JPH02119800A - 核酸の検出方法 - Google Patents
核酸の検出方法Info
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- JPH02119800A JPH02119800A JP27592888A JP27592888A JPH02119800A JP H02119800 A JPH02119800 A JP H02119800A JP 27592888 A JP27592888 A JP 27592888A JP 27592888 A JP27592888 A JP 27592888A JP H02119800 A JPH02119800 A JP H02119800A
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- JP
- Japan
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- solution
- nucleic acid
- membrane
- pva
- hybridization
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（イ）産業上の利用分野
本発明は、特定の塩基配列を持つ核酸を検出する方法、
詳しくは核酸のハイブリダイゼシ日ン全利用する検出方
法に関する。
詳しくは核酸のハイブリダイゼシ日ン全利用する検出方
法に関する。
（ロ）従来技術
検体試料中の目的とする特定の塩基配列を持つ核酸を検
出する方法として核酸のハイブリダイゼーションが利用
さｎている。この分析法は一本鎖に変性さｆした核酸が
適当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖の核
酸と配列に特異な水素結合を介してハイブリッド全形成
する（ハイブリダイズする）ことを利用したものである
。
出する方法として核酸のハイブリダイゼーションが利用
さｎている。この分析法は一本鎖に変性さｆした核酸が
適当な条件下で相補的な塩基配列を含む別の一本鎖の核
酸と配列に特異な水素結合を介してハイブリッド全形成
する（ハイブリダイズする）ことを利用したものである
。
すなわち、ハイブリダイゼーションアッセイにおいては
、既知の配列を有する核酸をプローブとして用いて、試
料のなかにターゲットとなる相補的な配列がないかを調
べる。プローブとターゲットによって形成さｆ′Ｌだハ
イブリッドに標識を付けることにより、試料中の相補的
配列の検出及び定量が可能になる。
、既知の配列を有する核酸をプローブとして用いて、試
料のなかにターゲットとなる相補的な配列がないかを調
べる。プローブとターゲットによって形成さｆ′Ｌだハ
イブリッドに標識を付けることにより、試料中の相補的
配列の検出及び定量が可能になる。
ハイブリッドを検出するためにプローブに標識付けをす
る方法の−っけ、プローブに放射性同位元素（例えば、
Ｐあるいは ■）を結合させることである。
る方法の−っけ、プローブに放射性同位元素（例えば、
Ｐあるいは ■）を結合させることである。
しかし、安全性や安定性、また設備等の問題から非放射
性標識システムの開発が進められている。
性標識システムの開発が進められている。
非放射性標識システムとしては、第一のタイプとして、
プローブに直接、共有結合で螢光あるいは化学発光を生
ずる官能基を導入するものである。第二のタイプとして
は、抗体やピオチンなどの巨大分子によって認識さ几る
部位をプローブに共有結合で導入し、螢光標識あるいは
化学発光標識した巨大分子で認識し、プローブの存在を
検出しようとするものである。第三のタイプとしては、
第−及び第二のタイプのシステムに酵素による増幅作用
全利用したものである。
プローブに直接、共有結合で螢光あるいは化学発光を生
ずる官能基を導入するものである。第二のタイプとして
は、抗体やピオチンなどの巨大分子によって認識さ几る
部位をプローブに共有結合で導入し、螢光標識あるいは
化学発光標識した巨大分子で認識し、プローブの存在を
検出しようとするものである。第三のタイプとしては、
第−及び第二のタイプのシステムに酵素による増幅作用
全利用したものである。
ハイブリダイゼーションアッセイは、疾患の診断に用い
らｎることが多くそのため迅速、簡便、高感度でしかも
放射性同位元素？扱うのに必要な特別の設備が不要であ
ることが求めらｎている。こｎらのことから最近では、
第三のタイプの非放射性標識システムの開発が進めら几
ている。
らｎることが多くそのため迅速、簡便、高感度でしかも
放射性同位元素？扱うのに必要な特別の設備が不要であ
ることが求めらｎている。こｎらのことから最近では、
第三のタイプの非放射性標識システムの開発が進めら几
ている。
第三のタイプの非放射性システムとしては。
例えば、プローブに直接酵素を共有結合で導入したもの
（ＲｅｎＺ、 Ｍ、、 ａｎｄ Ｋｕｒｚ、 ｃ、 （
１９Ｂ４ ） ＮＬＩＣＩ 。
（ＲｅｎＺ、 Ｍ、、 ａｎｄ Ｋｕｒｚ、 ｃ、 （
１９Ｂ４ ） ＮＬＩＣＩ 。
Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １２．３４３８４４４ ）が知
られている。
られている。
従来から行わｎている核酸のハイブリダイゼーションア
ッセイの概要は以下に示した通りである。
ッセイの概要は以下に示した通りである。
才ず９検体試料中の核酸を変性して一本鎖とした後、支
持体であるニトロセルロース製の膜に８０°Ｃで２ｈ程
度焼付け、固足する。
持体であるニトロセルロース製の膜に８０°Ｃで２ｈ程
度焼付け、固足する。
次に、標識プローブの非特異吸着を抑えるためにプレハ
イブリダイゼーションバッファー（例えば、 ＥＤＴＡ
、塩化す） ＩＪウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリ
エチレングリコール、フィコール、ポリビニルピロリド
ン、牛血清アルブミン。
イブリダイゼーションバッファー（例えば、 ＥＤＴＡ
、塩化す） ＩＪウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリ
エチレングリコール、フィコール、ポリビニルピロリド
ン、牛血清アルブミン。
サケ精子ＤＮＡ及びホルムアミドを含むトリス塩酸緩衝
液）中でプレハイブリダイゼーションを行う。プレハイ
ブリダイゼーションは通常３７℃で３０ｒｎｉｎ；ｌ’
！ｉｊ度行うことが多い。
液）中でプレハイブリダイゼーションを行う。プレハイ
ブリダイゼーションは通常３７℃で３０ｒｎｉｎ；ｌ’
！ｉｊ度行うことが多い。
プレハイブリダイゼーションの後、試料の核酸を固足し
た膜？標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッ
ファー（プレハイブリダイゼーションバッファーと組成
は同じ）中で数りから一晩インキーベートする。
た膜？標識プローブを含むハイブリダイゼーションバッ
ファー（プレハイブリダイゼーションバッファーと組成
は同じ）中で数りから一晩インキーベートする。
次いで膜に固定さｎている試料の核酸にハイブリダイズ
していない標識プローブを除去するためにドデシル硫酸
ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム金倉
むトリス塩酸緩衝液等で洗浄する。
していない標識プローブを除去するためにドデシル硫酸
ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム金倉
むトリス塩酸緩衝液等で洗浄する。
洗浄の終わった膜を酵素反応によって沈着性色素、可溶
性色素、螢光性物質１発光性物質等全生成する酵素反応
基質を含む緩衝液中でインキ−ベートすると検体試料中
に標識プローブと相補的□な配列を持つ核酸が含ま九る
場合にのみ膜が着色、あるいは螢光、あるいは全党が観
測さｎる。このことにより検体試料の核酸中の特定塩基
配列を検出する。
性色素、螢光性物質１発光性物質等全生成する酵素反応
基質を含む緩衝液中でインキ−ベートすると検体試料中
に標識プローブと相補的□な配列を持つ核酸が含ま九る
場合にのみ膜が着色、あるいは螢光、あるいは全党が観
測さｎる。このことにより検体試料の核酸中の特定塩基
配列を検出する。
（ハ）発明が解決しようとする課題
しかし、現在十分な感度でしかも迅速、簡便。
定量的にターゲットの核酸を検出する非放射性標識シス
テムは確立していない。
テムは確立していない。
この原因は、ハイブリダイゼーションアッセイを行う過
程で酵素等の巨大分子で標識したプローブがターゲット
以外のもの、特に試料の核酸の固定に用いるニトロセル
ロース膜に非特異吸着し、バックグラウンドが上昇する
からである。現在、広く用いられているＤｅｎｈａｒｄ
ｔ ｓ溶液やスキムミルク溶液（ＪＯｈｎＳＯｎ、 Ｄ
、Ａ、ＧａｕｔＣ，ｈ、Ｊ。
程で酵素等の巨大分子で標識したプローブがターゲット
以外のもの、特に試料の核酸の固定に用いるニトロセル
ロース膜に非特異吸着し、バックグラウンドが上昇する
からである。現在、広く用いられているＤｅｎｈａｒｄ
ｔ ｓ溶液やスキムミルク溶液（ＪＯｈｎＳＯｎ、 Ｄ
、Ａ、ＧａｕｔＣ，ｈ、Ｊ。
Ｗ、、 Ｓｐｏｒｔｓｍａｎ、 Ｊ、Ｒ８ａｎｄ Ｅｌ
ｄｅｒ、 Ｊ、 Ｈ，（１９８４）。
ｄｅｒ、 Ｊ、 Ｈ，（１９８４）。
Ｇｅｎｅ Ａｎａｌｙｔ １ｃａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ’１．３−８ ）では、十分にプローブの非特異
吸着を抑えることができず、高感度にターゲットの核ｒ
Ｉ！を検出することができない。
ｇｙ ’１．３−８ ）では、十分にプローブの非特異
吸着を抑えることができず、高感度にターゲットの核ｒ
Ｉ！を検出することができない。
本発明は１以上のような状況を鑑みなさｎたものである
。すなわち、標識プローブのターゲット以外への非特異
吸着を抑える方法を開発することによって、迅速、簡便
、かつ高感度にターゲットの核酸を検出するシステムを
供することである。
。すなわち、標識プローブのターゲット以外への非特異
吸着を抑える方法を開発することによって、迅速、簡便
、かつ高感度にターゲットの核酸を検出するシステムを
供することである。
に）課題を解決するための手段
本発明は、上記の課題を解決する手段としてハイブリダ
イゼーションアッセイにおいて試料の接散全固定した後
にこの膜’ｉｏ、０１〜３０Ｗ／Ｖ％ＰＶＡ及び０ 、
０１ ヘ３０ Ｗ／Ｖ％のｐｖｐ ｔ−含有する溶液（
以下ＰＶＡ−ＰＶＰ溶液と略する。）、あるいは。
イゼーションアッセイにおいて試料の接散全固定した後
にこの膜’ｉｏ、０１〜３０Ｗ／Ｖ％ＰＶＡ及び０ 、
０１ ヘ３０ Ｗ／Ｖ％のｐｖｐ ｔ−含有する溶液（
以下ＰＶＡ−ＰＶＰ溶液と略する。）、あるいは。
０．０１へ３０Ｗ／Ｖ％のＰＶＡ ｆ含有する溶液（以
下、ｐｖＡ溶液と略する）、あるいは、 ０．０１〜３
０Ｗ／ＶチのＰＶＰ ｋ含有する溶液（以下、 ｐｖｐ
溶液と略する）に浸してブロッキング処理を行う過程全
台む核酸の検出法？供するものである。
下、ｐｖＡ溶液と略する）、あるいは、 ０．０１〜３
０Ｗ／ＶチのＰＶＰ ｋ含有する溶液（以下、 ｐｖｐ
溶液と略する）に浸してブロッキング処理を行う過程全
台む核酸の検出法？供するものである。
本発明においては、用いるＰＶＡは重合度が５００のも
のが好ましいがこｎに限定されるものではない。また、
ＰＶＡ及びｐｖｐ ２溶解する溶媒は蒸留水が好まし
いがこ扛に限足さｎるものではない。また９本発明にお
けるブロッキング処理の条件は、処理温度は３０〜５０
°Ｃ１処理時間は０．２５〜〕ｈが好ましいがこｎに限
定さ九るものではない。
のが好ましいがこｎに限定されるものではない。また、
ＰＶＡ及びｐｖｐ ２溶解する溶媒は蒸留水が好まし
いがこ扛に限足さｎるものではない。また９本発明にお
けるブロッキング処理の条件は、処理温度は３０〜５０
°Ｃ１処理時間は０．２５〜〕ｈが好ましいがこｎに限
定さ九るものではない。
（ホ）実施例
以下、実施例に基づき９本発明を具体的に説ｔ７）
明する。但し本発明は、実施例に限定さ九るものではな
い。
い。
（１）Ｍ１３プライマー（５−ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧ
ＧＣＯＡＧＴ−３′）のＡＬＰ標識は、多田ら、特願昭
６３−１９１０８７号に記載さｎている方法に従った。
ＧＣＯＡＧＴ−３′）のＡＬＰ標識は、多田ら、特願昭
６３−１９１０８７号に記載さｎている方法に従った。
すなわち９Ｍ１３プライマーの５′位へリン酸残基全導
入し、さＨ２Ｎ （ＣＨ２）２ Ｓ−Ｓ （ＣＨ２）２ ＮＨＰ−〇○ ５’ （Ｍ１３プライマー）３′ さらにジチオスレイ）−／Ｌ”を用いて還元し末端がチ
オール基に変換さｆ′したＭ１３プライマー全得た。
入し、さＨ２Ｎ （ＣＨ２）２ Ｓ−Ｓ （ＣＨ２）２ ＮＨＰ−〇○ ５’ （Ｍ１３プライマー）３′ さらにジチオスレイ）−／Ｌ”を用いて還元し末端がチ
オール基に変換さｆ′したＭ１３プライマー全得た。
また、 ＡＬＰと２５倍相当量の５ＰＤＰとを反応させ
、 ＡＬＰＫ ２−ビリジルジヌルフィド基を導入した
。
、 ＡＬＰＫ ２−ビリジルジヌルフィド基を導入した
。
（２）こ九らの工程によって得らｎた５′末端がチオー
ル基に変換さ九たＭ’ｌＬ３プライマーと２−ピリジル
ジスフィト基を導入したＡＬＰ（ｉ−反応させＡＬＰ標
識したＭ１３プライマーを得た。
ル基に変換さ九たＭ’ｌＬ３プライマーと２−ピリジル
ジスフィト基を導入したＡＬＰ（ｉ−反応させＡＬＰ標
識したＭ１３プライマーを得た。
ＡＬ、Ｐ−ＮＨ−Ｃｏ−（ＯＨ２）２
（３１Ｍ１３ ｍ ｐ Ｂ−水銀ファージＤＮＡとＡＬ
Ｐ標識Ｍ１３プライマーとのハイブリダイゼーション（
ブロッキング処理の効果） Ｍ ｌ ３ ｍ Ｐ ８−水銀ファージＤＮＡ （約７
０００ ｂｐ） ′ｋＴＥ緩衝’Ｑ（ｐＨ７，５，１０
ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＣＩ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）で段階希
釈し、−辺５闘の正方形に切ったニトロセルロース膜に
１μｍずつＯｍｏ １．５ ｆｅｍ ｔ−ｏｍｏ ｌ
Ｉ７）Ｍ１３ｍｐ ８−本領ファージＤＮＡ ’ｉドツ
トした。風乾後、オーブンで１８０°Ｃ，２ｈ熱しＤＮ
Ａを固定した。これらの膜を、■、ブロッキング処理し
ないもの■、 ｐｖｐ ｙ２５Ｗ／Ｖ％含む溶液で処理
するもの■、 ＰＶＡ ｉ ＩＷ／Ｖ％含む溶液で処理
するもの■、ＰＶＡ’（ｉ−ＩＷ／Ｖ％含み、 ｐｙ
ｐ ｐ ５Ｗ／Ｖ％含む溶液で処理するものに分け９６
穴プレートに固定しそ九ぞれの溶液全１フ０μｌ加えマ
イクロプレートミキサー上で４０°Ｃ，３０ｍ振とうし
た。その後こ九、らの溶液を捨てリン酸緩衝生理食塩水
全各室に１’ｉ’Ｏμｍずつ加えマイクロプレートミキ
サー上で１ｍ振とうし、膜全洗浄した。さらにこの洗浄
操作全１回繰り返した。
Ｐ標識Ｍ１３プライマーとのハイブリダイゼーション（
ブロッキング処理の効果） Ｍ ｌ ３ ｍ Ｐ ８−水銀ファージＤＮＡ （約７
０００ ｂｐ） ′ｋＴＥ緩衝’Ｑ（ｐＨ７，５，１０
ｍＭ Ｔｒｉｍ−ＣＩ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ）で段階希
釈し、−辺５闘の正方形に切ったニトロセルロース膜に
１μｍずつＯｍｏ １．５ ｆｅｍ ｔ−ｏｍｏ ｌ
Ｉ７）Ｍ１３ｍｐ ８−本領ファージＤＮＡ ’ｉドツ
トした。風乾後、オーブンで１８０°Ｃ，２ｈ熱しＤＮ
Ａを固定した。これらの膜を、■、ブロッキング処理し
ないもの■、 ｐｖｐ ｙ２５Ｗ／Ｖ％含む溶液で処理
するもの■、 ＰＶＡ ｉ ＩＷ／Ｖ％含む溶液で処理
するもの■、ＰＶＡ’（ｉ−ＩＷ／Ｖ％含み、 ｐｙ
ｐ ｐ ５Ｗ／Ｖ％含む溶液で処理するものに分け９６
穴プレートに固定しそ九ぞれの溶液全１フ０μｌ加えマ
イクロプレートミキサー上で４０°Ｃ，３０ｍ振とうし
た。その後こ九、らの溶液を捨てリン酸緩衝生理食塩水
全各室に１’ｉ’Ｏμｍずつ加えマイクロプレートミキ
サー上で１ｍ振とうし、膜全洗浄した。さらにこの洗浄
操作全１回繰り返した。
次に各人にプレハイブリダイゼーション溶液（４Ｘ Ｓ
ＥＴ、 ０．０４Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ、 ０．０４Ｗ／Ｖ
、％ ＰＶＰ、 ０，０４Ｗ／Ｖ％フィコーＡ＜、６Ｗ
／Ｖ％ポリエチレンクリコ／Ｌ／ 、 ０．ＩＷ／Ｖ％
５ＤＳ）ｉ１７０μｍずつ加え、マイクロプレートミキ
サー上で４０°Ｃ，１５ｍ振とうした。
ＥＴ、 ０．０４Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ、 ０．０４Ｗ／Ｖ
、％ ＰＶＰ、 ０，０４Ｗ／Ｖ％フィコーＡ＜、６Ｗ
／Ｖ％ポリエチレンクリコ／Ｌ／ 、 ０．ＩＷ／Ｖ％
５ＤＳ）ｉ１７０μｍずつ加え、マイクロプレートミキ
サー上で４０°Ｃ，１５ｍ振とうした。
プレハイブリダイゼーション溶液を捨てた後（１）で調
製しｆｌ Ａ Ｌ Ｐ標識プローブｆ Ｏ，６ｐｍ ｏ
ｌＡｒ１１含むハイブリダイゼーション溶液（その他の
組Ｆｖ、ｔｉプレハイブリダイゼーション溶液と同じ。
製しｆｌ Ａ Ｌ Ｐ標識プローブｆ Ｏ，６ｐｍ ｏ
ｌＡｒ１１含むハイブリダイゼーション溶液（その他の
組Ｆｖ、ｔｉプレハイブリダイゼーション溶液と同じ。
）ｉ１７０μｍずつ加えマイクロプレートミキサー上で
４０°Ｃ，３Ｏ＝撮とうしハイブリダイゼーションを行
った。
４０°Ｃ，３Ｏ＝撮とうしハイブリダイゼーションを行
った。
その後、１ＸＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ溶液１．７０ ｐ
ｌずつを用いてマイクロプレートミキサー上で室温１
悶全２回、４０°Ｃ，５１ｊｙ１回、室温、ｌ駆を２回
振とうしながら膜全洗浄した。次に氷冷したＩ Ｘ Ｓ
ＳＯ溶液１７０μｍずつ？用いてマイクロプレートミキ
サー上で１ｍ、２回振とうしながら膜を洗浄した。続い
て氷冷しｆｃｌ、、５ｍｍの過塩素酸マグネシウムを含
むＣＢ緩衝液１７０μｍずっを用いてマイクロプレート
ミキサー上で１駆。
ｌずつを用いてマイクロプレートミキサー上で室温１
悶全２回、４０°Ｃ，５１ｊｙ１回、室温、ｌ駆を２回
振とうしながら膜全洗浄した。次に氷冷したＩ Ｘ Ｓ
ＳＯ溶液１７０μｍずつ？用いてマイクロプレートミキ
サー上で１ｍ、２回振とうしながら膜を洗浄した。続い
て氷冷しｆｃｌ、、５ｍｍの過塩素酸マグネシウムを含
むＣＢ緩衝液１７０μｍずっを用いてマイクロプレート
ミキサー上で１駆。
２回振とうしながら膜を洗浄した。
膜をそｎぞれ１．５１Ｊのサンプリングチューブに移し
替え、１ｍＭのフェニルフォスフエイト及び１．５ｍｂ
ＮＩ０．４塩素醒マグネシウムを含むＣＡＢ緩衝液ｉ
１００μずつ加え、３７°Ｃ，１ｈインキユベートした
。
替え、１ｍＭのフェニルフォスフエイト及び１．５ｍｂ
ＮＩ０．４塩素醒マグネシウムを含むＣＡＢ緩衝液ｉ
１００μずつ加え、３７°Ｃ，１ｈインキユベートした
。
その後、＠ちに氷冷し、それぞｆ’Ｌ Ｋ Ｏ，１５Ｍ
リン酸５ ｐ Ｉ 、 ０．２ＭＥ ＤＴＡ −２Ｎ
ａ水溶液２０μｌｉ加え酵素反応を停止させた。
リン酸５ ｐ Ｉ 、 ０．２ＭＥ ＤＴＡ −２Ｎ
ａ水溶液２０μｌｉ加え酵素反応を停止させた。
酵素反応によって生成したフェノ−／Ｌ／ヲ検出するた
めに各反応液から１０μＩずつ第１図に示したアンベロ
メ） ＩＪラック出器を組み込んだ高速液体クロマトグ
ラフシステムのオートインジェクターからインジェクト
した。分析条件はカラムｉ ＳＨＩＭ−ＰＡＣ！Ｋ Ｏ
ＤＳ内径４．６朋長さ５０１、カラム温度ｉ４０’Ｃ，
移動相ｉ０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ＰＨ６’、
８ ） ：メタノール＝４：１゜流速； １．Ｏ簿１／
ｍ、検出電位ｉ ０．８０ＶＶＳ、Ａｇ／Ａ、ｇＣｌ、
検出温度；４０°Ｃである。１ｍｙフーニルフォスフエ
イト及び１．５ｍＭ過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩
衝液１００μｌ ’ｉ ３７°Ｃ，１ｂ （ンキＷべ一
） Ｌ、 ’＋ Ｏ’Ｎ Ｍリン酸５μ４．０．２ＭＥ
ＤＴＡ−２Ｎａ 水溶液２０μｍ２加えたもの１０μｍ
２インジエクトして得らｆしたクロマトグラムをベース
ラインとして３繍付近に現ｎるビークのビーク電流値を
読み取った。ここでＳ／Ｎ ｉ ５ ｆｍｏｌ ＤＮＡ
ｉ固定した占）ら得ら九たピーク電流値とｏｍｏｌ
ＤＮＡで得られたピーク電流値の比とすると第２図に示
したようにブロッキング処理全しないものでけＳ／Ｎ＝
３．２であるがｐｙｐ溶液を用いてブロッキング処理す
るとＳ／Ｎ ＝ １４まで向上し、 ＰＶＡ溶液を用い
てブロッキング処理するとＳ／Ｎ ＝ １６まで向上し
た。さらにＰＶ’Ａ−ＰＶＰ溶液を用いることによって
Ｓ／Ｎ ＝ ２９まで向上した。
めに各反応液から１０μＩずつ第１図に示したアンベロ
メ） ＩＪラック出器を組み込んだ高速液体クロマトグ
ラフシステムのオートインジェクターからインジェクト
した。分析条件はカラムｉ ＳＨＩＭ−ＰＡＣ！Ｋ Ｏ
ＤＳ内径４．６朋長さ５０１、カラム温度ｉ４０’Ｃ，
移動相ｉ０．１Ｍカリウム−リン酸緩衝液（ＰＨ６’、
８ ） ：メタノール＝４：１゜流速； １．Ｏ簿１／
ｍ、検出電位ｉ ０．８０ＶＶＳ、Ａｇ／Ａ、ｇＣｌ、
検出温度；４０°Ｃである。１ｍｙフーニルフォスフエ
イト及び１．５ｍＭ過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩
衝液１００μｌ ’ｉ ３７°Ｃ，１ｂ （ンキＷべ一
） Ｌ、 ’＋ Ｏ’Ｎ Ｍリン酸５μ４．０．２ＭＥ
ＤＴＡ−２Ｎａ 水溶液２０μｍ２加えたもの１０μｍ
２インジエクトして得らｆしたクロマトグラムをベース
ラインとして３繍付近に現ｎるビークのビーク電流値を
読み取った。ここでＳ／Ｎ ｉ ５ ｆｍｏｌ ＤＮＡ
ｉ固定した占）ら得ら九たピーク電流値とｏｍｏｌ
ＤＮＡで得られたピーク電流値の比とすると第２図に示
したようにブロッキング処理全しないものでけＳ／Ｎ＝
３．２であるがｐｙｐ溶液を用いてブロッキング処理す
るとＳ／Ｎ ＝ １４まで向上し、 ＰＶＡ溶液を用い
てブロッキング処理するとＳ／Ｎ ＝ １６まで向上し
た。さらにＰＶ’Ａ−ＰＶＰ溶液を用いることによって
Ｓ／Ｎ ＝ ２９まで向上した。
すなわち１本発明によるｐｖｐ溶液、 ＰＶＡ溶液。
ＰＶＡ −ｐｖｐ溶液を用いることによってそれぞｎ核
酸のハイブリダイゼーションにおける標識プローブの非
特異吸Ｎ全従来の２３．２０．１１％にまで減少させる
ことができた。
酸のハイブリダイゼーションにおける標識プローブの非
特異吸Ｎ全従来の２３．２０．１１％にまで減少させる
ことができた。
（４） Ｍ １３ｍｐ ８−末鎖ファージＤＮＡとＡＬ
Ｐ標識Ｍ１３プライマーとのハイブリダイゼーション（
ｐｖＡ −ＰＶＰ溶液金用いた高感度検出）Ｍ １３ｍ
ｐＢ −末鎖ファージＤＮＡ （約７０００ ｂｐ
）’ｉＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＴｒｉＳ
−０１，１ｒｒ＋ＭＥＤＴＡ）で段階希釈し、−辺５
ｆｆｌの正方形に切ったニトロセルロース膜に１μｍず
つ０．０．０５．０．５゜５、５０．５００．５０００
ａｔｔｏｍ ｏｌのＭ１３ｍｐ８−水銀フアージＤＮ
Ａ ’ｉドツトした。風乾後、オーブンで１８０°Ｑ、
２ｈ熱しＤＮＡを固定した。この膜を９６穴プレートに
固定し、各室にＰＶＡ ｉ ｘｗ／ｖ ％含みＰｖＰ（
ｉ−５Ｗ／Ｖ係含む溶液？１７０μｍ加えマイクロブ水
を穴に１７０μずつ加えマイクロプレートミキサー」二
で１回振とうし、膜を洗浄した。さらにこの洗浄操作全
１…ｊ繰り返した４、 次に各室にプレハイブリダイゼーション溶液（４Ｘ Ｓ
ＥＴ 、 ０．０４Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ 、 ０．０４Ｗ
／Ｖ％ＰＶＰ 、 Ｑ。
Ｐ標識Ｍ１３プライマーとのハイブリダイゼーション（
ｐｖＡ −ＰＶＰ溶液金用いた高感度検出）Ｍ １３ｍ
ｐＢ −末鎖ファージＤＮＡ （約７０００ ｂｐ
）’ｉＴＥ緩衝液（ｐＨ７，５，１０ｍＭ ＴｒｉＳ
−０１，１ｒｒ＋ＭＥＤＴＡ）で段階希釈し、−辺５
ｆｆｌの正方形に切ったニトロセルロース膜に１μｍず
つ０．０．０５．０．５゜５、５０．５００．５０００
ａｔｔｏｍ ｏｌのＭ１３ｍｐ８−水銀フアージＤＮ
Ａ ’ｉドツトした。風乾後、オーブンで１８０°Ｑ、
２ｈ熱しＤＮＡを固定した。この膜を９６穴プレートに
固定し、各室にＰＶＡ ｉ ｘｗ／ｖ ％含みＰｖＰ（
ｉ−５Ｗ／Ｖ係含む溶液？１７０μｍ加えマイクロブ水
を穴に１７０μずつ加えマイクロプレートミキサー」二
で１回振とうし、膜を洗浄した。さらにこの洗浄操作全
１…ｊ繰り返した４、 次に各室にプレハイブリダイゼーション溶液（４Ｘ Ｓ
ＥＴ 、 ０．０４Ｗ／Ｖ％ＢＳＡ 、 ０．０４Ｗ
／Ｖ％ＰＶＰ 、 Ｑ。
０４Ｗ／Ｖ％７ イ：７−７Ｌ’、 ６Ｖ／Ｖ％ポリエ
チレングリコール、０．１Ｗ／Ｖチ５ＤＳ）’ｉｌ’ｉ
’ｏμｍずつ刃口え、マイクロプレートミキサー上で４
０”０．１５ｍ振とうした。
チレングリコール、０．１Ｗ／Ｖチ５ＤＳ）’ｉｌ’ｉ
’ｏμｍずつ刃口え、マイクロプレートミキサー上で４
０”０．１５ｍ振とうした。
プレハイブリダイゼーション溶液を捨てた後（１）で調
製したＡＬＰ標識プローブ全０．６ｐｍｏｌ含むハイブ
リダイゼーション溶液（その他の組成はプレハイブリダ
イゼーション溶液と同じ。）ｉｌ’７０μｌずつ加えマ
イクロプレートミキサー上で４０”Ｃ，３０ａｉｘ振と
うしハイプリダイゼーシ四ン全行つた。
製したＡＬＰ標識プローブ全０．６ｐｍｏｌ含むハイブ
リダイゼーション溶液（その他の組成はプレハイブリダ
イゼーション溶液と同じ。）ｉｌ’７０μｌずつ加えマ
イクロプレートミキサー上で４０”Ｃ，３０ａｉｘ振と
うしハイプリダイゼーシ四ン全行つた。
その後、 ｌＸ５ＳＣ、０，２％ＳＤＳ溶液１’７０μ
ｍずつを用いてマイクロプレートミキサー上で室温。
ｍずつを用いてマイクロプレートミキサー上で室温。
１ ｗｆ ２回、４０°Ｃ、５ｍ ｆ １ｈ ｑ ２回
振とうしながら膜を洗浄した。次に氷冷したｌＸ５ＳＣ
溶ｇ）７ｏμｌずつ？用いてマイクロプレートミキサー
上で１餌、２回振とうしながら換金洗浄した。続いて氷
冷した１、５ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩
衝液１７０μ勢つを用いてマイクロプレートミキサー上
で１ｍ、２回振とうしながら換金洗浄した。
振とうしながら膜を洗浄した。次に氷冷したｌＸ５ＳＣ
溶ｇ）７ｏμｌずつ？用いてマイクロプレートミキサー
上で１餌、２回振とうしながら換金洗浄した。続いて氷
冷した１、５ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩
衝液１７０μ勢つを用いてマイクロプレートミキサー上
で１ｍ、２回振とうしながら換金洗浄した。
膜をそｎぞ′ｎ１．５Ｍｉのサンプリングチューブに移
し替え、１ｍＭのフェニル７オスフエイト及び’１．５
ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液を１００
μｍずつ加え、３７°Ｃ、１ｈインキユベートした。
し替え、１ｍＭのフェニル７オスフエイト及び’１．５
ｍＭの過塩素酸マグネシウムを含むＣＢ緩衝液を１００
μｍずつ加え、３７°Ｃ、１ｈインキユベートした。
その後、直ちに氷冷し、それぞｎに０．１５ Ｍ ＩＪ
ン酸５μｍ 、 ０．２ＭＥ ＤＴＡ −２Ｎａ水溶液
２０ｐ１ｑ加え醇素反応？停止させた。
ン酸５μｍ 、 ０．２ＭＥ ＤＴＡ −２Ｎａ水溶液
２０ｐ１ｑ加え醇素反応？停止させた。
酵素反応によって生成したフェノ−／Ｌ／全検出するた
めに各反応液から１０μｍずつ第１図に示したアンペロ
メトリック検出器を組み込んだ高速液体クロマトグラフ
システムのオートインジェクターからインジェクトした
。分析条件は。
めに各反応液から１０μｍずつ第１図に示したアンペロ
メトリック検出器を組み込んだ高速液体クロマトグラフ
システムのオートインジェクターからインジェクトした
。分析条件は。
カラムｉ ＳＨＩＭ −ＰＡＣＫ ＯＤＳ内径４．６朋
長さ５０闘、カラム温度；４０°Ｃ９移動相； ０．１
Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６，８） メタノ−／
ｌ／−４；ｌ。
長さ５０闘、カラム温度；４０°Ｃ９移動相； ０．１
Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ６，８） メタノ−／
ｌ／−４；ｌ。
流速； １．Ｏｍ ｌ／ｌＩＩ＊ 、検出電位； ０．
８０Ｖ ｖｓ、Ａｇ／Ａｇ（！ｌ 、検出温度；４０°
Ｃである。ＤＮＡｆｉが０ａｔｔｏ ｍ ｏ ｌのもの
から得らｎたクロマトグラム全ベースラインとして３馴
付近に現九るビークのピーク電派値を読み取ジ、グラフ
にプロットすると第３図のようになった。すなわち、こ
のシステムを用いることによって５０ａｔｔｏｍｏｌま
でのｙ１３ｍｐｓ−水銀ＤＮＡ全検出できた。
８０Ｖ ｖｓ、Ａｇ／Ａｇ（！ｌ 、検出温度；４０°
Ｃである。ＤＮＡｆｉが０ａｔｔｏ ｍ ｏ ｌのもの
から得らｎたクロマトグラム全ベースラインとして３馴
付近に現九るビークのピーク電派値を読み取ジ、グラフ
にプロットすると第３図のようになった。すなわち、こ
のシステムを用いることによって５０ａｔｔｏｍｏｌま
でのｙ１３ｍｐｓ−水銀ＤＮＡ全検出できた。
（へ）効果
ＰＶＡ溶液、 ｐｙｐ溶液、 ｐ、ｙＡ−ｐｙｐ溶液溶
液ロブロッキング処理いることによって標識プローブの
膜への非特異成層全大幅に減らすことができる。そ扛ゆ
え、今まではバックグラウンドの中に埋もｎでいた弱い
シグナルも検出することができ、高感度に核酸全検出す
ることができる。
液ロブロッキング処理いることによって標識プローブの
膜への非特異成層全大幅に減らすことができる。そ扛ゆ
え、今まではバックグラウンドの中に埋もｎでいた弱い
シグナルも検出することができ、高感度に核酸全検出す
ることができる。
第１図は、酵素反応によって生成したフェノ−／１／に
検出するための高速液体クロマトグラフシステム？示す
図、第２図は１本発明に係るブロッキング処理の効果を
示す図、第３図は９本発明による処理を施してＭ１３η
ｍ Ｐｓ Ｓ５ ＤＮＡ ６Ｔ＋検出特性図である。
検出するための高速液体クロマトグラフシステム？示す
図、第２図は１本発明に係るブロッキング処理の効果を
示す図、第３図は９本発明による処理を施してＭ１３η
ｍ Ｐｓ Ｓ５ ＤＮＡ ６Ｔ＋検出特性図である。
Claims (1)
- （１）検体試料の核酸を膜に固定し、試料核酸の検出し
ようとする配列順序と実質的に相補な塩基配列を含む核
酸を試料核酸とハイブリダイズさせて、試料核酸の検出
を行なう方法において、 試料核酸の膜への固定後、この膜を０．０１〜３０Ｗ／
Ｖ％のＰＶＡまたは／及び０．０１〜３０Ｗ／Ｖ％のＰ
ＶＰを含有する溶液に浸してブロッキング処理すること
を特徴とする核酸の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27592888A JP2794728B2 (ja) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | 核酸の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27592888A JP2794728B2 (ja) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | 核酸の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02119800A true JPH02119800A (ja) | 1990-05-07 |
| JP2794728B2 JP2794728B2 (ja) | 1998-09-10 |
Family
ID=17562381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27592888A Expired - Lifetime JP2794728B2 (ja) | 1988-10-31 | 1988-10-31 | 核酸の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2794728B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010748A1 (en) * | 1994-10-03 | 1996-04-11 | Lifecodes Corporation | Methods and materials for detecting autoimmune antibodies |
| JP2005315785A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Canon Inc | プローブ固定担体およびその製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7534621B2 (en) | 2003-02-07 | 2009-05-19 | Canon Kabuhsiki Kashia | Method of producing probe medium and method of immobilizing probe using probe medium |
-
1988
- 1988-10-31 JP JP27592888A patent/JP2794728B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996010748A1 (en) * | 1994-10-03 | 1996-04-11 | Lifecodes Corporation | Methods and materials for detecting autoimmune antibodies |
| JP2005315785A (ja) * | 2004-04-30 | 2005-11-10 | Canon Inc | プローブ固定担体およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2794728B2 (ja) | 1998-09-10 |
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