JPH02203787A - 迅速な変異分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は１分子生物学および免疫学の分野に属する。本
発明は、変異体を選択し分析する新規な方法に関する。

さらに９本発明はタンパクもしくはポリペプチドの抗原
ドメインもしくは抗原決定基を同定するための末法の使
用に関する。

（従来の技術） 静止ヒ）Ｔ細胞は、　ＣＤ２と呼ばれるＴ細胞の特異的
５０ｋＤ細胞の表面タンパクを介してヒツジ赤血球と結
合する〔パーク、　Ｊ、Ｆ、ら（Ｂａｃｋ、　Ｊ、Ｆ、
　ｅｔａｌ）　、　Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、
　　８巻、　２６５−２８０頁、　１９６９年：ハワー
ド、　Ｆ、Ｄ、ら（ｌ（ａｗａｒｄ、　Ｆ、口、　ｅｔ
　ａｔ）　。

Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、＋　１２６巻、　２１１？−２
１２２Ｌ　１９Ｂ１年〕。

この現象は、長年にわたって実用化されているが。

最近に至るまでその生理学的意義は、はとんど知られて
いなかった。しかし、Ｔ細胞とヒツジ赤血球との相互作
用〔ヒュニッヒ、　Ｔ、　（Ｈｕｎｉｇ、　Ｔ、）　。

Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１６２巻、　８９０−９
０１頁、　１９８５年；ヒューニッヒ、　Ｔ、　Ｒ（Ｈ
ｕｎｉｇ、　Ｔ、Ｒ，）　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
。

１３６巻、　２１０３−２１０８頁、　１９８６年〕お
よび、Ｔ細胞とその生理学的標的との相互作用〔シュー
、Ｓ、ら（ＳｈａＷ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ）　、　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　３２３巻、　２６２−２６４頁。

１９８６年〕に関する研究が平行して行われ、　ＣＤ２
に対して特異的な分子リガンドが同定された。これは広
く分布する表面タンパクであり、ヒトの場合にはＬＦＡ
−３と呼ばれている。ＣＤ２／ＬＦＡ−３の相互作用は
、細胞溶解標的接合反応〔ショー、Ｓ、ら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ。

３２３巻、　２６２−２６４　、１９８６年〕と、胸腺
細胞−上皮細胞粘着反応〔ボルガーら（Ｖｏｌｌｇｅｒ
　ｅｔ　ａｌ　）　。

１９８７年〕および混合リンパ球反応〔マーチン、Ｐ。

Ｊ、ら（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｐ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ）　、
　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３１巻、　１８０−１８
５頁、　１９８３年］とを媒介する。さらに。

抗ＣＤ２モノクローナル抗体のある種の組み合せが。

抗原とは無関係な過程によって、成熟Ｔ細胞を直接活性
化することができることが発見されたことから、　ＣＤ
２抗原がさらに広範囲の役割をもっていることが示唆さ
れた。

現在、タンパクの抗原決定基の遺伝子地図を作成するも
っとも一般的な方法では、タンパク配列を連結する短か
い合成ペプチド列を合成し、このペプチドを多重結合検
定法〔ゲイセン、　Ｈ，Ｍ、ら（Ｇｅｙｓｅｎ、　Ｈ，
Ｍ、　ｅｔ　ａｔ）　、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３５巻
、　１１８４１１９０頁、　１９８７年〕に使用する必
要がある。抗体の結合に重要な特異的残基を同定するた
めに１種々のペプチドが、各位置の置換反応によって合
成されている。合成ペプチド法にはいくつもの制限があ
る。もし、抗体がポリペプチド主鎖の異種の部分との相
互作用、または主鎖の特異な構造との相互作用から、そ
の親和力を引出すならば、ペプチドは、抗体と結合する
際に、完全なタンパクを模倣することはできない。抗体
に接触した個々の残基を同定するためには、極めて多数
のペプチド変異体を合成しなければならない。現在まで
のこのような研究の最も徹底的なものでは、　１５００
以上の個々のペプチドの検定が行われた〔ゲラオフ、Ｅ
。

Ｄ、ら（Ｇｅｔｚｏｆｆ　Ｅ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ）、
５ｃｉｅｎｃｅ、２３５巻、　１１９１〜１１９６頁、
　１９８７年〕。

モノクローナル抗体が、ウィルスの外皮決定因子を選択
するのに利用されてきた〔ニーデル、Ｊ。

Ｗ、　（Ｙｅｗｄｅｌｌ、　Ｊ、Ｗ、）とジャーハード
、　ｌ、　（Ｇｅｒｈａｒｄ。

Ｗ、）　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
、、　３５巻、　１８５〜２０６頁、　１９Ｂ１年〕。

このような選択法は、希望するほどに便利ではなくかつ
鋭敏ではない。というのは。

変異の変化をウィルスゲノムから抽出せねばならず、ウ
ィルスの生存不能を起こす変異は検出できないからであ
る。

（発明の要旨） 本発明は、タンパクの抗原決定基の迅速で簡単な遺伝子
地図作成法に関する。本発明の迅速な変異分析法は、抗
原抗体反応の活性を喪失させる抗原ｃＤＮＡの変異の選
択法を包含する。この方法はｃＤＮへ抗原決定基喪失変
異体を利用して、天然の分子のきわめて多数のアミノ酸
の置換物を採取することを可能にする。変異誘発法を使
用することによって変異の頻度は非常に高く、めったに
おこらない変種を効率よく単離することができる。本発
明の方法は、充分に迅速かつ簡単なので、非常に多数の
変異体を単離することができ、　ｃＤＮＡおよびモノク
ローナル抗体に利用できるあらゆる表面タンパクに適用
できる。

多数の抗原決定基喪失変異体を容易に得ることができる
ので、タンパクが接近し得る表面の詳細な遺伝子地図の
作成、リガンド結合部位の同定および抗原性は低いがよ
り大きな生物学的効果を有するタンパクの設計が可能に
なる。

さらに、この発明の方法を用いれば、負の選択試薬とし
て、直接、希望どおりに作製されたりガントを適切に利
用することができる。また、リガンドもしくは抗体に近
づかないポケットでおこる基質／タンパクの相互作用に
とって重要な残基の同定を可能にする方法への道が開け
る。リガンド結合部位の同定によって、新しいりガント
および医薬品を設計するための構造研究が容易になる。

本発明の方法はＣＤ２抗原が抗ＣＤ２モノクローナル抗
体に結合する領域およびヒト免疫不全ウィルス（ｌ（Ｉ
Ｖ　）のＣＤ４抗原上の結合部位を定義するのに使用さ
れた。

ＣＤ２−抗体の反応性を喪失させるＣＤ２ｃＤＮＡ変異
が選択された。変異体中のアミノ酸置換のパターンは、
　ＣＤ２分子の三つの個々の領域を定義付ける：すなわ
ち第１群と１群の抗体で認識される第１の抗原決定領域
；第■群の抗体で認識される第２抗原決定領域；および
第■群の抗体で認識される第３抗原決定領域である。抗
体の結合に重要なアミノ酸残基と、　ＬＦ＾−３の結合
に重要なアミノ酸残基とを比較すると、第１群と１群の
抗体がＬＦＡ−３結合部位の一部分と相互作用し；第■
群の抗体がＬＦＡ−３結合部位の他の一部分と相互作用
し；そして第■群の抗体がＬＦＡ−３結合部位には包含
されていて。

さらに、別の部分と相互作用することがわかる。

その上、第■群抗体の個々の置換の効果とＬＦＡ−３の
結合とがぴったりと一致していることは、第１群の抗体
が、　ＬＦＡ−３結合の効果を模倣することによって、
Ｔ細胞活性化に対してその効果を媒介することを示唆し
ている。

第１図は、変異体単離ベクターと変異体単離の手順とを
示す概略図である。

第１図Ａは、変異体の単離に用いられたベクターｐｔｌ
（３にＣＤ２を示す図である。

第１図Ｂは、変異体の単離法を示す概略図である。第（
ｉ）工程において、変異体を発現するＣＯＳ細胞と野生
型分子とが抗原決定基を認識するモノクローナル抗体で
処理される。この抗原決定基は喪失することが望まれる
。依然としてその抗原決定基を発現する細胞は抗体と結
合し、ひき続いて補体固定（第ｉｉ工程）、および細胞
溶解を起こす。

第ｉｉｉ工程では、残りの細胞を、　ＣＤ２の第２の抗
原決定基を認識する抗体で処理しく　ｉｉｉ　）　、マ
ウスのモノクローナルを認識する抗血清でコートした皿
に付着させる。第２抗原決定基を発現する細胞だけが皿
に結合する（　ｉｖ　）。プラスミドＤＮＡを粘着した
細胞から回収する。第ｉ工程では、喪失が望まれている
抗原決定基を依然発現している分子を除去し；第２工程
では、この方法の効率を増大させるとともに、確実に、
ヌル変異体が得られないようにする。

第２図は、−次ＣＤ２配列上の抗原決定基の位置を示す
。

第２図Ａは、予測される成ＰＣＤ２タンパクの配列を示
す。その膜通過領域は、黒線で下線を引いている。用い
た抗体を左の余白に示す。−次配列の下の記号は、各抗
体がその位置で変化する感度を示す。“０°゛印は、変
異体がその位置での置換によって得られたか、または他
の抗体で得られた変異体の関節的免疫蛍光分析において
その位置での置換に対して感度を示したことを示す、“
°＋゛。

印は、その位置での置換が試験されたが、抗体の反応性
に対する影響を検出できなかったことを示す。“＝”印
は、その位置のプロリンだけが反応性に影響したことを
意味する。

第３図は、　ＣＤ２の抗原決定領域を形成する変異体を
示す。２つの主要抗原決定領域の各々を含有するＣＤ２
ポリペプチドの短かい配列を示す。変異体の選択によっ
て得られるアミノ酸置換の変化は。

各野生型配列の下に示しである。第３図Ａは、　ＣＤ２
ポリペプチドの抗原決定領域１の配列を示す。第３図Ｂ
は、　ＣＤ２ポリペプチドの抗原決定領域２の配列を示
す。右方の欄は、左から右へ、負の選択に用いられた抗
体と、正の選択に用いられた単一もしくは複数の抗体を
示す。“全１６”は、第２図の１６個のモノクローナル
全部が正の選択段階で結合されたことを意味する。“′
他７°”は、第１抗原決定領域を認識する３５．１以外
の７個の抗体が正の選択工程で結合されたことを意味す
る。ＣＤ２の配列のすぐ下に示す変異体は、タンパクの
細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ部分を通じて変異
を誘発されたプラスミドのプールから変異体を選択する
ことによって得たものである。黒線の下の変異体は、黒
線で示されるオリゴヌクレオチドだけで変異が誘発され
たプラスミドを用いて選択することによっ得た変異体を
示す。

第４図は、−次のＣＤ４配列上の抗原決定基の位置を示
す。ＣＤ４タンパクの予想される配列は、提案された旧
Ｖ結合部位（上方に線を引いである）。

膜通過領域（アンダーラインしである）、および変異体
置換が起こるアミノ酸の位置（＊）とともに示しである
。

遺伝子の変異体を単離する本発明の方法は、以下の工程
を包含する：ａ）目的の構造遺伝子が連結されているベ
クターで哺乳類細胞をトランスフェクトすること；ｂ）
トランスフェクトされた該哺乳類細胞を、該構造遺伝子
によりコードされるタンパクの抗原決定基に対する第１
のモノクローナル抗体および補体を用いて、該抗原決定
基を発現する細胞が該第１のモノクローナル抗体に結合
し、かつ補体の固定化と該抗原決定基を発現する細胞の
溶解とを起こさせるのに適した条件下において処理する
こと；Ｃ）残存する溶解していない哺乳類細胞を、該構
造遺伝子の第２の抗原決定基に対する第２のモノクロー
ナル抗体で処理すること；ｄ）処理された該哺乳類細胞
を、該第２のモノクローナル抗体を認識する抗血清で被
覆した基質に付着させること；そしてｅ）該付着細胞か
らプラスミドＤＮ＾回収すること。

細胞表面タンパクの抗原決定基を同定する本発明の方法
は、以下の工程を包含する：ａ）目的の構造遺伝子が連
結されているベクターで哺乳類細胞をトランスフェクト
すること、ｂ）該哺乳類細胞を１該構造遺伝子によりコ
ードされるタンパクの抗原決定基に対する第１のモノク
ローナル抗体および補体を用いて、該抗原決定基を発現
する細胞が該第１のモノクローナル抗体に結合し、かつ
補体の固定化と該抗原決定基を発現する細胞の溶解とを
起こさせるのに適した条件下において処理すること；ｃ
）残存する溶解していない哺乳類細胞を、該構造遺伝子
の第２の抗原決定基に対する第２のモノクローナル抗体
で処理すること；ｄ）処理された該哺乳類細胞を、該第
２のモノクローナル抗体を認識する抗血清で被覆した基
質に付着させること；ｅ）該付着細胞からプラスミドＤ
ＮＡを回収すること；ｆ）回収したプラスミドＤＮＡを
適当な宿主細胞において増幅すること；ｇ）該構造遺伝
子が増幅された回収プラスミドＤＮＡである該工程ａ）
のベクターで哺乳類細胞をトランスフェクトすること；
ｈ）該工程ｂ）〜ｇ）を適宜反復すること；ｉ）該工程
ａ）〜ｈ）から得られるプラスミドＤＮＡで哺乳類細胞
をトランスフェクトし；トランスフェクトされた該細胞
を、該プラスミドＤＮＡの発現を起こさせるのに適した
条件下で維持すること；そしてｊ）該プラスミドＤＮＡ
の発現産物が該第１のモノクローナル抗体に結合するこ
とを検出すること。

細胞表面タンパクの抗原決定基を同定する本発明の他の
方法では、以下の工程を包含する：ａ）細胞表面タンパ
クの少なくとも一部をコードする遺伝子が連結されてい
るｐｉＨ３Ｍｃ０２ベクターでＣＯＳサル細胞をトラン
スフェクトすること；ｂ）トランスフェクトされた該Ｃ
ＯＳ細胞を約４８時間培養すること；Ｃ）トランスフェ
クトされた細胞を採取し、該細胞表面タンパクおよび負
の選択抗体を発現する細胞、補体の固定化、ならびに該
細胞の溶解に適した条件下において、これらの細胞を、
負の選択抗体と、ウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体と
、補体とにより順次処理すること：ｄ）溶解されない細
胞を採取し、正の選択抗体でこれらの細胞を処理するこ
と；ｅ）溶解されない細胞を。

ヒツジ抗マウス免疫グロブリンで被覆した基質に付着さ
せること；ｆ）付着しない細胞を除去すること；ｇ）付
着しない該細胞のＤＮＡ抽出物を調製し２回収すること
；ｈ）回収したＤＮＡ抽出物をＬｃｏｌｉ　ＭＣ１００
Ｉ／ｐ３に形質転換すること；そしてｉ）得られた細菌
コロニーを、該工程ａ）〜ｈ）におけるように、さらに
数回選択するか、あるいは負の選択抗体に結合する能力
を直接分析すること。

細胞表面抗原に対する抗体で被覆した材料を用いて、該
細胞表面抗原の抗原決定基変異体を単離する本発明の方
法は、以下の工程を包含する：ａ）該抗原を発現する細
胞を１選択された抗原決定基を発現する細胞が溶解され
るように処理すること；およびｂ）残存する溶解されな
い細胞を、該細胞表面抗原の第２の異なる抗原決定基を
認識するモノクローナル抗体で処理すること。

本発明はさらに以下のような可溶化ペプチドを提供する
：ヒト免疫不全ウィルスがＣＤ４抗原に結合することを
妨害することにより、ヒト細胞がヒト免疫不全ウィルス
に感染することを阻害する可溶化ペプチド；　ＣＤ４抗
原のＬｅｕ３ａ抗原決定基のアミノ酸配列と実質的に相
同であるアミノ酸配列を有する可溶化ペプチド；および
第４図のアミノ酸配列のうち、上側に線を付した部分で
表わされるような、　Ｌｅｕ３ａ抗原決定基のアミノ酸
配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有する可溶化
ペプチド。

ヒト細胞がヒト免疫不全ウィルスに感染することを阻害
する本発明の方法は、ヒト免疫不全ウィルスとＣＤ４細
胞表面受容体との相互作用を妨害する可溶化ペプチド、
またはヒト免疫不全ウィルスに結合することにより、該
ウィルスがＣＤ４細胞表面受容体に結合することを妨害
する可溶化ペプチドを１個体に投与することを包含する
。

（発明の構成） 細胞表面の抗原の決定基の遺伝子地図を作成する本発明
の方法によって、　ｃＤＮＡとモノクローナル抗体が利
用できるあらゆる表面タンパクの抗原決定基の遺伝子地
図を作成することができる。この方法は、　ｃＤＮＡの
抗原決定基喪失変異体を用いることによって実施される
が、天然の（自然に存在する）分子中に非常に多数のア
ミノ酸置換をしたものを採取することができ、したがっ
て、タンパクが接近し得る表面の遺伝子地図を作成し、
リガンド結合部位を同定し、その天然物より抗原性は低
いが、より大きな生物学的効果を有するタンパクを設計
することを可能にする。

゛′細胞表面抗原゛°という用語は、細胞表面に存在す
るタンパクを意味するが、一般に、細胞表面抗原は、細
胞内メンプラン系を通じて細胞表面に輸送される。この
ような抗原は５通常、細胞表面メンプランの脂質二重層
に存在する疎水性アミノ酸を含有するカルボキシル末端
ドメインによって該細胞表面メンプランにつなぎ止めら
れている。

以下に記載するように１本発明の方法を、ヒトＴ細胞レ
セプター（ＣＤ２抗原）の結合部位を同定し２かつＣＤ
４抗原上の旧Ｖ結合部位を同定するのに用いた。その結
合をそれぞれ第２図と第４図とに示す。

（以下余白） ＣＤ２変異体を単離する一般的な方法 変異体の単離は、第１図に示すようにして実施される。

第１図に示す方法は、　ＣＤ２抗原決定基を喪失した変
異体を単離するのに用いる場合について考察する。しか
し、この方法は、Ｃ０４抗原決定基を喪失した変異体を
同定するのに用いられたが。

他の細胞表面抗原にも広く適用できることは理解される
べきである。

第１図に示すように、　ＣＤ２抗原決定基を喪失した変
異体は次のようにして単離された。すなわち。

変異を誘発させたプラスミドのプールでＣＤＳ細胞をト
ランスフェクトし、４８時間培養し、収集し。

そして抗ＣＤ２モノクローナル抗体（すなわち、喪失が
望まれる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体）、
ラビット抗マウス免疫グロブリン抗体。

および補体で、連続的に処理した。この工程を負の選択
工程と呼び、第１図Ｂに工程ｉ）として示しである。

ＣＯＳ細胞には、自然欠失変異体がしばしば発生するの
で〔キャロス、エム、ピー（Ｃａｌｏｓ、　Ｍ、Ｐ、）
。

Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　
　ＵＳＡ、　　８０：３０１５−３０１９（１９８３）
　；　　ラザック、エイら（Ｒａｚｚａｑｕｅ、　Ａ、
　　ｅｔ　ａｌ、）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　　ｏｆ　Ｓｃｉ、　
　ＵＳＡ、　　８０：３０１０−３０１４（１９８３）
）　、正の選択工程は次のように実施される。

すなわち、補体処理を行わない（ｓｐａｒｅｄ）細胞を
。

別個の単一もしくは複数のＣＤ２抗原決定基を認識する
単一もしくは複数の抗体で処理し、ヤギ抗マウス免疫グ
ロブリン抗体で被覆した皿に付着させた〔ウィソキイ、
エル、ジエイおよびサトウ、ブイ、エル（Ｗｙｓｏｃｋ
ｉ、　Ｌ、Ｊ、　ａｎｄ　５ａｔｏ、　Ｖ、Ｌ、）。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ、　７５：２８４４−２８４８（１９７８））。抗
原決定基を喪失した変異体の単離に用いられる抗体を表
１に示す。

付着細胞から回収したプラスミドＯＮＡ　　Ｃハート。

ビイ（）ｌｉｒｔ、　Ｂ、）、　ＪｌＭｏｌ、８ｉｏ１
．、２６：３６５−３６９（１９６７））は９次いでエ
セリヒア・コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）に形質転換され、増
幅され、そして適切な場合には１次のラウンドでＣＤＳ
細胞に再導入される。選択プロセスの最後には１個々の
細菌コロニー由来のＤＮＡがＣＯＳ細胞にトランスフェ
クトされ１次いで該ＣＯＳ細胞は抗体結合について評価
される。

表１ ＯＣＲ２１？ １３Ｍ 本発明の方法を、　ＣＤ２抗原決定基をマツピングする
のに利用した場合には、変異体の単離に、ベクターｐｉ
）１３Ｍを用いた。細胞表面抗原をコードするｃＤＮＡ
セグメントを１本出願人の同時係属中の米国特許出願第
１６０．４１６号（１９８８年２月２５日付で出願）に
記載されているのと同様にして、ベクターｐｉ８３Ｍに
挿入する。ｐｉ８３Ｍは、プラスミドの複製起点と、エ
セリヒア・コリ内で複製および選択を行えるサプレッサ
ーｔＲＮＡ遺伝子とを有する。さらに、このベクターは
バクテリオファージＭ１３と５ｖ４０ウイルス（第１図
Ａ）とに由来する複製起点を有する。これらにより、該
プラスミドの一本鎖形を産生させ１次いで該プラスミド
を、　ＳＶ４０複製に必要なタンパクを発現する細胞（
すなわち、　ＣＯＳサル細胞）に導入して増幅させるこ
とができる。

ＣＯＳ細胞中での細胞ｃＤＮＡ表面抗原の発現は、ヒト
のサイトメガロウィルス由来の隣接する初期領域プロモ
ーターにより導かれる。

ＲＮＡスプライシングシグナルおよび３゛末端プロセツ
シングシグナルが、　ｃＤＮＡから下流に見出され。

これらのシグナルＳＶ４０ウィルス由来のものである。

ＣＯ２細胞表面抗原決定基が抗ＣＤ２モノクローナル抗
体に結合する領域を単離して明確にする場合。

ｃＤＮＡの変異は１本願に記載の方法で選択した。

初期の変異体を単離することは１組織培養細胞にトラン
スフェクトされたＤＮＡが受ける高い変異率を利用して
いる〔キャロス、エム、ビーら（ｆ：ａｌｏｓ。

Ｍ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、）、　　上記文献；ラサック、
ニーら（Ｒａｓｓａｑｕｅｅｔ　ａｌ、）、上記文献；
およびミラー、ジェイ、エイチら（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ
、Ｈ，ｅｔ　ａｌ、）、ＥＭＢＯＪ、、　　３　：３１
１？−３１２１（１９８４）　）。Ｃ［ｌＳ細胞を通じ
て変異を誘発させたプラスミドの集団は、エセリヒア・
コリに回収される。変異を誘発させたプールに対して。

負の選択にはモノクローナル抗体（Ｍａｂ）　９．６を
用い、正の選択にはＭａｂ　３５．１を用いる選択を連
続して３回行い、単一の変異体を単離した（第２図）。

単離された変異体は、２個のヌクレオチドが置換されて
いた。すなわち、　Ｌｙｓ４８がＡｓｎに、　Ａｓｐ１
８６がＧｌｕに変化していた（以下では、各種変異体を
野生型残基／変異体残基で示すことにする。例えば、Ｌ
ｙｓ４８Ａｓｎは、４８位のりシンがアスパラギンで置
換されていることを示す）。オリゴヌクレオチドの変異
誘発により上記の２つの変化が分離されたことは、ＬＹ
Ｓ４８Ａｓｎが単独で抗体９．６の結合の喪失に関与し
ていることを示した。しかし、他の抗体を用いて、この
プールから別の変異体を単離する試みをさらに行ったが
不成功に終わった。

変異体内のアミノ酸置換のパターンは、多くの配列変異
体を含むＣＤ２分子の３種の別個の領域を形成している
。すなわち、活性化に参画し１赤面球が第１の領域に付
着結合するのを阻止する抗体；第２の領域への付着結合
だけを阻止する抗体；および活性化には参画するが、第
３の領域への付着結合を阻止しない抗体である。

また９本発明の方法は、　ＣＤ４細胞表面抗原決定基が
抗ＣＤ４モノクローナル抗体に結合する領域を単離して
Ｉ！ｌ１１確にするのに用いられている。本発明の方法
を用いて、ＣＤ４のアミノ酸置換変異体が単離されてい
る。Ｉ（［Ｖの結合に影晋を及ぼす変異が。

Ｌｅｕ３ａ抗原決定基を含む抗原決定基のクラスターに
見い出された。

以下の詳細な説明では、遺伝子組換えの技術分野におけ
る当業者によく知られている各種の方法が引用されてい
る。このような公知の方法について記載している刊行物
などの資料は、参照文献としてここに採用する。

組換えＤＮＡ技術の一般的な原理について記載している
＋１的な文献には、以下のものが包含される：ダーネル
、ジェイ、イーら（Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、Ｅ。

ｅｔ　　ａｌ、）、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｅ１
ｌ　　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　　ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍ
ｅｒｉｃａｎ’Ｂｏｏｋｓ、　　Ｉｎｃ、、　　ｐｕｂ
ｌ＋５ｈｅｒ、　　ニューヨーク州　ニューヨーク（１
９８６）　　；レビン、ビー、エム（Ｌｅｖｉｎ、　８
９Ｍ、）、　Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ
ｙ　＆　５ｏｎｓ。

ニューヨーク（１９８５）　　；オ′−ルド、アール、
ダブｉｎｇ、　　第２版、カリフォルニア大学出版局、
カリフォルニア州、バークレー、　（１９８１）　；お
よびマニアＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州、コ
ールド・スプリング・ハーバ−（１９８２）。

ＣＤ２ 変異体単離の確度を高めるために、高い効率で任意のＤ
ＮＡをランダムに変異誘発させる一般的な方法が考案さ
れた。例えば、ポットスタイン、デイおよびデイ、ジョ
ートル（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ　ａｎｄ　Ｄ。

５ｈｏｒｔｌｅ）、　　５ｃｉｎｅｃｅ、　２２９．１
１９３−１２０１（１９８５）を参照されたい。ＣＤ２
細胞外ドメインをコードする可能性があるすべての塩基
対の１均一で非特異的な置換体が１各位置における野生
型塩基の９５％と。

他の３つの塩基の各々１．７％ずつとの混合物で合成さ
れた２０個の重複する３３単位（３３単体）のオリゴヌ
クレオチドから創製される。これらのオリゴヌクレオチ
ドは重複していないが、その理由は。

合成中、マトリックスに結合している残基は、簡単には
不純化されず、またオリゴヌクレオチドの丁度末端に起
こる変異を組込む効率は知られていないからである。

塩基対置換の効率を最大にするために１　クンケル（Ｋ
ｕｎｋｅｌ）の方法を用いて、縮退オリゴヌクレオチド
を発現ベクターｐｉ）１３ＭＣＤ２に組込んだ（第１の
選択 Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　８２：　４８８　４９２（１９８５
］　。これらのヌクレオチドの縮退度と、それらの組込
みの効率に基づいて・エセリヒア・コリに形質転換して
得られたプラスミドのほぼ４０％が、少なくとも１つの
塩基置換を含んでいることが推定された。２０の異なる
変異誘発反応を行い、エセリヒア・コリに形質転換し、
そして得られた各培養物の一部をプールして変異体のス
トックを作製した。

得られた変異体ストックのアリコートを、負の選択には
Ｍａｂ９．６を用い、正の選択にはＭａｂ　３５．１を
用いる選択方法に供したところ１回収されたプラスミド
の１０〜１５％が、所望の表現型を持っていることが分
かった。２回の選択後には、所望の変異体が、プラスミ
ド集団の５０〜７５％を占めていた。

同じ変異体ストックを、すべての連続的変異体選択処理
に利用した。

変異の位置 １１４個の一次変異体を単離して、　５０種類のアミノ
酸配列変異体を収集した。この変異体選択の結果を第２
図および第３図に要約した。これらの変異はすべて、３
つの別々の領域に属する。第１の領域は、　Ｌｙｓ　４
８がほぼ中心であり、第１群の抗体全部（９，６，７Ｂ
１０．　ＭＴＩＩＤ、およびＭＴ９１［］）、第■群の
抗体の１種を除く全部、および第■群の抗体の１種につ
いての４７個の変異を含んでいる（第３図Ａ）。第２の
領域は、　Ｇｌｙ９５がほぼ中心になっている。この第
２の抗原決定基領域では、負の選択に５種類の抗体を用
いて２７個の突然変異体を得た（第３図Ｂ）。ひとつだ
けの刺激抗体が他のいずれの抗体よりも広い領域に接触
しているが、外に明らかな区別をすることができない。

各抗体は独特の変異パターンを与える。第２の領域を認
識する抗体のほとんどは、Ｔ細胞の活性化にはほとんど
効果がない。第３の領域が、第■群の抗体（９，１およ
び０ＣＨ２１？　）の両方に対する反応性の喪失を起こ
す単一変異により示される。

特に第３図Ａは、第１の抗原決定基領域を形成する変異
体を示す。ＣＤ２残基４２〜５６は、各変異体によって
コードされるアミノ酸置換の上に示す。

右側の第１欄は、負の選択に用いた抗体を示す。

第２１１ｉは、正の選択に用いた抗体を示す。「全１６
」は１表１の１６種のモノクローナル抗体全部を組み合
わせて正の選択工程に用いられたことを示す。

「他７」は、第１の抗原決定基領域を認識する抗体３５
、■以外の７種の抗体が、正の選択工程で組合わせたこ
とを意味する。ＣＤ２配列のすぐ下に示す変異体は、タ
ンパクの細胞外ドメイン全体が変異誘発されたプラスミ
ドのプールから変異体を選別することにより得られた。

横線の下に示す変異体は、横線の全長をカバーするオリ
ゴヌクレオチドだけで変異誘発されたプラスミドを用い
て本発明の方法で得た変異体を示す。第２の抗原決定基
領域を形成する変異体のコレクションを第３図已に示す
。ＣＤ２残基８６〜１００は、変異体置換部分の上に示
す。他の表記は、第３図Ａと同じである。

赤血球のロゼツト形成 ＬＦＡ−３が仲介する。ヒト赤血球がトランスフェクト
されたＣＯＳ細胞へ付着する反応を変異体ＣＤ２タンパ
クが促進する・能力を、赤血球ロゼツト定性分析法で測
定した。３種の表現型（すなわち、野生型１部分型、お
よび非ロゼツト形成型）について評価した。第１と第２
の領域（第１群、第■群。

および第■群の抗体と反応性）に変化を起こさせる変異
の多くは、ロゼツト形成を劇的に減少させた。これをさ
らに試験するために、オリゴヌクレオチドに特異的な変
異を誘発させて、少数の変異体を創製した。第１の抗原
決定基領域の４６．４７゜および４８の各位置のりシン
をアスパラギンもしくはアラニンで置換すると、第１群
の抗体Ｍａｂ９．６の結合と赤血球の付着との間に著し
い相関が認められた。しｙｓ４６Ａｓｎ／Ａｌａは、　
Ｍａｂ　９．６の結合と赤血球の結合との両方にあまり
大きな効果は与えず。

Ｌｙｓ４７Ａｓｎ／Ａｌａは上記の両方に全く効果を与
えず。

そしてＬｙｓ４８Ａｓｎ／Ａｌａは上記の両相夏作用を
完全に消失させた。同様に、残基５１は、赤血球の結合
とＭａｂ９．６の結合の両方にとって重要であることを
示すことができた。残基５２は１両相互作用に弱い効果
を与えるだけであった。

他の抗体や他の変異体によるその後の実験で。

ＣＤ２と、第１群の抗体およびＬＦＡ−３との相互作用
に、　Ｌｙｓ４８が主要な役割を果たしていることが分
かった（第２図および第４図）。例えば、変異体Ｌｙｓ
４８　Ｇｌｙは、第１群の抗体全部と非反応性であり、
　Ｌｙｓ４８の位置が置換された分子はいずれも。

検出可能なロゼツト形成活性を示さない。Ｌｙｓ　４８
における置換の上記挙動は、第１群の抗体が、Ｔ細胞の
増殖を刺激するＬＦＡ−３結合の効果を模倣するという
強力な証拠の１つになっている。

Ｔ細胞の活性化に参加する１つの抗体だけが。

第２の抗原決定基領域の決定基を認識する。この領域に
おける置換により、ロゼツト形成は特徴的に減少するが
完全には消失しない。このことは。

活性化を促進する抗体で選択された変異体が９通常、ロ
ゼツト形成に影響を与えるという見解と一致する。

（以下余白） 々のアミノ　習　のｔ いくつかの残基が、抗体の反応性を直接決定する場合が
ある。そして、抗体の親和力にとっては第２に重要なこ
とであるが、このいくつかの残基は他の残基の変化と関
連して変化することが多いので、他の残基を同定できる
ことは明らかである。

例えば、　Ｌｙｓ４６Ａｓｎの置換は、　Ｍａｂ９．６
と結合しない変異体にしばしば認められるが、それ自体
ごく部分的な結合の喪失を起こすだけである。類似の現
象は、５１および５２の位置における二重変異体を繰り
返し単離する際に起こる。

原則として、アミノ酸が置換されると、特異的な相互作
用の消失または局部的な変性を起こすことにより、抗体
もしくはＬＦＡ−３の結合が喪失するに至る。抗体もし
くはＬＦＡ−３の結合のいくつかのパターンは、後者の
可能性に対する反証になっている。例えば、　Ｌｙｓ４
８の位置で置換された分子はすべて、依然としてＭａｂ
３５．１と結合する。このＭａｂはｌ１ｅ４９における
変化に敏感である。同様に、　Ｍａｂ９．６およびＬＦ
Ａ−３の両方は、　Ｇ１ｎ５１Ｌｅｕ変異体に結合する
ことができないが、それにもかかわらず。

この変異体は、抗体７Ｅ１０および９−２により認識さ
れる。Ｇ１ｎ５１Ａｒｇの置換がなされたＣＤ２は、　
７Ｅ１０および９−２とは非反応性であるが、　ＬＦＡ
−３と結合し野生型と区別できない。第２の抗原決定基
領域では、　Ｔｙｒ９１Ａｓｐの変異により、ロゼツト
形成の喪失が起こるが、抗体ＮＵ−ＴＥＲの結合は、た
とえ９２の位置における多（の置換によりＮＵ−ＴＥＲ
の反応性が消失しても影響されない。

局部的な変性が、抗体結合の喪失に重要な役割を果して
いる１つの例がある。プロリン残基は。

構造上の自由度が制限されているので、αヘリツクスの
形成を促進しないことが知られている〔シュー、ビー、
ワイおよびファスマン、シイ・デイ（Ｃｈｏｕ、　Ｐ、
Ｙ、　ａｎｄ　Ｆａｓｍａｎ、　Ｇ、Ｄ、　）　、　Ａ
ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　４７：２５１−２７６　（１９７
８）　、　Ｇ１ｎ５１Ｐｒｏ変異体は、第１の抗原決定
基領域と反応するいかなる抗体にも認識されず、　Ｇ１
ｎ５１Ｐｒｏは、全１６の抗体による正の選択を用いた
場合、第１の領域の抗体による負の選択で単離されるこ
とが多い。最も極端な場合には５全１６の抗体を正の選
択のために組み合わせると、　Ｍａｂ３５．１による負
の選択により、排他的にＧＩｎ５１Ｐｒｏが単離される
。ＧＩｎ５１Ｐｒｏを反復して単離することを避けるた
めに、第１の抗原決定基領域における多くの変異体（第
２図および第３図）が、単独の正の選択抗体としてＭａ
ｂ３５．１を用いることにより単離された。

Ｇ１ｎ５１Ｐｒｏ以外の３５．１変異体を単離するため
に。

この変異体に結合できない抗体だけを、正の選択に用い
た。濃縮を３回行った後２元のコドンの３つの塩基のす
べてが変化した単一の３５．Ｉ　１１ｅ４９ＧＩｎ変異
体が得られた。この変異の異常な性質は次のことを示唆
している。すなわち、３５．１抗体については、その親
和力がＣＤ２構造の多くの特徴から得られ、単一の特徴
を置換することにより、親和力が著しく低下することは
極く希であるということである。Ｇ１ｎ５１Ｐｒｏの変
異は２局所的な２次構造を大きく変化させることにより
、これらの相互作用をいくつも消失させる。３５゜１抗
体の親和力は抗体９．６の親和力と同等であるから〔マ
ーチン　ピージェイら（Ｍａｒｔｉｎ、　Ｐ、Ｊ、ｅｔ
　ａｌ、）　、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１３１　：　１８０−１８５　（１９８３）　）　、こ
の抗体の異常な変異スペクトルは、結合の定性的に異な
った様式から生ずるのであって、単純により強い相互作
用から生ずるものではないことは明らかである。第■群
の他の抗体であるＴｉｔ／３ＰＴ２１１９も、正の選択
を行うために全１６のモノクローナル抗体をプールした
場合に、　Ｇ１ｎ５１Ｐｒｏの変異を排他的に起こした
。

■　　の　　　の　　　。

第■群の抗体については、ただ１種の変異体。

Ｔｙｒ１４０Ａｓｎ／Ｇ１ｎ１４１）１ｉｓ二重置換体
を得た。しかし。

第■群の抗体は、ＣＯＳ細胞に発現されたＣＤ２分子と
ごく弱い反応しか行わないが、これは活性化されていな
いＴ細胞上では、第■群の抗体とＣＤ２との反応性が弱
いということを示唆している〔モイヤー、ニス、シーら
（Ｍｅｕｅｒ、　Ｓ、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｃｅ旦
。

共：８９７−９０６　　（１９８４）　）。第■群の抗
体の抗原決定基を利用可能にするには、Ｔ細胞を予め活
性化するか、または第１群の抗体とともにインキュベー
トすることが必要である〔モイヤー　ニス、シーら、上
記文献〕。第■群の抗体の反応性が迅速に得られるとい
うことは、この現象が、その分子の構造的変化により起
こるものであって、別の種の新規合成によるものではな
いことを示唆している（モイヤー、ニス、シーら、上記
文献；ヤン。

ニス、ワイら（Ｙｏｕｎｇ、Ｓ、Ｙ、、ｅｔ　ａｌ、）
　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１３７：１０９７−１１００　　（１９８６）　）。

本願の研究における各モノクローナル抗体は。

変異の連続的な線形パターンを示した。３種の抗原決定
基領域の全部は、抗体結合を行うのに利用できる分子の
露出部分として予想されるように。

親水性である（第２図）。分子のごく少数の限定された
部分だけが多数の独立した抗体を生ずる理由を説明する
のに、いくつもの方法がある。例えば、第１の抗原決定
基の一部が、一方の側には親水性残基を有し、他方の側
には疎水性残基を有するαヘリックスを形成すると予想
される〔シュービイ、ワイおよびファスマン、ジー、デ
イ、展Ｒｅｖ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ、、　４７　：　２５
１−２７６　（１９７８）　）　、このようなヘリック
スは、Ｔ細胞が認識するのに特に好ましい抗原を形成す
ると考えられた〔ド・リシシイ、およびベルツォフスキ
イ、ジェイ、エイ（Ｄｅ　Ｌｉ５ｉ、Ｃ，ａｎｄ　Ｂｅ
ｒｚｏｌｓｋｙ＋　Ｊ、　Ａ、）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２　：　７０４８
　（１９８５）　）　、マウスのヘルパーＴ細胞による
この領域の認識は、抗体の反応を集中させる。第２の抗
原決定基領域に対応する領域（第３図Ｂ）では、３つの
潜在的なＮ結合グリコジル化部位が、ヒトの配列には存
在しないラットＣＤ２配列〔ウィリアムズ、エイ、エフ
ら（Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ａ、　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ、　
）　、　４ｄ。

月臣：　３６Ｂ−３８０（１９８７）　）に見い出され
ている。これは、ヒトの配列と交差反応し得るマウスの
サプレッサーＴ細胞の数を減少させることにより、ヒト
配列との反応性を向上させるのに役立つ。あるいは、赤
血球受容体の反応性について抗体を予め選択することに
より、抗体結合部位のスペクトルを限定することができ
る。

以Ｖ 本発明の方法を用いて、　ＣＤ４のアミノ酸置換変異体
を単離した。旧Ｖの結合に影響を与える変異が、　Ｌｅ
ｕ３ａの抗原決定基を有する抗原決定基クラスター中に
見い出されている（第４図）。この抗原決定基のマツピ
ング実験は、　ＣＤ４−ａｐ１２０間の相互作用を阻害
するのに最も有効なものを含めて。

抗ＣＤ４抗体のほとんどがＣＤ４のアミノ末端ドメイン
を認識することを示している。ＣＤ４のアミノ末端ドメ
インと、免疫グロブリンＶドメインとが類似していると
ともに、これらの抗原決定基の位置を決定することによ
り、　ａｐ１２０と相互作用を行うＣＤ４の表面のモデ
ル化が可能となる。

ＣＤ２は、細胞−細胞間の付着反応と、抗原非依存性の
活性化反応との両方を媒介する。１（ＩＶエンベロープ
タンパクｇｐ１２０は、高い親和力でＣＤ４に結合しく
ＫｄｌＯ−９Ｍ）　、旧Ｖを宿主細胞に導入することを
可能にする。ＣＤ４の細胞表面発現は、ウィルスが浸透
するのに必要であり、ヒト細胞においては、感染に対す
る感受性には充分なようである。また、　ＣＤ４とｇｐ
１２０との間の相互作用は、感染細胞と、　ＣＤ４を有
する非感染細胞との融合細胞の形成を媒介する。これは
、インビトロでのウィルス感染に伴って観察される細胞
変性効果に対して少なくとも部分的な原因になっている
。

本発明の方法により同定され１機能的に明確にされた結
合部位（特に、　ＣＤ２分子もしくはＣＤ４分子に対す
る結合部位）は、可溶性の形態で調製することができる
ので、放射免疫検定法、酵素免疫検定法、および酵素結
合免疫吸着検定法を包含する。当該技術分野で公知の免
疫診断検定法に使用できる。さらに１本発明の方法によ
り単離された細胞表面抗原は、可溶性の形態で調製する
ことができ、ヒトを含む動物の免疫に関連する疾患を治
療するために、単独もしくは本発明の他の細胞表面抗原
と組合わせて投与することができる。このような疾患の
例は、　ＡＩＤＳ、喘息、慢性関節リウマチ、免疫不全
腎臓疾患、免疫内分泌障害、およびＵ織／器官移植拒絶
反応である。

３番目のジスルフィドで結合された細胞外ドメインと、
膜通過領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏ
ｎ）および細胞質領域を欠いている可溶性形ＣＤ４は、
　ｇｐ１２０と結合できる〔ディーン、ケイ、シーら（
Ｄｅｅｎ。

に、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、）　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１　
：　８２−８４　（１９８８）　；ダルグレイシュら（
Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ｅｔ　ａｌ、）　、　Ｔｈｅ　Ｌ
ａｎｃｅｔ。

１９８７年１１月７日、　１０４７−１０４９３゜これ
は、２つの最大アミノ末端ドメインに対するＣＤ４の旧
Ｖ結合活性を制限する。この最大アミノ末端ドメインは
。

免疫グロブリンのＶ領域ドメインに対して顕著な相同性
を示す。このことは、　ｇｐ１２０がＣＤ４の免疫グロ
ブリン様ドメインと相互作用し得ることを示唆している
。

ＣＤｄ上のＩＩＩＶに対する結合部位は２モノクロ一ナ
ル抗体を用いてＣＤ４−ｇｐ１２０間の相互作用を阻害
することにより４間接的に位置決めがなされた。

ＣＤ４の２つの抗原決定基は、　ｌ１ｆＶ結合部位の近
傍に存在するようである。その一方はＬｅｕ３ａおよび
０ＫＴ４Ａの抗体で形成され、他方はＭＴ１５１および
ＶＩＴ４の抗体で形成されている。これら２つの抗原決
定基は、立体的に全く別個のものであり、一方の抗原決
定基を認識する抗体は、他方の抗原決定基を認識する抗
体の結合を阻害しない。Ｌｅｕ３ａ抗体に対して生じる
抗イデイオタイプ抗体は、　ｇｐ１２０の保存部分を認
識する。このことは、　Ｌｅｕ３の抗原決定基が旧Ｖ結
合部位の一部を実際に構成しているということを示して
いる。

従って、　ＣＤ４上の旧Ｖ結合部位を同定ずればＨＩＶ
がＣ［］４細胞表面受容体と相互作用するのを妨害する
ことにより、　ＩＩＩＶがヒト細胞に感染する能力を阻
害するペプチド類を生産することができる。

これは１例えば、　）ＩＩＶに結合して、　Ｉ（ＩＶが
細胞表面受容体に結合するのを阻害するペプチドを生産
することにより達成できる。例えば、この目的に対して
特に有用であるのは、　Ｌｅｕ３ａ抗原決定基と同じア
ミノ酸配列かまたは実質的に同じアミノ酸配列を有する
ペプチド、あるいは第４図のアミノ酸配列の上側に線を
付した部分を有するペプチドである。このようなペプチ
ドは、公知の方法を用いて合成することが可能であり、
ＩＩＩＶと結合してＨＩＶが細胞に感染する能力を阻害
するのに充分な量を、可溶性の形態で（例えば、免疫グ
ロブリンのような他のタンパクの一部分として）１個体
に（例えば、静脈投与により）導入することができる。

本発明の抗原は、免疫治療に用いられる場合治療用薬剤
で標識しても２　しなくてもよい。このような薬剤の例
としては、薬物、放射性同位元素レクチン類、および細
胞毒素類がある。本発明の方法および組成物は、以下の
実施例により、さらに例示されるが、これらの実施例は
本発明を限定するためのものではない。

（以下余白） ｍ　　第１ゴヌクレオチドの　　沃 野生型配列９５％および他の３種の配列各１．７％のホ
スホアミダイトからなるホスホアミダイト混合物を用い
、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＤＮＡ　
　シンセサイザーにより、所定の位置で変化している変
性（縮退）オリゴヌクレオチドを合成した。５ｅｅｄ、
　Ｂ。

およびＡｒｕｆｆｏ、　Ａ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８４：３３６５〜３３６９　（１９８７）で述べている
ように、　ＣＯ２配列６００ヌクレオチドの６３位以降
の配列を２０種の３３鴫体オリゴヌクレオチド中に合成
した。この配列は、出願人の同時係属中の米国特許出願
第１６０．４１６（１９８８年２月２５日）においても
開示されている。

各々のオリゴヌクレオチドは、３塩基だけ前にあるオリ
ゴヌクレオチド配列と重複する。３′末端塩基のほとん
どは不変性である（合成は樹脂固定ホスホアミダイトを
起点とし、３°から５″方向に進行する）。しかし、オ
リゴヌクレオチドによって決定される５゛末端塩基が変
化した変異体を得ることも可能である。これは、１個の
塩基が重複するということは、すべての位置を異変性に
するのに十分であることを意味する。これらのオリゴヌ
クレオチドは、脱保護および脱塩後、さらに精製せずに
、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａ
ｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　　１ｌａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹ
ｏｒｋ　（１９８２）に記載されている条件下でポリヌ
クレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）を用いて
ただちにリン酸化した。リン酸化したオリゴヌクレオチ
ド各１０Ｂを別々に５００ｎｇの一本鎖鋳型に添加した
。

各々の混合物を手早＜７０℃に加熱し、室温にまで冷却
し、デオキシヌクレオチド三すン酸、ＩＯ単位の逆転写
酵素（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　）および逆転写酵
素緩衝液を添加して最終反応容量を１０μｌとした。

３７°Ｃで１時間インキュベート後、　ＡＴＰ　、ジチ
オスレイトールおよびウシ血清アルブミンを添加し。

Ｔ４ＯＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌａｂｓ）について推奨されている反応条件に近づけた
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（４００単位）の添加後さらに３７
°Ｃで１５分間インキヱベートした。各連結反応物の５
分の１を大腸菌の形質転換に使用し、その結果各オリゴ
ヌクレオチドから約１　、０００個の細菌コロニーを得
た。各プレートからのコロニーをかきとってＬＢに入れ
。

２０のグリセロールストック（ｇｌｙｃｅｒｏｌ　　５
ｔｏｃｋ　）を作成した。これらのそれぞれは、異なる
３３塩基対配列内で変異誘発されたｐｉ８３ＭｃＤ２の
個体群を代表する。

ＲｐｘＲ縁プラスミドｐ３　（Ｓｅｅｄ、　Ｂ、、　Ｎ
ｕｃ、＾ｃｉｄＲｅｓ、１１　：　２４２７〜２４４５
　（１９８３）　）により形質転換されたＢＷ３１３　
　（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、Ａ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２　：　４Ｂ８〜４９２　（１９
８５）　）由来のＢＷ３１３／ｐ３株において、−末鎖
鋳型ＤＮＡを１周製した。ＢＷ３１３／ｐ３は、アンピ
シリンおよびテトラサイクリンを含む培地中での増殖に
より、サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子を含むプラスミドの
選択を可能にする。プラスミドｐｉ）１３ＭｃＤ２をＢ
Ｗ３１３／ｐ３に導入し、　Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、　Ａ。

ら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ　　１．　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
　　２：５０７〜５１７（１９８４）に記載されている
ように、プラスミドを有する株を野生型Ｍ１３ウィルス
で感染させて、−末鎖ＤＮＡを調製した。ＢＷ３１３／
ｐ３において生じた一本鎖ＤＮＡは、各鋳型につき２０
〜３０のウラシル残基を持つ。

これは、インビトロで１周製したＤＮＡストランド。

従ってオリゴヌクレオチドの導入（にｕｎｋｅｌ＋Ｔ、
Ａ、。

前出）について、効果的な選択を可能にする。導入の頻
度は約７５％であった。

４６、４７および４８位の特異的なアミノ酸の変化を同
様にして行なった。但し、変性オリゴヌクレオチドの代
わりに、特定の潜在的なコードを有するオリゴヌクレオ
チドを使用した。

裏隻開■　迎ムＪＬ！１１λ蓮択 変異誘発したｐｉＨ３ＭＣＤ２を保有する細菌からスフ
ェロプラストを調製し、　ＣＯＳ細胞に融合した。これ
は、出願人の同時係属中の米国特許出願第１６０，４１
６（１９８８年２月２５日出願）に開示されている方法
で行なった。融合から４８時間後に、　ＣＤ２を発現す
るＣＯＳ細胞をＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴ＾を含むデイシ
ュから得た。

６つの６０鴫のデイシュからのＣＯ３細胞を２次に腹水
の１／１０００希釈物（負の選択用抗体）を含む、　Ｐ
ＢＳ。

１０％子ウシつ清、　０．０２％アジ化ナトリウム（Ｐ
ＢＳ−ＦＢＳ　）中でインキュベートした。抗体のイン
キュベートは、すべて、氷上で３０分間１１ｎｉのＰＢ
Ｓ−ＦＢＳ中で実施し、その後ＰＢＳ中２％フィコール
のクツションにより遠心分離した。次に、細胞を５μｇ
／ｒｎｌのウサギ抗マウスＩｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ
　）と共にインキュベートした。次に、　ＤＭＥ　　（
ＧＩＢＣＯ）中の５０％ウサギ補体（Ｐｅｔ−Ｆｒｅｅ
ｚｅ）　２　ｍｌを添加し、凝集を防ぐために撹拌しな
から３７°Ｃで３０分間インキユヘートした。ＰＢＳ１
５ｍＭ　ＥＤＴＡで１０！Ｉ１１に希釈し、そして５戚
のフィコールのクツションにより細胞を遠心分離するこ
とにより補体を除去した。次に１７１０００希釈された
正の選択用抗体と共に細胞をインキュベートし、ヒツジ
抗マウス免疫グロブリン（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄ
ｉｃａｌ）で被覆したデイシュ（ＷｙｓｏｃｈｉＬ、　
Ｊ、、および５ａｔｏ、　Ｖ、　Ｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

垢遺りし２８４４〜２８４８　（１９７８）　）に添加
した。この被覆したデイシュは、出願人の係属中の米国
特許出願第１６０，４１６号（１９８８年２月２５日出
願）に開示されているように調製された。細胞を１時間
付着させた後、非付着細胞を静かに洗い流し、付着細胞
の旧ｒｔ上清からＤＮＡを調製した。回収したＤＮＡで
大腸菌ＭＣ１０６１／ｐ３に形質転換し、生じたコロニ
ーをさらに選択するか、あるいは直接分析した。

直接分析の場合には１個々のコロニーから調製したプラ
スミドＤＮＡをＤＥＡＥデキストラン法によってＣＯＳ
細胞をトランスフェクトするために使用した。

上記ＤＥＡＥデキストラン法は、出願人の同時係属中の
米国特許出願第１６０，４１６号（１９８８年２月２５
日出願）に開示されている。変異体の表現型を、最初に
負の選択用抗体１次に正の選択用抗体を用いた連続的間
接免疫蛍光測定法によって測定した。

ＣＤ２の全細胞外ドメインが変異誘発する時には。

全部で２０のプールされた細菌を組合せて任意に置換さ
れた調製物を得た。定方向変異の場合には。

プールされた細菌から１つまたは２つだけを使用した。

モノクローナル抗体の部分パネルは、白血球型別に関し
てｔｈｅ　Ｔｈ１ｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　
Ｗｏｒｋｓｈｏｐにより入手した。

ス」１舛ＩＩＩ　　ＣＤ２　　　　の［ｌＮＡ配　　　
およびロゼームテコメベ久 変異株のＤＮＡ配列を、ジデオキシヌクレオチド法（Ｓ
ａｎｇｅｒ、　Ｆ、ら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７４　：　５４６３〜５４
６７　（１９７７）　）により、−本領鋳型あるいはア
ルカリ変性プラスミドＤＮＡで決定した。

任意に変異させたｐ　ｉ　Ｈ３ＭＣＤ２を用いて得た変
異体について、Ｃ０２の細胞外ドメイン全体を配列決定
した。定方向変異誘発によって得た変異体については、
変異ドメインを含むｃＤＮＡの２００　ｂｐ部分を配列
決定した。すべての場合において、予想されたように、
変異は１個のオリゴヌクレオチドの範囲内であった。

トランスフェクションの４８時間後に、ビーターソン赤
血球の２％懸濁液を、室温で３０分間付着ＣＯＳ細胞上
に沈降させた。過剰の赤血球を静かに取り除き、顕微鏡
検査によって表現型の計数を行なった。すべてのロゼツ
ト表現型を、野生型および負の対照と共に少なくとも別
々に３回アッセイした。

ある場合には１表面ＣＤ２の発現を、赤血球にさらした
後に間接免疫蛍光測定法によって確認した。

野生型ロゼツトは、赤血球のＣＯＳ細胞への強固な結合
によって特性づけられる。部分的なロゼツトの形成は、
野生型のロゼツトの場合よりもより赤血球の数が少なく
、かつ結合がよりゆるやかである。ロゼツト形成がない
ということは、変異体が負の対照（つまり、　ＣＳ８を
発現するＣＯＳ細胞）と識別できないことを意味する。

表２は、ロゼツトパターンを生じる様々な変異体の置換
をまとめたものである。コンマで分けたアミノ酸置換は
同一の分子上に存在する。

（以下余白） 実施例ｒＶＣ口４変異体の選択 本文中で述べる１表面抗原決定基欠失変異体を分離する
一般的方法を、　ＣＤ４抗原に適用した。但し、スフェ
ロプラストを、変異誘発したプラスミドｐｉ８３Ｍ［Ｄ
４保有細菌から調製するという修正を加えて行った。Ｃ
Ｄ４抗原は、旧ＶについてのＴ細胞結合部位として働く
ことから、特に興味深い。

抗原決定基欠失変異体の分離は９次のように実施した。

ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞系から分離したＣＤ４　ｃＤＮ＾を
。

実施例Ｉで述べたように調製した変性オリゴヌクレオチ
ドをデオキシウリジン置換した一本鎖鋳型にアニールす
ることにより、変異を誘発した。プラスミドをスフェロ
プラスト融合によってＣＯＳ細胞に導入した。融合２日
後に、細胞を採取し、抗ＣＤ４モノクローナル抗体、ウ
サギ抗マウスＩｇ抗血清、およびウサギ補体と共に順次
インキュベートした。これにより、モノクローナル抗体
によって認識される抗原決定基を有する細胞についての
選択が行われた。ＣＤ４０発現を完全に排除する再配列
物の単離をさけるために、補体溶解後に残存する細胞を
、プールされた抗ＣＤ４モノクローナルと共にインキュ
ベートし、ペトリ皿にコートされたヤギ抗マウスＩｇに
その細胞を付着させた。抗体被覆プレートに付着してい
る細胞から回収したプラスミドＤＮＡを大腸菌の形質転
換に使用し、増幅して、　ＣＯＳ細胞に再導入した。Ｃ
ＯＳ細胞での３回の選択後１個々の細菌コロニーからの
プラスミド調製物をＣＯＳ細胞にトランスフェクトし、
２日後に間接免疫螢光法で分析した。補体の固定に使用
したモノクローナルとは反応しなかったが、その他のＣ
Ｄ４決定基を保持しているＣＤ４分子をコードするプラ
スミドを配列決定した。第４図は、置換が起こると指示
された抗体との結合が欠失するアミノ酸の一次配列配置
を示す。表３は、各々の場合に置換されるアミノ酸を示
す。アミノ酸変異体は。

表３および本明細書全体を通じて野生型残基−位置１新
しい残基という形で表される。例えば１通常１８位に認
められるセリンをチロシンで置換した変異体は、　５ｅ
ｔ１８Ｔｙｒと称される。

分離された変異体のほとんどは、ヌクレオチド置換され
た株であった。挿入体および欠失体もまた９分離された
。これら２つの再配列は明らかにオリゴヌクレオチドの
変異誘発とは無関係であるが、その代わりに、　ＣＯＳ
細胞による継代から生じる。ＣＯＳ細胞のトランスフェ
クションは、約１％の変異率を生じることが知られてい
る。その変化の大半は挿入および欠失である。

抗原決定基の位置 ｇｐ１２０−ＣＤ４の相互作用を強力に阻害しつる抗体
を使用して選択されたいくつかの変異体を含めて。

変異体のほとんどは、　ＣＤ４のアミノ末端にあるＩｇ
Ｖに関連するドメインにおける置換されたアミノ酸配列
をコードする。このドメインは１ｇドメインの基本的特
徴のいくつか、つまり２個のシスティン。

１個のアルギニンおよび１個のグルタミン酸を有してお
り、それらは免疫グロブリンにおいては各々ジスルフィ
ド結合および塩架橋、および保存トリプトファン残基を
形成する。そのため、　ＣＤ４のアミノ末端がＩｇＶ　
ドメインと同じように折りたたみ構造を有するというの
は極めて考えられることである。ＣＤ４のこのドメイン
がＩｇＶ　ドメインに類似した形で折りたたまれている
という仮説に基づいて、折りたたみ構造におけるアミノ
酸置換の位置モデルが作成され得る。モデルを作成する
と。

作成されるＣＤ４のこのドメインとｇｐ１２０との相互
作用についての予測が可能となる。第３図はＣＤ４とＩ
ｇＶ　ドメインとの間の配列を示す。第４図は。

この同じＩｇＶドメインの折りたたみの立体図ならびに
一部の目標となる残基の配置を示す。

６６．１抗体により、Ｃ０４アミノ末端のアミノ酸の変
化を生じる変異が選択される（第４図および表３）。そ
の置換は２３までの残基によって分離され。

このことは、６６、ｌが、−次アミノ酸配列によってで
はなく、タンパクの三次元折りたたみパターンによって
形成される抗原決定基を認識することを示唆している。

変異はＩｇＶ分節の第１および第２の超可庇部に相当す
る２つのドメインに分けられる。これら２つのドメイン
は、−次配列ではかなり離れているが１折りたたみ免疫
グロブリンにおいては互いに近接している（第２図およ
び第３図）。

この結果は、　ＣＤ４アミノ末端領域が、　　ＩｇＶ　
ドメインと同様の形態で折りたたまれているという見解
を強力に支持する。

抗ＣＤ４抗体が他の抗ＣＤ４抗体の結合を阻害する能力
もまた。第３図に示された折りたたみパターンを裏付け
る。例えば、　ＶＩＴ４および１３Ｂ、　８．２抗体を
使用して選択した変異体は、　Ｇ１９−２選択変異体に
よってコードされるアミノ酸置換から約７０残基によっ
て分けられるアミノ酸置換をコードする（第１図および
表１　）　。１３Ｂ、８．２およびＶＩＴＩ１７）イず
れも、　Ｇ１９−２の結合を実質的に阻害し得る。これ
はＩｇの折りたたみパターンから予測される。

６６．１およびＧ１９−２抗体は、飽和濃度の多数倍の
濃度においてもＣＤ４−ｇｐ１２０の相互作用を阻害す
ることができない。このことは、　ｇｐ１２０がＣＤ４
のＢおよびＣ鎖相同体によって形成される分子の面にか
かわらない形態でＣＤ４と相互作用することを意味する
（第３図）。しｅｕ３ａあるいは０ＫＴ４Ａのいずれか
の結合により、その他の抗体の結合を完全に阻害し得る
。いずれの抗体結合も、６６．１およびＧ１９−２抗体
の結合を有効に排除することはできない。０ＫＴ４Ａを
用いて選択した変異体は、１ｇの折りたたみのＤ鎖の残
基の置換をコードする。Ｌｅｕ３ａ選択変異体は、Ｃ゛
　およびＣ１１釦の変異体をコードする。１ｇの折りた
たみにおけるＢ、Ｃ，Ｃ’　Ｃ″。

およびＤ鎖の立体配置から、　Ｌｅｕ３ａおよびＴ４Ａ
は。

ＣＤ４のり、　　ＥおよびＣＩ＋鎖の相同体によって形
成されるドメインの面と相互作用するという予測がなさ
れる。Ｔ４ＡおよびＬｅｕ３ａは、どちらも非常に低い
抗体濃度でＣＤ４−ｇｐ１２０の相互作用を阻害する。

０ＫＴ４ＡおよびＬｅｕ３ａが、　ＣＤ４のアミノ末端
ドメインの部位へのｇｐ１２０の接近を阻害するとすれ
ば、その部位はＣＤ４のり、　　ＥおよびＣ″″鎖相同
ドメイン上にあるに相違ない。

ＶＩＴ４抗体のＣＤ４への結合は、　Ｌｅｕ３ａあるい
はＴ４Ａの結合を阻害しない。ＶＩＴ４の抗原決定基の
位置（第４図）を考えるとこれは驚くことではない。し
かし、　ＶＩＴ４ｆｔ、　ＣＤ４−ｇｐ１２０依存性の
融合細胞の形成を阻害することにおいて、　Ｌｅｕ３ａ
およびＴ４Ａと同じくらい強力である。ＶＩＴ４は、Ｄ
、Ｅ、Ｃ″。

如上の結合部位へのｇｐ１２０の接近を間接的に阻害す
るか、あるいは９間接的な接近阻害または結合部位の占
有のいずれかによって空間的に異なる結合部位を阻害す
ると考えられる。Ｇ１９−２はＣＤ４への結合に関しテ
ＶＩＴ４と競合するが、　Ｃ［１４−ｇｐ１２０相互作
用を阻害しない。この事実は、　ｇｐ１２０を阻害する
ＶＩ７４の能力が間接的であることを示唆している。Ｖ
Ｉ７４抗原決定基の保存を伴わない、　）ＩＩＶ感受性
の系統発生的保存は、この抗原決定基が旧Ｖ結合に直接
には関与しないという見解を裏付ける。

ＭＴ１５１抗体はＶＩＴ４と同様にしてＣ’Ｄ４との相
互作用を阻害する。この抗体は、　ｇｐ１２０の相互作
用を阻害するが、　０ＫＴ４ＡあるいはＬｅｕ３ａの結
合は阻害しない。ＭＴ１５１抗原決定基欠失変異体によ
ってコードされる置換は、カルボキシ末端において、　
ＶＩＴ４抗原決定基欠失に関連する置換について、５残
基および７７残基で見い出される。ＭＴ１５１抗体は１
明らかに折りたたみタンパクの立体配置によって形成さ
れる抗原決定基を認識する。この抗原決定基は、　ＶＩ
Ｔ４および１３Ｂ、　８．２抗原決定基領域と重複する
が、第２ドメインのカルボキシ末端部分をも包含する。

ＭＴ１５１抗原決定基は、アミノ末端のＩｇ様ドメイン
のカルボキシ末端に極めて近接する。　ＣＤ４の第２ジ
スルフイド結合ドメインのカルボキシ末端を配置し、そ
して、　Ｖ［Ｔ４およびＭＴ１５１が、第１ドメインで
はなく第２ドメインの部位への接近を阻害することによ
ってＣＤ４−ｇｐ１２０の相互作用を阻害するという可
能性を強化する。

変異体は、試験すべき抗原決定基の位置から導かれるい
くつかの予測を可能にする。口Ｄ４−ｇｐ１２０相互作
用の発現の１つは、多核巨細胞の形成である。これらの
融合細胞は、少なくとも部分的には。

ウィルス感染の細胞変性作用の原因である。融合細胞は
、　ＨＩＶｅｎｖ遺伝子産物ｇｐ１６０　　（ＣＤ４を
発現する細胞と相互作用する）だけを発現する細胞によ
って形成され得る。発明者は、トランスフェクトされた
ＣＯＳ細胞において融合細胞を誘発することができなか
った。しかし、　ＨｅＬａ細胞は細胞−細胞融合におい
て非常に有効であることが明らかになった。変異体のそ
れぞれを、　ｆ（ｅＬａ細胞のトランスフェクションに
よって９次いで旧Ｖ　ｇｐ１６０を発現するワタシニア
ウイルス組換え体の感染によって。

融合細胞形成に寄与する能力について試験した。

ＣＤ４変異体のあるものを安定して発現するＨｅＬａ細
胞系を、　Ｇ−４１８耐性を有するレトロウィルスベク
ターを用いて創製した。単クローンあるいはプールされ
たＧ−４１８耐性細胞を増殖させ、　ｇｐ１６０を発現
するワタシニアウイルスによる感染後に融合細胞形成に
ついて試験した。−時的アッセイで同じ結果を得、クロ
ーンあるいはプールされたＧ−４１８細胞系を安定して
発現した。

アミノ酸変異体のほとんどは、融合細胞形成において野
生型ＣＤ４と同程度に有効であった。これに対して、　
３９．４４．４５および４６位のアミノ酸の置換は、　
ＭＴ１５１の選択を利用して１分離した挿入変異の場合
のように、融合細胞を誘発するＣＤ４の能力に著しい効
果を与えた。いくつかの置換は、タンパクの局所変性を
生じさせるらしい。例えば。

Ｔ４／１８Ｔ３Ａ９抗体を用いて選択した変異体は１通
常３９位に認められるグルタミンの代わりにプロリンを
有していた。プロリンはグルタミンよりもはるかに無理
な骨格を有し１局所的な折りたたみ構造を変化させると
予想される。同様に、　０ＫＴ４Ｄ、　Ｇｌｙ４６Ａｒ
ｇ、およびＧ１ｙ４６Ｇｌｕを用いて選択した変異体は
。

グリシンを、嵩高く、電荷を有する残基で置換し。

そしてＣＤ４のＣ”調相同体を変性させ得る。

融合細胞形成に影響をおよぼす置換は、タンパクの折り
たたみを分断し得るが、一部の観察によれば、融合細胞
形成への影響は、タンパク構造における短い範囲の変化
によるものであることが示唆される。ＣＤ４媒介の融合
細胞形成を排除する置換の場合と同様に、置換が他の位
置にある時には同じ影響を与えない。Ｇ１ｎ３９Ｐｒｏ
変異体は融合細胞形成を支持する能力が少しだけ低く、
　Ｇ１ｙ３７Ｇ１ｕおよびＧ１ｎ１６４Ｐｒｏ変異体は
、融合細胞形成への関与において野生型ＣＤ４と同程度
に有効である。Ｌｅｕ３ａを用いて選択したＬｙｓ４５
Ａｓｎ、　Ｇ１ｙ４６Ｖａｌ二重置換変異体は、明らか
に破壊的ではないが、融合細胞を形成させない。

ＭＴ１５１を用いて分離した挿入変異のＣＤ４構造への
影響は、評価が困難である。これは、第２ドメインの末
端の近くに１３アミノ酸の大きな挿入を生じる。ＭＴ１
５１を用いて選択した点変異は、第２ドメインの部分が
第１領域のカルボキシ末端に非常に近接するような形で
ＣＤ４が折りたたまれていることを示す。この挿入はＣ
Ｄ４の折りたたみに極めて間接的な影響を持ち、第１ド
メインを変化させる可能性がある。

融合細胞形成を破壊する変異は、少なくとも２つのクラ
スであり得る。ＣＤ４のｇｐ１２０への結合能力を排除
した変異が、融合細胞形成を誘発する能力を排除すると
いうことは確実であると思われる。

もう１つのクラスの変異も可能である。それは。

融合細胞形成を排除するが、結合は排除しない変異であ
る。

ＨＩＶ結合における変異の影響 ＨＩＶに結合するＣＤ４の能力における変異の影響を１
間接免疫螢光測定法を用いて評価した。濃縮ウィルス粒
子を、異なる変異体を表現するＣ’Ｏ３細胞と共にイン
キユベートシ、そして高い抗ｇｐ１２０力価を有するヒ
ト血清を用いて結合した粒子を検出した。細胞螢光光度
計での細胞の分析によって結合を定量した。各々の場合
において、抗ＣＤ４モノクローナルおよび間接免疫螢光
検査を使用して。

細胞表面でのＣＤ４の発現を平行して定量した。変異体
のＣＤ４分子がウィルスを結合する能力は、融合細胞誘
発におけるそれらの相対的有効性と一致した。融合細胞
形成を排除する変異はまた。ウィルス粒子の結合を排除
した。細胞融合を支持するＣＤ４の能力を大きく低下さ
せる変異は、同様に。

ｇｐ１２０を結合する能力をも低下させた。このことは
、変異の主要な影響は、融合細胞を誘発する能力に対し
てではなく、　ｇｐ１２０を結合するＣＤ４の能力に対
してであることを示している。

考察 ｇｐ１２０を結合するＣＤ４の能力への様々な変異の影
響は、抗原決定基の位置から導かれる予測と大部分一致
する。Ｃ′鎖を分断すると考えられる変異は、結合およ
び融合細胞形成の検定における行動を変化させた。Ｃ′
″鎖を変化させる変異は、　ＣＤ４のウィルスを結合す
る能力を消失させる。０ＫＴ４Ａ抗体を用いて選択した
変異体は、融合細胞形成検定において野生型Ｃ［１４と
は異なった行動をすると予想された。この変異体はＣＤ
４　ｃＤＮＡのＤＥＮ相同領域におけるアミノ酸置換を
コードする。この変異体によってコードされる置換は、
マウス１　ラットおよびヒ）　ＣＤ４の間で保存される
配列パターン（マウス−３ＫＫＧ、　　ラット−３ＲＫ
Ｎ、　　ヒト−３ＲＲ３，０ＫＴ４Ａ−３ＲＲＲ）を変
化させる。このアミノ酸置換は、予測されるＣＤ４のＤ
ｔＪｌを変化させると考えられるが。

ＨＩＶの結合は変化させない。さらに０ＫＴ４Ａ抗原決
定基は、　）ＩＩＶに感染し得る霊長類においては十分
に保存されず、このことは、やはり、　０ＫＴ４ＡがＩ
ＩＩＶ結合を阻害する能力は、おそら＜　Ｌｅｕ３ａ抗
原決定基領域への接近を阻害することによる間接的なも
のであることを示唆している。

ＶＩＴ４抗原決定基もまた霊長類においては旧Ｖ感染性
はどには保存されず、そして、この抗体を用いて選択し
た変異は旧Ｖ結合に影響をおよぼさない。ＶＩ７４もま
た。おそら＜、　ｇｐ１２０がその抗体認識部位とは異
なる配列と相互作用するのを間接的に妨げることによっ
て、　ＨＩＶ結合を阻害するのであろう。この抗体を用
いて選択した変異は、　　ＩｇＶドメインの第４超可変
部に相当するものである。

ＶＩＴ４は、発明者がＬｅｕ３ａ抗原決定基として同定
した旧Ｖ結合部位のその部分への接近を阻害する可能性
がある。そのような説明は、２つの抗原決定基領域間の
提案された関係、およびＶＩＴ４がＬｅｕ３ａおよび０
ＫＴ４Ａの結合を阻害しないという事実から。

明らかではない。第１ドメインでＶＩＴ４抗原決定基と
重複するＭＴ１５１抗原決定基はまた。第２ドメインの
カルボキシ末端にまで達している。この抗原決定基は、
　ＶＩＴ４抗原決定基部分を、第１ドメインのり、Ｅ、
Ｃ”面よりも第２ドメインの方により密接に連結する。

ＶＩＴ４およびＭＴ１５１がｇＰ１２０−Ｃ［１４相互
作用を阻害する能力は、従って、第２ドメインの旧Ｖ相
互作用部位の可能性を引き起こす。

Ｌｅｕ３ａ抗体をｇＥｔＪ（する抗イデイオタイプ抗血
清は、　ＨＩＶの異なった分離物を中和することができ
る。このことから、この抗体がＨｒＶ結合部位の重要な
決定基を認識するはずであることが示唆された。霊長類
種におけるＬｅｕ３ａ抗原決定基の発現とＨＩＶに対す
る感受性との間の一致は、　Ｌｅｕ３ａ抗原決定基旧Ｖ
に対する結合の重要性を裏付ける。Ｌｅｕ３ａについて
の認識部位と旧Ｖの結合に重要な部位とが同一であると
いう直接的な証拠が提供される。

Ｌｅｕ３ａによるＳ忍識に変化のあるじＤ４変異体は、
　ＨＩＶを結合する能力においても変化する。Ｌｅｕ３
ａ抗原決定基は、　ＩｇＶ　ドメインのＣ゛およびＣ″
′鎖に相当するＣＤ４の分節上に存在する。Ｃ［１４分
子のこの部分の構造を模倣する試薬を設計することは可
能であろう。Ｃ′鎖およびそれに隣接するドメインを含
む短いペプチドは、　ｇｐ１２０のＣＤ４との相互作用
を妨げるのに十分な結合力を持ってｇｐ１２０に結合し
得る。真性１ｇＶ領域のＣ′およびｃ”鎖のＣ［］４同
族体による置換により、同様に、　ＨＩＶの？ｌおよび
／または病理を阻害しうる構造が生じ得る。

そのような試薬はＡＩＤＳの治療における重要な治療薬
であろう。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｔ
４ヒ）　ＣＤ４タンパクの１次アミノ酸配列を第４図に
示す。その下に示す配列は、ヒト配列と異なるマウスの
配列を表す。下線部は［０４の膜通過ドメインの範囲を
示す。配列の上方の線は、　ＣＤ４タンパクの考えられ
る旧Ｖ結合邪位を表わす。正の選択工程に使用した１６
の異なる抗体を左側余白に沿って示す。−次配列上部の
本マークは、特定の抗体を使用して分離した変異体は、
その位置が置換されていることを表わす。３９位および
４６位のアミノ酸の置換は、　ＨＩＶ結合に影響をおよ
ぼす。これらの位置もまた。第４図中に示されている。

表３には、負の選択工程において使用した抗体ならびに
本発明の方法を用いて分離したＣＤ４変異体をまとめて
示す。

表３ Ｐ４？Ｓ Ｐｒｏ４７Ｓｅｒ ９４ｂ１ ７４４Ｐ ０にＴＯ ＫＴ４Ｄ ４６Ｒ Ｔ４／１８Ｔ３Ａ９　　　Ｑ３９Ｐ ＦＩＯＩ−５６３７１１ｉ １８Ｙ １９Ｋ Ｔｈｒ４４Ｐｒ。

Ｇ１ｙ４６Ａｓｐ Ｇ１ｙ４６Ａｒｇ Ｇ１ｎ３９Ｐｒ。

Ｇｌｙ３７ＧＩｕ Ｓｅｒ１８ＴＹｒ Ｇ１ｎ１９Ｌｙｓ られている本発明の特定の実施態様の数多くの同等物を
認め、あるいは確かめることができるであろう。そのよ
うな同等物は１本発明の特許請求の範囲に包含される。

（以下余白） １３Ｂ、８．２　　　８７６に ＶＩＴ４　　　　　　Ｑ７８Ｌ ＯＫＴ４Ａ　　　　　５５９Ｒ ＢＬ／１０Ｔ４　　　　　　ＧＩＩＯＡＢＬ／１０Ｔ４
　　　　Ｐ１２１Ｈ Ｇ１ｕ７６ＬＹ９ Ｇ１ｕＴ８Ｌｅｕ Ｓｅｒ５９Ａｒｇ Ｇ１３１１１０Ａ１ａ Ｐｒｏ１２１Ｈｉｓ ＯＫＴＡＢ　　　　　Ｐ１２１Ｈ ＯにＴ２Ｏ０１６４Ｐ ＮＬＩＴＨ〜Ｉ　　　　　Ａ２１６Ｇ ＭＴ３２１　　　　　Ｖ３２５１ ０この欄では一文字のアミノ Ｐｒｏ１２１Ｈｉｓ Ｇ１ｎ１６４Ｐｒ。

Ａ１ａ２１６Ｇ１ｙ Ｖａｌ１３２５１１ｅ 酸コードを使用 同等物 当業者は、ルーチンの実験のみで、ここで述べ（発明の
要約） タンパクの抗原決定基をマツピングする新規で迅速な変
異分析法が開示されている。この方法は。

１６個の抗ＣＤ２モノクローナル抗体および抗ＣＤ４モ
ノクローナル抗体に対する結合部位を同定するのに用い
られている。本発明の強力で迅速かつ簡単な方法によれ
ば、極めて多数の変異体を単離することができる。また
１本発明の方法は、　ｃＤＮ＾およびモノクローナル抗
体を利用し得る表面タンパクに適用することができる。

本発明は特に、新しいリガンドおよび薬剤を設計するた
めのりガント結合部位に関する研究に有用である。

土−回皿夏皿車星脱里 第１図は、変異体単離ベクターと変異体単離の手順とを
示す概略図である。

第１図Ａは、変異体の単離に用いられたベクターｐｉ１
３ＭｃＤ２を示す図である。

第１図Ｂは、変異体の単離法を示す概略図である。

第２図は、−次ＣＤ２配列上の抗原決定基の位置を示す
図である。

第３図は、　ＣＤ２の抗原決定領域を形成する変異体を
示す図である。

第４図は、−次のＣＤ４配列上の抗原決定基の位置を示
す図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、遺伝子の変異体を単離する方法であって、ａ）目的
   の構造遺伝子が連結されているベクターで哺乳類細胞を
   トランスフェクトすること；ｂ）トランスフェクトされ
   た該哺乳類細胞を、該構造遺伝子によりコードされるタ
   ンパクの抗原決定基に対する第１のモノクローナル抗体
   および補体を用いて、該抗原決定基を発現する細胞が該
   第１のモノクローナル抗体に結合し、かつ補体の固定化
   と該抗原決定基を発現する細胞の溶解とを起こさせるの
   に適した条件下において処理すること； ｃ）残存する溶解していない哺乳類細胞を、該構造遺伝
   子の第２の抗原決定基に対する第２のモノクローナル抗
   体で処理すること； ｄ）処理された該哺乳類細胞を、該第２のモノクローナ
   ル抗体を認識する抗血清で被覆した基質に付着させるこ
   と；そして ｅ）該付着細胞からプラスミドＤＮＡ回収すること、 を包含する単離方法。 ２、前記哺乳類細胞がＣＯＳ細胞である、請求項１に記
   載の方法。 ３、目的の前記構造遺伝子が細胞表面抗原である、請求
   項１に記載の方法。 ４、前記細胞表面抗原が、Ｔリンパ球のＣＤ２抗原ある
   いはＴリンパ球のＣＤ４抗原である、請求項３に記載の
   方法。 ５、細胞表面タンパクの抗原決定基を同定する方法であ
   って、 ａ）目的の構造遺伝子が連結されているベクターで補乳
   類細胞をトランスフェクトすること、ｂ）該哺乳類細胞
   を、該構造遺伝子によりコードされるタンパクの抗原決
   定基に対する第１のモノクローナル抗体および補体を用
   いて、該抗原決定基を発現する細胞が該第１のモノクロ
   ーナル抗体に結合し、かつ補体の固定化と該抗原決定基
   を発現する細胞の溶解とを起こさせるのに適した条件下
   において処理すること； ｃ）残存する溶解していない哺乳類細胞を、該構造遺伝
   子の第２の抗原決定基に対する第２のモノクローナル抗
   体で処理すること； ｄ）処理された該哺乳類細胞を、該第２のモノクローナ
   ル抗体を認識する抗血清で被覆した基質に付着させるこ
   と； ｅ）該付着細胞からプラスミドＤＮＡを回収すること； ｆ）回収したプラスミドＤＮＡを適当な宿主細胞におい
   て増幅すること； ｇ）該構造遺伝子が増幅された回収プラスミドＤＮＡで
   ある該工程ａ）のベクターで哺乳類細胞をトランスフェ
   クトすること； ｈ）該工程ｂ）〜ｇ）を適宜反復すること；ｉ）該工程
   ａ）〜ｈ）から得られるプラスミドＤＮＡで哺乳類細胞
   をトランスフェクトし；トランスフェクトされた該細胞
   を、該プラスミドＤＮＡの発現を起こさせるのに適した
   条件下で維持すること；そして ｊ）該プラスミドＤＮＡの発現産物が該第１のモノクロ
   ーナル抗体に結合することを検出すること、を包含する
   同定方法。 ６、細胞表面タンパクの抗原決定基を同定する方法であ
   って、 ａ）細胞表面タンパクの少なくとも一部をコードする遺
   伝子が連結されているｐｉＨ３ＭＣＤ２ベクタ−でＣＯ
   Ｓサル細胞をトランスフェクトすること；ｂ）トランス
   フェクトされた該ＣＯＳ細胞を約４８時間培養すること
   ； ｃ）トランスフェクトされた細胞を採取し、該細胞表面
   タンパクおよび負の選択抗体を発現する細胞、補体の固
   定化、ならびに該細胞の溶解に適した条件下において、
   これらの細胞を、負の選択抗体と、ウサギ抗マウス免疫
   グロブリン抗体と、補体とにより順次処理すること； ｄ）溶解されない細胞を採取し、正の選択抗体でこれら
   の細胞を処理すること； ｅ）溶解されない細胞を、ヒツジ抗マウス免疫グロブリ
   ンで被覆した基質に付着させること；ｆ）付着しない細
   胞を除去すること； ｇ）付着しない該細胞のＤＮＡ抽出物を調製し、回収す
   ること； ｈ）回収したＤＮＡ抽出物を￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥ＭＣ１０
   ０１／ｐ３に形質転換すること；そして ｉ）得られた細菌コロニーを、該工程ａ）〜ｈ）におけ
   るように、さらに数回選択するか、あるいは負の選択抗
   体に結合する能力を直接分析すること、 を包含する同定方法。 ７、前記構造遺伝子がＴリンパ球およびＢ細胞の細胞表
   面抗原である、請求項６に記載の方法。 ８、前記負の選択抗体および正の選択抗体が、表１の抗
   体からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。 ９、細胞表面抗原に対する抗体で被覆した材料を用いて
   、該細胞表面抗原の抗原決定基変異体を単離する方法で
   あって、 ａ）該抗原を発現する細胞を、選択された抗原決定基を
   発現する細胞が溶解されるように処理すること；および ｂ）残存する溶解されない細胞を、該細胞表面抗原の第
   ２の異なる抗原決定基を認識するモノクローナル抗体で
   処理すること を包含する単離方法。 １０、ヒト免疫不全ウィルスがＣＤ４抗原に結合するこ
   とを妨害することにより、ヒト細胞がヒト免疫不全ウィ
   ルスに感染することを阻害する可溶化ペプチド。 １１、ＣＤ４抗原のＬｅｕ３ａ抗原決定基のアミノ酸配
   列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有する可溶化ペ
   プチド。 １２、第４図のアミノ酸配列のうち、上側に線を付した
   部分で表わされるような、Ｌｅｕ３ａ抗原決定基のアミ
   ノ酸配列と実質的に相同であるアミノ酸配列を有する可
   溶化ペプチド。 １３、ヒト細胞がヒト免疫不全ウィルスに感染すること
   を阻害する方法であって、 ヒト免疫不全ウィルスとＣＤ４細胞表面受容体との相互
   作用を妨害する可溶化ペプチドを個体に投与すること、
   を包含する阻害方法。 １４、前記可溶化ペプチドが、第４図のアミノ酸配列の
   うち上側に線を付した部分で表わされるような、Ｌｅｕ
   ３ａ抗原決定基のアミノ酸配列と実質的に相同であるア
   ミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の方法。 １５、ヒト細胞がヒト免疫不全ウィルスに感染すること
   を阻害する方法であって、 ヒト免疫不全ウィルスに結合することにより、該ウィル
   スがＣＤ４細胞表面受容体に結合することを妨害する可
   溶化ペプチドを、個体に投与すること、を包含する阻害
   方法。 １６、前記可溶化ペプチドが、第４図のアミノ酸配列の
   うち上側に線を付した部分で表わされるような、Ｌｅｕ
   ３ａ抗原決定基のアミノ酸配列と実質的に相同であるア
   ミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の方法。