JPH02200176A - 細胞培養方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞の培養方法及び培養装置に関し、更に詳し
くは、細胞を高密度で長期にわたって安定して培養する
ための培養方法及び培養装置に関するものである。

〔従来の技術〕

細胞培養技術は、例えばウィルス、ワクチン、インター
フェロンの如き抗ウィルス剤、或いはホルモンの如き生
物薬品の製造にとって重要である。

更に近年特定タンパク賞などを標的とするモノクローナ
ル抗体の生産は抗体産生細胞とミエローマによるハイブ
リドーマの培養によるものであり、その技術の解決は工
業的に重要なテーマである。

従来、細胞培養は培養びんなどを用いて実験室的規模で
行なわれている。一方、近年前記した如き有用物質の産
生を目的として工業的な細胞の培養法及びそのための装
置として、いくつかの提案がなされている。これらの提
案は、大きく分けて付着培養と浮遊培養つまり懸濁培養
との２つの方式に分類されるが、それらの方式は培養さ
れる細胞の特性によっていずれかに決められる。

本発明は懸濁培養型の細胞培養における装置および方法
に関する。その懸濁培養によって細胞を培養する方法に
関し、例えばマグネテインクスクーラーもしくは機械的
に駆動されるシャフト上の羽根車によって、スピナーフ
ラスコの中に調整された撹拌機能を設けた培養方法など
が提案されている。しかし上記の方法においては、一定
量の栄養分の中で培養されるため細胞の生長増殖は比較
的低い密度で停止する。このような細胞の懸濁培養にお
いて、大量に且つ高密度で培養するために一般に新しい
培養液を培養槽中へ供給しつつ生育阻害物質を含んだ古
い培養液を培養槽外へ排出しながら培養する方式が提案
され、この方式は潅流培養方式と言われている。この方
式を用いて潅養するに当って重要なことは、懸濁液中の
細胞と前記古い培養液とを長期にわたって効率よく分離
し、古い培養液を培養槽外へ取り出し、培養槽内の細胞
の生育環境を最適条件下に維持することである。

さらに細胞培養により有用物質を得るために工業的に重
要なことは、目的とする有用物質を高い濃度で得ること
である。一般に細胞培養において培養液中の細胞が産生
ずる有用物質の濃度は極めて低く、培養液から有用物質
を分離、精製するために煩雑な手段を要し、回収率の低
下、コストアップの原因の１つとなっている。このため
培養を可能なかぎり高い細胞密度で行うことが強く望ま
れている。

なお、この種の装置に関連するものとしては例えば特開
昭６１−２５７１８１号公報が挙げられる。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術は懸濁培養液からの細胞の長期にわたって
安定した分離について配慮がされておらず、十分な潅流
培養が行えず高密度培養ができないという問題があった
。すなわち、この動物細胞と培養液との分離は無菌環境
下で細胞が生育した状態で、分離された培養液中に細胞
が混入しない方法で分離できればよく、通常培養槽内で
行う。

その分離手段としてはホローファイバモジュール、遠心
分離や培養槽内にセトリングゾーンを設けた方法がある
。これらの手段のうちホローファイバモジュールを用い
る方法は、体積当りの濾過面積が大きくとれ、膜を介し
て古い培養液を培養槽外に排出し、続いて新鮮培地で膜
の逆洗浄を行うことにより培地を供給するので潅流培養
に適している。しかし、膜分離法には、常に膜汚染によ
る目づまりという問題がつきまとい、特に動物細胞の分
離では顕著であり、長期にわたって安定した分離は難し
いという問題があった。

そこで本発明の目的は、長期にわたって安定した潅流培
養が行え高密度培養が可能な方法及び装置を提供するこ
とである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成するため、本発明の細胞培養方法は細胞
を懸濁状態で培養しつつ培養槽内に設けた膜を介して懸
濁培養液から培養液の培養槽外への一部排出、続いて新
鮮培地の供給を行いつつ連続培養を行なう細胞培養方法
に於いて、細胞を培養槽内で懸濁状態を保つための培養
液の流動方向を、濾過膜を介しての培養液の排出時と、
新鮮培地の供給時とで逆転させることにある。

さらに、本発明は上記細胞培養方法において、細胞を培
養槽内で懸濁状態を保つための培養液の流動方向を、攪
拌手段による培養液の攪拌方向とし、濾過膜を介しての
培養液の排出時と、新鮮培地の供給時とで前記攪拌方向
を反転することを特徴とする。

さらに、本発明は細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内
に設けた膜を介して懸濁培養液から培養液の培養槽外へ
の一部排出、続いて新鮮培地の供給を継続的に行いつつ
連続培養を行なう細胞培養方法に於いて、濾過膜を介し
ての培養液の排出時に生じた細胞の変形を、新鮮培地の
供給時に復元せしめることにより細胞による膜の目詰ま
りを除去することを特徴とする細胞培養方法にある。

さらに、本発明は細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内
に設けた濾過膜を介して懸濁培養液から培養液の培養槽
外への一部排出、続いて新鮮培地の供給を継続的に行い
つつ連続培養を行なう細胞培養装置に於いて、培養液を
攪拌して細胞を懸濁状態とするための攪拌手段と、前記
濾過膜を介して培養液の培養槽外への一部排出、及び、
新鮮培地の供給を行う培養液排出・供給手段と、前記培
養液排出・供給手段による培養液排出・供給を制御する
培養液排出・供給制御手段と、前記攪拌手段の攪拌方向
を前記培養液排出・供給と同期的に制御する攪拌方向制
御手段と、を具備し、攪拌手段による培養液の攪拌方向
を、濾過膜を介しての培養液の排出時と、新鮮培地の供
給時とで反転せしめ得るように構成したことを特徴とす
る細胞培養装置にある。

さらに、本発明は上記細胞培養装置において、撹拌手段
が正逆回転可能な攪拌翼を有し、培養液排出・供給制御
手段が、培養液排出・供給経路のバルブの開閉及びポン
プの作動を制御する手段からなり、攪拌手段の攪拌方向
を制御する攪拌方向制御手段が、前記攪拌翼を回転せし
めるスターラー及び前記スターラーの作動を前記培養液
排出・供給経路のバルブの開閉及びポンプの作動と同期
的に制御して前記攪拌翼の回転方向を所定時間に反転甘
めしる手段からなる細胞培養装置にある。

さらに、本発明は細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内
に設けた濾過膜を介して懸濁培養液から培養液の培養槽
外への一部排出、続いて新鮮培地の供給を継続的に行い
つつ連続培養を行なう細胞培養装置に於いて、培養液を
攪拌して細胞を懸濁状態とするための攪拌手段と、前記
濾過膜を介して培養液の培養槽外への一部排出、及び、
新鮮培地の供給を行う培養液排出・供給手段と、前記培
養液排出・供給手段による培養液排出・供給を制御する
培養液排出・供給制御手段と、前記攪拌手段の攪拌方向
を前記培養液排出・供給と同期的に制御する攪拌方向制
御手段と、を具備し、攪拌手段による培養液の攪拌方向
を、濾過膜を介しての培養液の排出時と、新鮮培地の供
給時とで反転せしめ得るように構成し、かつ、前記培養
液排出・供給手段が酸素供給手段を兼ねた複数対の機構
からなり、前記複数対の機構のそれぞれについて、培養
液排出・供給及び酸素供給を交互に行わしめる制御手段
を具備したことを特徴とする細胞培養装置にある。

上記濾過膜としては本発明の細胞培養方法の目的に適す
ものであればいずれのものも使用できるが、例えば中空
系膜が好適に用いられる。

さらに、上記の濾過膜を介して供給する新鮮培地として
は目的とする細胞を増殖せしめるに好適な培地であれば
いずれのものも使用できるが、特に、タンパク成分を除
いたものが好適であり、タンパク成分は濾過膜を介する
ことなく培養槽に供給することが好ましい。

本発明の培養方法において、培養する細胞としては、懸
濁状態にて増殖可能なものであればよく、天然の動物細
胞のみならず、人為的或いは遺伝子操作により変性され
た細胞、例えばハイブリドーマであってもよい。また細
胞としてリンホカインを産生ずるリンパ球由来の細胞で
あってもよく、インターフェロンの如き有用な生理活性
物質を産生ずる２倍体細胞であってもよい。さらに種々
のモノクローナル抗体を産生ずる細胞であってもよく、
植物細胞、微性物であってもよい。

本発明における懸濁状態の細胞培養において培養槽では
培養しようとする細胞が培養液中に浮遊した状態で培養
される。この細胞の浮遊は、前記したように、培養液の
流動方向を所定の時間間隔で逆転させることによりなさ
れ、そして、この流動方向の逆転は、例えばマグネティ
ックスクーラーによる培養槽の中に調整された撹拌手段
によってなされる。培養液は実質的に水よりなる水性媒
体に、種々の無機塩、ビタミン類、ブドウ糖、アミノ酸
などの通常細胞培養に使用される添加成分が加えられて
いる。また動物の血清やアルブミン、インシュリン等の
タンパク質は細胞の増殖に不可欠であり、それぞれ適量
加えられている。

本発明における潅流培養を行うための細胞分離用の膜と
しては、体積当りの濾過面積が大きくとれる中空糸膜が
好ましい。膜はテフロンやポリエチレン製の疎水性膜、
セルロース製の親水性膜いずれでもよい。又、膜の細孔
径は、例えば動物細胞がハイブリドーマである場合、−
ａにその大きさはＩＯｐｍ以上であるから５μｍ以下で
あればよい。

また本発明の方法を実施するに当って１．新しい培地の
供給と、古い培養液の排出とは、培養槽中の液面の水準
がほぼ一定となるように維持することが望ましいが、必
ずしもその必要はない。新しい培地の供給と古い培養液
の排出とは、それぞれ独立して、連続的に行なうことも
でき、また間欠的に行なうこともできる。

本発明の培養方法において、懸濁液中の酸素濃度を一定
に維持するために、酸素を供給する方法としては、懸濁
液中へ酸素または酸素含有ガスを直接供給してもよく、
また他の供給手段によってもよい。他の供給手段として
は、例えば培養槽内に浸漬した多孔性の酸素供給管に酸
素を流し、酸素を拡散・溶解させる方法である。

培養を効率的に行なうために、新しい培養液および酸素
などを懸濁液中へ均一に供給し、一方、古い培養液を槽
外へ排出する必要があり、そのため懸濁液は良く撹拌さ
れていることが望ましい。

これには撹拌方法として、撹拌翼の回転による如き機械
的撹拌方法が適している。

また培養は、培養槽の有効培養容積に対して新しい培養
液を供給する割合（Ｉｔ換率）は−日当り０．２〜１０
．好ましくは０．５〜５の範囲とするのが適当である。

本発明の細胞培養装置の概要は第１図に示す通り、酵素
供給チューブ４、中空系膜３、攪拌翼２を具備した培養
槽と前記攪拌翼に対応して外部に設置した反転スターク
−５からなる。

第２図は本発明の培養液の攪拌方向を変えるために必要
な装置構成及び制御手段の一例を示したものである。す
なわち、反転スターク−５の回転方向を制御するスター
ラーコントロールボックス６とポンプＰ−１＋　Ｐ−２
，Ｐ−３及び電動バルブｖ−１゜Ｖ−２をタイマー７に
より、それぞれ制御し、潅流培養を行うものである０例
えば、実施例１おけるポンプＰ−１，Ｐ−２，Ｐ−３、
電動バルブＶ−１，Ｖ−２及び反転スターク−５の培養
時間経過における作動状態は第３図の通りである。

なお、ポンプ、電動バルブ及び反転スターラーの制御は
上記の様にタイマーにより行う方法の外に、培養槽内に
設けた液面計（レベルセンサー）により行うことも可能
である。

第４図は細胞分離膜と酸素供給膜を併用したものである
。すなわち、中空糸膜３Ａにて、濾過及び逆流サイクル
中は、中空糸膜３Ｂには酸素Ｂを通気し、培養槽１に酸
素を供給する。中空糸膜３Ａでの濾過、逆流サイクル終
了後は、中空糸膜３Ｂにて濾過、逆流サイクルを開始す
ると共に、中空糸膜３Ａに酸素Ｂを通気し培養槽１に酸
素を供給する。このような酸素の供給と細胞の分離には
、多孔質のテフロン膜が適している。この方法によれば
、膜の濾過負荷が半減すると共に、酸素通気により膜洗
浄が強化されるため、膜の濾過寿命が著しく向上する。

〔作　用〕

培養槽内で動物細胞を懸濁状態に保つために培養液を撹
拌するための撹拌機の回転が、中空糸膜による培養液の
濾過排出時と新鮮培地の供給による膜洗浄時で異なるよ
うに動作する。このため、濾過時の培養液の撹拌により
変形した細胞は膜の細孔の一部に入り込み目づまりを起
こすが、新鮮培地の供給による膜洗浄時は培養液の撹拌
方向が逆であるため、濾過時変形し膜の細孔内に目づま
りした細胞の形状は復元するため、細孔より離脱しやす
くなり膜は十分洗浄される。なお、この時の膜洗浄はタ
ンパク質成分不含の新鮮培地を用いて行うことが望まし
い、このようにすると、培養液のタンパク質成分の析出
による中空糸膜の内面汚染は半減する。ここで、細胞の
増殖に不可欠なタンパク質成分は、別途、培養槽に供給
する。

また、細胞培養装置において、複数対の中空糸膜を培養
槽内に装着し、前記複数対の中空糸膜を介して酸素供給
と濾過・膜洗浄サイクルを交互に行わしめるようにした
細胞培養装置は、濾過時に細胞が変形し膜の細孔内に目
づまりする。しかし膜洗浄時及び特に酸素供給時に膜の
細孔内から目づまりした細胞が放出されるため膜は十分
洗浄される。

以上述べた方法及び装置において、撹拌翼を濾過時と膜
洗浄時とで互いに反対の方向に回転させるには、タイマ
ー及びコントロールボックス又は液面レベルセンサー及
びコントロールボックスにより構成された手段を用いる
。コントロールボックスは反転スターラー、全てのバル
ブ及びポンプと電気的に連動している０反転スターラー
の回転方向、バルブの開閉、ポンプの作動を濾過時と膜
洗浄時の周期に合わせて適切に往復するよう電気信号を
送る。

更に複数対の中空糸膜が交互に酸素供給と濾過・洗浄サ
イクルへと作動する構成の作用は、少なくとも一つの中
空糸膜の付近に酸素濃度センサーを具備しているためこ
の中空糸膜付近の酸素濃度が高くなると（この時はこの
中空糸膜は酸素供給を行なっている）、該酸素濃度セン
サーが酸素供給管の中途に位置する調節器に電気信号が
送られ、この信号が該調節器から直結したポンプ・バル
ブをそれぞれ作動させ、該中空膜を濾過・逆洗浄に配さ
れる。次にこの中空糸膜付近の酸素濃度が低くなると、
このときは酸素濃度センサーから前記と逆の電気信号が
調節器に送られる酸素濃度センサー付近の中空糸膜は酸
素供給へと配せられ、このがサイクルが繰り返されるの
である。

また、酸素濃度センサーと調節器が電気的に連動し、該
調節器が各々ポンプ、バルブへと連動する構成によって
前述と似たような作用によって培養槽内の酸素濃度は終
始はぼ一定に保たれる。

また、更に、上述の中空糸膜の構成により懸濁培養液中
にユニットが沈められており、そのユニットにある毛管
束の一端より導管を経て新鮮培地が供給され、中空糸膜
を介して新鮮培地が懸濁培養液中へ供給されると共に、
細胞が産出した老廃物、代謝生産物、その他生前阻害物
質を含んだ古い培養液が中空糸膜を通過してユニットの
他端にある毛管束を経て培養槽の外へ流出されるので、
懸濁培養液中において細胞の大量、高密度による培養が
容易に可能となる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を用いて詳細に説明する。

但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない
。

〈実施例１〉 （１）培養装置 第１図に示す培養システムを使用した。培養槽１には細
孔径２μｍのテフロン製中空糸膜（２φＸ６ｍ）３が内
蔵されており、モジュールの一端はバルブにより切換え
られる培養液の流出口りと新鮮培地の流入口Ａが設けら
れている。なお、培養槽１の正味の容積は約２０００１
Ｂ！である。

（２）培養液 イーグルＭＥＭ培地と新生子牛血清を用いた。

（３）培養方法及び結果 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約２０００−になるように培養液（新生子牛血
清１０％含む）を送入し、これにラット腹水肝ガン由来
株化細胞を１×１０ｈ個／−となるように接種した。培
養槽１では炭酸ガスを含む酸素ガスＢが（溶存酸素が３
　ｐｐｍとなるように）多孔質ポリテトラフルオロエチ
レン製の酸素供給管４を通して自動的にコントロールさ
れて送入されている。培養槽中の培養液は３７°Ｃに保
持されている。培養槽中にはマリン型撹拌翼２が取付け
られており、撹拌速度は６０ｒｐｍであった。なお、撹
拌翼２はタイマーにより任意の時間反転可能なマグネテ
ィック反転スターラー５と連動する。培養は下記■、■
、■により行った。

■濾過過程 ポンプＰ−２により中空糸膜３を介して培養液を２００
ｍｔ／ｈで２．５時間濾過し古い培養液を排出する。

反転スターラ−５は右回転とした。

■逆洗浄過程 ポンプＰ−１により血清不含新鮮培地Ａを２０〇−／ｈ
で２．５時間、中空糸膜３を逆洗浄すると共に、ポンプ
Ｐ−３により血清Ｃを２０　ｍ／　／ｈで２．５時間培
養槽ｌに別途に送入し、新鮮培地と血清を供給する。

反転スターラー５は左回転とした。

■休止過程 ポンプＰ−１，Ｐ−２，Ｐ−３を全て１時間停止する。

反転スターラ−５は右回転とした。

上記、■→■→■を１サイクル（６時間）とし、これを
くり返す潅流培養操作を４０日間継続した。

その結果を第１表に示すとおり細胞密度、生存率ともに
きわめて良好であった。

（本頁以下余白） 反転 （タンパク質を別途入れる）（ｆｉ艮Ｊ反転 （培地にタンパク質含む）（艮） 〈実施例２〉 培養装置及び培養液は実施例１と同じものを用いた。実
験方法は実施例１における■逆洗浄過程をポンプＰ−１
により血清含有（１０χ）新鮮培地を２００ｍ／ｈで２
．５時間、中空糸膜３を逆洗浄する（ポンプＰ−３によ
る血清の供給は停止する）。この時の反転スターテ−５
は左回転とした。これら以外は全て同じとした。結果は
第２表に示すとおり、細胞密度、生存率ともに良好であ
った。

（本質以下余白） 〈実施例３〉 培養装置及び培養液は実施例１と同じものを用いた。培
養する細胞は株化細胞のＨｅＬａを用いた。

実験方法は実施例１における■逆洗浄過程をポンプＰ−
１により血清含有（１０χ）新鮮培地を２００−／ｈで
２．５時間、中空糸膜３を逆洗浄する（ポンプＰ−３に
よる血清の供給は停止する）。この時の反転スターテ−
５は左回転とした。これら以外は全て同じとした。結果
は第３表に示すとおり、細胞密度、生存率ともに良好で
あった。

（本質以下余白） 反転 第 表 （培地にタンパク質含む）（良） 細胞はＨｅＬａ 〈実施例４〉 （１）培養装置 第３図に示す培養システムを使用した。培養槽１には細
孔径２μｍのポリテトラフルオロエチレン製中空糸膜（
２φｘ６ｍ）３Ａ、３Ｂが内蔵されており、それぞれに
は酸素供給管と濾過逆洗浸管を兼ねた管が埋設されてい
る。モジュールの一端はバルブにより切換えられる培養
液の流出口りと新鮮培地の流入口Ａが設けられている。

なお、培養槽１の正味の容積は約１８００−である。

（２）培養液 イーグルＭＥＭ培地と新生子牛血清を用いた。

（３）培養方法及び結果 あらかじめオートクレーブ滅菌した前記培養槽に正味培
養容積が約１８００ｍｌになるように培養液（新生子牛
血清１０％含む）を送入し、これにラット腹水肝ガン由
来株化細胞を１×１０ｂ個／ｄとなるように接種した。

培養槽１では炭酸ガスを含む酸素ガスＢが（溶存酸素が
３　ｐｐｍとなるように）多孔質ポリテトラフルオロエ
チレン製の酸素供給管４を通して自動的にコントロール
されて送入されている。培養槽中の培養液は３７°Ｃに
保持されている。培養槽中にはマリン型撹拌翼２が取付
けられており、撹拌速度は６０ｒｐｍであった。培養は
下記■、■、■により行った。

■濾過逆洗浄過程 ポンプＰ−２：Ｐ−１により中空糸膜３Ａを介して培養
液を２００−／ｈで５時間濾過逆洗浄し古い培養液を排
出する。そして、中空糸膜３Ｂはその間酸素ガスＢを送
入する。スター５−５は右回転である。ポンプＰ−３に
より血清Ｃを２０ｄ／ｈで２．５時間培養槽ｌに送入し
、新鮮培地と血清を供給する。

反転スターラ−５は左回転とした。

■休止過程 ポンプＰ−１，Ｐ〜２．Ｐ−３を全て１時間停止する。

スター５−５は右回転である。

上記、■→■を１サイクル（６時間）とし、これをくり
返す潅流培養操作を４０日間継続した。その結果は第４
表に示すとおり、細胞密度、生存率ともに良好であった
。

第 表 （培地にタンパク質含む）（良） 複中空糸膜 〈実施例５〉 培養装置及び培養液は実施例４と同じものを用いた。培
養する細胞は株化細胞の一種であるＨｅＬａを用いた。

実験方法は実施例４におけるの濾過逆洗浄過程をポンプ
Ｐ−２：Ｐ−１により血清含有（１０χ）新鮮培地を１
５０ｄ／ｈで５時間、中空糸膜３−Ａを濾過逆洗浄する
。（ポンプＰ−３による血清の供給は停止する）この時
の反転スターシーは左回転とした。これら以外は全て同
じとした。結果は第５表に示すとおり、細胞密度、生存
率ともに良好であった。

（本質以下余白） （培地にタンパク質含む）（良） 複中空糸膜　　　細胞はＨｅＬａ 〈比較例１〉 培養装置及び培養液は実施例１と同じものを用いた。実
験方法は実施例１における反転スターシ−５の回転方向
を常時右回転とした以外は全て同じとした。結果は第６
表に示すとおりである。

（本質以下余白） 常時右回転 （タンパク質含まず）（良） 〈比較例２〉 培養装置及び培養液は実施例４と同じものを用いた。実
験方法は実施例１における反転スタージ−５の回転方向
を常時右回転とし、■逆洗浄過程をポンプＰ−１により
血清含有（１０χ）新鮮培地を２００ｍ／／ｈで２．５
時間、中空糸膜３を逆洗浄する（ポンプＰ−３による血
清の供給は停止する）。以外は全て実施例１と同じとし
た。結果第７表に示すとおりである。

（本質以下余白） 第　　７　　表 常時右回転（タンパク質含む）（不良）複中空糸膜 上記実施例と比較例より中空糸膜の目づまりが起ると、
圧力損失が増大するため膜を介しての培養液の濾過と新
鮮培地による逆洗浄が十分行えなくなり、置換率が徐々
に低下する。このため古い培養液の抜き取りと、新鮮培
地の供給が行えず栄養成分（例えばグルコースやアミノ
酸）の供給不足と増殖阻害因子（例えば細胞の老廃成分
である乳酸やアンモニアなど）の蓄積が起り、細胞の増
殖は頭打ちとなると共に生存率が低下する。これより、
中空糸膜の目づまりによる置換率の低下を防ぐことが重
要であることが分る。

本実施例によれば中空糸膜の逆洗浄において、■血清不
合新鮮培地による洗浄、■培養液の撹拌方向の反転によ
り、タンパク質成分による中空糸膜の内面汚染の減少と
、濾過時中空糸膜細孔に目づまりした細胞形状の復元に
よる脱離が起るため中空糸膜の目づまりが著しく減少す
る効果がある。

上記のことより、培養実験は置換率を１．０に設定して
行ったが、置換率を大きくすれば、細胞密度は更に増大
することは明らかである。

〔発明の効果〕

以上述べた構成：作用により細胞を培養液の中で懸濁培
養（浮遊培養）・潅流培養の方法で長期間にわたって高
い生存率で高密度培養する方法が確立され、また、その
ための装置も提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の細胞培養装置を示す図であり、第２図
は本発明の制御手段を設えた細胞培養装置を示す図であ
り、第３図は複数対の中空糸膜を具備した細胞培養装置
を示す図であり、第４図は本発明細胞培養装置における
反転スタージーの回転方向、ポンプの作動、バルブの開
閉を横軸を時間軸とした作動図である。 ｌ・・・培養槽、２・・・撹拌翼、３　　（３Ａ、３Ｂ
）・・・中空糸膜、４・・・酸素供給管、５・・・反転
スタージー６・・・コントロールボックス、７・・・タ
イマー、８・・・タンパク譬成分導入管、９・・・酸素
濃度センサー１０・・・調節器、１１・・・アルカリタ
ンク、１２・・・ｐＨコントロール用電磁弁、１３・・
・ｐＨ電極、工４・・・ｐＨ電極コネクタ、１５・・・
回転計、１６・・・回転数調整ハンドル、１７・・・軸
受、１８・・・のぞき窓、１９・・・ヒーター、２０・
・・サーモセンサー、２工・・・温度制御器、５０・・
・スターラーＡ・・・新鮮培地の流入口、Ｂ・・・酸素
ガスモジュール、Ｃ・・・タンパク質成分モジュール、
Ｄ・・・培養液の流出口。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内に設けた膜を
   介して懸濁培養液から培養液の培養槽外への一部排出、
   続いて新鮮培地の供給を行いつつ連続培養を行なう細胞
   培養方法に於いて、細胞を培養槽内で懸濁状態を保つた
   めの培養液の流動方向を、濾過膜を介しての培養液の排
   出時と、新鮮培地の供給時とで逆転させることを特徴と
   する細胞培養方法。 ２、細胞を培養槽内で懸濁状態を保つための培養液の流
   動方向が、攪拌手段による培養液の攪拌方向であり、濾
   過膜を介しての培養液の排出時と、新鮮培地の供給時と
   で前記攪拌方向を反転することを特徴とする請求項１記
   載の細胞培養方法。 ３、細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内に設けた膜を
   介して懸濁培養液から培養液の培養槽外への一部排出、
   続いて新鮮培地の供給を継続的に行いつつ連続培養を行
   なう細胞培養方法に於いて、濾過膜を介しての培養液の
   排出時に生じた細胞の変形を、新鮮培地の供給時に復元
   せしめることにより細胞による膜の目詰まりを除去する
   ことを特徴とする細胞培養方法。 ４、濾過膜が中空糸膜であることを特徴とする請求項１
   乃至３のいずれか１つに記載の細胞培養方法。 ５、濾過膜を介して供給する新鮮培地としてタンパク質
   成分を除いた成分からなる培地を用い、濾過膜の目詰り
   を除去することを特徴とする請求項１〜４記載の細胞培
   養方法。 ６、細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内に設けた濾過
   膜を介して懸濁培養液から培養液の培養槽外への一部排
   出、続いて新鮮培地の供給を行いつつ連続培養を行なう
   細胞培養装置に於いて、培養液を攪拌して細胞を懸濁状
   態とするための攪拌手段と、前記濾過膜を介して培養液
   の培養槽外への一部排出、及び、新鮮培地の供給を行う
   培養液排出・供給手段と、前記培養液排出・供給手段に
   よる培養液排出・供給を制御する培養液排出・供給制御
   手段と、前記攪拌手段の攪拌方向を前記培養液排出・供
   給と同期的に制御する攪拌方向制御手段と、を具備し、
   攪拌手段による培養液の攪拌方向を、濾過膜を介しての
   培養液の排出時と、新鮮培地の供給時とで反転せしめ得
   るように構成したことを特徴とする細胞培養装置。 ７、攪拌手段が正逆回転可能な攪拌翼を有し、培養液排
   出・供給制御手段が、培養液排出・供給経路のバルブの
   開閉及びポンプの作動を制御する手段からなり、攪拌手
   段の攪拌方向を制御する攪拌方向制御手段が、前記攪拌
   翼を回転せしめるスターラー及び前記スターラーの作動
   を前記培養液排出・供給経路のバルブの開閉及びポンプ
   の作動と同期的に制御して前記攪拌翼の回転方向を所定
   時間に反転せめしる手段からなることを特徴とする請求
   項５記載の細胞培養装置。 ８、濾過膜が中空糸膜であることを特徴とする請求項６
   又は請求項７記載の細胞培養装置。 ９、濾過膜を介して供給する新鮮培地としてタンパク質
   成分を除いた成分からなる培地を用い、タンパク質成分
   を含む液体は直接培養槽内に供給することを特徴とする
   請求項５ないし７のいずれか１つに記載の細胞培養装置
   。 １０、細胞を懸濁状態で培養しつつ培養槽内に設けた濾
   過膜を介して懸濁培養液から培養液の培養槽外への一部
   排出、続いて新鮮培地の供給を継続的に行いつつ連続培
   養を行なう細胞培養装置に於いて、培養液を攪拌して細
   胞を懸濁状態とするための攪拌手段と、前記濾過膜を介
   して培養液の培養槽外への一部排出、及び、新鮮培地の
   供給を行う培養液排出・供給手段と、前記培養液排出・
   供給手段による培養液排出・供給を制御する培養液排出
   ・供給制御手段と、前記攪拌手段の攪拌方向を前記培養
   液排出・供給と同期的に制御する攪拌方向制御手段と、
   を具備し、攪拌手段による培養液の攪拌方向を、濾過膜
   を介しての培養液の排出時と、新鮮培地の供給時とで反
   転せしめ得るように構成し、かつ、前記培養液排出・供
   給手段が酸素供給手段を兼ねた複数対の機構からなり、
   前記複数対の機構のそれぞれについて、培養液排出・供
   給及び酸素供給を交互に行わしめる制御手段を具備した
   ことを特徴とする細胞培養装置。