた。

ＣＮＢｒ消化物をアメリカン・バイオシステム社モデル
４７０Ａシーケンサ−（Ｍａｒｉｎｓ−ｏｎ−ｓｔ。

Ｃｒｏｉｘ、　ＭＮ）に適用した。得られた配列は、市
販の精製されたプロティンＣ及びＫＥＸ２−１０５８プ
ロテインの両者のＣ−末端配列がＧｌｕで終ることを示
し、両蛋白質の軽鎖がアミノ酸１４９で終ることが示さ
れた。

Ｈ，１６４５Ｚｅｍ２２９Ｒの　　び プラスミドｐ９６２の蛋白質配列（第３表；野性型プロ
ティンＣをコードする配列に付加されたアミノ酸にはア
ンダーラインが付してあり、そしてアミノ酸間のスペー
スは軽鎖配列及び重鎖配列を整列させるためのみに使用
される）によりコードされる活性化ペプチドのアミノ酸
９−１１をコードするＤＮＡ配列の代りにアミノ酸Ａｒ
ｇ−ＡｒｇをコードするＤＮＡ配列を設けた。ｐ１６４
５によりトランスフェクトされた細胞は活性化されたプ
ロティンＣを培地中に分泌した。プラスミドｐ９６２を
５ａｌｌ及び５ｓｔｌにより消化し、そして７３０ｂｐ
断片を精製し、そして５ａｉｌ及び５ｓｔｌにより消化
して線状化されたＭ１３ｍｐｌＯに挿入した。合成オリ
ゴヌクレｆｆ　　ｌ’Ｚｃ１６４５（５’　　−ＧＡＡ
　　ＧＡＣＣＡＡ　　ＡＣＡ　　ＡＣＡ　　ＡＡＡ　　
ＣＧＧＣＴＣＡＴＴ　　ＧＡＴ−３’　　）　　、　及
びＺＣ５５０（５’　　−ＴＣＣＣＡＧＴＣＡ　ＣＧＡ
　ＣＧＴ−３’　）を用いて部位特異的インビトロ変異
誘発（Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍ１ｔｈ　、前掲）により、
上に得られたファージから調製した単鎖鋳型ＤＮ、へを
変異せしめる。変異体ファージをジデオキシ配列決定に
かけて変異誘発を確認した。１６４５と称する確認され
た変異体クローンから複製形（ｒｆ）ＤＮＡを調製し、
そして５ｓｔｌ及びＰｓｔｌで消化して４１１ｂｐ断片
を単離する。プラスミドｐ２２９／９６２（例３．Ｅ、
）をＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ［で消化して５９２ｂｐプロ
ティンＣ断片を単離した。プラスミドｐ２２９／９６２
をＥｃｏＲＩ及びＳｓ口で消化して７００ｂｐのプロテ
ィンＣ断片を単離した。１６４５ｒｆからの４１１ｂｐ
プロティンＣ断片、ｐ２２９／９６２からの４１１ｂｐ
プロティンＣ断片、及び７００ｂｐプロティンＣ断片を
四部分連結により、ＥｃｏＲＩにより線状させれそして
自己連結を防止するためにウシ腸ホスファターゼにより
処理されたｐＺｅｍ２２９Ｒと連結した。　（プラスミ
ドｐＺｅｍ２２９ＲはＺｅｍ２２９に類似するが、但し
、部分消化、Ｋｌｅｎｏｗフィルインによる平滑末端化
、再連結、これに続（Ｂａｍ１ｌ　Ｉ消化及びＢａｍＨ
Ｉ　−ＥｃｏＲｌアダプターを用いる再連結により、Ｅ
ｃｏＲ１部位が破壊されている。正しいプラスミドを選
択し、そしてｐＰｃ１６４５／２２９Ｒと命名した。

２ε［表 ＷＴ　（５９４）〜Ｓ−トし−Ｋ−Ｒ−Ｄ−７８２９−
５−１１−Ｌ−Ｋ−１１ ９６２−５−１１−Ｌ−１？−トに−Ｒ−Ｄ−Ｔ１０５
８　　−３−Ｈ−Ｌ−Ｒ−＋１−に−１？−１６４５−
ｓ−＋トＬ−Ｒ−１１−に−１１−１）−Ｔ−ＩＥ１８
８０　　−３−１１−１．−１？−１？−に−１？−Ｄ
−Ｔ１９５３　　−５−１１−Ｌ−１？−Ｒ−に−１１
１９５４−５−１１−Ｌ−Ｒ−１１−に−Ｉ？−Ｄ〜Ｅ
−Ｄ−Ｑ−Ｅ−［１−Ｑ−Ｖ−Ｄ−Ｐ−１？−Ｌ−１−
Ｄ−１−Ｄ ＩＥ−Ｄ−ローＥ−［］−］Ｑ−Ｖ−０−Ｐ−１？−Ｌ
−１−Ｄ−−−１−Ｄ− ロー旧Ｅ−Ｄ−（１〜Ｒ−Ｒ−に−１？−Ｌ−１−ＤＯ
−Ｇ−１２４−に−１？−Ｌ−−Ｄ Ｒ４−に−Ｒ−Ｌ−１−Ｄ Ｑ−旦−ｉ−に−１１−Ｌ−＝Ｉ］−−プラスミドｐＰ
ｃ１６４５／２２９Ｒをリン酸カルシウム法（Ｇｒａｆ
＋ａｍ及びｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、前掲）によりＬｋ−
ＢＩＩＫ細胞によりトランスフェクトした。トランスフ
ェクトされた細胞を１１１Ｍメトトレキセートによる選
択にかけ、そして培地をプロティンＣについてＩＥＬ　
［ＳＡ　（例３．Ｅ、）により測定した。陽性クローン
を、ｌＯ％ウシ胎児血清及び１囲メトトレキセ−１・が
補充されたダルベコＭＥＭ中で、細胞がコンフルエンシ
ーに達するまで増殖せしめた。コンフルエント細胞を１
％ウシ胎児血清及び１オメトトレキセートを補充したダ
ルベコＭＥＭに切り替えた。

培地を７日間にねたり１又は２日ごとに集め、そして−
２０°Ｃにて貯蔵した。凍結された培地サンプルを解凍
し、そしてＱ　、　４．５　ｇｎフィルターを通して濾
過してすべての細胞片を除去した。固体塩化カルシウム
を５ｍＭの最終濃度に加え、そして固体ナトリウムアン
ドを０．０２％（ｗ／ｖ）の最終濃度に加えた。プロテ
ィンＣを、プロティンＣのカルシウム誘導コンホーメー
ションに対して特異的なモノクローナル抗体カラムを用
いて培地から回収した。

処理された培地をカラムに適用し、そして１０ｍＭ１：
ＤＴＡを含有するＴＢＳによりプロティンＣを溶出した
。プロティンｃ？ａ度を２８０ｎｍでの吸光により、及
びＥＬｒＳＡにより測定した。

ｐｐｃｔ６ｓ５／２２９でトランスフェクトされた細胞
から生産された活性化されたプロティンＣを、トランス
フェクトされた細胞から生産されたＰＣ２２９／９６２
プロティンＣの同量と、発色測定（ｃｈｒｏｍ。

ｇｅｎｉｃ　ａｓｓａｙ）によって比較した。４０μｌ
のＴＢＳ　＋ＥＤＴＡ中に稀釈された１ｎのアフィニテ
ィー精製されたプロティンＣを９６−ウェルプレートの
各ウィルに加えた。４０ｔｔｌの２ｍＭ　Ｓｐｅｃｔｒ
ｏｚｙｍｅ　ＰＣａ（アメルシャム・ダイアグノスチ力
社、ニューヨーク、ＮＹ）を各ウェルに加え、そして十
分に発色するまで３７°Ｃにインキュベートした。４０
５ｎｍにおける吸収の増加として活性を測定した。この
結果は、ｐＰｃ１６４５／２２９によりトランスフェク
トされた細胞により生産された活性化されたプロティン
ＣがｐＣ２２９／９６２により生産されたプロティンＣ
より５〜１０％活性が高いことを示した。

Ｉ、　　　ＰＣｌ３８０　２２９Ｒの　　　びプラスミ
ド１６４５中のプロティンＣをコードするＤＮＡ配列を
さらに変更して、活性化ペプチドの第一、第二、第七及
び第八アミノ酸（第３表）を除去した。単鎖１６４５鋳
型ＤＮＡを調製し、そして合成オリゴヌクレオチドＺＣ
１８８０（５’　−ＡＡＡ　ＣＧＡ　ＧＡＣＡＣＡ　Ｇ
ＡＣＣへへ＾ＧＡ　ＡＧ八−３′）、及びＺＣ５５０を
用いて部位特異的インビトロ変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ及
びＳｍ１ｔｈ　、前掲）にかけた。陽性クローンをジデ
オキシ配列決定にかけて変異誘発を確認した。陽性クロ
ーンを同定しそして１８８０と命名した。

クローン１８８０から調製された複製型ＤＮＡを５ｓｔ
ｌ及びＰｓＬＩで消化して５６２ｂｐプロティンＣ断片
を単離した。プラスミドＰＣ２２９／９６２をＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｓｔｌにより消化して’ｙｏｏｂｐプロティン
Ｃ断片を単離した。１８８０ｒｆからの４１１ｂｐプロ
ティンＣ断片並びにＰＣ２２９／９６２からの５６２ｂ
ｐ断片及び７００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩにより消化さ
れたｐＺｅｍ２２９Ｒに、四分連結により連結した。正
しいプラスミドを選択し、そしてρＰＣｌ３８０／２２
９Ｒと命名した。

プラスミドｐＰｃ１８８０／２２９Ｒをｔｋ−ＢＩＩＫ
細胞にトランスフェクトし、そして前記のようにして測
定した。

Ｊ、ＰＣｌ９５４　２２９Ｒの　、　　びプラスミド１
６４５中に存在する活性化ペプチドのコード配列を変更
して活性化ペプチドの第二〜第七アミノ酸コドンを除去
し；　１６４５中の活性化ペプチドの第一アミノ酸コド
ンと第八アミノ酸コドンを融合せしめる。単鎖１６４５
鋳型ＤＮＡを調製し、そして合成オリゴヌクレオチドＺ
Ｃ１９５４（５’　−ＧＡＧ＾ＡＧ　　ＡＡＡ　　ＡＣ
Ｇ　　ＡＧＡ　　ＣＣＡ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　Ａ１
ＡＡＣ−３’）　　、及びＺＣ５５０を用いて部位特異
的インビトロ変異誘発にかける。陽性クローンを選択し
、そして１９５４と命名する。コードされる蛋白質の軽
鎖及び重鎖の連結部のアミノ酸配列を第３表に示す。

クローン１９５４から複製形ＤＮＡを調製し、そして５
ｓｔｌ及びＰｓｔｌで消化して約４００ｂｐの変異した
プロティンＣ断片を単離する。プラスミドｐＰＣ２２９
／９６２をＥｃｏＲＩとＰｓＬＩ、又は５ｓｔＩとＥｃ
ｏＲＩにより消化して、それぞれの５６２ｂｐのＥｃｏ
Ｒｌ−ＰｓｔＪ断片、及び７００ｂｐのプロティンＣ断
片を単Ｌｉｔする。１９５４ｒｆからの約４００ｂｐの
プロティンＣ断片、並びにｐｃ２２９／９６２からの５
６２ｂｐ断片及び７００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩにより
消化されたｐＺｅｍ２２９Ｒに、四方連結により連結す
る。正しいプラスミドを選択し、そしてｐＰｃ１９５４
／　２２９Ｒと命名する。

プラスミドｐＰＣ１９５４／　２２９Ｒをリン酸カルシ
ウム共沈法によりｔｋ−ｔｕｕ［ｉランスフエクトする
。

細胞を選択し、そして前記のようにして測定する。

Ｋ、　ＰＣ１９５３２２９Ｒの制び プラスミド１６４５中に存在する活性化ペプチドのコー
ド配列を変更して活性化ペプチドの第一〜第八アミノ酸
コドンを除去し、１６４５中に存在する第一及び第二セ
ットのＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇアミノ酸コドン
間の融合を行う。単鎖１６４５鋳型ＤＮＡを調製し、そ
して合成オリゴヌクレオチドＺＣ１９５３（５’ＡＣＣ
ＴＣＡ　　Ｇ八八　ＧＡＡ　　ＡＡＣＧＡＡ　　ＧＡＡ
　　ＧＡＡ　　ＡＡＣＧＧＣＴＣ八八３′）、及びＺＣ
５５０を用いて部位特異的インビトロ変異誘発にかける
。陽性クローンを配列決定して変異誘発を確認する。陽
性クローンを選択し、そして１９５３と命名する。コー
ドされた蛋白質の軽鎖−重鎖接合部におけるアミノ酸配
列を第３表に示す。

クローン１９５３から複製型ＤＮＡを調製し、そしてＳ
ｓｔ　Ｉ及びＰｓｔｌにより消化して約４ｏｏｂｐの変
異したプロティンＣ断片を単離する。プラスミドＰＣ２
２９／９６２をＥｃｏＲＴ　ｋ　Ｐｓｔ　Ｉ、又は５ｓ
ｔＩとＥｃｏＲＩで消化し、それぞれ５６２ｂｐのＥｃ
ｏＲＩ　−Ｐｓｔ　１断片、及び７００ｂｐのプロティ
ンＣ断片を単離する。

１９５３ｒｆからの約４００ｂｐのプロティンＣ断片、
並びにＰＣ２２９／９６２からの５６２ｂｐ断片及び７
００ｂｐ断片を、ＥｃｏＲｒにより消化されたｐＺｅｍ
２２９Ｒと、画部分連結により連結する。正しい配列を
選択し、そしてｐＰｃ１９５３／２２９Ｒと命名する。

プラスミドｐＰｃ１９５３／２２９Ｒをリン酸カルシウ
ム共沈法によりＬｋ−ＢｌｌＫ細胞にトランスフェクト
する。細胞を選択し、そして前記のようにして測定する
。

例〕エ　　　　　■　び■の プラスミドＦＩＸ／ｐＤ２　（Ｂｕｓｂｙ等、Ｎａｔｕ
ｒｅ、　３１６＋２７１−２７３．１９８５）をＢａｍ
ｔｌ　Ｉで消化し、そして１．４ｋｂフアクタ一■断片
を回収した。この断片を、Ｂａｍ１ｌ　ｌで消化されそ
してウシ腸ホスファターゼで処理されたｐＤ５　’　と
連結した。生ずるプラスミドをｌ’ｌＸ／　ｐｏ！５’
　と命名した。

ファクター■及びファクター■を同時発現させるため、
１０■のＦＩＸ／ｐＤ５’　　　１０μｇのＦ■（５６
５２４６３）　／　ｐＤＸ　（ｌｌａｇｅｎ等、ＥＰ　
２００．４２１　；　ＡＴＣＣ４０２０５）及び１■の
ＤｌｌＦＲｒｅｓ　−ｐＤ５　’　　（メトトレキセー
ト耐性Ｄ　Ｉ！　ＦＲ遺伝子を含有するｐＤ５　’由来
のプラスミド（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ等、ＥＰ　１７７．０
６０）　）を用いてむに−ＢＨＫ細胞をトランスフェト
した。トランスフェクトされた細胞をメトトレキセート
の存在下で選択し、そして両組白質に対する抗体を用い
てイムノフィルターアンセイによりファクター■及びフ
ァクター■の生産について測定した。ファクター■及び
ファクター■の両方に対して陽性であるコロニーを選択
し、増殖せしめ、そして３５３−システィンによりパル
スした。培地蛋白質及び細胞内蛋白質をファクター■抗
体及びファクター■抗体を用いて免疫沈澱せしめ、そし
てポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する。フ
ァクター■及びファクター■を同時発現する細胞は二本
鎖ファクター■（すなわち、ファクター■ａ）を生産し
た。他方、ファクター■のみを生産する細胞はこの蛋白
質の単鎖形のみを示した。

Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　
ＢＡＲＩ遺伝子はバリヤー（Ｂａｒｒｉｅｒ）　Ｌして
知られる分泌される蛋白質をコードする。ＢＡＲＩ遺伝
子産物の分泌ペプチド部分、又はバリヤーの分泌ペプチ
ド＋第三（Ｃ−末端）ドメインはＳ、セレビシェ−にお
いて生産される外来蛋白質の分泌を促進するために使用
され得る（ＭａｃＫａｙ、　Ｗｏ　８７１０２６７０、
及びＭａｃＫａｙ等、ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、８８１
１６３３５．６）。

ヨーロッパ特許出願Ｎｏ、８８１１６３３５．６に記載
されている様にして、Ｂ（１−２９）Ａｌａ−Ａｌａ−
１ｙｓ−八（１−２１）インシュリン前駆体（Ｍａｒｋ
ｕｓｓｅｎ等、ＥＰ　１６３，５２９　；以後Ｍｌ−３
と称する）のコード配列に融合したバリヤーのシグナル
ペプチド及び第三ドメインをコードする配列を含有する
発現ヘクターを作製した。ｐｓＷ１９５　（第１４図）
と称するこのヘクターは酵母ＴＰＩＩプロモーター及び
ターミネータ−をさらに含有する。バリヤー及びインシ
ュリン配列をアミノ酸配列＋ｙｓ−ａｒｇにおいて連結
する。トロンビンによる融合蛋白質のプロセシングを可
能にするため、ｌｙｓ−ａｒｇ連結配列をｐｒｏ−ａｒ
（Ｈに変異せしめる。トロンビンによるこの部分におけ
る開裂が非融合インシュリン前駆体の分泌をもたらすで
あろつ。

第１４図に示すように、プラスミドｐｓＷ１９５をｓｐ
ｈ　Ｉ及び５ａｌｌで消化して、ＢＡＩｌｌ−インシュ
リン融合及びＴＰＩＩターミネータ−を含んで成る１、
７ｋｂ断片を単離する。この断片を、あらかじめｓｐｈ
　１及び５ａｌｌにより完全消化されたＭ１３ｍｐ１８
に連結する。生ずるファージクローンをｍｐＬ８−ＺＶ
１７２と称する。オリゴヌクレオチド（５’　−ＴＣＣ
ＴＴＧ　ＧＡＴＣＣＡ　ＡＧＡ　ＴＴＣＧＴＴ−３’　
）を用い、ウラシル法（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２　：　４８８
　４９２゜１９８５）によりｍｐ１８　　ＺＶ１７２を
変異せしめる。生ずる変異体を配列決定して変異誘発を
確認し、そして陽性クローンをＺＶ１７２／１０８３と
命名した。便宜上、ＺＶ１７２／１０８３中に存在する
挿入部をｐＵｃ１８にサブクローニングした。ＺＶ１７
２　／１０８３からの１．７ｋｂ　Ｓｐｈ　Ｉ　−Ｓａ
ｌ　Ｉ挿入部を単離し、そしてｓｐｈ　Ｉ及びＳａｔ　
Ｉによりあらかじめ完全消化されたｐＵｃ１８に連結し
た。生ずるプラスミドｐＺＶ１８０をＳａｌ　Ｉにより
完全消化した。線状化されたｐＺＶ１８０の接着末端を
ＤＮＡポリメラーゼＩ　　（Ｍｌｅｎｏｗ断片）により
平滑化し、そしてキナーゼ処理されたＢｇｌ　ＩＩリン
カ−に連結した。Ｂｇｌ　ＩＩによる消化によって過剰
のリンカ−を除去した。次に、リンカ−が付されたＤＮ
ＡをＳｐｈ　ｒで完全に切断して１．７ｋｂの挿入部を
単離した。部分的■旦プロモーター、ＢＡＲＩ　−旧−
３融合物及び■旦ターミネーターを含有する１、７ｋｂ
の挿入部をプラスミドルＳ誓２０７のｓｐｈ　Ｉ　−Ｂ
ａｍｌｌ　１部分せ旦プロモーターーヘクター断片に連
結してｐＺＶ１８７を作製した。　（ｐｚｙ２０７はｐ
ｃＰＯＴ　（ＡＴＣＣ３９６８５）から・次の様にして
誘導された。すなわち、２ミクロン配列及びｐＢＲ３２
２配列を含有するｐｃｐｏＴの７５０ｂｐのＳｐｈ　Ｉ
　−Ｂａｍｌｌ　Ｉ断片をｐＢＲ３２２テトラサイクリ
ン耐性遺伝子からの１８６ｂｐのＳｐｈ　Ｉ　　Ｂａｍ
１ｌＩ断片で置き換え；Ｓｐｈ［部位を破壊しそしてテ
トラサイクリン耐性遺伝子中にＮｏｔＩ部位を挿入し；
生、するプラスミドをＮｏｔ　Ｉ及びＢａｍ１ｌ　Ｉで
消化し；そしてＮｏｔ　Ｉ　　Ｂａｍ１ｌ　Ｉ　　ｐＢ
Ｒ３２２−由来断片に代えてＮｏｔ　Ｉ　−Ｂａｍｌｌ
　Ｉ　　Ｔｌ’旦プロモーター断片を挿入する。〕 ｐＢＲ３２２（Ｆｒｉｅｚｎｅｒ−Ｄｅｇａｎ等、前掲
）へのＰｓｔ１部位にクローン化されたプロトロンビン
ｃＤＮへからトロンビンｃＤＮＡを単離する。ｐ１５１
５（第３図）からの皿遺伝子を消化し、そして触媒領域
を除去するために操作し、そして残りの配列をトロンビ
ンｃＤＮＡに連結する。バイブリド遺伝子をＴＰＩＩプ
ロモーター及びターミネータ−に連結することにより発
現ユニットを調製する。次に、この発現ユニットを、酵
母ＢＡＲＩ遺伝子のコード領域の代りに置く。

ＢＡＲＩ遺伝子非コード配列を両端に有する発現ユニッ
トを含んで成る得られる構成物を用いてＳ、セレビシェ
−をトランスフォームする。トランスフォームされた細
胞を培養し、そして酵素活性測定によりトロンビンの生
産についてスクリーニングする。次に、トロンビン生産
について陽性のコロニーをｐＺＶ１８７によりトランス
フォームする。この細胞を培養し、そしてインシュリン
前駆体を培地から単離する。

以上、本発明を具体的に説明したが、本発明の範囲を逸
脱することなく種々の変更を行うことができよう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プラスミドＺｅｍ９９の作製過程を示す。 第２図は、ｔ−ＰＡ発現ヘクターＺｅｍ２１９の作製過
程を示す。 第３図は、プラスミドＺｅｍ２２８の作製過程を示す。 第４図は、α−１−アンチトリプシンｃＤＮＡのサブク
ローニングの過程を示す。 第５図は、発現ベクターＺｅｍ２３５の作製過程を示す
。 第６図は、プラスミノーゲンｃＤＮＡのヌクレオチド配
列を、コードされたアミノ酸配列と共に示す。 第７図は、トランスフェクトされたＢＨＫ細胞（ａ）、
及びα−１−アンチトリプシンを同時発現するトランス
フェクトされたＢ　ＨＫ細胞（ｂ）におけるプラスミノ
ーゲンの生産を示す。レーンｌは培地サンプルの結果で
あり、そしてレーン２は細胞質抽出物の結果である。矢
印はネイティブなプラスミノーゲンの位置（９１’ｄ）
を示す。 第８図は、ベクターｐＤ５の作製の過程を示す。 図中に使用されている記号は、Ｏ−１がアデノウィルス
５０−１　ｍａｐミルユニット−ＥがＳＶ４０エンハン
サ−；ＭＬＰがアデノウィルス２主要後期プロモーター
；Ｌｌ−３がアデノウィルス２トリパルタイｌ−（ｔｒ
ｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー；５′が５′スプライス部
位；３′が３′スプライス部位；ｐ（Ａ）がポリアゾニ
レ−ジョンシグナル、ＤＩｌｒ’Ｒがジヒドロホレート
レダクターゼ遺伝子、をそれぞれ示す。 第９図は、ベクターｐＤＸの作製の過程を示す。 第８図と同じ記号が使用されている。 第１Ｏ図は、Ｓ、セレビシェ−（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）ＫＥＸ２遺伝子を含有する発現ベクターの作製
の過程を示す。 第１１図は、トランスフェクトされた２９３細胞からの
培地サンプルにおける活性化されたプロティンＣの測定
の結果を示す。 第１２図は、トランスフェクトされた哺乳類細胞中で生
産された活性化されたプロティンＣの抗凝固活性を示す
。 第１３図は、ファクター■を同時発現する細胞により（
レーン１）、及びファクター■−トランスフェクトされ
た対照細胞により（レーン２）、生産されたファクター
■の放射免疫沈澱（ｒａｄｉ。 ｉｍｍｕｎｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）の結果を
示す。 第１４図は、トロンビン−開裂性融合蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を含有する酵母発現ベクターの作製の過程
を示す。°°旧−３°”はインシュリン前駆体Ｄ　Ｎ　
Ａ配列を示す。 第１５図は、合成アプロチニン遺伝子のヌクレオチド配
列を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、目的蛋白質をコードする第一ＤＮＡ配列、及び該目
   的蛋白質をプロセシングし又は安定化する蛋白質をコー
   ドする少なくとも１つの追加のＤＮＡ配列によりトラン
   スフェクトされ又はトランスフォームされた真核宿主細
   胞。 ２、前記真核宿主細胞が哺乳類宿主細胞又は酵母宿主細
   胞である、請求項１に記載の宿主細胞。 ３、前記第一ＤＮＡ配列が、ｔ−ＰＡ、ファクターVII
   、ファクターIX、ファクターＸ、プロテインＣ、活性化
   されたプロテインＣ、プロテインＳ、プラスミノーゲン
   、インシュリン、並びにこれらの誘導体及び類似体をコ
   ードするそれぞれの配列から成る群から選ばれたもので
   ある、請求項１に記載の宿主細胞。 ４、前記第一ＤＮＡ配列がセリンプロテアーゼをコード
   している、請求項１に記載の宿主細胞。 ５、前記追加のアミノ酸配列が、プロテアーゼ、プロテ
   アーゼ阻害物質、及び前記目的蛋白質に結合する蛋白質
   をコードするそれぞれの配列から成る群から選択された
   ものである、請求項１に記載の宿主細胞。 ６、前記第一ＤＮＡ配列がファクターVIIをコードして
   おり、そして前記追加のＤＮＡ配列がファクターIXをコ
   ードしている、請求項１に記載の宿主細胞。 ７、前記第一ＤＮＡ配列がプロテインＣ又は活性化され
   たプロテインＣをコードしており、そして前記追加のＤ
   ＮＡ配列が酵母￥ＫＥＸ２￥遺伝子である、請求項１に
   記載の宿主細胞。 ８、前記第一ＤＮＡ配列がｔ−ＰＡをコードしており、
   そして前記追加のＤＮＡ配列がＴＩＭＰ、トリプシン阻
   害物質及びアプロチニンから成る群から選択されたプロ
   テアーゼ阻害物質をコードしている、請求項１に記載の
   宿主細胞。 ９、前記第一ＤＮＡ配列がプラスミノーゲンをコードし
   ており、そして前記追加のＤＮＡ配列がα−１−アンチ
   トリプシン又はその変形体をコードしている、請求項１
   に記載の宿主細胞。 １０、前記第一ＤＮＡ配列がプロテインＣをコードして
   おり、そして前記追加のＤＮＡ配列がプロテインＳをコ
   ードしている、請求項１に記載の宿主細胞。 １１、前記第一ＤＮＡ配列がファクターVIIをコードし
   ており、そして前記追加のＤＮＡ配列が組織因子をコー
   ドしている、請求項１に記載の宿主細胞。 １２、目的蛋白質の製造方法であって、請求項１〜１１
   のいずれか一項に記載の宿主細胞を、前記第一ＤＮＡ配
   列及び前記追加のＤＮＡ配列の発現を許容する条件下で
   培養し、そして該目的蛋白質を該宿主から単離する、こ
   とを含んで成る方法。 １３、前記培養段階に先立って、それぞれが別個の発現
   ユニットを含有する複数のベクターにより宿主細胞をト
   ランスフェクトするか又はトランスフォームすることを
   含んで成る、請求項１２に記載の方法。 １４、前記培養段階に先立って、複数の発現ユニットを
   含有する単一のベクターにより宿主をトランスフェルト
   するか又はトランスフォームすることを含んで成る、請
   求項１２に記載の方法。 １５、前記培養段階に先立って、ポリシストロン性メッ
   セージに転写される単一の発現ユニットを含有する単一
   のベクターにより哺乳類細胞をトランスフェクトするこ
   とを含んで成る、請求項１２に記載の方法。 １６、ヒトの活性化されたプロテインＣと実質的に同じ
   生物学的に活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ配列
   であって、該配列がさらにアミノ酸配列Ｌ−Ｒ＿１−Ｒ
   ＿２−Ｒ＿３−Ｒ＿４−Ｘ−Ｒ＿５−Ｒ＿６−Ｒ＿７−
   Ｒ＿８−Ｈをコードしており、ここでＬは実質的に、活
   性化されたプロテインＣの軽鎖であり、Ｒ＿１〜Ｒ＿８
   はＬｙｓ又はＡｒｇであり、Ｘはペプチド結合であるか
   又は１〜１２アミノ酸のスペーサーペプチドであり、そ
   してＨは実質的に、活性化されたプロテインＣの重鎖で
   ある、ＤＮＡ配列。 １７、哺乳類宿主細胞ＤＮＡに組み込まれることができ
   発現ベクターであって、請求項１６に記載のＤＮＡに作
   用可能に連細されたプロモーターを含有する発現ベクタ
   ーによりトランスフェクトされた哺乳類細胞。 １８、前記細胞がサッカロミセス・セレビシエー（￥Ｓ
   ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ￥￥ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ￥
   ）の￥ＫＥＸ１￥又はＫＥＸ２遺伝子によりさらにトラ
   ンスフェクトされている請求項１７に記載の哺乳類細胞
   。