JPH0989747A - 生体分子吸着層の動的界面張力測定法とこれに用いる測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 タンパク質等の生体分子を含む水溶液中
に試料板を所定時間浸せきさせた後、瞬間的に試料板の
一部を気相中に露呈させ、光干渉法で試料板に付着した
液膜の落下速度を測定し、該測定値より試料板表面の生
体分子吸着層の疎水性・親水性の判定、接触角並びに界
面張力の測定を行うタンパク質吸着層の動的界面張力測
定法とその装置。 【効果】 試料板をタンパク質等の生体分子を含む水溶
液中に浸せきさせることにより形成した生体吸着層の性
状を変化させることなく、生体吸着層の疎水性・親水性
の判定、接触角並びに界面張力の測定を行うことがで
き、このため生体物質と固体表面が関与する、食品、化
粧品、医科、歯科学などの広い分野で利用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、タンパク質等の生体
分子が固体表面吸着する際の表面吸着層の疎水性・親水
性の判定、接触角並びに界面張力の測定を、表面吸着層
を変性させずに測定できる方法と装置に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】現在、タンパク質等の生体分子が吸着し
た表面がもつ疎水性・親水性の尺度である界面張力を測
定するのには、通常、吸着層をもつ固体基板を乾燥後、
水滴や油滴を滴下して液滴の接触角を測定する方法が用
いられている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかし、乾燥による生
体物質の形状・性状変化は無視できないことが多い。特
に、大きな分子量を持ち、高次構造を有するタンパク質
の場合はこれ重要な問題である。

【０００４】また、固体表面に形成されたタンパク質等
の生体分子吸着層表面のもつ性状は、その上に更に他の
生体分子、細胞、細菌等が作用或は吸着する時に重要な
問題を生ずる。

【０００５】例えば、医学における生体適合材料の開発
に際しての材料の表面処理の問題、食品工業におけるプ
ロセス制御等の際のバイオ・センサー表面の性状変化の
問題、予防歯科におけるタンパク質吸着した歯に対する
バクテリヤの作用の問題等が生ずるが、従来の液滴法で
は固体表面に形成されたタンパク質等の生体分子吸着層
を一旦乾燥させた後、接触角等を測定するため、乾燥に
よって生体分子吸着層が変性することが考えられるの
で、液中で形成されたままの状態での生体分子吸着層表
面の性状測定ができない。

【０００６】液適法に依らない方法として、傾斜板法、
Wilhelmy板法等があるが、これらは喫水線や気相に接す
る生体分子吸着層表面からの液蒸発の問題を解決しなけ
ればならない。

【０００７】この他に、気泡法があるが、この場合は気
泡界面への生体分子吸着の問題を解決しなければならな
い。

【０００８】このように液中で形成されたままの状態で
の生体分子吸着層表面がもつ疎水性・親水性或は接触角
並びに界面張力を測定する有効な方法がないことから各
方面で本来必要とされるデータが報告されていないのが
現状である。

【０００９】そこで、この発明の課題は従来の界面張力
測定法で問題となる液の蒸発による吸着層の構造・性状
変化を防ぎ、液中でのそのままの状態でタンパク質吸着
層の疎水性・親水性の判定、接触角並びに界面張力を知
ることができる方法とその装置を開発することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明者は創意工夫研究の結果、この発明をなすに
至った。即ち、本願の第１発明としてはタンパク質等の
生体分子を含む水溶液中に試料板を所定時間浸せきさせ
た後、瞬間的に試料板の一部を気相中に露呈させ、光干
渉法で試料板に付着した液膜の落下速度を測定し、該測
定値より試料板表面の生体分子吸着層の疎水性・親水性
を判定する方法を提案するものである。

【００１１】また、本願の第２発明としては予め下記式
３に基づく検量線を作成し、

【式３】｛式中、Ａ、Ｂは定数、[ Δt/Δh_u］は水中に
試料板を挿入した後、瞬間的に試料板を水中より引き上
げた場合、試料表面の液膜の落下速度、θは試料板の接
触角｝

【００１２】次にタンパク質等の生体分子を含む水溶液
中に試料板を所定時間浸せきさせた後、瞬間的に試料板
の一部を気相中に露呈させ、光干渉法で試料板に付着し
た液膜の落下速度を測定し、該測定値より上記検量線を
利用して試料板の生体分子吸着層の接触角並びに界面張
力を求めるようにした方法を提案するものである。

【００１３】なお、この発明では測定に光の干渉縞パタ
ーンを用いるため液膜の空間的厚み分布の変化から生体
物質の吸着状態が把握できると共に測定の再現性を確認
でき測定の信頼度を上げることが可能となる特徴があ
る。

【００１４】この発明の原理は基板に沿った液膜の落下
速度が定常状態においては液膜に働く重力、液膜の粘性
力、液膜、気相、基板間の界面張力で決まることを用い
るものであり（図１参照）、これは下記式１で表すこと
ができる。

【００１５】

【式１】

【００１６】そして、式１を解くことにより下記式２を
導く出すことができ、簡便には下記式３が成立する。

【００１７】

【式２】

【００１８】

【式３】

【００１９】これらの式でｌは基板の幅、ｈは水面の高
さ、ｙは液膜の厚み方向の座標、ρは液体の密度、ｇは
重力加速度、γは空気／液体の界面張力、θは接触角、
Δは液膜の厚さ、μは粘性係数、dv/dy は液膜の厚さ方
向の速度勾配、h₀は観測点の水面からの高さ、k'は液膜
の表面での厚み方向の速度勾配、Δ^* はk'がゼロになる
場合の仮想厚みである。

【００２０】したがって、簡便には落下運動が定常状態
になった二点間距離を通過（落下）するに要する時間を
基板の表面に形成される生体分子吸着層等の疎水・親水
の指標とすることができる。

【００２１】また、上記式３に基づく検量線を作成し、
次にタンパク質を含む水溶液に基板を所定時間浸せきさ
せた後、瞬間的に基板を引き上げて基板表面の液膜の落
下速度を測定すれば、該測定値を基に上記検量線を利用
して基板表面に形成される生体分子吸着層等の接触角を
測定することができる。

【００２２】更に測定された接触角と気／水界面の表面
張力の値(72mN/m、常温) の積により上記タンパク質吸着
層等と液体相界面の界面張力の値を求めることができ
る。

【００２３】この発明に係る方法は以上の原理に基づく
ものであるが、この方法は基本的に動的測定法であり、
瞬時にサンプルを引き出し液膜の落下を測定するので極
めて落下速度が遅い場合を除き液の蒸発による影響はな
いという特徴を持つ。

【００２４】なお、試料板表面に形成された液膜の落下
速度の測定は光干渉法が有効であり、このうち透過法に
よる測定装置の概略を図２に、反射法による測定装置の
概略を図３に示す。

【００２５】図２に透過法による測定装置の概念図を示
す。図中、１はヘリウムイオンレーザー光源、２はスペ
イシャルフィルター、３はコリメーター、４はビームス
プレッター、５，６は反射鏡、７は試料セル、８はビー
ムスプリッター、９はレンズ系、10はビデオカメラ、11
はモニターテレビ及び画像解析器である。

【００２６】測定動作は、先ず試料板（通常ガラス板や
表面処理したガラス板）を液中に垂直に降ろし、溶液か
らの各種物質の吸着処理を行った後、溶液の入ったセル
７を瞬時に下げる。

【００２７】即ち、レーザー光源１からの光をスペイシ
ャルフィルター２とコリーメータレンズ３を通してビー
ムスプリッター４で二つに分岐し、一方をサンプルにあ
て、他方はそのままの参照光とした後、ビームスプリッ
ター８で混合し、シャリングモードによる干渉縞をビデ
オ画像として採録し、干渉縞の移動速度を計測する。

【００２８】このとき、干渉縞が不規則である場合は吸
着過程の初期段階で試料が表面に疎らに吸着しているこ
とを示す。落下運動が定常状態になった二点間距離を通
過（落下）するに要する時間を測定する。

【００２９】図３には反射法による装置の概念図を示
す。基本的には通過法と類似であるが、ビームスプリッ
ター16で分割した光を一方の試料板にあて、他方は参照
の反射鏡18にあて、両者より反射してきた光をビームス
プリッター16により混合し、形成される干渉縞をビデオ
カメラ20、画像解析器21を用いて液膜の落下運動を測定
する。

【００３０】

【実施例】

実施例１ 試料板として機械洗浄用洗剤を用い超音波照射による洗
浄で親水性表面をもつガラス板とこれを更にフッ素カチ
オン性界面活性剤で処理した疎水性表面をもつガラス、
フッ素系両イオン性界面活性剤で処理し中間の接触角を
もつガラス板の３つの種類を用意した。

【００３１】測定装置としては図２に示す通過法による
測定装置を使用し、セル７には水を入れ、上記試料板を
セル７中の水に挿入した後、瞬間的に引き上げて試料板
の表面に形成された液膜の落下時間を測定した。また、
上記試料板を乾燥後、その表面に水滴を滴下して液滴の
接触角を測定した。これらの結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】接触角が大きい疎水性基板の落下時間は短
く、接触角が小さい親水性の基板の落下時間は大きいこ
とが分かる。つまり、親水性表面は水分子を保持する力
が大きく、液膜の落下時間がかかり、疎水性基板は撥水
性であるため液膜の落下時間が短いということを端的に
表している。

【００３４】これらの値を，縦軸に［Δｔ／Δｈ_u ］、
横軸にｃｏｓθ［Δｔ／Δｈ_u ］にしてプロットする
と、図４のように直線関係が得られ、式３で導かれた理
論原理と一致することが明らかとなった。

【００３５】この図を検量線として接触角未知の溶液と
試料板について接触角並びに界面張力を測定することが
できる。具体的には接触角未知の溶液と試料板について
上述の方法で落下速度を測定し、図４の検量線の横軸か
ら落下速度と接触角の積が求められるので、これより接
触角を測定することができる。更に、界面張力の値は気
／水界面の表面張力の値(72mN/m、常温）と接触角の積に
より計算できる（f=72xcosθ) 。

【００３６】実施例２ 実施例１と同様な方法を高分子疎水化剤で処理した疎水
性ガラスに血清タンパク質であるアルブミンが吸着した
時の吸着膜表面の界面張力の測定に適用した例について
説明する。

【００３７】アルブミンは変性し易いタンパク質で固体
表面等への吸着に際しそのコンフォメーション変化を起
こす。特に、疎水性表面をもつ材料表面に対してその変
化も大きいことが言われている。しかし、水中で吸着し
た状態でその表面がもつ疎水性・親水性のデータは報告
されていない。このタンパク質は生体適合材料等の表面
処理にも利用される。その表面の性状を把握すること
は、更にその上への種々の物質の積層吸着の有無等に関
して極めて重要なことである。

【００３８】アルブミン水溶液（濃度1mg/ml) を準備
し、予め疎水化剤で処理し接触角約100 度を持つガラス
板を浸す。タンパク水溶液を撹拌した状態で浸せき時間
をいろいろ変えてタンパク溶液が入ったセルを瞬時に下
げ液膜が一定の距離を落下する時間を図２乃至図３に示
す方法で測定する。

【００３９】図５には落下時間と浸せき時間（吸着処理
時間）との関係に関する測定結果の一例である。タンパ
ク質の界面吸着現象の吸着飽和に到達する時間は一般に
数十分であるが、図は30分以上では落下時間が約60秒に
なることを示す。これは吸着アルブミン層表面が非常に
親水性であることを示す。

【００４０】図５のデータから図４の検量線を利用して
接触角及び界面張力を測定し、この結果を縦軸を接触
角、横軸を浸せき時間（吸着処理時間）としてプロット
したのが図６であり、縦軸を界面張力、横軸を浸せき時
間（吸着処理時間）としてプロットしたのが図７であ
り、図８は従来用いられている液適法で測定した接触角
と浸せき時間（吸着処理時間）の関係を示す参考図であ
る。

【００４１】図８では吸着時間30分後では約80度の接触
角を示す。これは、サンプルの表面がかなり疎水性にな
っていることを示している。つまり、従来の液滴法では
サンプルを液中から引き上げ乾燥させてから、水滴を滴
下して接触角を測定するため、サンプルの吸着タンパク
質表面が乾燥によって親水性から疎水性に変換されてし
まうことを示す。これに対して、この発明の方法ではサ
ンプルをタンパク質を含む溶液中に所定時間浸せきさせ
た後、瞬間的にサンプルを引き上げてその表面に形成さ
れた落下速度を測定してサンプルの吸着タンパク質層の
疎水・親水の判定をするため、溶液中でサンプル表面に
形成されたままの状態で吸着タンパク質層をもつ疎水・
親水の判定ができる。

【００４２】実施例３ 高分子疎水化剤で処理された疎水性基板への体内の粘性
タンパク質であるムチンと溶菌作用を持つ酵素リゾチー
ムの吸着挙動の観測にこの発明に係る方法を適用した例
について説明する。

【００４３】濃度の異なる２つのムチン水溶液（0.1mg/
mlと0.01mg/ml)及び２つのリゾチーム水溶液(1mg/ml と
0.001mg/ml) を用意し、疎水性ガラス板を浸す。タンパ
ク水溶液を撹拌した状態で浸せき時間をいろいろ変えて
タンパク溶液が入ったセルを瞬時に下げ液膜が一定の距
離を落下する時間を測定する。

【００４４】図９（ａ）（ｂ）は２つのサンプルに対す
る落下時間と浸せき時間（吸着処理時間）との関係に関
する測定結果の一例である。両濃度とも吸着飽和に達す
るまで、落下時間が徐々に増加することが示される。こ
のことは溶液の粘度は落下速度に支配的な影響は与えな
いことを示す。また、タンパク質の吸着量の増加と共に
表面が疎水性から親水性に変化することが判る。更に、
吸着の初期（浸せき時間が10分以下の領域）では光干渉
縞パターンが不規則であることが示され、吸着分子が縞
状になっていることも判定可能である。

【００４５】実施例４ ２種類のフッ素系界面活性剤（カチオン性と両イオン
性）で処理したガラス板に対する血清アルブミンの吸着
挙動にこの発明を適用した例を示す。

【００４６】濃度0.01mg/ml のアルブミン水溶液に界面
活性剤処理したガラス板を浸せきし、アルブミン水溶液
を撹拌した状態で浸せき時間をいろいろ変えてアルブミ
ン水溶液が入ったセルを瞬時に下げ液膜が一定の距離を
落下する時間を測定する。

【００４７】図１０は２種類の活性剤処理のサンプルに
対する落下時間と浸せき時間（吸着処理時間）との関係
に関する測定結果の一例である。両性界面活性剤処理液
へ吸着したサンプルの方がカチオン性活性剤で処理した
サンプルに比べより親水性の表面を持つことが示され
る。

【００４８】

【発明の効果】この発明によれば、液中で固体表面に吸
着した構造変形し易い生体物質層が持つ疎水・親水性
度、接触角並びに界面張力）をそのままの状態で知るこ
とができる。

【００４９】したがって、この発明は上述の生体物質層
上に更に他の生体分子、細胞、細菌等の作用或は吸着等
が重要な問題となる分野、その他タンパク質と固体材料
が接する多方面の分野での利用が期待される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 この発明の測定原理を示す図

【図２】 この発明の原理による透過法の装置の概略図

【図３】 この発明の原理による反射法の装置の概略図

【図４】 表１のデータを式３を用いてプロットして作
成した検量線図

【図５】 疎水化剤処理ガラス板上のアルブミン吸着層
の示す疎水・親水性指標としての落下時間と吸着処理時
間との関係図

【図６】 図５のデータから図４の検量線を基に計算し
た接触角と吸着処理時間との関係図

【図７】 図６の接触角を基に計算した界面張力の値と
吸着処理時間との関係図

【図８】 図５の実施例に対応する従来法（液滴法）に
よる接触角と吸着処理時間との関係図

【図９】 （ａ）はムチン吸着層の示す疎水・親水性指
標としての落下時間と吸着処理時間との関係図、（ｂ）
はリゾチーム吸着層の示す疎水・親水性指標としての落
下時間と吸着処理時間との関係図

【図１０】 ２種類の活性剤処理ガラスに対するアルブ
ミン吸着層の示す疎水・親水指標としての落下時間と吸
着処理時間との関係図

【符号の説明】

１，12はヘリウム・ネオン、レーザー光源 ２，13はスペイシャル・フィルター ３，14はコリメーター ４，８，16はビームスプリッター ５，６，15,18 は反射鏡 ７，17は試料セル ９，19はレンズ系 10,20 はビデオカメラ 11,21 はモニターテレビ・画像解析器

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 神原 正樹 大阪府中央区大手前１丁目５番31号 大阪 歯科大学内 (72)発明者 川崎 弘二 大阪府中央区大手前１丁目５番31号 大阪 歯科大学内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体分子を含む水溶液中に試料板を所定
   時間浸せきさせた後、瞬間的に試料板の一部を気相中に
   露呈させ、光干渉法で試料板に付着した液膜の落下速度
   を測定し、該測定値より試料板表面の生体分子吸着層の
   疎水性・親水性を判定することを特徴とする生体分子吸
   着層の動的界面張力測定法。
2. 【請求項２】 予め下記式３に基づく検量線を作成し、 【式３】 ｛式中、Ａ、Ｂは定数、[ Δt/Δh_u］は水中に試料板を
   挿入した後、瞬間的に試料板を水中より引き上げた場
   合、試料表面の液膜の落下速度、θは試料板の接触角｝ 次に生体分子を含む水溶液中に試料板を所定時間浸せき
   させた後、瞬間的に試料板の一部を気相中に露呈させ、
   光干渉法で試料板に付着した液膜の落下速度を測定し、
   該測定値より上記検量線を利用して試料板の生体分子吸
   着層の接触角並びに界面張力を求めるようにしたことを
   特徴とする生体分子吸着層の動的界面張力測定法。
3. 【請求項３】 生体分子を含む水溶液中に含浸してその
   表面に液膜を形成する試料板と、レーザー光源と、該レ
   ーザー光源からのレーザー光を分割するビームスプリッ
   ターと、分割されたレーザー光の一方を上記液膜を透過
   させた後に分割されたレーザー光の他方の光と合成して
   干渉縞を形成するビームスプリッターと、該干渉縞を採
   録するビデオカメラと、採録された干渉縞より液膜の落
   下の動きを観察する画像解析器とからなる生体分子吸着
   層の動的界面張力測定装置。
4. 【請求項４】 生体分子を含む水溶液中に含浸してその
   表面に液膜を形成する試料板と、レーザー光源と、該レ
   ーザー光源からのレーザー光を分割し、分割されたレー
   ザー光の一方を上記液膜に反射させた後に分割されたレ
   ーザー光の他方と合成して干渉縞を形成するビームスプ
   リッターと、該干渉縞を採録するビデオカメラと、採録
   された干渉縞より液膜の落下の動きを観察する画像解析
   器とからなる生体分子吸着層の動的界面張力測定装置。