JPH02163088A - 緑膿菌のリポタンパク質ｉ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 緑Ｒｆｆｒ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕ３ｉ
ｎｏｓａ）は、広く分布しており、ヒトの医学分野で「
厄介な微生物」とみなされている。その主な標的は、衰
弱した患者で、抗生物質療法が頻繁に用いられるが、辛
うじてコントロールされるのみである。特に、集中治療
室の患者、対麻痺（ｐａｒａｐｌｅｇｉａ）の患者、火
傷を負ったヒト、または消防夫または製鋼職工のような
火傷の危険性の高い人々で、特に危険である。これら全
ての場合において、能動免疫による感染防御が期待され
る。リボタンパク質（ＯＭＰＩ）（ｌ　１ｐｏｐｒｏｔ
ｅｉｎ　Ｉ）は、ボリンＦ　（ｐｏｒｉｎ　Ｆ（ＯＭＰ
Ｆ））のように、緑膿菌の外膜の主要成分であり、この
ために、同様にワクチンの成分として適している可能性
がある。

本発明は、血清型６、Ａ　Ｔ　ＣＣ３３３５４の緑膿菌
からの外膜タンパク質Ｉ（ＯＭＰＴ）の遺伝子の完全な
特徴付けに基づいている。それから得られたＤＮＡ配列
およびアミノ酸配列は表１に示された通りである。表中
、アミノ酸の３文字コードを対応する塩基トリブレット
の下に示し、シグナルペプチドをイタリック体で強調し
ている。

この目的のために、外膜のタンパク質を緑ｌｉ＠菌から
得て、これから古典的な方法にてモノクローナル抗体を
得た。

ゲノムＤＮＡを菌株から単離精製して、ラムダＥＭＢＬ
３遺伝子バンクを既述（Ａ、−屯Ｆｒ１ＳＣｈａＵｆら
：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１７０　（１９８３
）　８２７−８４２、Ｍ、　Ｄｕｃｈｅｎｅら：　Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１７０　（１９８８）１５５
−１６２）のようにして作出した。この遺伝子バンクを
ブレーティングして、得られたプラークからの材料をニ
トロセルロース膜に移した。緑膿菌のリボタンパク質■
に特異的なモノクローナル抗体を少量のリボタンパク質
Ｉを発現したプラークを検出するために用いた。すなわ
ち、抗体−抗原反応をアルカリホスファターゼとカップ
リングした第二抗体と適当な呈色反応とを用いることに
よって可視化した。リボタンパク質Ｉをコードする遺伝
子は、１５ｋｂの大きさで陽性の入ファージに含まれて
いるＤＮＡ断片上に位置させて、次いで、６２６ｂｐの
大きさのＴａｑ　Ｉ断片に配置させた。

ＤＮＡの画鋲をＳａｎｇｅｒ　（Ｓａｎｇｅｒら：　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　（１９７７）　
５４６３−５４６７）の方法によって完全に配列決定し
た。対応するアミノ酸配列をこのようにして得たＤＮＡ
配列から推知した。

成熟タンパク質のＮ末端を、成熟タンパク質が同様にシ
スティン残基で始まる、対応する大腸菌タンパク質と比
較して推知した。このシスティン残基は、緑膿菌におけ
るように同じ配列集合ｃ＋ｙ−Ｃｙｓ−５ｅｒ−５ｅｒ
　（Ｋ、　ＮａｋａｍｕｒａおよびＭ、　Ｉｎｏｕｙｅ
：Ｃｅ１ｌ　１８　（１９７９）　１１０９−１１１７
）に位置している。

遺伝子の単離によりて、ここで、リボタンパク質Ｉおよ
びこのタンパク質の免疫原性を有する部分配列をワクチ
ンの調製に用いるに必要な量および純度で得ることが可
能になる。

このように、本発明は、表１に示されたアミノ酸配列を
有するリボタンパク質ｒ（ＯＭＰＩ）、それをコードす
るＤＮＡ（そのタンパク質コード鎖は表に示されている
）、リボタンパク質■の免疫原性部分配列、リボタンパ
ク質■およびこのタンパク質の免疫原性部分配列を用い
て得られたポリクローナルおよびモノクローナル抗体な
らびに対応する血清、さらにはそのような抗体または対
応するヌクレオチド配列を含む診断補助物およびそれら
の診断補助物を用いる診断方法、さらに、リボタンパク
質■または免疫原性部分タンパク質の調製のための遺伝
子操作法、に関する。

さらに、本発明は、ヒトモノクローナル抗体を用いる受
動免疫の道を開く。本発明は、したがって、本発明によ
って得られる抗原の、対応するモノクローナル抗体を生
産するリンパ細胞の誘導およびそのような抗体の産生に
ついてのリンパ細胞の試験のための、使用にも間する。

調製操作、精製、免疫および血清および抗体の獲得は、
公知の方法で行うことができる。例えば、門−Ｅ、　Ｇ
１１ｌｅｌａｎｄら：　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　
Ｉｍｍｕｎｉｔｙ４４　（１９８４）　４９−５４、Ｒ
，Ｅ、讐、　Ｈａｎｃｏｃｋら：Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１４９　（
１９８４）　２２０−２２６．５゜５ａｗａｄａら：　
Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　１５
０　（１９８４）５７０−５７６）を参照されたい。

本発明は、以下に詳述される通りである。特に記載がな
い限り、パーセントは重量パーセントを表す。

例」− リボタンパク質Ｉの調製 リボタンパク質ＩをＩｎｏｕｙｅら（Ｊ、ｏｆＢａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ　１２７　（１９７６）　５５５−５
６３）の方法に従って得る。

肚２ リボタンパク質Ｉに対するモノクローナル抗体の調製 精製したリボタンパク質■をフロイントのアジュバント
またはＡＩ　（ＯＨ）３とともにＢａ１ｂ／Ｃマウスに
腹腔内注射する。溶解した抗原を６週間後のブースター
に用いる。抗体価をＥＬＩＳＡによって１週間後に決定
する。免疫応答が適当でない場合には、さらなる注射を
行う。１０μ８の溶解抗原を、細胞融合の３日前にマウ
スの静注ブースターに用いる。標準法（に、　［ｏｅｈ
ｌｅｒおよびＣ０Ｍ１ｌｓｔｅｉｎ：　Ｎａｔｕｒｅ　
２５６　（１９７５）　４９５−４９７）を用いて肺臓
細胞をＮＳＩ細胞と融合させる。ＨＡＴ培地における選
択の後、単一コロニーをマイクロウェルで増殖させて、
それらの培養上清を、リボタンパク質Ｉに対する抗体に
ついて順次ＥＬｒＳＡで試験する。陽性のコロニーをサ
ブクローニングする。抗体を培養上清からおよびＢａ１
ｂ／ｃマウスの誘導した腹水から得て、従来の生化学的
方法によって精製して特徴付けを行った。

肚旦 リボタンパク質Ｉ　　ＤＮＡの調製および特徴付は緑膿
菌からの遺伝子バンクの作出： 遺伝子バンクの作出については報告（Ｍ。

［）ｕｃｈｅｎｅら：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　
１７０　（１９８Ｂ）　１５５−１６２）があり、これ
に従って行フた。

リボタンパク質Ｉ配列のための遺伝子バンクのスクリー
ニング： 組換えファージを５００　ｐｆｕ　（ｐｌａｑｕｅ　ｆ
ｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓ、プラーク形成巣位）の密度て
ＮＭ５３９ｍ菌ローンにブレーティングして一晩培養し
た。ファージブラークーをさらに３７℃で６時間培養し
て、それからニトロセルロース膜に移す。陽性のプラー
クをそれらのリボタンパク質Ｉの含有量によって同定す
る。すなわち、フィルターをまずモノクローナル抗体６
Ａ４とともにインキュベートして、次いで、陽性の抗体
−抗原反応を第二の抗体およびアルカリホスファターゼ
による酵素呈色反応を用いて同定する。

リボタンパク質Ｉ遺伝子およびそれに隣接する領域の配
列分析： 単離したファージの一つを大量培養（１リツトル）して
、ＤＮＡをそれから調製した（Ｍａｎｉａｔｉｓら：Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　ｓｐｒ
ｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　
１９８２）。後者を制限酵素５ａｌｌで切断して、得ら
れる制限断片をショットガン法にてｐ　Ｂ　Ｒ３２２（
Ｂｏｌｉｖａｒら：　Ｇｅｎｅ　２　（１９７７）９５
−１１３）に、次いでｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎら：　Ｇｅｎｅ　３３　（１９８５）　
１０３−１１９）にサブクローニングする。この場合、
形質転換された大腸菌細胞中で、陽性の形質転換体が抗
体反応によって認識されるほど充分な量のリボタンパク
質Ｉ　（ＯＭＰ　Ｉ）が同様に発現される。タンパク質
を発現する最小のサブクローンは、クローンｐＩＴａｑ
である。

プラスミドＤＮＡをこのクローンから単離して、Ｅｘｏ
ＩＩＩおよびＥｘｏ■で消化（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒ
ｒｏｎら二上記を参照されたい）の後、Ｃｈｅｎおよび
Ｓｅｅｂｕｒｇ（ＤＮＡ　４　　（１９８５）　１６５
−１７０）の方法で配列決定する。クローンは６２６ｂ
ｐの大きさでリボタンパク質１（ＯＭＰＩ）をコードす
る完全な配列を含むＴａｑ　Ｉ挿入物を有している。こ
の配列は、表１に示される通りである。

阻ユ リボタンパク質■の発現： リボタンパク質■遺伝子の緑膿菌における転写を導くプ
ロモーターは大腸菌のコンセンサスプロモーターときわ
めて似ていることから、タンパク質は、今日までに研究
されたリボタンパク質１転写単位の完全な配列を含む全
てのプラスミドで発現される。

リボタンパク質Ｉは、プラスミドｐＩＴａｑで形質転換
された大腸菌の培養から上記したＩｎｏｕｙｅらの方法
によってそれを単離して得られる。

敢旦 抗血清の調製： アレルギー　糖尿病、免疫不全症、貧血または皮膚病の
病歴を持たない健康成人を、異質Ｗ織で（ｈｅｔｅｒｏ
ｌｏｇｏｕｓｌｙ）発現させたリボタンパク質■、また
はその部分配列物、で免疫する。接種は、第１日日、８
日目および１５５日目行う。最後の接種から３週間の後
に、ボランティア被験者から採血して、Ｂ型肝炎表面抗
原およびＨＩＶ抗原について試験した。陰性反応を示す
供与血づ１のみをプールして、管理された無歯条件下で
分画して包装する。

表１：緑膜面からのリボタンパク質Ｉの配列コード領域
は３文字コードでアミノ酸残基が示されている。シグナ
ルペプチドはイタリック体で書かれている。

ＡＴＧ　ＡＡＣＡＡＣＧＴＴ　　ＣＴＧ　ＡＡＡ　τＴ
ＣＴＣτＧＣＴ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　Ｇ
ＣＴ　ＧＴＴＭａｔ　Ａｓｎ　ｋｓｎ　Ｖａｌ　Ｘ、ａ
ｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈａ　Ｅａｒ　Ａｈａ　Ｌａｕえ−Ｌｅ
ｕλ―）、ｉａ　Ｖａ１ＣＴＧ　　ＧＣＣＡＣＣＧＧＴ
　　ＴＧＣ入ＣＣＡＣＣＣＡＧ　　ＴＣＣＡＡＡ　ＧＡ
Ａ　ＡＣＣＣＡＡ　　ＧＣＴ　Ｃ０ＴＺｓｕ　　ｈｌａ
　　Ｔｂｒ　　Ｇユｙ　　Ｃｙｓ　　Ｓａｒ　　Ｓｕｒ
　　ｌ１ｉｓ　　Ｓａｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　入：ｑｌｏｏ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１２０ＣτＧ　ＡＣＣ
ＧＣＴ　ＡＣＣＧＡＡ　ＧＡＣＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＴ
　ＣＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＧ　ＧＣＴ　ＣＧＣＧＣＴＬａ
ｕ　Ｔｈｒ　Ｊｕａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＡＪｐ　Ｊｕａ
　ＪＬＬａ　Ａｌａ　社ｑ　ＡＩＪＬ　Ｇｉｎ　Ａｉａ
　Ａｒｇ　ＡＬａ１４０　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１６０　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　”８０ＧＡＣＣＡＡ　ＧＣＣＴＡＴ　ＣＧＣＡ
ＡＧ　ＧＣＴ　ＧＡＣ（−ＡＡ　ＧＣＴ　ＣＴＧ　ＧＧ
ＣＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＡＧλｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ
　　Ｔｙｒ　　入ｒｇ　　Ｉ、ｙｓ　　Ｊｕａ　　λｓ
ｐ　　Ｇｌｕ　　入ユａ　　Ｌｅｕ　　Ｇユｙ　Ａｌａ
　λユａＧユｎλＡ入　ＧＣＴ　　ＣＡＧ　　ＣＡＧ　
　ＡＣＣＧＣＴ　　（、λＣＧＡＧ　　ＧＣＴ　ＡＡＣ
ＣＡＧ　　ＣＧＴ　　ＧＣＣＣ″ＴＧ　Ｃ’＝ＣＬｙｓ
入−Ｇｉｎ　〕１　Ｔｂｒ　Ｊｕａ　ＪＬｓｐ　Ｇｌｕ
　Ｊｕａ　ｋｓｘｓ　にｌｕλ＝ｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
）；ｑＡＴＧ　　ＣＴＧ　　（、入Ａ　　ＡＡＡ　　Ｇ
ＣＣＡＧＣＣＧＣＡＡＧ　　丁λ入　τλＧＭａｔ　　
Ｌａｕ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ｊｕｘ　　Ｓ＠ｒ　　
ＪＬｒｇ　　Ｌｙｓ　　　　會　　　　舎弟１頁の続き ■Ｉｎｔ、　Ｃ１’ 識別記号 庁内整理番号 し Ｕ／ に ９９：　００

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表１に示されたアミノ酸配列を有する、緑膿菌の外
   膜タンパク質であるリボタンパク質 I 。 ２、請求項１に記載のリボタンパク質 I をコードする
   、ＤＮＡ。 ３、請求項１に記載のリボタンパク質 I の、免疫原性
   部分配列物。 ４、表１に示されたリボタンパク質 I または免疫原性
   部分配列物をコードするＤＮＡを、原核または真核細胞
   中で発現させることからなる、表１に示されたリボタン
   パク質 I または免疫原性部分配列物の製造法。 ５、請求項１に記載のリボタンパク質 I または請求項
   ３に記載のこのタンパク質の免疫原性部分配列物を抗原
   として用いることによって得られる、ポリクローナル抗
   体またはモノクローナル抗体。 ６、請求項５に記載の抗体を含んでなる、診断補助物。 ７、請求項２に記載のヌクレオチド配列物の全部または
   部分、またはそれから派生するヌクレオチド配列物、を
   含んでなる、診断補助物。 ８、請求項６または７に記載の診断補助物を用いること
   からなる、診断法。 ９、抗体を産生するためにリンパ細胞を誘導するための
   、請求項１または３に記載のタンパク質の使用。 １０、請求項１または３に記載のタンパク質に対する抗
   体の産生についてリンパ細胞を試験するための、請求項
   １または３に記載のタンパク質の使用。