JPH09511137A

JPH09511137A - Non-A non-B non-C non-D non-E hepatitis reagents and methods of their use

Info

Publication number: JPH09511137A
Application number: JP7521441A
Authority: JP
Inventors: シモンズ，ジヨン・エヌ; パイロツト−マテイアス，タミ・ジエイ; ドーソン，ジヨージ・ジエイ; シユラウダー，ジヨージ・ジー; デサイ，サーレツシユ・エム; リアリー，トマス・ピー; ミユーホフ，アンソニー・スコツト; エルカー，ジエイムス・カール; ビユイジク，シエリ・エル; マツシユアワー，イサ・ケイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1994-02-14
Filing date: 1995-02-14
Publication date: 1997-11-11
Anticipated expiration: 2019-10-27
Also published as: JP3848663B2; JP2005041862A; JPH10337193A; JP3580822B2

Abstract

(57)【要約】種々の診断及び治療用途に有用な肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）の核酸及びアミノ酸配列、ＨＧＢＶ核酸またはアミノ酸配列を使用するためのキット、ＨＧＢＶ免疫原性粒子、ＨＧＢＶに特異的に結合する抗体、及び、ＨＧＢＶ核酸またはアミノ酸配列からポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を製造する方法を提供する。 (57) [Summary] Hepatitis GB virus (HGBV) nucleic acid and amino acid sequences useful for various diagnostic and therapeutic applications, kits for using HGBV nucleic acid or amino acid sequences, HGBV immunogenic particles, antibodies that specifically bind to HGBV, and Methods of producing polyclonal or monoclonal antibodies from HGBV nucleic acid or amino acid sequences are provided.

Description

【発明の詳細な説明】非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎試薬及びそれらの使用方法発明の背景本発明は、ヒトにおいて肝炎を惹起する一群の感染性ウイルス性物質、特にかかるウイルス群から誘導されるポリヌクレオチド、それらにコードされるポリペプチド、かかるポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに、かかる材料を使用する診断薬及びワクチンに係わる。肝炎は、血液製剤の輸血、臓器移植及び血液透析によってドナーからレシピエントに感染される最も重要な疾患の１つである。また肝炎は、汚染された食物及び水の摂取や、人同士の接触によっても感染し得る。ウイルス性肝炎は固有のウイルス遺伝子及び複製モードを有する一群のウイルス性物質を含み、種々の感染経路で肝損傷の程度は様々であるが、肝炎を惹起することが知られている。急性ウイルス性肝炎は、黄痕、肝圧痛及び、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＳＤ）のごとき肝トランスアミナーゼレベルの上昇を含む特定の患者症状によって臨床診断される場合もあるが、臨床的に顕在化しないこともあり得る。ウイルス性肝炎物質としては、肝炎Ａ型ウイルス（ＨＡＶ）、肝炎Ｂ型ウイルス（ＨＢＶ）、肝炎Ｃ型ウイルス（ＨＣＶ）、肝炎δ型ウイルス（ＨＤＶ）、肝炎Ｅ型ウイルス（ＨＥＶ）、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）が挙げられる。１９６０年代後期に使用可能となった、献血血液をＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の存在についてスクリーニングする特異的血清アッセイは、血液レシピエントの輸血後肝炎（ＰＴＨ）の発生を低減させることにおいて良い結果を与えてはいるが、ＰＴＨは相変わらず有意な率で発生している。Ｈ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．７７：６９１−６９９（１９７２）；Ｈ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ｌａｎｃｅｔｉｉ：８３８−８４１（１９７５）。研究者らは、これまでヒトにおいて肝炎を惹起することが知られているウイルス（ＨＡＶ、ＨＢＡ、ＣＭＶ及びＥＢＶ）への暴露と関係なくウイルス性肝炎を惹起する、「非Ａ非Ｂ型肝炎」（ＮＡＮＢＨ）と名付けられた新規の物質を探し始めた。例えばＳ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，ＮｅｗＥｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２９２：７６７− ７７０（１９７５）；編者無記名，Ｌａｎｃｅｔｉｉ：６４−６５（１９７５）；Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓのＦ．Ｂ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ及びＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ２２３９ −２２７３（１９９０）参照。静脈内薬物使用者における急性ＮＡＮＢＨの多発性発症；輸血後ＮＡＮＢＨを獲得した患者の固有の感染後潜伏期間；チンパンジー交差攻撃（ｃｒｏｓｓ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）実験の結果；感染チンパンジーの超微細構造肝病理分析；及び疑似患者のクロロホルムに対する抵抗性の差など、幾つかの疫学的及び実験的な証拠により１種以上の非経口感染ＮＡＮＢ物質の存在が示されている。Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８５：４３９−４６２（１９８３）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ８５，７４３−７６８（１９８３）；Ｆ．Ｂ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４２：４００−４０７（１９８０）；Ｆ．ＣｈｉｓａｒｉのＤ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙ編，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＨｅｐａｔｉｔｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｍａｓｓｏｎ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２６８−２８０（１９８４）；及び、Ｄ．Ｗ．Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４８：２５４−２６５（１９８３）。急性肝炎を発症した外科医から得た血清試料は、タマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓｓｐｅｃｉｅｓ）に接種すると肝炎を誘発することが示された。４匹のタマリンのうち４匹ともが接種後数週間以内に肝酵素の上昇を生じ、これから、該外科医の血清中の物質がタマリンに肝炎を誘発した可能性があることが判る。種々の非ヒト霊長目動物において順次継代されることにより、この肝炎は感染性物質によって惹起されることが判り、濾過実験からはこの物質がウイルス性であることが示された。上記外科医及びタマリンにおいて肝炎の原因となった感染性物質は「ＧＢ物質（ＧＢａｇｅｎｔ）」と名付けられた。Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．１２５：６７３−６８８（１９６７）；Ｆ．Ｄｉｅｎｈａｒｄｔら，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄ．，前出；Ｅ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５：１０３−１０８（１９８０）；Ｒ．Ｏ．Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら，ＶｉｒａｌａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓｉｎＮｏｎｈｕｍａｎＰｒｉｍａｔｅｓ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，ｐｐ．２２１−２２４（１９８３）。ＧＢ物質はヒトにおいてＮＡＮＢＨを惹起する物質であり得ること、及びＧＢ物質は種々の実験室で研究された既知のＮＡＮＢＨ物質とは関連のないことが示されているが、ＧＢ物質に関する決定的な、また最終的な研究は知られておらず、ウイルス性物質は発見されていないし、分子学的に特性分析されてもいない。Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２７０：７３−８０（１９７５）；及びＪ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇら，Ｎａｔｕｒｅ２６４：２６０− ２６１（１９７６）。更にＥ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，前出；Ｅ．Ｔａｂｏｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１４０：７９４−７９７（１９７９）；Ｒ．Ｏ．Ｗｈｉｔｔｉｎｇｔｏｎら，前出；及びＰ．Ｋａｒａｙｉａｎｎｉｓら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ９：１８６−１９２（１９８９）参照。初期の研究では、ＧＢ物質はいかなる既知のヒト肝炎ウイルスとも無関係であるとされていた。Ｓ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ１８２：１０２６−１０２８（１９７３）；Ｐ．Ｊ．Ｐｒｏｖｏｓｔら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１４８；５３２−５３９（１９７５）；Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ１８：１０５−１０６（１９８２）；Ａ．Ｗ．Ｈｏｌｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ２４３：４１９−４２０（１９７３）；及び、Ｆ．Ｄｅｉｎｈａｒｄｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，前出。しかしながら、ＧＢ物質がヒトにおいて肝炎感染を誘発するウイルスであるのか、またはＧＢ血清によって活性化され、一旦活性化されると他のタマリンに容易に継代してそれらに肝炎を誘発する潜在的タマリンウイルスであるのかが問題とされた。また、ＧＢ陽性血清を接種されたマーモセットの極一部は臨床上肝炎を発症せず（５２匹のうち４匹，７．６％）、かかる動物は自然免疫を有していた可能性があり、従ってＧＢ物質はマーモセットウイルスであり得ることも示された。Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２０：５３９−５４７（１９６９）；Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２０：５４８−５５９（１９６９）。形態的研究は不明瞭であり、ある報告書の免疫電子顕微鏡調査では、ＧＢ物質は、パルボウイルスの球構造と類似の、寸法分布が２０〜２２ｎｍの免疫複合体を形成していると示されているが、他の研究では、ＧＢ陽性タマリンの肝ホモジネートから得られた免疫電子顕微鏡データから正二十面体対称構造の３４〜３６ｎｍの凝集体（ａｇｇｒｅｇａｒｅｓ）が検出され、ＧＢ物質はカリチ様ウイルスであると報告されている。例えばＪ．Ｄ．Ａｌｍｅｉｄａら，Ｎａｔｕｒｅ２６１：６０８−６０９（１９７６）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇら，Ｎａｔｕｒｅ，前出参照。主に非経口感染によって生じるＨＣＶと、腸内感染するＨＥＶとの２種類の肝炎を惹起するウイルスが最近になって発見され報告された。例えば、Ｑ．Ｌ．Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：３５９−３６２（１９８９），Ｇ．Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：３６２−３６４（１９８９），欧州特許出願公開第０３１８２１６号明細書（１９８９年３月３１日公開），Ｇ．Ｒ．Ｒｅｙｅｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３３５−１３３９（１９９０）参照。ＨＣＶは、ＮＡＮＢＨ物質が原因とみられるＰＴＨの大部分及び輸血によるものでない急性ＮＡＮＢＨの多くに関与している。編者無記名，Ｌａｎｃｅｔ３３５：１４３１−１４３２（１９９０）；Ｊ．Ｌ．Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ９９：１１７７−１１８０（１９９０）；及び、Ｍ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，ＪＡＭＡ２６４：２２３１−２２３５（１９９０）。ドナー試料中のＨＣＶ抗体を検出することにより、血液供給系におけるＮＡＮＢＨ感染血液の７０〜８０％が除外されるが、ＨＣＶの発見及び検出によって肝炎感染が完全に予防されているわけではない。Ｈ．Ａｌｔｅｒら，ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：１４９４−１５００（１９８９）。最近の文献で、別の肝炎物質がＰＴＨ、並びにＰＴＨと関連のない集団獲得急性及び／または慢性肝炎の原因であり得るかどうかが問題とされた。例えば、１９８８〜１９９０年にフランスで行われた予測臨床標本調査においてモニターとなった１８１人の患者のうち、調査人は全部で１８のＰＴＨ症例を記載している。これら１８人の患者のうちの１３人は、抗ＨＣＶ抗体、ＨＢｓＡｇ、ＨＢＶ及びＨＣＶ核酸について陰性であった。筆者らにはＰＴＨを惹起する非Ａ非Ｂ非Ｃ型物質の潜在的な重要性が推量された。Ｖ．Ｔｈｉｅｒｓら，Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１８：３４−３９（１９９３）。１９８５〜１９８８年にドイツで行われた別の調査でモニターとなった１，４７６人の患者のうち、記録された２２のＰＴＨ症例はＨＢＶまたはＨＣＶ感染とは関係なかった。Ｔ．Ｐｅｔｅｒｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３９：１３９−１４５（１９９３）。肝炎を惹起する新規の固有のウイルス群から誘導される物質、例えばポリヌクレオチド、そこにコードされている組換え及び合成ポリペプチド、かかるポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びにかかる物質を使用する診断薬及びワクチンを同定及び提供することは有利となろう。このような物質により、急性及び／または慢性ウイルス性肝炎をより正確に診断する医療機関の能力が著しく向上し、提供された血液及び臓器において非Ａ、非Ｂ及び非Ｃ型肝炎を検出することにより、より安全な血液及び臓器を供給し得るであろう。発明の要約本発明は、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）のゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイズし得るＨＧＢＶから誘導された精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントであって、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ− Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、より好ましくは４０％の一致率、更に好ましくは６０％の一致率、最も好ましくは８０％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする精製ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）のゲノムまたはその相補体に選択的にハイブリダイズし得るＨＧＢＶから誘導される組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメントも提供されるが、ここで、前記ヌクレオチドはＨＧＢＶの少なくとも１つのエピトープをコードする配列を含んでおり、前記組換えヌクレオチドは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。かかる組換えポリヌクレオチドは組換えベクター内に含まれ、更に前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を構成する。本発明は更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）ゲノムから誘導されるヌクレオチド配列を含むＨＧＢＶ組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメントであって、組換えベクター内に含まれ、更に前記ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を構成し、前記配列がＨＧＢＶのエピトープをコードするＨＧＢＶ組換えポリヌクレオチドまたはそのフラグメントを提供する。ＨＧＢＶ組換えポリヌクレオチドは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。本発明は、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）から誘導されるＤＮＡまたはＲＮＡの読取り枠を含む組換え発現系であって、前記読取り枠がＨＧＢＶゲノムまたはｃＤＮＡの配列を含んでおり、且つ前記読取り枠が所望の宿主と適合性のある制御配列に操作可能に結合されている組換え発現系を提供し、更に、前記組換え発現系を用いて形質転換された細胞及び、前記細胞によって産生される長さが少なくとも約８個のアミノ酸のポリペプチドを提供する。本発明は更に、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）ポリペプチドまたはそのフラグメントの調製物、即ち、ＨＧＢＶ− Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率、より好ましくは４０％の一致率、更に好ましくは６０％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む組換えポリペプチドを含む精製ＨＧＢＶを提供する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、並びに、少なくとも１種の肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む融合ポリペプチド、真核性または原核性宿主内で産生されたときに粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非ＨＧＢＶポリペプチドと、少なくとも１つのＨＧＢＶエピトープとを含む、肝炎ＧＢ（ＨＧＢＶ）感染に対して免疫原性である粒子、及び、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）に対するポリヌクレオチドプローブが提供される。少なくとも１つの肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）エピトープを含むポリペプチドを製造するためのアッセイキット及び方法であって、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも３５％の一致率を有するアミノ酸配列を含むポリプロテインをコードする読取り枠（ＯＲＦ）を含む正鎖ＲＮＡゲノムを特徴とするポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞をインキュベートすることからなるアッセイキット及び方法も提供される。更には、固相、組換えもしくは合成ペプチド、またはプローブを使用する方法を含む、検査試料中のＨＧＢＶ核酸、抗原及び抗体を検出する方法も提供される。更に、ワクチン、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）に感染させた組織培養増殖細胞、免疫応答を生じるのに十分な量の少なくとも１つのＨＧＢＶエピトープを含む単離免疫原性ポリペプチドまたはそのフラグメントを個体に投与することからなる、肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）に対する抗体を製造する方法も提供される。更に、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはこれらのフラグメントを含む診断試薬も提供される。図面の簡単な説明図１〜１２は、個々のタマリンの肝酵素（ＡＬＴまたはＩＣＤ）の量（ｍＵ／ｍｌ）を時間（接種後の週数）に対してプロットしたグラフである。グラフ中、ＡＬＴＣＯはＡＬＴのカットオフ値を示し、ＩＣＤＯＤはＩＣＤのカットオフ値を示している。ここで、図１はタマリンＴ−１０５３のグラフを示し、図２はタマリンＴ−１０４８のグラフを示し、図３はタマリンＴ−１０５７のグラフを示し、図４はタマリンＴ−１０６１のグラフを示し、図５はタマリンＴ−１０４７のグラフを示し、図６はタマリンＴ−１０４２のグラフを示し、図７はタマリンＴ−１０４４のグラフを示し、図８はタマリンＴ−１０３４のグラフを示し、図９はタマリンＴ−１０５５のグラフを示し、図１０はタマリンＴ−１０５１のグラフを示し、図１１はタマリンＴ−１０３８のグラフを示し、図１２はタマリンＴ−１０４９のグラフを示す。図１３は、クローンの同定に使用される代表相違分析（representational dif ference analysis，ＲＤＡ）に含まれるステップの流れ図を示す。図１４は、接種前及び急性ＨＧＢＶ感染タマリンの血漿に実施した代表相違分析（ＲＤＡ）で得られた生成物のエチジウムブロミド染色２．０％アガロースゲルを示す。図１５は、最初の３回の控除（subtraction）／ハイブリダイゼーションで得られた、ゲノムＤＮＡ、アンプリコン（amplicon）ＤＮＡ、及び産物のサザンブロットのオートラジオグラムを示す。図１６は、図１５に示したのと同じオートラジオグラムであるが、但し、別の放射性標識プローブを使用した。図１７は、ゲノムＤＮＡ由来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅産物のエチジウムブロミド染色１.５％アガロースゲルを示す。図１８は、図１７の１.５％アガロースゲルのサザンブロットで得られたオートラジオグラムを示す。図１９は、正常ヒト血清並びに接種前及び急性タマリン血漿から得られたＲＴ −ＰＣＲ産物のエチジウムブロミド染色１.５％アガロースゲルを示す。図２０は、図１９に示したのと同じゲルのサザンブロットで得られたオートラジオグラムを示す。図２１Ａ及びＢは、未感染タマリン及びＨＧＢＶ感染タマリンの肝臓から抽出された全細胞ＲＮＡのノーザンブロットのオートラジオグラムを示す。図２２は、各組換えポリヌクレオチド単離体が連続ＲＮＡ種に存在することを示す図である。図２３Ａ〜Ｃは、核酸配列のドットプロット分析を示す。ここで、図２３ＡはＨＧＢＶ−Ａのドットブロット比較を示し；図２３ＢはＨＧＢＶ−Ｂのドットブロット比較を示し；図２３ＣはＨＧＢＶ−Ａ対ＨＧＢＶ−Ｂのドットブロット比較を示す。図２４Ａ〜Ｂは、以下のような保存残基を示す。図２４Ａは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶ−１ＮＳ３の推定翻訳産物の推定ＮＴＰ結合ヘリカーゼドメインにおける保存残基を示し；図２４Ｂは、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＣＶ−１ＮＳ５ｂの推定翻訳産物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼドメインの保存残基を示す。図２５Ａ〜Ｂは、ＣＫＳ融合タンパク質全細胞溶解物のクーマシー染色１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを示す。３つのＣＫＳ融合タンパク質がＨＧＢＶ感染タマリン血清に対して免疫反応性を示している。図２６〜３０は、個々のタマリンの、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１. ４組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白丸で示す）；４）ＣＫＳ−４.１組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた＋で示す）；５）配列番号２１のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の四角で示す）；６）配列番号２１のプライマーを使用した陽性ＰＣＲ結果（中黒の四角で示す）；７）配列番号２６のプライマーを使用した陰性ＰＣＲ結果（中白の菱形で示す）；８）配列番号２６のプライマーを使用した陽性ＰＣＲ結果（中黒の菱形で示す）；９）接種データ（矢頭で示す）をプロットしたグラフである。ここで、図２６はタマリンＴ−１０４８のグラフを示し；図２７はタマリンＴ−１０５７のグラフを示し；図２８はタマリンＴ−１０６１のグラフを示し；図２９はタマリンＴ−１０５１のグラフを示し；図３０はタマリンＴ−１０３４のグラフを示す。図３１〜３４は、ヒト検査試料の、１）時間（接種後の週数）に対する肝酵素（ＡＬＴ）の量（ｍＵ／ｍｌ）（実線で示す）；２）ＣＫＳ−１.７組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた黒丸で示す）；３）ＣＫＳ−１.４組換えタンパク質のＥＬＩＳＡ吸収値（点線で結ばれた白丸で示す）をプロットしたグラフである。ここで、図３１は患者１０１のグラフを示し；図３２は患者２５７のグラフを示し；図３３は患者２６０のグラフを示し；図３４は患者３４０のグラフを示す。図３５は保存残基を示す。ここで、図３５Ａは、Ｃｏｎｔｉｇ．Ａ、Ｃｏｎｔｉｇ．Ｂ及びＨＣＶ−１ＮＳ３の推定翻訳産物の推定ＮＴＰ結合ヘリカーゼドメインの保存残基を示し；図３５Ｂは、Ｃｏｎｔｉｇ．Ａ、Ｃｏｎｔｉｇ．Ｂ及びＨＣＶ−１ＮＳ５ｂの推定翻訳産物のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼドメインの保存残基を示す。図３６は、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃ及びＨＣＶ−１のヌクレオチドの整列を示す。図３７は、ＧＢ−Ｃ由来の放射性標識プローブを用いてハイブリダイズした後のＰＣＴ産物のサザンブロットから得られたＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を示す。図３８は、ＨＧＢＶ−Ｃと２種の変種クローンとのヌクレオチド整列を示す。図３９は、ＨＧＢＶ−Ｃの集成後のＣｏｎｔｉｇの概略を表わす。図４０は、ＨＧＢＶ−Ｃと４種の変種クローンとのヌクレオチド整列を示す。図４１は、カナダ人患者ＧＢ−Ｃ.５.由来の放射性標識プローブを用いてハイブリダイズした後のカナダ人肝炎患者から生成されたＰＣＴ産物のサザンブロットのＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を示す。図４２は、記載のウイルスのヘリカーゼドメインの整列から生成された系統樹を示す。図４３は、ＳＣＯＴＴ、記載のウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼドメインの整列から生成された系統樹を示す。図４４は、記載のウイルスの大読取り枠（推定前駆体ポリプロテイン）の整列から生成された系統樹を示す。発明の詳細本発明は、新たに確認された病因物質である非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、及び非Ｅ型肝炎を惹起する物質、総称して「肝炎ＧＢウイルス」または「ＨＧＢＶ」の特性分析法を提供する。本発明は、ＨＧＢＶ病因物質の存在を判定する方法、ＨＧＢＶに感染したヒトまたはタマリンの個体由来の感染血清、血漿または肝ホモジネートから生成された病因物質の核酸を得、これまでに単離されていないウイルス性物質のゲノムから新たに合成される抗原を検出し、非感染個体と比較して感染個体のみに認められる生成物を産生したクローンを選択する方法を提供する。ＨＧＢＶから誘導される核酸配列の部分は、検査試料中のＨＧＢＶの存在を判定するため、及び天然変種を単離するためのプローブとして有用である。かかる配列により、ＨＧＢＶゲノム内にコードされているＨＧＢＶ抗原のポリペプチド配列を得ることもできるし、診断試験の標準または試薬として及び／またはワクチンの成分として有用なポリペプチドを製造することもできる。かかるポリペプチド配列内に含まれる少なくとも１つのエピトープに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体もまた、診断試験及び治療薬に、抗ウイルス性物質のスクリーニングに、かかる核酸配列が誘導されるＨＧＢＶ物質の単離に有用である。ＨＧＢＶゲノムのその他の部分の単離及び配列決定も、かかる核酸配列から誘導されるプローブまたはＰＣＲプライマーを使用することにより行うことができ、従って、ＨＧＢＶの診断及び／または治療において予防薬及び治療薬として有用となろうＨＧＢＶの別のプローブ及びポリペプチドを製造することができる。本発明の１つの態様によれば、精製ＨＧＢＶポリヌクレオチド、組換えＨＧＢＶポリヌクレオチド、ＨＧＢＶゲノムから誘導された配列を含む組換えポリヌクレオチド、ＨＧＢＶのエピトープをコードする組換えポリペプチド、ＨＧＢＶのエピトープをコードする合成ペプチド、上記組換えポリペプチドのいずれかを含む組換えベクター、及び、かかるベクターを用いて形質転換された宿主細胞が提供される。これらの組換えポリペプチド及び合成ペプチドは単独でも組合せても使用することができるし、或いは、ＨＧＢＶのエピトープを与える他の物質と一緒に使用することもできる。本発明の別の態様においては、精製ＨＧＢＶ、精製ＨＧＢＶ由来のポリペプチドの調製物、精製ＨＧＢＶポリペプチド、ＨＧＢＶに含まれるエピトープと免疫学的に同一であるエピトープを含む精製ポリペプチドが提供される。本発明の更に別の態様においては、所望の宿主と適合性である制御配列に操作可能に連結されている、ＨＧＢＶゲノムまたはＨＧＢＶｃＤＮＡから誘導されたＤＮＡの読取り枠（ＯＲＦ）を含む組換え発現系、該組換え発現系を用いて形質転換された細胞、及び、該形質転換細胞によって産生されたポリペプチドが提供される。本発明の別の態様は、少なくとも１つの組換えＨＧＢＶポリペプチド、ＨＧＢＶゲノムまたはＨＧＢＶｃＤＮＡから誘導された配列を含む少なくとも１つの組換えポリペプチド、ＨＧＢＶエピトープを含む少なくとも１つの組換えポリペプチド、ＨＧＢＶポリペプチドを含む少なくとも１つの融合ポリペプチドを含む。更に本発明は、ＨＧＢＶの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を製造する方法、少なくとも１つのＨＧＢＶエピトープに特異的に結合するポリクローナル抗体の精製調製物、並びに、診断、予防及び治療用途を含む、かかる抗体を使用する方法を提供する。本発明の更に別の態様においては、真核性宿主中で産生されたときに粒子を形成し得るアミノ酸配列を有する非ＨＧＢＶポリペプチドと、ＨＧＢＶエピトープとを含む、ＨＧＢＶ感染に対して免疫原性の粒子が提供される。更に、ＨＧＢＶに対するポリヌクレオチドプローブも提供される。本発明は、適当な容器に入った、ＨＧＢＶから誘導されたポリヌクレオチトの存在及び／または量を検出するために使用し得る試薬であって、約８個またはそれ以上のヌクレオチドからなるＨＧＢＶ由来のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドプローブを含む試薬；適当な容器に入った、ＨＧＢＶ抗原の存在及び／または量を検出するための試薬であって、検出すべきＨＧＢＶ抗原に対する抗体を含む試薬；及び、適当な容器に入った、ＨＧＢＶ抗原に対する抗体の存在及び／または量を検出するための試薬であって、ＨＧＢＶ抗原中に存在するＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドを含む試薬を含むキットを提供する。種々のアッセイ形式のための他のキットも本明細書に記載の本発明によって提供される。本発明の他の態様として、固相に付着された少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドと、固相に付着されたＨＧＢＶエピトープに対する抗体とが挙げられる。更に、ＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、該ポリペプチドの発現が可能となる条件下でインキュベートすることからなる、ＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドを製造する方法と、該方法によって製造されたＨＧＢＶエピトープを含むポリペプチドも本発明に含まれる。本発明は更に、本発明の組換えまたは合成ポリペプチド及び本発明の抗体を、いずれもシグナル生成化合物を使用し得る種々の形式で使用するアッセイを提供する。検出手段を与えるためのシグナル生成化合物を使用しないアッセイも提供される。記載の全てのアッセイは、通常は抗原もしくは抗体のいずれかまたは両方を検出するものであり、検査試料を少なくとも１種の本発明の試薬と接触させて少なくとも１種の抗原／抗体複合体を形成させ、該複合体の存在を検出することを含む。かかるアッセイについては詳述する。ＨＧＢＶエピトープを含む免疫原性ペプチド、もしくはＨＧＢＶの不活化調製物、もしくはＨＧＢＶの弱毒化調製物を含むＨＧＢＶ感染治療用ワクチン、または、ＨＧＢＶエピトープを発現する組換えワクチンの使用、並びに／または合成ペプチドの使用も本発明に含まれる。有効なワクチンにはこれらの免疫原性ペプチドの組合せが使用され得る（例えば、組換え抗原、合成ペプチド及び天然ウイルス性抗原のカクテルが同時にまたは異なる時点で投与される）。これらのなかには、単独で使用し得るものもあるし、後で免疫原性エピトープを別に与えて補い得るものもある。更に本発明には、ＨＧＢＶに対する抗体を産生させる方法であって、個体に、接種個体において免疫応答を生起するのに十分な量のＨＧＢＶエピトープを含む単離免疫原性ポリペプチドを投与することからなる方法も含まれる。更に、ＨＧＢＶに感染した組織培養増殖細胞も本発明によって提供される。本発明の更に別の態様においては、同定されていない感染性物質のゲノムから誘導されたＤＮＡまたはｃＤＮＡを単離する方法が提供されるが、該方法は代表相違分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ，ＲＤＡ）の他に類のない改良方法であって、これについては後述する。定義本明細書において使用される「肝炎ＧＢウイルス」または「ＨＧＢＶ」なる用語は、ヒトにおいて非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎を惹起するウイルス種、及びそれらから誘導される弱毒化株または欠陥干渉粒子を総称的に示す。これには更に、汚染された食物、飲料水などによって感染された急性ウイルス性肝炎；（性行為、呼吸及び非経口経路伝染を含む）人同士の接触または静脈内薬物使用によって感染されるＨＧＢＶに起因する肝炎も含まれる。本発明方法により、ＨＧＢＶを獲得した個体の同定が可能となる。個々には、ＨＧＢＶ単離体を特に「ＨＧＢＶ−Ａ」、「ＨＧＢＶ−Ｂ」及び「ＨＧＢＶ−Ｃ」と表記する。本明細書においてＨＧＢＶゲノムはＲＮＡからなる。ＨＧＢＶのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列の分析から、このウイルス群はＦｌａｖｉｒｉｄａｅファミリーと類似のゲノム構成を有することが明らかである。絶対的ではないが、基本的には、ゲノム構成の類似性に基づき、ｔｈｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｎｔｈｅＴａｘｏｎｏｍｙｏｆＶｉｒｕｓｅｓは、このファミリーがＦｌａｖｉｖｉｒｕｓ、Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ及び肝炎Ｃ型グループの３つの属からなると勧告している。アミノ酸レベルでの類似性を探すと、肝炎ＧＢウイルスサブクローンの配列は、少しではあるが一部が肝炎Ｃ型ウイルスのものと類似であることが判る。ここで与えられる情報は、ＨＧＢＶの他の株を分類するのに十分である。ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの一遺伝子型ではないことを示す幾つかの証拠が挙がっている。第１に、ＨＧＢ−Ｃ配列を含む血清においてＨＣＶ抗体の存在を試験した。ＨＣＶに暴露されたかまたは感染した個体の常套検出方法は、ＨＣＶ−１由来の３つ以上の領域から誘導される抗原を使用する抗体試験に依存する。かかる試験により、ＨＣＶの既知の遺伝子型に対する抗体を検出し得る（例えばＳａｋａｍｏｔｏら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７６１−１７６８（１９９４）及びＳｔｕｙｖｅｒら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０９３−１１０２（１９９３）参照）。ＨＣＶ特異的ＥＬＩＳＡでは８つのうち６つのケースでＧＢ−Ｃ配列を含む血清を検出できなかった。第２に、ＨＣＶ抗体に対して血清反応陰性の幾つかのヒト血清は、高感度ＲＴ−ＰＣＲアッセイによるとＨＣＶゲノムＲＮＡに対して陽性であることが判った（Ｓｕｇｉｔａｎｉ，Ｌａｎｃｅｔ３３９：１０１８−１０１９（１９９２））。このアッセイでは、ＨＧＢ−Ｃ配列を含む８つの血清のうち７つでＨＣＶＲＮＡを検出できなかった（表Ａ）。即ち、血清学的アッセイ及び分子学的アッセイのいずれによってもＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの一遺伝子型ではない。ヘリカーゼ領域内のＨＧＢ−Ｃの推定翻訳産物の一部をＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＣＶ−１、及びＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅの別のメンバーの相同領域と並べ、一致した配列を系統発生学的に分析すると、ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶグループの他のメンバーよりＨＧＢＶ−Ａに密接に関係することが判る。進化距離（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｄｉｓｔａｎｃｅ）０．４２を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ａの配列は、進化距離０．９２を示すＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ｂほどは離れていない（表３３、後記）。即ち、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−ＣはＧＢウイルスの１つのサブグループのメンバーであり、ＨＧＢＶ−Ｂはそれ自体で１つのサブグループのメンバーであると考えられる。種々のＨＣＶ単離体由来のヘリカーゼ配列を系統発生学的に分析すると、それらは、最大進化距離が０．２０である分岐の小さいグループを形成していることが判る（表３２、後記）。ＨＣＶグループとＨＧＢＶグループとを比較すると、各グループからの任意の２つの配列の最小進化距離は０．６９であることが判る。上記の距離の値を使用し、図４２に表す系統樹を作成した。これらのウイルスの分岐度が比較的高いことから、ＧＢウイルスは単に肝炎Ｃ型グループ内のタイプまたはサブタイプをなすのではなく、独自の系統発生学的グループを構成することが判る。ＨＣＶウイルスゲノムの小部分から誘導される配列情報を使用した系統発生学的分析は、新規の単離体を遺伝子型グループに割当てる容認可能な方法であることが示されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１９：１３２１−１３２４（１９９４））。最近の分析では、代表的なＨＣＶ単離体由来のヘリカーゼ遺伝子内の１１０個のアミノ酸からなる配列を使用すれば、それらは、それぞれの遺伝子型に適当に分類される（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１０５３−１０６１（１９９４））。従って、示された進化距離は、多分、ＧＢウイルスと肝炎Ｃ型ウイルスとの高度の分岐を正しく反映している。先行特許出願において、「ＨＧＢＶ株はポリペプチドレベルで同定可能であり、ＨＧＢＶ株はポリペプチドレベルで４０％以上が相同、好ましくは約６０％以上が相同、更に好ましくは約８０％以上が相同である」と述べられていた。「相同」なる用語は、使用されてはいるが、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関連の度合いを示す場合に曖昧であり、実際には進化上の関連性を示唆するものである。当分野の最近の慣例によれば、「相同性」なる用語はもはや使用されず、代わりに、「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」及び／または「一致性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」なる用語を使用して２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の関連の度合いを示している。アミノ酸配列の「類似性」及び／または「一致性」を決定する方法は当分野において公知であるが、例えば、アミノ酸配列を直接決定し、それを本明細書に与えられた配列と比較したり、推定ＨＧＢＶのゲノム材料のヌクレオチド配列を（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）決定し、そこにコードされているアミノ酸配列を決定し、対応領域を比較するなどが挙げられる。通常、「一致性」とは、各ゲノム上の適当な場所においてＨＧＢＶのヌクレオチド配列と別の株のヌクレオチド配列、またはＨＧＢＶのアミノ酸配列と別の株のアミノ酸配列が正確に一致することを意味する。通常、「類似性」とは、適当な場所においてＨＧＢＶのアミノ酸配列と別の株のアミノ酸配列が正確に一致することを意味するが、その場合、アミノ酸は同一または類似の化学的及び／または物理的特性、例えば電荷または疎水性を有する。（ｔｈｅＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，５３７１１から入手可能な）ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ，バージョン８において使用可能なプログラム、例えばＧＡＰプログラムにより、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの配列間の一致率及び類似率を計算し得る。２つの配列間の一致率及び類似率を計算する他のプログラムも当分野において公知である。更に、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃの株を同定することにおいて、以下のパラメーターを単独または組合せて使用し得る。ＨＧＢＶ株は好ましくは約６０％以上、より好ましくは約８０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられることから、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃとこれらの肝炎ＧＢウイルスの１つの株との間のヌクレオチド配列全体の一致率は約４５％以上であると推定される。更に、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約８０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられることから、ＨＧＢＶ−ＡのゲノムとＨＧＢＶ−Ａのある株のゲノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は約３５％以上であろうと推定される。更に、２つ以上の連続配列の組合せで与えられているであろう、少なくとも約１３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。また、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約８０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられることから、ＨＧＢＶ−ＢのゲノムとＨＧＢＶ−Ｂのある株のゲノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は約３５％以上であると推定される。更に、２つ以上の連続配列の組合せで与えられているであろう、少なくとも１３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。また、ＨＧＢＶ株は好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、更に好ましくは約８０％以上の遺伝的関連性があり得ると考えられることから、ＨＧＢＶ−ＣのゲノムとＨＧＢＶ−Ｃのある株のゲノムとのアミノ酸レベルでの配列全体の一致率は約３５％以上であろうと推定される。更に、２つ以上の連続配列の組合せで与えられているであろう、少なくとも約１３ヌクレオチドからなる対応連続配列がある。本発明の組成物及び方法により、ＨＧＢＶ及びその存在し得る株の増殖、同定、検出及び単離が可能となる。更に本発明の組成物及び方法により、ＨＧＢＶの存在し得る種々の株に対する診断薬及びワクチンの製造が可能となり、抗ウイルス性物質のスクリーニング処理に有用となる。情報は、ウイルス分類学者が該種に属する他の株を同定するのに十分となろう。本発明者らは、ＨＧＢＶが本明細書に含まれる配列をコードすると考えている。かかる配列の存在をアッセイする方法は当分野において公知であり、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びハイブリダイゼーションといった増幅方法が挙げられる。更に、かかる配列は、免疫原性ウイルスエピトープを見い出し得る読取り枠を含む。このエピトープは、他の既知の肝炎誘発ウイルスと比較し、ＨＧＢＶに固有である。エピトープの固有性は、ＨＧＢＶに対する免疫学的反応性と、肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型ウイルスに対する免疫学的反応性の欠如とによって判定し得る。免疫学的反応性を判定する方法は当分野において公知であり、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、血球凝集反応（ＨＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が挙げられるが、適当な方法の幾つかの例を本明細書に記載する。特定の配列、例えばＨＧＢＶｃＤＮＡまたはＨＧＢＶゲノム「から誘導された」ポリヌクレオチドとは、特定のヌクレオチド配列の領域に対応する、即ち類似であるかまたは相補的である、おおよそ少なくとも約６個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約１５〜２０個のヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチド配列を指す。ポリヌクレオチドを誘導する領域の配列は、ＨＧＢＶゲノムに固有の配列に類似または相補的であるのが好ましい。配列がＨＧＢＶゲノムに固有の配列に相補的または類似であるか否かは、当業者には公知の方法で判断し得る。特定の配列の固有性を決定する方法として、例えばデータバンクにある配列との比較を行い得る。配列を誘導し得る領域としては、限定的ではないが、特異的エプトープをコードする領域、並びに非翻訳及び／または非転写領域が挙げられる。誘導ポリヌクレオチドは必ずしもＨＧＢＶのヌクレオチド配列から物理的に誘導される必要はなく、限定的ではないが、ポリヌクレオチドを誘導する領域の塩基配列により与えられる情報に基づいた化学的合成、複製、または逆転写もしくは転写を含む任意の方法で生成し得る。更に、特定の配列に対応する領域の組合せは、当分野において公知の方法で所期の用途に応じて変更し得る。特定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから誘導される「ポリペプチド」または「アミノ酸配列」とは、配列内にコードされているポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または、少なくとも３〜５個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、更に好ましくは１５〜２０個のアミノ酸からなり、配列内にコードされているポリペプチドと免疫学的に一致し得る前記ポリペプチドの一部を指す。本明細書において使用される「組換えポリペプチド」とは少なくとも、起源または操作によって、天然もしくはライブラリーの形態で関連するポリペプチドの全部または一部と関連せず、及び／またはそれが天然で結合しているもの以外のポリヌクレオチドに結合している、ゲノム、半合成または合成のポリペプチドを意味する。組換えまたは誘導ポリペプチドは必ずしもＨＧＢＶの特定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから翻訳される必要はない。組換えまたは誘導ポリペプチドは、化学的合成もしくは組換え発現系の発現、または突然変異ＨＧＢＶからの単離を含む任意の方法で生成することもできる。本明細書において使用される「合成ペプチド」なる用語は、当業者には公知の方法で化学的に合成し得る、任意の長さの重合形態のアミノ酸を意味する。かかる合成ペプチドは種々の用途に有用である。本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」なる用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれかの任意の長さの重合形態のヌクレオチドを意味する。この用語は分子の一次構造のみを指す。従って該用語には、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ並びに二本鎖及び一本鎖ＲＮＡが含まれる。更に、メチル化及び／またはキャップ付加による修飾形態のポリヌクレオチド、並びに未修飾形態のポリヌクレオチドも含まれる。「ｃＤＮＡに対応する配列を含むＨＧＢＶ」とは、ＨＧＢＶが、特定のＤＮＡ内の配列と類似または相補的なポリヌクレオチド配列を含むことを意味する。該ｃＤＮＡに対する類似または相補の程度は約５０％以上、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％である。対応する配列の長さは少なくとも約７０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８０ヌクレオチド、更に好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチドである。ＨＧＢＶとｃＤＮＡの対応は当分野において公知の方法によって決定し得るが、例えば、配列決定した物質を記載のｃＤＮＡと直接比較したり、ハイブリダイズし一本鎖ヌクレアーゼにより消化し、消化されたフラグメントのサイズを決定することなどが挙げられる。「精製ウイルスポリヌクレオチド」とは、ウイルスポリヌクレオチドが天然で関連するポリペプチドを実質的に含まない、即ちその約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含まないＨＧＢＶゲノムまたはそのフラグメントを指す。ウイルスポリヌクレオチドを精製する方法は当分野において公知であり、例えば、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤を用いて粒子を破壊し、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度沈降によってポリヌクレオチド及びポリペプチドを分離することが挙げられる。「精製ウイルスポリペプチド」とは、ウイルスポリペプチドが天然で関連する細胞成分を実質的に含まない、即ちその約５０％未満、好ましくは約７０％未満、より好ましくは約９０％未満を含まないＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。精製方法は当業者には公知である。本明細書において使用される「ポリペプチド」とはアミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さ産物を指すものではない。従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。しかしながらこの用語には、ポリペプチドの発現後の修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などは含まれないものとする。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、及び単細胞物質として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他の同様の用語は、組換えベクターまたは他の移入ＤＮＡのレシピエントとして使用され得る、または使用された細胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の本来の子孫をも含む。本明細書において使用される「レプリコン」とは、細胞内でポリヌクレオチド複製の自立単位として挙動する、プラスミド、染色体またはウイルスといった任意の遺伝子エレメントを意味する。即ちレプリコンはそれ自体の制御下で複製し得る。「ベクター」は、別のポリヌクレオチドセグメントが複製及び／または発現し得るように付加されたレプリコンである。「制御配列」なる用語は、それらが結合しているコーディング配列の発現を行うのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。制御配列の特性は宿主生物に応じて異なる。原核細胞においては制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターを含み、真核細胞においては制御配列は一般にプロモーター、ターミネーター、及び場合によってはエンハンサーを含む。従って「制御配列」なる用語は、少なくともその存在が発現に必要な全ての成分を含んでいるものとし、更には、存在すれば有利な追加成分、例えばリーダー配列を含んでもよい。「操作可能に結合された」とは、上記成分が予定通りに機能し得る関係にある状況を指す。従って例えば、コーディング配列に「操作可能に結合された」制御配列は、制御配列に適合する条件下でコーディング配列の発現が行われるように連結されている。「読取り枠」または「ＯＲＦ」なる用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を指す。この領域はコーディング配列の一部または全コーディング配列を与え得る。「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれたときにｍＲＮＡに転写される、及び／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５’末端にある翻訳開始コドンと３’末端にある翻訳終結コドンとによって決定される。コーディング配列としては、限定的ではないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えポリヌクレオチド配列が挙げられる。「〜を用いて／として免疫学的に同定可能な」なる用語は、特定のポリペプチド、通常はＨＧＢＶタンパク質中に存在し、これに固有であるエピトープ及びポリペプチドが存在することを指す。免疫学的な一致（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、抗体結合及び／または結合の競合によって判定し得る。かかる方法は当業者には公知であるし、本明細書にも記載される。エピトープの固有性は、公知のデータバンク、例えばＧｅｎＢａｎｋにおいてエピトープをコードするポリヌクレオチド配列をコンピューター検索するか、または他の既知のタンパク質とアミノ酸配列を比較することにより判定し得る。本明細書において使用される「エピトープ」とはポリペプチドの抗原決定基を意味する。恐らく、エピトープは、３個のアミノ酸をそのエピトープに固有の空間的配置で含み得る。通常エピトープは少なくとも５個のこのようなアミノ酸からなり、より一般的には少なくとも８〜１０個のアミノ酸からなる。空間的配置を調査する方法は当分野において公知であり、例えばＸ線結晶分析及び２次元核磁気共鳴が挙げられる。ポリペプチド内に含まれる特定のエピトープを抗体が認識したことから抗体に結合するとき、該ポリペプチドは該抗体に対して「免疫学的に反応性である」。免疫学的反応性は、抗体結合、特に抗体結合速度、及び／または、該抗体に対するエピトープを含む既知のポリペプチドを競合物質として使用する結合の競合によって判定し得る。ポリペプチドが抗体に対して免疫学的に反応性であるかどうかを決定する方法は当分野において公知である。本明細書において使用される「ＨＧＢＶエピトープを含む免疫原性ポリペプチド」なる用語は、天然ＨＧＢＶポリペプチドまたはそのフラグメント、並びに、他の手段、例えば化学的合成または組換え微生物中でのポリペプチドの発現によって製造されたポリペプチドを意味する。「形質転換」なる用語は、挿入方法に関係なく、外来ポリヌクレオチドを宿主細胞中に挿入することを指す。例えば、直接取込み、形質導入またはｆ−交配（ｆ−ｍａｔｉｎｇ）が含まれる。外来ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えばプラスミドとして維持することもできるし、或いは、宿主ゲノム中に組込むこともできる。「治療」とは予防及び／または加療を指す。本明細書において使用される「個体」なる用語は、動物、特に哺乳動物種のものを指し、限定的ではないが、家畜、競技用動物、霊長目及びヒトを含むが、特に該用語はタマリン及びヒトを指す。本明細書において使用される「正鎖」（または「＋」）は、ポリペプチドをコードする配列を含む核酸を示す。「負鎖」（または「−」）は、「正」鎖の配列と相補的な配列を含む核酸を示す。ウイルスの「陽性鎖ゲノム」は、ＲＮＡであろうとＤＮＡであろうと、ゲノムが一本鎖であり、ウイルスポリペプチドをコードすることを示す。「検査試料」とは、被分析物（例えば問題の抗体または問題の抗原）のソースとなる個体の成分を指す。かかる成分は当分野において公知である。検査試料には本発明の方法によって試験し得る生物試料が含まれるが、ヒト及び動物の体液、例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液、並びに、呼吸管、胃腸管及び尿生殖管の種々の外分泌物、涙、唾液、乳、白血球、ミエローマなど、並びに、生物学的液体、例えば細胞培養液上清、固定組織試料、固定細胞試料が挙げられる。「精製ＨＧＢＶ」とは、ウイルスが通常関連する細胞構成物質、及び感染組織中に存在し得る他のタイプのウイルスから単離されたＨＧＢＶの調製物を指す。ウイルスを単離する方法は当業者には公知であり、例えば遠心及びアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。「ＰＮＡ」は、ある処理、例えばターゲットの存在を判定するようなアッセイに使用し得る「ペプチド核酸類縁物」を指す。ＰＮＡは、ＲＮＡターゲットまたはＤＮＡに対する電気的に中性の物質である。例えばＤＮＡプローブの代わりにアッセイに使用されるＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブを使用したときには得られない利点を与える。かかる利点としては、製造可能性、大規模標識、再現性、安定性、イオン強度の変化に対する低感度性、及び、ＤＮＡまたはＲＮＡを使用する方法に存在する酵素分解に対する抵抗性が挙げられる。ＰＮＡは、フルオレセイン、放射性核種、化学発光化合物などのシグナル生成化合物で標識することができる。このようにＰＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡの代わりに方法に使用し得る。本明細書にはＤＮＡを使用するアッセイを記載するが、必要であればアッセイ試薬を適当に変更し、ＰＮＡをＲＮＡまたはＤＮＡの代わりに使用することも常法の範囲内である。一般用途本発明の特定の組換えタンパク質、合成ペポチド、または精製ウイルスポリペプチドを製造したならば、その組換えまたは合成ペプチドを使用し、ＨＧＢＶに対する抗原または抗体の存在を検出する本明細書に記載のごとき固有のアッセイを開発することができる。またかかる組成物を使用し、所望するＨＧＢＶの免疫学的エピトープに特異的に結合する特異的組換えタンパク質または合成ペプチドを用い、モノクローナル及び／またはポリクローナル抗体を開発することができる。少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを使用して、当分野において公知の方法に従ってワクチンを開発することも考えられる。アッセイに使用される試薬は、アッセイに使用されるモノクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体の混合物または（組換えもしくは合成）ポリペプチドといった試薬を各々が含む１つ以上の容器、例えばバイアルやボトルを包含する試験キットの形態で提供され得ると考えられる。当業者には公知の緩衝液、対照などの他の構成成分をかかる試験キットに含めてもよい。「固相」（「固体支持体」）は当業者には公知であり、反応トレーのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、微粒子（例えばラテックス粒子）、ヒツジ（または他の動物）の赤血球、ｄｕｒａｃｙｔｅｓなどが挙げられる。「固相」は限定的なものではなく、当業者によって選択され得る。即ち、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適当な動物）の赤血球、及びｄｕｒａｃｙｔｅｓは全てが適当な例である。ペプチドを固相上に固定する適当な方法としては、イオン性、疎水性、共有結合性の相互作用などが挙げられる。本明細書において使用される「固相」とは、不溶性であるかまたは後続反応によって不溶性にし得る任意の材料を指す。固相は、捕獲剤を引き付けて固定する固有の能力において選択され得る。或いは固相は、捕獲剤を引き付けて固定する能力を有する補助的レセプターを保持し得る。補助的レセプターは、捕獲剤自体または捕獲剤に結合している帯電物質とは反対の電荷を有する帯電物質を含み得る。或いはまたレセプター分子は、固相上に固定（付着）されており、特異的結合反応によって捕獲剤を固定する能力を有する任意の特異的結合メンバーとすることもできる。アッセイ実施前またはアッセイ実施中に、レセプター分子によって捕獲剤を固相材料に間接的に結合することができる。固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、ガラスまたはシリコン表面を備えた試験管、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適当な動物）の赤血球、ｄｕｒａｃｙｔｅｓ、並びに、当業者には公知の他の構成とし得る。固相が、検出抗体がアクセスし得るに十分な多孔性及び抗原を結合するのに適当な表面親和性を有する任意の適当な多孔質材料からなることも考えられ、本発明の範囲内である。一般には微孔質構造が好ましいが、水和状態でゲル構造を有する材料も使用し得る。かかる有用な固体支持体としては、天然ポリマー炭水化物及びそれらの合成変性、架橋または置換誘導体、例えば寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換架橋グアゴム、特に硝酸及びカルボン酸とのセルロースエステル、混合セルロースエステル、セルロースエーテル；窒素を含む天然ポリマー、例えば架橋または変性ゼラチンを含むタンパク質及び誘導体；天然炭化水素ポリマー、例えばラテックス及びゴム；適当な多孔質構造を有するよう製造され得る合成ポリマー、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニルを含むビニルポリマー及びその部分加水分解誘導体、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、上記ポリ縮合物のコポリマー及びターポリマー、例えばポリエステル、ポリアミド、及び他のポリマー、例えばポリウレタンまたはポリエポキシド；多孔質無機材料、例えばアルカリ土類金属及びマグネシウムの硫酸塩または炭酸塩（例えば硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム）、アルカリ及びアルカリ土類金属、アルミニウム並びにマグネシウムのケイ酸塩；並びに、アルミニウムまたはケイ素の酸化物または水和物、例えばクレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの材料は上記ポリマー材料と一緒に充填剤として使用し得る）；並びに、これらの混合物またはコポリマー、例えば既存の天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始することにより得られるグラフトコポリマーが挙げられる。これらの材料は全てが、フィルム、シート、またはプレートといった適当な形状で使用することもできるし、紙、ガラス、プラスチックフィルム、またはファイバーといった適当な不活性担体に被覆、接着または積層することもできる。ニトロセルロースの多孔質構造は、モノクローナル抗体を含む広範囲の試薬に対して優れた吸収性及び吸着性を示す。ナイロンも同様の特性を有しており、やはり適当である。上述のごとき多孔質固体支持体は厚さが約０．０１〜０．０５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形態であると考えられる。孔径は広範囲で変えることができるが、約０．０２５〜１５μ、特に約０．１５〜１５μであるのが好ましい。かかる支持体の表面は、抗原または抗体と支持体との共有結合を惹起する化学処理によって活性化し得る。一般には、あまり理解されていない疎水性の力によって多孔質材料上に吸着することにより、抗原または抗体は不可逆的に結合される。適当な固体支持体は米国特許出願第２２７，２７２号明細書にも記載されている。「指示薬」は、ＨＧＢＶの特異的結合メンバーに結合（付着）した、外部手段によって検出し得る測定可能シグナルを生成し得るまたは生成する「シグナル生成化合物」（標識）を含む。本明細書において使用される「特異的結合メンバー」とは特異的結合対、即ち一方の分子が化学的または物理的手段を介して第２の分子に特異的に結合する２つの分子のメンバーを意味する。ＨＧＢＶに対する特異的結合対の抗体メンバーであるほか、指示薬は、ハプテン−抗ハプテン系、例えばビオチンまたは抗ビオチン、アビジンまたはビオチン、炭水化物またはレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子またはレセプター分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害物質または酵素などとし得る。免疫反応性特異的結合メンバーは、サンドイッチアッセイにおいてはＨＧＢＶに、競合アッセイにおいては捕獲剤に、また間接アッセイにおいては任意の特異的結合メンバーに結合し得る、抗体、抗原、または抗体／抗原複合体であり得る。考えられる種々の「シグナル生成化合物」（標識）としては、色原体、酵素のごとき触媒、フルオレセイン及びローダミンのごとき発光化合物、ジオキセタン、アクリジニウム、フェナントリジニウム及びルミノールのごとき化学発光化合物、放射性元素、直接可視標識が挙げられる。酵素の例としてはアルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。特定の標識の選択は限定的ではなく、標識はそれ自体でまたは１種以上の他の物質と一緒になってシグナルを生成することができる。本発明は、特異的結合メンバーを使用するアッセイを提供する。本明細書において使用される「特異的結合メンバー」は特異的結合対、即ち一方の分子が化学的または物理的手段を介して第２の分子に特異的に結合する２種類の異なる分子のメンバーである。従って、一般的なイムノアッセイの抗原及び抗体特異的結合対のほかに、他の特異的結合対として、ビオチンとアビジン、炭水化物とレクチン、相補的ヌクレオチド配列、エフェクター分子とレポーター分子、補因子と酵素、酵素阻害物質と酵素などを挙げ得る。特異的結合対には更に、元の特異的結合対の類似物、例えば被分析物質類似物であるメンバーも含まれ得る。免疫反応性特異的結合メンバーとしては、組換えＤＮＡ分子によって形成されるものを含み、抗原、抗原フラグメント、モノクローナル及びポリクローナル抗体及び抗体フラグメント、これらの複合体が挙げられる。本明細書において使用される「ハプテン」なる用語は、抗体に結合することはできるが、担体タンパク質に結合していなければ抗体形成を誘起し得ない部分抗原または非タンパク質結合メンバーを指す。本明細書において使用される「被分析物質」は、検査試料中に存在し得る検出すべき物質である。被分析物質は、それに対して天然特異的結合メンバー（例えば抗体）が存在するかまたはそれに対して特異的結合メンバーを調製し得る物質であり得る。即ち、被分析物質は、アッセイにおいて１つ以上の特異的結合メンバーに結合し得る物質である。「被分析物質」としては、任意の抗原性物質、ハプテン、抗体、及びこれらの組合せが挙げられる。特異的結合対のメンバーとして、被分析物質は天然特異的結合パートナー（対）によって検出することができ、例えば、ビタミンＢ１２の測定には特異的結合対のメンバーとして固有因子タンパク質が使用され、葉酸を測定するには葉酸塩結合タンパク質が使用され、炭水化物の測定には特異的結合対のメンバーとしてレクチンが使用される。被分析物質としてはタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ヌクレオチドターゲットなどが挙げられる。種々の他の固相を使用する他の実施態様も考えられ、それらも本発明の範囲内である。例えば、欧州特許出願公開第０３２６１００号明細書に対応する同時係属米国特許出願第１５０，２７８号明細書及び米国特許出願第３７５，０２９号明細書（欧州特許出願公開第０４０６４７３号明細書）に記載の、負電荷を有するポリマーを用いて固定可能な反応複合体を固定するイオン捕獲法を本発明に従って使用し、高速液相（ｆａｓｔｓｏｌｕｔｉｏｎ−ｐｈａｓｅ）免疫化学反応を行うことができる。固定可能な免疫複合体は、負電荷を有するポリアニオン／免疫複合体と予め処理して正電荷をもたせた多孔質マトリックスとのイオン相互反応によって反応混合物の残りの部分から分離し、ＥＰＯ特許出願公開第０，２７３，１１５号明細書に対応する同時係属米国特許出願第９２１，９７９号明細書に記載のごとき化学発光シグナル測定に記載のものを含む、文献明記の種々のシグナル生成系を使用して検出し得る。また本発明方法は、固相が（磁性または非磁性）微粒子からなる自動化及び半自動化系を含む、微粒子技術を使用する系での使用にも適合し得る。このような系として、ＥＰＯ特許出願公開第０４２５６３３号明細書及び同第０４２４６３４号明細書にそれぞれ対応する係属米国特許出願第４２５，６５１号明細書及び同第４２５，６４３号明細書に記載のものが挙げられる。イムノアッセイ用の走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）を使用すると、本発明のモノクローナル抗体を容易に適合し得る。走査型プローブ顕微鏡、特に原子力（ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅ）顕微鏡においては、捕獲相、例えば少なくとも１種の本発明のモノクローナル抗体を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を使用し、固相の表面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。走査型トンネル顕微鏡を使用すると、抗原／抗体複合体を検出するために多くのイムノアアッセイ系に通常は使用せねばならない標識が必要でなくなる。このような系は係属米国特許出願第６６２，１４７号明細書に記載されている。特異的結合反応をモニターするためにＳＰＭは多くの態様で使用され得る。１つの実施態様においては、特異的結合パートナーの１つのメンバー（本発明のモノクローナル抗体である被分析物質特異的物質）を走査に適した表面に付着させる。被分析物質特異的物質の付着は、当業者には公知の方法に従って、プラスチックまたは金属表面の固相からなる試験片に吸着させることにより行い得る。或いは、誘導体化プラスチック、金属、シリコン、またはガラスの固相からなる試験片に特異的結合パートナー（被分析物質特異的物質）を共有結合させることもできる。共有結合方法は当業者には公知であり、特異的結合パートナーを試験片に不可逆的に結合する種々の手段を含む。試験片がシリコンまたはガラスである場合、特異的結合パートナーを付着させる前に表面を活性化する必要がある。トリエトキシアミノプロピルシラン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）、トリエトキシビニルシラン（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及び（３−メルカプト−プロピル）−トリメトキシシラン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）といった活性化シラン化合物を使用し、それぞれアミノ、ビニル及びチオールといった反応性の基を導入することができる。このような活性化表面を使用して結合パートナーを（アミノまたはチオールの場合には）直接に結合することもできるし、活性化表面を更に、グルタルアルデヒド、ビス（スクシンイミジル）スベレート、ＳＰＰＤ９（スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート）、ＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン− １−カルボキシレート）、ＳＩＡＢ（スクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート）及びＳＭＰＢ（スクシンイミジル４−［１−マレイミドフェニル］ブチレート）といったリンカーと反応させ、結合パートナーを表面から離すこともできる。ビニル基は、酸化して共有結合手段を与えることもできるし、特異的結合パートナーに対して複数の付着点を与え得るポリアクリル酸のごとき種々のポリマーを重合するためのアンカーとして使用することもできる。アミノ表面を種々の分子量の酸化デキストランと反応させ、種々のサイズ及び結合能の親水性リンカーを与えることもできる。酸化可能なデキストランの例として、ＤｅｘｔｒａｎＴ−４０（分子量４０，０００ダルトン）、ＤｅｘｔｒａｎＴ−１１０（分子量１１０，０００ダルトン）、ＤｅｘｔｒａｎＴ−５００（分子量５００，０００ダルトン）、ＤｅｘｔｒａｎＴ−２Ｍ（分子量２，０００，０００ダルトン）（これら全てはＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能）、またはＦｉｃｏｌｌ（分子量７０，０００ダルトン）（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）が挙げられる。また、１９８８年１月２９日出願係属米国特許出願第１５０，２７８号明細書及び１９８９年７月７日出願同第３７５，０２９号明細書に記載の方法及び化学物質を使用し、高分子電解質相互作用を使用して特定的結合パートナーを試験片の表面に固定することもできる。好ましい付着方法は共有結合によるものである。特異的結合メンバーを付着させたあと、非特異的結合を最少限に抑えるために表面を更に、血清、タンパク質、または他のブロッキング剤で処理してもよい。該表面がアッセイに適しているか検証するため、それを製造場所または使用時点で走査してもよい。走査方法は、試験片の特異的結合特性を変化させないものとする。「サンドイッチ」イムノアッセイ及びプローブアッセイを含む種々の他のアッセイ形式を使用し得る。例えば、本発明のモノクローナル抗体を種々のアッセイ系に使用して、検査試料中のＨＧＢＶタンパク質の存在を、もしあるとするならば判定することができる。与えられるかかるモノクローナル抗体のフラグメントを使用してもよい。例えば高速アッセイ形式においては、固相に被覆したポリクローナルもしくはモノクローナル抗ＨＧＢＶ抗体またはそのフラグメントまたはこれらの抗体の組合せを、ＨＧＢＶタンパク質を含み得る検査試料と接触させ、混合物を形成する。この混合物を、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。シグナル生成化合物を付着させた、ＨＧＢＶ領域に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメントまたはこれらの抗体の組合せを含む指示薬を、抗原／抗体複合体と接触させて第２の混合物を形成する。この第２の混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。検査試料中に存在しており固相上に捕獲されたＨＧＢＶ抗原の存在は、もしあるとすれば、シグナル生成化合物によって生成される測定可能なシグナルを検出することにより判定される。検査試料中に存在するＨＧＢＶ抗原の量は生成されたシグナルに比例する。或いは、固体支持体に結合させたポリクローナルもしくはモノクローナル抗ＨＧＢＶ抗体またはそのフラグメントまたはこれらの抗体の組合せと、検査試料と、シグナル生成化合物を付着させた、ＨＧＢＶ抗原に特異的に結合するモノクローナルもしくはポリクローナル抗体またはそのフラグメントまたはこれらの抗体の組合せを含む指示薬とを接触させて混合物を形成する。この混合物を、抗体／抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。検査試料中に存在しており固相上に捕獲されたＨＧＢＶタンパク質の存在は、もしあるとすれば、シグナル生成化合物によって生成される測定可能なシグナルを検出することにより判定される。検査試料中に存在するＨＧＢＶタンパク質の量は生成されたシグナルに比例する。更に別のアッセイ形式においては、１種または２種以上組合せた本発明のモノクローナル抗体を、ＨＧＢＶタンパク質に対する抗体を検出するための競合プローブとして使用し得る。例えばＨＧＢＶタンパク質を単独でまたは組合せて固相に被覆することができる。次いで、ＨＧＢＶ抗原に対する抗体を含む疑いのある検査試料を、シグナル生成化合物と少なくとも１種の本発明モノクローナル抗体とを含む指示薬と一緒に、検査試料及び指示薬と固相、または指示薬と固相とで、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。モノクローナル抗体の固相への結合の低下を定量的に測定し得る。非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎陰性が確認されている検査試料から生成されるシグナルと比較してシグナル低下が測定され得るならば、検査試料中に抗ＨＧＢＶ抗体が存在することが判る。更に別の検出方法においては、本発明のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の各々を、免疫組織化学分析による固定組織片及び固定細胞におけるＨＧＢＶ抗原の検出に使用し得る。かかる抗体を直接標識する（フルオレセイン、コロイド金、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなど）か、または（本明細書に例示した種々の標識を用いた）第２標識抗種抗体を使用して標識して疾患の履歴を追跡する細胞化学分析も本発明の範囲内である。更に、モノクローナル抗体をＣＮＢｒ活性化セファロースと類似のマトリックスに結合し、細胞培養物、または血液及び肝といった生物組織由来の特異的ＨＧＢＶタンパク質のアフィニティー精製に使用し、組換えまたは天然ウイルスＨＧＢＶ抗原及びタンパク質を精製することもできる。本発明のモノクローナル抗体は、治療を目的とするキメラ抗体の生成や、他の類似の用途に使用することもできる。モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、ＨＧＢＶ抗原を検出するために個々に提供され得る。本明細書において与えられるモノクローナル抗体（及びそのフラグメント）の組合せは、少なくとも１種の本発明の抗ＨＧＢＶ抗体と、他のＨＧＢＶ領域に対する抗体との混合物または「カクテル」中の、各々が異なる結合特異性を有する成分として一緒に使用され得る。即ちこのカクテルは、ＨＧＢＶタンパク質に対する本発明のモノクローナル抗体と、ＨＧＢＶゲノムの他の抗原決定基に対する他のモノクローナル抗体とを含み得る。かかるアッセイ形式に使用し得るポリクローナル抗体またはそのフラグメントは、アッセイに使用される特異的ＨＧＢＶ領域または他のＨＧＢＶタンパク質に特異的に結合すべきである。使用されるポリクローナル抗体は哺乳動物由来のものであるのが好ましく、ヒト、ヤギ、ウサギまたはヒツジの抗ＨＧＢＶポリクローナル抗体を使用し得る。最も好ましくは、ポリクローナル抗体はウサギポリクローナル抗ＨＧＢＶ抗体である。アッセイに使用されるポリクローナル抗体は単独でもポリクローナル抗体のカクテルとしても使用し得る。アッセイ形式に使用されるカクテルは異なるＨＧＢＶ特異性を有するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体いずれかからなるので、それらは、ＨＧＢＶ感染の診断、評価及び予防に、並びにＨＧＢＶタンパク質の分化及び特異性の研究に有用となろう。全てのＨＧＢＶウイルスに共通な合成、組換えまたは天然ペプチドを使用することにより、ＨＧＢＶ群のウイルスがアッセイにおいて検出可能となり得ることが考えられ、本発明の範囲内である。ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ− Ｃ、更には他のＨＧＢＶウイルス由来の種々のエピトープを同定する種々の合成、組換えまたは天然ペプチドをアッセイ形式に使用し得ることも本発明の範囲内である。後者の場合、それらを１つの固相に被覆してもよいし、各ペプチドをそれぞれ別個の固相、例えば微粒子上に被覆し、それらを合わせて、あとでアッセイに使用し得るペプチドの混合物を形成してもよい。このようなアッセイ形式の変形は当業者には公知であり、後述する。別のアッセイ形式においては、ＨＧＢＶに対する抗体及び／または抗原の存在を以下のように同時アッセイにおいて検出し得る。検査試料を、固相に付着された第１被分析物質に特異的な第１結合メンバーを含む第１被分析物質用捕獲剤と、第２固相に付着された第２被分析物質に対する第１結合メンバーを含む第２被分析物質用捕獲剤とに同時に接触させ、それによって混合物を形成する。この混合物を、捕獲剤／第１被分析物質複合体及び捕獲剤／第２被分析物質複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。このように形成された複合体を、シグナル生成化合物で標識された第１被分析物質に特異的な結合対のメンバーを含む指示薬と、シグナル生成化合物で標識された第２被分析物質に特異的な結合対のメンバーを含む指示薬とに接触させ、第２混合物を形成する。この第２混合物を、捕獲剤／第１被分析物質／指示薬複合体及び捕獲剤／第２被分析物質／指示薬複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートする。１種以上の被分析物質の存在は、検査試料中の１種以上の被分析物質の存在の指標として、いずれか一方または両方の固相上に形成された複合体に関連して生成されたシグナルを検出することにより判定される。このアッセイ形式においては、ヒト発現系から誘導されたタンパク質を、本明細書に記載のごとき哺乳動物発現系から誘導されたタンパク質から生成されるモノクローナル抗体と同様に使用し得る。かかるアッセイ系は、欧州特許出願公開第０４７３０６５号明細書に対応する係属米国特許出願第０７／５７４,８２１号明細書、発明の名称“ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＡｓｓａｙｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＯｎｅＯｒＭｏｒｅＡｎａｌｙｔｅｓ”に詳述されている。更に別のアッセイ形式においては、組換えタンパク質及び／または合成ペプチドを使用して検査試料中の抗ＨＧＢＶの存在を検出し得る。例えば、検査試料を、少なくとも１種の組換えタンパク質または合成ペプチドを付着させた固相と一緒にインキュベートする。これらを、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で反応させる。インキュベーション後、抗原／抗体複合体を検出する。選択したアッセイ系に従い、指示薬を使用して検出を容易にし得る。別のアッセイ形式においては、検査試料を、本明細書に記載のごとく製造された組換えタンパク質または合成ペプチドを付着させた固相と接触させ、更に、好ましくは指示薬で標識された、該タンパク質に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体と接触させる。抗体／抗原複合体が形成されるのに十分な時間及び条件下でインキュベートした後、固相を遊離相から分離し、ＨＧＢＶ抗体の存在の指標としての標識を固相または遊離相において検出する。本発明のタンパク質を使用する他のアッセイ形式も考えられる。それらには、検査試料を、第１供給源由来の少なくとも１種の抗原を付着させた固相と接触させ、固相及び検査試料を、抗原／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下でインキュベートし、次いで固相を、第１供給源とは異なる第２供給源から誘導された標識抗原と接触させることを含む。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのごとき第１供給源から誘導された組換えタンパク質を固相上の捕獲抗原として使用し、検査試料をこのように調製された固相に添加し、異なる供給源（即ちＥ．ｃｏｌｉ以外）から誘導された組換えタンパク質を指示薬の一部として使用する。同様に、固相上の組換え抗原と指示薬相中の合成ペプチドとを組合せることもできる。第１供給源由来のＨＧＢＶに特異的な抗原を捕獲抗原として使用し且つ異なる第２供給源由来のＨＧＢＶに特異的な抗原を使用するアッセイ形式も考えられる。組換え抗原の種々の組合せ、並びに合成ペプチド、精製ウイルスタンパク質の使用などが本発明の範囲に含まれる。このようなアッセイその他が本出願人名義の米国特許第５,２５４,４５８号明細書に記載されており、その内容は参照により本明細書に包含されるものとする。他のアッセイ系では、ウイルスゲノム（またはそのフラグメント）を含むＨＧＢＶウイルス粒子またはサブウイルス粒子に、特異的抗体とウイルスタンパク質（ペプチドなど）の接触によって特異的に結合する（ポリクローナル、モノクローナルまたは天然）抗体が使用される。次いでこの捕獲された粒子をＬＣＲまたはＰＣＲなどの方法によって分析し、ウイルスゲノムが検査試料中に存在するかどうかを判定することができる。該方法に従って分析し得る検査試料としては、血液、肝、痰、尿、便、唾液などが挙げられる。かかる抗原捕獲増幅法を使用する利点は、特異的抗体を使用して検査試料中のウイルスゲノムを他の分子から分離し得ることである。このような方法は係属米国特許出願第０８／１４１,４２９号明細書に記載されている。本発明を固相を使用する場合について記載したが、本発明の抗体、タンパク質及びペプチドといった試薬は非固相アッセイ系においても使用し得ると考えられる。このようなアッセイ系は当業者には公知であり、本発明の範囲に含まれるものとする。材料及び方法一般方法特に記載のない限り、本発明の実施には、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ及び免疫学の分野における慣用的な公知の技術及び方法が使用される。このような技術は文献に詳述されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ（１９８５）；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓら編，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，（１９８４）；Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓら編，ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，（１９８４）；Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ，（１９８６）；ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，（１９８４）；シリーズ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌｏｒｉｄａ；Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒら編，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒＶｅｃｔｏｒｓＦｏｒＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８７）；Ｗｕら編，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５４及び１５５；Ｍａｙｅｒら編，ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．；及び、Ｄ．Ｗｅｉｒら編，ＨａｎｄｂｏｏｋＯｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ（１９８６）；Ｎ．Ｌｉｓｉｔｉｓｙｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：９４６−９５１（１９９３）参照。本発明の試薬及び方法は、本明細書に記載のごとく改良された代表相違分析によって単離された、タマリンまたはヒトであるＨＧＢＶ感染個体の血漿、血清または肝ホモジネート中に存在する極めて関連性のあるヌクレオチド配列群を与えることにより実現可能となる。このヌクレオチド配列群は、未感染個体由来のヒトまたはタマリンゲノムＤＮＡにはハイブリダイズしないこと、ＨＧＢＶ感染個体の肝（または肝ホモジネート）、血漿または血清中にしか存在しないこと、及びＧｅｎＢａｎｋに存在しないことから、ヒトまたはタマリンに由来するものではない。更に、該配列群は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ及びＨＥＶゲノム内に含まれる配列と核酸レベルで有意な一致を示さず、翻訳産物でも一致レベルは有意とは考えられないほど低い。ＨＧＢＶ感染ヒト由来の感染性血清、血漿または肝ホモジネートはかかるポリヌクレオチド配列を含むが、未感染ヒト由来の血清、血漿または肝ホモジネートはかかる配列を含まない。これらのポリヌクレオチド配列の幾つかを含む感染肝をノーザンブロット分析すると、それらがウイルスゲノムと同様のサイズの大きなＲＮＡ転写物から誘導されていることが判る。ＨＧＢＶ感染ヒト由来の血清、血漿または肝ホモジネートはこのポリペプチドに結合する抗体を含むが、未感染ヒト由来の血清、血漿または肝ホモジネートはこのポリペプチドに対する抗体を含まず、かかる抗体は、急性非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ感染後の個体において誘起されている。これらを基準にすると該配列は、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ型肝炎を惹起する、またはこれに関連のあるウイルスの配列であると考えられる。この核酸配列群を使用し得ることにより、ＨＧＢＶ感染に起因する非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎を診断したり、血液ドナー、献血血液、血液製剤及び個体を感染についてスクリーニングすることにおいて有用なＤＮＡプローブ及びポリペプチドを構築し得る。例えば、該配列から、例えばウイルスを保有する疑いのある被験者の血清中のウイルスゲノムの存在を検出するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとして有用であったり、また献血血液中のウイルスの存在をスクリーニングするために有用な、約８〜１０またはそれ以上のヌクレオチドのＤＮＡオリゴマーを合成し得る。当該核酸配列群により、ＨＧＢＶに感染した際に生成される抗体の存在に対する診断試薬として有用な、ＨＧＢＶ特異的ポリペプチドを設計及び製造し得る。該核酸配列から誘導される精製ポリペプチドに対する抗体を使用し、感染個体及び血液中のウイルス性抗原を検出することもできる。かかる核酸配列により、ＨＧＢＶに対するワクチンとして、及び抗体を製造するために使用し得るポリペプチドを設計及び製造することが可能となり、そうすればそれを疾患の予防及び／またはＨＧＢＶ感染個体の治療に使用し得る。かかる核酸配列群により、ＨＧＢＶゲノムを更に特性分析することも可能となる。かかる配列から誘導されるポリヌクレオチドプローブを使用し、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを別の重複核酸配列についてスクリーニングし、更にそれを使用して重複した配列を得ることができる。ゲノムがセグメント化されていてもセグメントが共通配列を欠いていることがなければ、この方法を使用して全ゲノムの配列を得ることができる。しかしながら、ゲノムがセグメント化されている場合、記載のごときＲＤＡクローニング処理を繰り返して後述のごとく修飾するか、後述のごとくλ−ｇｔ１１血清学的スクリーニング処理を繰り返して後述のクローンを単離するか、或いは、精製ＨＧＢＶ粒子からゲノムを単離することにより、ゲノムの他のセグメントを得ることができる。上記配列から誘導されるｃＤＮＡ配列及びポリペプチド、並びにかかるポリペプチドに対する抗体も、ＨＧＢＶ原因物質の単離及び同定に有用である。例えば、かかる核酸配列から誘導されるポリペプチド中に含まれるＨＧＢＶエピトープに対する抗体をアフィニティークロマトグラフィーに基づく方法に使用し、ウイルスを単離することができる。或いは、抗体を使用し、他の方法で単離されたウイルス粒子を同定することもできる。単離されたウイルス粒子中のウイルス性抗原及びゲノム物質を更に特性分析することもできる。ＨＧＢＶゲノムを更に配列決定すること、ＨＧＢＶ抗原を更に特性分析すること、及びゲノムを特性分析することにより得られる情報により、ＨＧＢＶに誘発される非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ、非Ｅ型肝炎の診断、予防及び治療に、並びに感染血液及び血液関連製剤のスクリーニングに使用し得る別のプローブ及びポリペプチド並びに抗体を設計及び合成することができる。かかる核酸配列群が誘導されるゲノムから誘導される抗原、抗体及びポリヌクレオチドを含む、ＨＧＢＶに対するプローブが得られれば、ＨＧＢＶの生物学的特性を明らかにすることに特に使用される組織培養系の開発が可能となる。一旦これが既知となれば、ＨＧＢＶの複製またはその感染を優先的に阻害する抗ウイルス性化合物をベースにして新規の治療方法を開発し得ると考えられる。ＨＧＢＶの病因物質を同定及び単離するために使用した１方法では、Ｎ．Ｌｉｓｉｔｓｙｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５９：９４６−９５１（１９９３）により報告されているような再現相違分析（ＲＤＡ）として知られる公知方法の変法によりＧＢ物質のクローニング／単離を行った。この方法は控除ハイブリダイゼーションの原理に基づいて２つの複合哺乳動物ゲノム間のＤＮＡ相違をクローニングする。要約すると、この方法では２つの被験ゲノムを（該当ターゲット配列を含む）「テスター」及び（正常ＤＮＡに相当する）「ドライバー」と属的に区別する。ＲＤＡに関するＬｉｓｉｔｓｙｎらの記述は類似する複合ＤＮＡバックグラウンド間のＤＮＡ相違の同定及びクローニングに限られている。これらの相違は特定の細胞系、血液、血漿又は組織サンプル中に存在し且つ非感染細胞系、血液、血漿又は組織サンプル中に不在の任意の大きいＤＮＡウイルス（例えば≧２５，０００ＤＮＡ塩基対）を含み得る。ＨＧＢＶは≦１０，０００塩基のＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを含む小さいウイルスであるらしいと先行文献に示されているので、小さいウイルスを検出できるようにＲＤＡプロトコルを修正した。方法の主要段階を以下に記載し、図１３に示す。要約すると、段階１では市販キットを使用して全核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を単離する。ＲＤＡではサンプルが高度に整合していることが必要である。理想的には、テスター及びドライバー核酸サンプルを同一源（動物、ヒト等）から得るべきである。高度に関連するものであれば、非同一材料をテスター及びドライバー核酸源に使用してもよい。ＲＮＡのランダムに開始される逆転写とそれに続いてランダムに開始されるＤＮＡ合成により全核酸から２本鎖ＤＮＡを生成する。この処理は、１本鎖ＲＮＡウイルス及び１本鎖ＤＮＡウイルスをＲＤＡに使用可能な２本鎖ＤＮＡ分子に変換するものである。未知ウイルスがＤＮＡ又はＲＮＡゲノムの一方を有すると仮定するならば、文献に記載されているようにＤＮＡ単独又はＲＮＡ単独抽出手順を使用して２本鎖ＤＮＡを生成することができる。段階２ではテスター及びドライバー核酸を増幅し、予備接種及び感染性血漿源から抽出された全核酸に相当する大量の材料（即ちテスターアンプリコン及びドライバーアンプリコン）を生成する。これは、４ｂｐ認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼ（例えばＳａｕ３ＡＩ）で上記のように調製した２本鎖ＤＮＡを開裂することにより達せられる。ＤＮＡフラグメントをオリゴヌクレオチドアダプター（セット＃１）に連結する。ＤＮＡフラグメントを末端充填し、ＰＣＲ増幅する。ＰＣＲ増幅後、オリゴヌクレオチドアダプター（セット＃１）を制限エンドヌクレアーゼ消化（例えばＳａｕ３ＡＩ）により除去し、その後の控除ハイブリダイゼーション法で使用する大量のテスター及びドライバー核酸を遊離させる。段階３の実験の目的はテスターゲノムに固有のＤＮＡを集積することである。これは控除ハイブリダイゼーション及び動的集積を単一段階として組み合わせることにより達せられる。要約すると、オリゴヌクレオチドアダプターセット（＃２又は＃３）をテスターアンプリコンの５’末端に連結する。テスターアンプリコンと過剰のドライバーアンプリコンを混合し、変性させ、２０時間ハイブリダイズさせる。テスター及びドライバーＤＮＡ間で共通して保存される大量の配列がこの時間中にアニールする。更に、テスターアプリコンに特有な配列が再アニールする。しかし、ハイブリダイゼーション時間が制限されているため、多少の１本鎖テスター及びドライバーＤＮＡが残存する。段階４では、再アニールしたテスター及びドライバーＤＮＡの３’末端を文献に記載されているように高温で熱安定ＤＮＡポリメラーゼで充填する。テスターに固有の再アニールした配列はアニールした配列の両鎖上に連結されたアダプターを含む。こうしてこれらの分子の３’末端充填により２つのＤＮＡ鎖上にＰＣＲプライマーに相補的な配列が生成される。従って、これらのＤＮＡ種はＰＣＲにかけると指数的に増幅される。これとは対照的にテスター及びドライバーアンプリコン間で共通に保存された配列を含む比較的大量のハイブリッド分子（即ち一方の鎖はテスターアンプリコンに由来し、一方の鎖はドライバーアンプリコンに由来する）はＰＣＲにより直線的に増幅される。これは、（テスターアンプリコンに由来する）鎖のみが連結されたアダプター配列を含み、３’末端充填がドライバーアダプターに由来する鎖上にＰＣＲプライマーに相補的な配列のみを生起するためである。段階５では、ＰＣＲを１０増幅サイクル使用して該当２本鎖ＤＮＡを定量的に増量する。段階４で記載したように、再アニールしたテスター配列は指数的に増幅され、テスター及びドライバーアニール間で共通して保存された配列は直線的に増幅される。段階６では、文献に記載されているようにヤエナリヌクレアーゼを使用して１本鎖ＤＮＡヌクレアーゼ消化により残存する１本鎖ＤＮＡを除去する。段階７では、ヌクレアーゼ消化後に残存する２本鎖ＤＮＡを更に１５〜２５サイクルＰＣＲ増幅する。最後に段階８ではこれらのＤＮＡ産物を制限エンドヌクレアーゼで開裂し、オリゴヌクレオチドアダプターを除去する。その後、これらのＤＮＡ産物を（前サイクルのＲＤＡで使用されなかったオリゴヌクレオチドアダプターを使用して段階＃３から開始する）次回の増幅にかけるか、又は適切なプラスミドベクターにクローニングし、更に分析する。上記ＲＤＡ法は当業者に公知の再現相違分析の変法である。予備接種及び感染性血清源からウイルスクローンを単離するように方法を変形した。これらの変形をテスター及びドライバーＤＮＡのアンプリコンの調製に関して以下に説明する。まず第１に、出発材料は従来報告されているように哺乳動物細胞のゲノムＤＮＡから得た２本鎖ＤＮＡではなく、タマリンから得た感染性予備接種生物血液サンプルから抽出した全核酸であった。他の生物サンプル（例えば臓器、組織、胆汁、糞便又は尿）を核酸源として使用してテスター及びドライバーアンプリコンを生成してもよい。第２に、出発核酸の量は文献に記載されているよりも実質的に少量である。第３に、６ｂｐでなく４ｂｐ認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼを使用した。これは従来技術と実質的に相違する。Ｌｉｓｉｔｓｙｎらの教示によると、ＲＤＡはアンプリコン（即ち再現物）の生成がハイブリダイズ（即ち控除）されるＤＮＡの複合度を低下させるという理由で有効である。従来技術では、６ｂｐ認識部位を有する制限酵素を使用してゲノムを分画した。これらの制限エンドヌクレアーゼは約４０００ｂｐ毎に開裂する。他方、従来技術に記載されているＰＣＲ条件では配列の増幅寸法は≦１５００ｂｐである。従って、６ｂｐ配列を認識する制限酵素で分画されたＤＮＡの複合種（例えばゲノム）のその後のＰＣＲ増幅の結果、制限エンドヌクレアーゼ消化後に寸法≦１５００ｂｐのＤＮＡのフラクションを含むアンプリコンが生成される。ＲＤＡのハイブリダイゼーション段階が有効に行われるためにはＤＮＡ複合度のこの低下（１０〜５０分の１と推定される）が必要であると報告されている。複合度が低下しないならば、控除段階中にテスター中の固有配列は有効にハイブリダイズすることができず、従って、これらの固有配列はＲＤＡの後続ＰＣＲ段階中に指数的に増幅されない。ＲＤＡを受ける核酸配列の複合度が低下すると、比較的小さいウイルスを単離するためにＲＤＡを使用し難くなる。相互に１．５ｋｂ以内に２つの６ｂｐ認識部位が存在する確率はかなり低いので、小さい（≦１０ｋｂ）ウイルスを単離できない恐れがある（表１）。これに対して本発明者らは、より切断頻度の高い制限エンドヌクレアーゼを使用してＲＤＡ被験ＤＮＡを分画するならば、小さいウイルスのクローニングにＲＤＡが有用であることを知見した。表１に示す通り、４ｂｐ認識部位酵素をベースとするアンプリコンは、約２５０ｂｐ毎に４ｂｐ認識部位フラグメントＤＮＡを有する制限エンドヌクレアーゼのように、如何なる小さいウイルスからも数個のフラグメントをほぼ確実に含む。他方、ＤＮＡ種のほぼ全部は４ｂｐ認識制限エンドヌクレアーゼによる消化後に≦１５００ｂｐで即ちＰＣＲ増幅されるので、アンプリコンはその生成起源である核酸源と同程度の複合度であると思われる。相対ウイルス配列コピー数は任意の特定又は内在配列コピー数よりも多いと予想されるので、テスターアンプリコン中に存在する固有ウイルス配列はハイブリダイゼーション段階（上記段階３）中に２本鎖分子を形成できるはずである。従って、これらの配列は上記のように指数的に増幅される。相対ウイルス配列コピー数がバックグラウンド又は内在核酸配列コピー数に近づくので、重複６ｂｐ配列を認識し（例えばＢｓｔＹＩ又はＨｉｎｃＩＩ）且つ約１０００ｂｐ毎に開裂する制限エンドヌクレアーゼを使用するか、又は６ｂｐ配列を認識する数個の制限エンドヌクレアーゼを同時に使用して、ＰＣＲによる増幅前にＤＮＡを分画することができると推論される。こうして、テスターアンプリコンからウイルス配列を排除する危険を最小限にしながら、ＲＤＡを受けるアンプリコンの複合度を適度に低下させることができる。この方法の有用性は、本明細書中に記載する感染性タマリン血漿からのＨＧＢＶ配列のクローニングにより立証される。ＨＧＢＶ免疫反応性エピトープを同定するための免疫スクリーニング以下に記載するような免疫スクリーニングも、ＨＧＢＶ配列を同定する付加的手段であった。急性又は慢性ＨＧＢＶ感染を有する下記パラメーター内で基準に合致する個体からの個々の血清、血漿又は肝臓ホモジネート又はそのプールを使用してウイルス粒子を単離する。これらの粒子から単離した核酸をゲノムライブラリー及び／又はウイルスゲノムに対するｃＤＮＡライブラリーの構築で鋳型として使用する。推定ＨＧＢＶ粒子を単離し、当業者に公知のλ−ｇｔ１１又は類似のシステムでゲノム及び／又はｃＤＮＡライブラリーを構築するために使用する手順を以下に説明する。λ−ｇｔ１１はβ−ガラクトシダーゼとの融合ポリペプチドとして挿入ｃＤＮＡを特異的に発現させ、規定抗原に対する特異抗血清で以って多数の組換えファージをスクリーニングするために開発されたベクターである。ｃＤＮＡを含むｃＤＮＡプールから生成されるλ−ｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを、非Ａ、非Ｂ、非Ｃ、非Ｄ及び非Ｅ肝炎既往個体からの血清と特異的に結合することが可能なコード化エピトープについてスクリーニングする。Ｖ．Ｈｕｎｙｈら，Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，ｐｐ．４９−７８（１９８５）を参照されたい。約１０⁶〜１０⁷個のファージをスクリーニングして陽性ファージを同定、精製後、ＨＧＢＶ物質に先に感染した各個体からの血清と結合する特異性を試験する。下記基準に合致する患者に由来し且つこれらの基準に合致しない患者には存在しない血清又は血漿と選択的に結合するファージがその後の試験に好適である。オーバーラップする核酸配列を単離する方法を使用することにより、付加的な上流及び下流ＨＧＢＶ配列を含むクローンが得られる。単離クローン内でコードされるＨＧＢＶ核酸配列のヌクレオチド配列を分析し、複合配列が１つの長い連続ＯＲＦを含むか否かを決定する。本明細書に記載するようなＨＧＢＶ配列から回収される配列（及びその相補体）及びその配列又は任意部分は、合成法を使用して調製してもよいし、本明細書に記載すると同様の方法を使用して合成法を部分配列の回収と組み合わせることにより調製してもよい。この記載は、完全ＨＧＢＶゲノムに対応するゲノム又はｃＤＮＡ配列を単離することが可能な方法に関する。しかしながら、これらの配列を単離するための他の方法も当業者に自明であり、本発明の範囲内であるとみなされる。菌株寄託ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの複製株（クローン２、４、１０、１６、１８、２３及び５０）はブダペスト条約に基づき１９９４年２月１０日付けで１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶｃＤＮＡ配列は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付託された。クローン２はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５６、クローン４はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５７、クローン１０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５８、クローン１６はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５５９、クローン１８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６０、クローン２３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６１、クローン５０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９５６２を付与された。ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの複製株（クローン１１、１３、４８及び１１９）はブダペスト条約に基づき１９９４年４月２９日付けで１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、本明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶｃＤＮＡ配列は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付託された。クローン１１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１３、クローン１３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１１、クローン４８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１０、クローン１１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６１２を付与された。ＨＧＢＶ核酸配列ライブラリーからの付加的株（クローン４−Ｂ１．１、６６ −３Ａ１．４９、７０−３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ１．１７）はブダペスト条約に基づき１９９４年７月２８日付けで１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、明細書中の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。全寄託材料中のＨＧＢＶｃＤＮＡ配列は参考資料として本明細書の一部とする。プラスミドは以下のＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号を付与された。クローン４−Ｂ１．１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６６、クローン６６−３Ａ１．４９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６５、クローン７０−３Ａ１．３７はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６４、クローン７８−１Ｃ１．１７はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９６６３を付与された。クローンｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はブダペスト条約に基づき１９９４年１１月８日付けで１２３０１ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ２０８５２に所在のＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、寄託日から３０年間、最新の試料分譲請求から５年間、又は米国特許の存続期間のうちのいずれか最長の期間保管される。上記寄託株及び本明細書に記載する他の全寄託材料は便宜の目的で呈示するに過ぎず、本明細書上の教示に鑑みて本発明を実施するために必要ではない。ｐＨＧＢＶ−Ｃクローン＃１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．寄託番号６９７１１を付与された。全寄託材料中のＨＧＢＶｃＤＮＡ配列は参考資料として本明細書の一部とする。ウイルスポリペプチド及びフラグメントの調製核酸配列を入手できることにより、いずれかの鎖でコードされるポリペプチドの抗原活性領域をコードする発現ベクターを構築することができる。これらの抗原活性領域は、例えばポリヌクレオチド結合タンパク質、ポリヌクレオチドポリメラーゼ、及びウイルス粒子の複製及び／又はアセンブリに必要な他のウイルスタンパク質を含むウイルスの非構造領域以外に、例えばエンベロープ（コート）又はコア抗原を含むウイルスの構造領域から誘導され得る。所望のポリペプチドをコードするフラグメントは慣用制限消化又は合成法によりゲノム又はｃＤＮＡクローンから得られ、例えばβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）又はＣＭＰ−ＫＤＯシンテターゼ（ＣＫＳ）等の融合配列の部分を含み得るベクターに連結される。ＳＯＤの融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法及びベクターは１９８６年１０月１日付け公開ＥＰＯ第０１９６０５６号に記載されており、ＣＫＳの融合配列を含むポリペプチドの製造に有用な方法及びベクターは１９８９年９月１３日付け公開ＥＰＯ第０３３１９６１号に記載されている。いずれかの方向の鎖においてオープンリーディングフレームを含む核酸配列の任意の所望部分は成熟又は融合タンパク質等の組換えタンパクとして得られ、あるいはＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡでコードされるポリペプチドを化学的合成により提供することもできる。融合又は成熟形態のいずれかに関係なく、また分泌を可能にするシグナル配列を含むか否かに関係なく、所望のポリペプチドをコードする核酸配列を任意の適当な宿主に適切な発現ベクターに連結することができる。当該技術分野では真核及び原核両者の宿主系を使用して組換えタンパク質を形成することができ、本明細書にはこれらの宿主のいくつかを挙げる。次に溶解細胞又は培地からポリペプチドを単離し、所期用途に必要な程度まで精製する。精製は当業者に公知の方法により実施することができ、特に塩析、イオン交換樹脂クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、遠心分離等を使用することができる。このようなポリペプチドは診断薬として又は受動的免疫療法に使用することができる。更に、これらのポリペプチドに対する抗体は、ＨＧＢＶ粒子を単離及び同定するために有用である。ＨＧＢＶ抗原はＨＧＢＶ粒子からも単離することができる。これらウイルス粒子は組織培養物又は感染個体中のＨＧＢＶ感染細胞中で増殖させることができる。抗原性ポリペプチドの調製及び固相との結合ポリペプチドの抗原性領域又はフラグメントは比較的小さく、通常約８〜１０アミノ酸長又はそれ以下である。５アミノ酸程度のフラグメントでも抗原性領域を特徴付けることができる。これらのセグメントはＨＧＢＶ抗原の領域に対応し得る。ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡ配列を基本として使用することにより、ＨＧＢＶポリペプチドの短いセグメントをコードする核酸配列を融合タンパク質又は単離ポリペプチドとして組換えにより発現させることができる。これらの短いアミノ酸配列は、化学的合成によっても得られる。化学的に合成された小さいポリペプチドは、得られた合成ポリペプチドが適正なエピトープを提供するように適正に配置されており且つ抗原性となるには小さ過ぎる場合に適切なキャリヤー分子に結合され得る。結合方法は当業者に公知であり、非限定的な例としては、Ｎ −スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及びスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を使用する。システイン残基を加えることにより、スルフヒドリル基をもたないポリペプチドを修飾することができる。これらの物質は、該物質と一方のタンパク質上のペプチドシステイン残基の間にジスルフィド結合を生成し、他方のタンパク質中のリジン上のε−アミノ又は他の遊離アミノ基を介してアミド結合を生成する。このような種々のジスルフィド／アミド形成物質は公知である。他の２官能カップリング剤はジスルフィド結合でなくチオエステルを形成する。これらのチオエーテル形成剤の多くは市販されており、当業者に公知である。そのカルボキシ基は、スクシンイミド又は１−ヒドロキシ−２−ニトロ− ４−スルホン酸ナトリウム塩と結合させることにより活性化することができる。宿主に有害な抗体の産生をそれ自体誘導しないものであれば、任意のキャリヤーを使用することができる。適切なキャリヤーとしては、特にタンパク質、多糖類（例えばラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズ）、ポリマーアミノ酸（例えばポリグルタミン酸、ポリリシン、アミノ酸コポリマー）及び不活性ウイルス粒子を挙げることができる。タンパク質基質の例としては、血清アルブミン、アオガイヘモシアニン、イムノグロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミン、破傷風毒素及び当業者に公知の他のタンパク質を挙げることができる。ＨＧＢＶエピトープを含むハイブリッド粒子免疫原の調製ＨＧＢＶエピトープの免疫原性は、粒子形成タンパク質（例えばＨＢＶ表面抗原にあるような）融合又は結合した哺乳動物又は酵母系で調製することにより強化することもできる。粒子形成タンパク質をコードする配列にＨＧＢＶエピトープを直接結合した構築物は、ＨＧＢＶエピトープに対して免疫原性のハイブリッドを生成する。更に、調製されるＨＧＢＶに対して特異的なエピトープを含む全てのベクターは、異なる程度の免疫原性を有する。ＨＧＢＶ配列を含む粒子形成タンパク質から構築される粒子はＨＧＢＶ及びＨＢＶに対して免疫原性がある。Ｂ型肝炎表面抗原はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及び哺乳動物細胞中で形成されて粒子に結合することが確認され、これらの粒子の形成はモノマーサブユニットの免疫原性を強化することが報告されている。Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｎａｔｕｒｅ２９８：３３４（１９８２）；Ｐ．Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら，Ｉ．Ｍｉｌｌｍａｎら編，ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ｐｐ．２２５ −２３６（１９８４）。構築物はＨＢｓＡｇの免疫優性エピトープを含み得る。このような構築物は酵母で発現可能であることが報告されており、酵母発現のための異種ウイルス配列を含むハイブリッドが開示されている。例えばＥＰＯ第１７４，４４４号及びＥＰＯ第１７４，２６１号を参照されたい。これらの構築物はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳動物細胞で発現され得ることも報告されている。Ｍｉｃｈｅｌｌｅら，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍｐｏｓｉｕｍｏｎＶｉｒａｌＨｅｐａｔｉｔｉｓ，１９８４を参照されたい。ＨＧＢＶにおいては粒子形成タンパク質をコードする配列の部分を、ＨＧＢＶエピトープをコードするコドンで置換することができる。この置換では、酵母又は哺乳動物中で免疫原性粒子を形成するための単位の凝集を媒介するために不要な領域を削除し、こうしてＨＧＢＶエピトープとの競合から付加的なＨＧＢＶ抗原部位を排除することができる。ワクチン製造ワクチンは、ＨＧＢＶ核酸配列又は該核酸配列に対応するＨＧＢＶゲノムに由来する１種以上の免疫原性ポリペプチド又は核酸から製造することができる。ワクチンはＨＧＢＶのエピトープを含む組換えポリペプチドを含み得る。これらのポリペプチドは細菌、酵母又は哺乳動物細胞中で発現させてもよいし、あるいはウイルス調製物から単離してもよい。種々の構造タンパク質が防御抗ＨＧＢＶ抗体を誘導するＨＧＢＶのエピトープを含み得ることも予想される。こうして、これらのワクチンの製造時には合成ペプチドも使用することができる。従って、ＨＧＢＶの少なくとも１個のエピトープを含むポリペプチドをＨＧＢＶワクチン中で単独又は組み合わせて使用することができる。更に、非構造タンパク質及び構造タンパク質は、中和抗体を産生しないとしても、ウイルス病原性に対する防御を提供し得ると予想される。上記に鑑み、ＨＧＢＶに対する多価抗体は１種以上の構造タンパク質及び／又は１種以上の非構造タンパク質を含み得る。これらのワクチンは例えば組換えＨＧＢＶポリペプチド及び／又はウイルス粒子から単離されたポリペプチド及び／又は合成ペプチドから構成され得る。これらの免疫原エピトープは組み合わせて使用することができ、即ち組換えタンパク質、合成ペプチド及び／又はウイルス粒子から単離されたポリペプチドの混合物として使用することができ、これらのワクチンは同一又は異なる時刻に投与することができる。更に、ワクチンに不活化ＨＧＢＶを使用することも可能であり得る。このような不活化はウイルス溶解物を調製してもよいし、肝炎様ウイルスの不活化を生じることが当業者に知られている他の手段、例えば有機溶媒もしくは界面活性剤による処理、又はホルマリン処理により実施してもよい。本発明では弱毒ＨＧＢＶ株調製物も開示する。ＨＧＢＶにおけるタンパク質には他の公知ウイルスと交差反応できるものもあり、従って、ＨＧＢＶと他のウイルスとの間に共有エピトープが存在し、これらの病原物質により生じる疾患の１種以上に対する防御抗体をもたらすと予想される。この確信に基づいて多重目的ワクチンを設計できることが予想される。少なくとも１種の免疫原性ペプチドを活性成分として含むワクチンの調製は当業者に公知である。典型的には、このようなワクチンは溶液又は懸濁液としての注射剤として調製される。注射前に液体に溶解又は懸濁するのに適切な固体形態も製造可能である。調製物を乳化してもよいし、タンパク質をリポソームに封入してもよい。活性免疫原性成分は多くの場合には活性成分と適合可能な医薬的に許容可能な賦形剤と混合する。適切な賦形剤の非限定的な例としては、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等が挙げられ、種々の量のこれらの賦形剤を組み合わせて使用してもよい。ワクチンは更に、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤及び／又はワクチンの効力を強化するアジュバント等の少量の補助物質も含有し得る。例えば、このようなアジュバントとしては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ −アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６８７、別称ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、別称ＭＴＰ−ＰＥ）及びＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）の２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）エマルジョンが挙げられる。アジュバントの効力は、同様に種々のアジュバントから構成されるワクチン中のポリペプチドを投与した結果生じたＨＧＢＶ抗原配列を含む免疫原性ポリペプチドに対する抗体の量を測定することにより決定することができる。ワクチンは通常、静脈内又は筋肉内注射により投与される。他の投与方法に適切な別の製剤には座薬があり、場合によっては経口製剤でもよい。座薬の場合、慣用バインダー及びキャリヤーの非限定的な例としてはポリアルキレングリコール又はトリグリセリドが挙げられる。このような座薬は約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような一般に使用される賦形剤を含有する。これらの組成物は溶液、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、徐放製剤又は散剤の形態をとることでがき、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％の活性成分を含有し得る。ワクチン中で使用するタンパク質は中性又は塩形態としてワクチンに配合され得る。医薬的に許容可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミノ基と共に形成され且つ）無機酸（例えば塩酸又はリン酸）又は有機酸（酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸）と共に形成される酸付加塩や、当業者に公知の他の塩を使用することができる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化鉄（III）等）及び有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン）及び当業者に公知の他の塩基から誘導され得る。ワクチンは剤形に適合可能な方法で且つ予防及び／又は治療上有効な量を投与される。投与量は一般に１回に抗原約５μｇ〜約２５０μｇであり、被投与患者、患者の免疫系の抗体合成能力及び所望の防御度に依存する。投与するために必要な活性成分の厳密な量は処方医の判断にも依存し、患者毎に異なる。ワクチンは単一投与スケジュールで投与してもよいし、多重投与スケジュールで投与してもよい。多重投与では、１〜１０回に分けて一次ワクチン接種過程を実施した後、免疫応答を維持及び／又は強化するために必要な期間後、例えば１〜４カ月後に二次投与を実施し、個体が必要とする場合には更に数カ月後にも投与する。投与計画は少なくとも一部には個体の必要により決定され、処方医の判断による。免疫原性ＨＧＢＶ抗原を含有するワクチンは他の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと併用投与し得ることが予想される。ＨＧＢＶエピトープに対する抗体の製造本明細書中に記載するように調製した免疫原性ペプチドを使用してポリクローナル又はモノクローナル抗体を製造する。ポリクローナル抗体を製造する際には、選択した哺乳動物（例えばマウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を少なくとも１種のＨＧＢＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫感作する。免疫感作した動物からの血清を適当なインキュベーション時間後に収集し、公知手順に従って処理する。ＨＧＢＶエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含有する場合には、例えばイムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗体を製造及び処理するための方法は当業者に公知であり、特にＭａｙｅｒとＷａｌｋｅｒ編，ＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓＩｎＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）に記載されている。ポリクローナル抗体は先にＨＧＢＶに感染した哺乳動物からも得られる。アフィニティークロマトグラフィーを使用してＨＧＢＶに感染した個体の血清からＨＧＢＶエピトープに対する抗体を精製するための方法の１例をここに記載する。ＨＧＢＶエピトープに対するモノクローナル抗体も当業者により製造することができる。このような抗体を製造するための一般方法は周知であり、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９４（１９７５）に記載されており、Ｊ．Ｇ．Ｒ．Ｈｕｒｒｅｌ編，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＨｙｂｒｉｄｏｍａＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣＰｒｅｓｓＩｎｃ．，ＢｏｃｏＲａｔｏｎ，ＦＬ（１９８２）に考察されており、Ｌ．Ｔ．Ｍｉｍｍｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６：６０４−６１９（１９９０）により教示されている。不死化抗体産生細胞系は細胞融合により作成することができ、オンコジーンＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換又はエプスタイン−バールウイルスによるトランスフェクション等の他の方法により作成することもできる。同様にＭ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｓｃｏｐｅｓ（１９８０）ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８４）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ−ＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔら，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１９８０）を参照されたい。モノクローナル抗体の使用及び技術の例は米国特許出願第７４８，２９２号、７４８，５６３号、６１０，１７５号、６４８，４７３号、６４８，４７７号及び６４８，４７５号に開示されている。こうして開発されたＨＧＢＶエピトープに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体は診断及び予後用途に有用であり、更に中和抗体は受動的免疫療法で有用である。モノクローナル抗体は特に抗イディオタイプ抗体を製造するために使用することができる。これらの抗イディオタイプ抗体は防御が所望される感染物質の抗原の「内部像」を有するイムノグロブリンである。例えば、Ａ．Ｎｉｓｏｎｏｆｆら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．２１：３９７−４０６（１９８１）及びＤｒｅｅｓｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：７６１（１９８５）を参照されたい。このようなイディオタイプ抗体を誘導するための方法は当業者に公知であり、例えばＧｒｙｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ３１６：７４（１９８５）；ＭａｃＮａｍａｒａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２６：１３２５（１９８４）；及びＵｙｔｄｅｈａａｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３４：１２２５（１９８５）に例示されている。これらの抗イディオタイプ抗体はＨＧＢＶ感染の治療及びＨＧＢＶ抗原の免疫原性領域の解明にも有用であり得る。診断オリゴヌクレオチドブローブ及びキット単離したＨＧＢＶ核酸配列の所定部分を基材として用いて、ＨＧＢＶゲノムとハイブリダイズし、ウイルス剤の同定、ウイルスゲノムの更なる特性分析、及び羅患した個体でのウイルス検出に有用である約８ヌクレオチド以上のオリゴマーを切り出し又は合成により産生することができる。ＨＧＢＶポリヌクレオチド用の天然又は誘導プローブは、ハイブリダイゼーションによる単一ウイルス配列の検出を可能とする長さである。６〜８ヌクレオチドが処理可能な長さであり得るが、１０〜１２ヌクレオチドの配列が好ましく、約２０ヌクレオチドの配列が最も好ましいものであり得る。これらの配列が異質性に欠けた領域から誘導されることが好ましい。これらのプローブは、自動化オリゴヌクレオチド合成方法を含む常用の標準的な方法を用いて製造することができる。ＨＧＢＶゲノムの任意の単一部分の相補体は満足すべきものであろう。完全相補性は、断片長さが増せば不要であり得るが、プローブとして使用するには望ましい。診断試薬として使用するときには、血液又は血清のような分析すべき試験試料を処理してもよく、例えば試料内に含まれる核酸を抽出する。試料から得られた核酸をゲル電気泳動又は他のサイズ分離技術に付してもよいし、核酸試料をサイズ分離せずにドットブロットしてもよい。次いで、プローブを標識する。ラベルをプローブに付着させるための適切なラベル及び方法は当業界では公知であり、ニックトランスレーション又はキナーゼ反応（kinasing）により取り込まれる放射性ラベル、ビオチン、蛍光及び化学発光プローブが含まれるが、これらに限定はされない。これらのラベルの例は多数本明細書に開示されている。次いで、試料から抽出した核酸を、適切な厳密度のハイブリダイゼーション条件下にて標識プローブで処理する。プローブをＨＧＢＶゲノムに対して完全に相補的にすることができる。従って、通常は偽陽性を回避するために厳密度の高い条件が望ましい。しかしながら、厳密度の高い条件は、プローブが異質性に欠けたＨＧＢＶゲノムの領域に相補的である場合にのみ使用すべきである。ハイブリダイゼーションの厳密度は、洗浄手順中の幾つかの要素（例えば温度、イオン強度、時間及びホルムアミド濃度）により決定される。例えばＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ（上掲）を参照されたい。ハイブリダイゼーションは幾つかの様々な技術により実施することができる。増幅は、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、ＮＡＳＢＡ等により実施することができる。ＨＧＢＶゲノム配列は、例えば約１０²〜１０³個の配列／ｍｌの比較的低レベルで、感染した個体の血清中に存在し得ると考えられる。このレベルでは、ハイブリダイゼーションアッセイで、リガーゼ連鎖反応又はポリメラーゼ連鎖反応のような増幅技術を使用する必要があり得る。このような技術は当業界では公知である。例えば、“バイオブリッジ”系は末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、非改変３’−ポリ−ｄＴ−テールを核酸プローブに付加する（ＥｎｚｏＢｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）。ポリ−ｄＴ−テールを有するプローブを標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、次いでビオチン改変ポリ−Ａにハイブリダイズする。更には、被分析物質を、酵素標識オリゴヌクレオチドと相補的な一本鎖ＤＮＡプローブにアニーリングし、得られたテール付き二本鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイがヨーロッパ特許第１２４２２１号に記載されている。ヨーロッパ特許第２０４５１０号は、被分析物質ＤＮＡを、テール（一例えばポリ−ｄＴ−テール）を有するプローブ、及びプローブのテールにハイブリダイズする配列（例えばポリ−Ａ配列）を有し、複数の標識鎖と結合し得るアンプリファイア鎖と接触させるＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを記載している。この技術はまず、血清中の標的ＨＧＢＶ配列を約１０⁶個の配列／ｍｌに増幅することからなり得る。これは、Ｓａｉｋｉ等、Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３（１９８６）に記載の方法に従って実施され得る。次いで、増幅した配列を、当業界では公知のようなハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出することができる。標識され得るプローブ核酸配列を含む診断キットにプローブをパッケージすることができる。あるいは、プローブを標識せずに、標識用成分をキットに含ませてもよい。キットは更に、特定のハイブリダイゼーションプロトコルに必要な又は望ましい他の適切にパッケージされた試薬や材料、例えばアッセイ実施のための標準物や指示書を含み得る。本発明で使用できる他の公知の増幅方法には、ＰＮＡＳＵＳＡ８７：１８７４−１８７８（１９９０）に教示され、Ｎａｔｕｒｅ：３５０（Ｎｏ．６３１３）：９１−９２（１９９１）でも議論されているいわゆる“ＮＡＳＢＡ”又は“３ＳＲ”技術や、Ｑ−βレプリカーゼが含まれるが、これらに限定はされない。本明細書に記載する試薬を用いて、蛍光インシトウハイブリダイゼーション（ “ＦＩＳＨ”）を実施することもできる。インシトウハイブリダイゼーションは、核酸ハイブリダイゼーション法により形態の損なわれていない組織、細胞又は染色体を採取して、特殊な遺伝情報の存在や、個体細胞内での前記情報の特定位置を実証することからなる。これは細胞の均質化及び標的配列の抽出を必要としないので、細胞集団中での配列の正確な位置や分布が判明する。インシトウハイブリダイゼーションは、細胞中に集中して含まれる問題の配列を同定し得、更には該配列を含む異質細胞集団中の細胞のタイプやフラクションを同定し得る。ＤＮＡ及びＲＮＡを同一のアッセイ試薬で検出することができる。ＰＮＡをＦＩＳＨ法で使用して、増幅せずに標的を検出することができる。シグナルの増加が望ましければ、多数の発蛍光団を使用してシグナルを増し、方法の感度を高めることができる。多数のオリゴヌクレオチドを用いる一工程法又は従来の多工程法を含む様々なＦＩＳＨ法が知られている。これらのタイプの方法を様々な手段（例えばフローサイトメトリー及び画像分析）により自動化できることは本発明の範囲内である。イムノアッセイ及び診断キットＨＧＢＶ抗体及びその複合体を含む血清と免疫反応するポリペプチド、及びこれらのポリペプチド中のＨＧＢＶ特異エピトープに対する抗体は共に、生物試験試料中でのＨＧＢＶ抗体の存在又はウイルス及び／もしくはウイルス抗原の存在を検出するイムノアッセイで有用である。これらのイムノアッセイの設計は変形を受けることが多く、これらの変形は当業界では公知である。これらの変形は本明細書に記載する。イムノアッセイは、１個のウイルス抗原（例えばＨＧＢＶ核酸配列を含むクローン、又はこれらのクローン中のＨＧＢＶ核酸配列に由来する複合核酸配列、又はこれらのクローン中の核酸配列のソースであるＨＧＢＶゲノムから誘導されるポリペプチド）を使用し得る。あるいは、このイムノアッセイは、これらのソースから誘導されるウイルス抗原を組み合わせて使用してもよい。イムノアッセイは例えば、同一ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体、又は異なるウイルス抗原に対するポリクローナル抗体を使用し得る。アッセイには、競合アッセイ、直接反応アッセイ又はサンドイッチ型アッセイに基づくものが含まれるが、これらに限定はされない。アッセイは、固相を使用してもよいし、免疫沈殿又は固相を使用しない他の任意の方法で実施してもよい。ラベルをシグナル生成化合物として使用するアッセイや、これらのラベルの例は本明細書に記載する。シグナルは更に、係属中の米国特許出願第６０８，８４９号、第０７０，６４７号、第４１８，９８１号、及び第６８７，７８５号に記載のビオチン及びアビジン、酵素ラベル又はビオチン抗ビオチン系を使用して増幅してもよい。ＨＧＢＶの免疫優性領域に由来するエピトープを含む組換えポリペプチドは、感染個体の生物試験試料でウイルス抗体を検出するのに有用であり得る。抗体は、急性感染と非急性感染とを識別するのに有用であり得るとも考えられる。適切な材料（例えばＨＧＢＶエピトープ又はＨＧＢＶエピトープに対する抗体を含む本発明のポリペプチド）を、アッセイの実施に必要な他の試薬や材料、及び適切なアッセイ指示書と一緒に適切な容器にパッケージングすることにより、適切な試薬を含んだ免疫診断に適したキットを製造する。本明細書に詳述する組換えタンパク質を使用するアッセイ方式を設計することができる。本発明者らはＣＫＳタンパク質を記載しているが、本発明でスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）等のような他の発現系を使用して、様々な方法で使用できる融合タンパク質、例えばイムノアッセイの抗原、抗体産生用免疫原等を産生できるとも考えられる。ヒト試験試料中の特異被分析物質（例えばウイルスのような感染物質）に対する抗体の存在を検出するためのアッセイ方式では、ヒト試験試料を、少なくとも１種の組換えタンパク質（ポリペプチド）でコーティングした固相と接触させてインキュベートする。試験試料中に抗体が存在すれば、この抗体は抗原ポリペプチドと複合体を形成して、固相に固定化する。複合体の形成後、固相を洗浄して未結合の物質や試薬を除去する。複合体を指示試薬と反応させて、第２の複合体形成のための時間及び条件下でインキュベートする。生成したシグナルを検出して、試験試料中でのＣＫＳ組換えポリペプチドに対する抗体の存在を調べる。カットオフ値より高いシグナル生成は、試験試料中に被分析物質に対する抗体が存在することを示す。酵素のような多数の指示試薬を用いると、存在する抗体の量は生成するシグナルに比例する。試験試料の種類によっては、試験試料を適切な緩衝試薬で希釈してもよいし、濃縮してもよいし、操作せずに（“ニート”）固相と接触させてもよい。例えば通常は、予め希釈した血清もしくは血漿試料を試験するか又は尿のような試料を濃縮して、抗体の存在及び／又は存在する抗体の量を調べることが好ましい。更には、研究中の感染物質のウイルスゲノムの様々な抗原エピトープに対するＣＫＳ融合タンパク質を使用して特異感染物質に対する抗体の存在を試験する前述のアッセイ方式では、２種以上の組換えタンパク質を使用することができる。従って、特異ウイルス抗原領域内のエピトープと、ウイルスゲノム由来の他の抗原領域に由来するエピトープとを含んでいる組換えポリペプチドを使用して、１種のエピトープに由来するポリペプチドを用いるよりも感度が増し、恐らくは特異性の高いアッセイを提供することが好ましいであろう。このようなアッセイは、確認（confirmatory）アッセイとして使用することができる。この特定のアッセイ方式では、既知量の試験試料を、組換えタンパク質／抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で少なくとも１種の組換えタンパク質でコーティングされた既知量の少なくとも１種の固相と接触させる。反応を生起するための時間、適切な条件下で、複合体を既知量の適切な指示試薬と接触させる。生成したシグナルを陰性試験試料と比較して、試験試料中での被分析物質に対する抗体の存在を調べる。微粒子のようなある種の固相を使用するときには、アッセイで使用される各組換えタンパク質が、個々の微粒子や、種々の被覆微粒子を合わせて製造される前記微粒子の混合物に付着して、各アッセイのために最適化され得る。前述のアッセイ方式の変形には、各被分析物質に対する抗体の存在を検出するための同一又は異なる固相に付着した種々の被分析物質のＣＫＳ組換えタンパク質（例えば同一又は異なる固相上にコーティングされた１種の感染物質のある抗原領域に特異的なＣＫＳ組換えタンパク質）を、異なる感染物質のある抗原領域に特異的なＣＫＳ組換えタンパク質と共に取り込んで、一方（又は両方）の感染物質の存在を検出することが挙げられる。他のアッセイ方式としては、抗原エピトープを含むＣＫＳ組換えタンパク質が、中和アッセイのような競合アッセイで有用である。中和アッセイを実施するには、ウイルスのような感染物質の抗原領域のエピトープを示す組換えポリペプチドを可溶化し、試料希釈液と混合して、０．５〜５０．０μｇ／ｍｌの最終濃度にする。所要により希釈した既知量の試験試料（好ましくは１０μｌ）を反応ウェルに添加し、次いで組換えポリペプチドを含む試験希釈液４００μｌを添加する。所望とあれば、混合物を約１５分〜２時間プレインキュベートしてもよい。次いで、本明細書に記載のＣＫＳ組換えタンパク質でコーティングした固相を反応ウェルに加え、約４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、既知量の指示試薬、例えば結合希釈液中のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ２００μｌを添加し、４０℃で１時間インキュベートする。洗浄後、前述のような酵素結合体を使用するときには、酵素基質（例えばＯＰＤ基質）を添加して、室温で３０分間インキュベートする。１Ｎ硫酸のような停止剤を反応ウェルに添加して、反応を停止させる。４９２ｎｍで吸光度を読み取る。特異ポリペプチドに対する抗体を含む試験試料では、溶液中でのペプチドと前記抗体との競合結合によるシグナル生成は減少する。競合結合のパーセンテージは、組換えポリペプチドの存在下での試料の吸光度値を、同一希釈度の組換えポリペプチドの不在下でアッセイした試料の吸光度値と比較して計算することができる。従って、組換えタンパク質の存在下の試料と、組換えタンパク質の不在下の試料との間で生じるシグナルの差は、抗体の存在又は不在を調べるために使用する尺度となる。他のアッセイ方式としは、イムノドットブロットアッセイ系で組換えタンパク質を使用することができる。イムノドットブロットアッセイ系は、ニトロセルロース固相担体上に並置された精製組換えポリペプチドのパネルを使用する。製造した固相担体を試料と接触させ、組換えタンパク質（他の特異結合要素）に対する特異抗体（特異結合要素）を捕捉して、特異結合要素対を形成する。捕捉した抗体は、指示試薬と反応させて検出する。１９８８年８月２日出願の米国特許出願第０７／２２７，４０８号に記載されている機器内でレフレクタンスオプチックスアセンブリーを用いて、結合体特異反応を定量することが好ましい。関連米国特許出願第０７／２２７，５８６号及び第０７／２２７，５９０号（共に１９８８年８月２日出願）、は更に、本出願人によるものであり、参考として本明細書に組み入れる米国特許第５，０７５，０７７号（１９８８年８月２日出願の米国特許出願第０７／２２７，２７２号）と同様に、イムノドットアッセイを実施するのに有用な特定方法や装置を記載している。簡潔に言えば、ニトロセルロースベースの試験カートリッジを多数の抗原ポリペプチドで処理する。各ポリペプチドは、試験カートリッジ上の特異反応ゾーン内に含まれている。全ての抗原ポリペプチドがニトロセルロース上に置かれた後に、ニトロセルロース上の過剰結合部位を阻止する。次いで、試験カートリッジを試験試料と接触させて、試験試料が適切な抗体を含めば各反応ゾーンの各抗原ポリペプチドが反応するようにする。反応後、試験カートリッジを洗浄し、よく知られた適切な試薬を用いて、任意の抗原抗体反応を同定する。本明細書に引用した特許及び特許出願に記載されているように、全プロセスは自動化可能である。イムノドットブロットアッセイを実施するための方法及び装置に関連する前記出願明細書は参考として本明細書に組み入れる。試験試料中に被分析物質の特異抗原に対する抗体を検出するために後述する第１及び第２の固相担体を使用するアッセイでＣＫＳ融合タンパク質を使用することができる。このアッセイ方式では、試験試料の第１のアリコートを、組換えタンパク質／被分析物質抗体複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、被分析物質に特異的なＣＫＳ組換えタンパク質でコーティングされた第１の固相担体と接触させる。次いで、複合体を、組換え抗原に特異的な指示試薬と接触させる。指示試薬を検出して、試験試料中での組換えタンパク質に対する抗体の存在を調べる。その後、試験試料の第２のアリコートを、組換えタンパク質／第２の抗体の複合体を形成するのに十分な時間及び条件下で、第２の抗体に特異的なＣＫＳ組換えタンパク質でコーティングされた第２の固相担体と接触させて、同一被分析物質の異なる抗原決定基の存在を調べる。複合体を、複合体の抗体に特異的な第２の指示試薬と接触させる。シグナルを検出して、試験試料中での抗体の存在を調べる。一方又は両方の被分析物質組換えタンパク質に対する抗体の存在は、試験試料中に抗被分析物質が存在することを示している。固相担体を同時に試験できるとも考えられる。ハプテンの使用は当業界では公知である。ＣＫＳ融合タンパク質を用いるアッセイでハプテンを使用して、アッセイの性能を高めることもできると考えられる。プローブを用いたＨＧＢＶゲノム、ビリオン及びウイルス抗原の更なる特性分析ＨＧＢＶ核酸配列を使用して、ＨＧＢＶゲノムの配列、並びにＨＧＢＶ剤の同定及び単離について更なる情報を得ることができる。従って、この知識は、ＨＧＢＶの特性（例えばＨＧＢＶゲノムの種類、ウイルス粒子の構造、及びＨＧＢＶを構成する抗原の種類）の分析に役立つと考えられる。この情報により、付加的なポリヌクレオチドプローブ、ＨＧＢＶゲノムに由来するポリペプチド、及びＨＧＢＶエピトープに対する抗体を得ることができる。これらは、ＨＧＢＶにより発病する非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の診断及び／又は治療に有益である。核酸配列情報は、ＨＧＢＶゲノムの非確定領域に由来する更なる核酸配列を単離するためのプローブ又はＰＣＲプライマーの設計に有用である。例えば、８個以上、好ましくは２０個以上のヌクレオチドの配列を含み、ＨＧＢＶ核酸配列ファミリーの５’末端又は３’末端に近い領域に由来するＰＣＲプライマー又は標識プローブを使用して、重複核酸配列をＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから単離してもよいし、ウイルス核酸から直接単離してもよい。次いで、ＨＧＢＶ核酸配列と重複するが、該ＨＧＢＶ核酸配列のソースではないゲノムの領域に由来する配列を更に含んでいる前記配列を使用して、必ずしもクローン中の核酸配列とは重複しない他の重複断片を同定するためのプローブを合成してもよい。ＨＧＢＶゲノムがセグメント化されていても共通配列が欠けていれば、ウイルスゲノムに由来する重複核酸配列の単離技術を使用して、全ウイルスゲノムの配列を決定することが可能である。あるいは、精製したＨＧＢＶ粒子から単離したウイルスゲノムから、ゲノムセグメントの特性分析を行うことができる。ＨＧＢＶ粒子を精製し、精製手順中に該粒子を検出する方法は本明細書に記載する。ウイルス粒子からポリヌクレオチドゲノムを単離する手順は当業界ではよく知られている。次いで、単離したゲノムセグメントをクローニングして配列決定することができる。従って、ＨＧＢＶゲノムをその種類とは関係なくクローニングして配列決定することが可能である。ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡライブラリーの構築方法は当業界では公知であり、このために有用なベクターも当業界では公知である。これらのベクターには、λ−ｇｔ１１、λ−ｇｔ１０等が含まれる。単離したポリヌクレオチドを適切な制限酵素で消化して、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡ由来のプローブにより検出されるＨＧＢＶ由来の核酸配列をクローンから単離し、配列決定してもよい。これらの重複ＨＧＢＶ核酸配列に由来する配列情報は、ウイルスゲノム内の相同性エリア及び異質性エリアを決定するのに有用である。これは、種々のゲノム株及び／又は欠陥粒子集団の存在を示し得る。これは、本明細書に記載の技術を使用して、ＨＧＢＶの単離中に、生物試料中のＨＧＢＶ又はＨＧＢＶ抗原又はＨＧＢＶ核酸を検出するためのハイブリダイゼーションプローブの設計にとっても有用である。重複核酸配列を使用して、ＨＧＢＶゲノム由来のポリペプチドに対する発現ベクターを産生してもよい。ＨＧＢＶに対してユニークであると考えられるエピトープを含む抗原が核酸配列ファミリー内にコードされている。即ち、これらの抗原に対する抗体は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ及びＨＥＶに感染した個体には存在せず、ＧｅｎＢａｎｋのゲノム配列と、これらの核酸配列及び前記ソースのポリヌクレオチド配列との間の相同性は小さいと考えられる。従って、ＨＧＢＶ核酸配列でコードされた抗原に対する抗体を使用して、感染個体から単離した非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型粒子を同定してもよい。更には、これらはＨＧＢＶ物質の単離にも有用である。ＨＧＢＶ粒子は、例えばサイズ識別をベースとする技術（例えば沈降もしくは排除法）、又は密度をベースとする技術（例えば密度勾配超遠心分離、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような物質による沈殿、もしくはアニオンもしくはカチオン交換材料や、疎水性相互反応により結合する材料、及び親和性カラムのような様々な材料でのクロマトグラフィー）を含む当業界で公知の任意の方法により、感染個体の血清又は細胞培養物から単離することができる。単離手順中に、ＨＧＢＶ核酸配列に由来するプローブを用いて抽出ゲノムのハイブリダイゼーション分析を行って、又はＨＧＢＶ核酸配列ファミリー内にコードされたＨＧＢＶ抗原に対する抗体をプローブとして使用するイムノアッセイによりＨＧＢＶの存在を検出することができる。抗体はポリクローナルであっても、モノクローナルであってもよく、抗体をイムノアッセイで使用する前に精製することが所望され得る。固相に固定化したＨＧＢＶ抗原に対する前記抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによるＨＧＢＶの単離に有用である。イムノアフィニティークロマトグラフィー法は当業界では公知であり、免疫選択活性を保持するように抗体を固相に固定化する方法を含んでいる。これらの方法には、吸着及び共有結合が含まれる。抗体の抗原結合部位が接近可能なままであるように、二官能価カップリング剤にスペーサー基を含ませてもよい。精製手順中に、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡ配列ファミリー、及び重複ＨＧＢＶ核酸配列に由来するポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして使用して、ＨＧＢＶの存在を核酸ハイブリダイゼーション又はＰＣＲにより検出及び／又は検証してもよい。ウイルス粒子の破壊を引き起こす条件下で、例えばキレート化剤の存在下で洗剤を使用して画分を処理し、ウイルス核酸の存在をハイブリダイゼーション技術又はＰＣＲにより調べる。個体（好ましくはタマリン）に単離したウイルス粒子を感染させ、次いで本明細書に記載の非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型及び非Ｅ型肝炎の症状が感染によるものかどうかを調べることにより、単離した粒子がＨＧＢＶ感染誘発物質である別の確証が得られ得る。次いで、精製した調製物から得た前述のウイルス粒子の特性を更に分析することができる。ゲノム核酸を精製すれば、これを試験して、ＲＮＡｓｅ又はＤＮＡｓｅＩに対する感度を調べることができる。これらの試験に基づいて、ＨＧＢＶをＲＮＡゲノム又はＤＮＡゲノムとして調べてもよい。当業界で公知の方法により、例えば電子鏡検法による可視化、密度勾配による移動及び沈降特性により、鎖の数及び環状性又は非環状性を調べることができる。ＨＧＢＶゲノムのハイブリダイゼーションから、精製核酸の陰性又は陽性鎖数（strandedness）を調べることができる。更には、ゲノム材料がＲＮＡならば、公知の技術（例えば逆転写酵素）により精製核酸をクローニングして配列決定することができる。次いで、ウイルス粒子に由来する核酸を用いて、全ゲノムをセグメント化の如何を問わず配列決定することが可能である。保存された配列を含むポリペプチドの決定は、ＨＧＢＶゲノムと結合するプローブ選択に有用であり、それはプローブを単離することにつながる。更には、保存された配列を、ＨＧＢＶ核酸配列に由来する配列と一緒に使用して、ゲノム配列を増幅する系で使用するプライマーを設計してもよい。更には、ＨＧＢＶの構造を調べて、その成分を単離してもよい。例えば電子鏡検法により形態及び寸法を調べることができる。抗原が主要ウイルス成分中に存在するのか、少量ウイルス成分中に存在するのかを確かめ、単離した核酸配列内にコードされた特異抗原に対する抗体をプローブとして使用して、特異ウイルスポリペプチド抗原［例えばエンベロープ（コート）抗原又は内部抗原（例えば核酸結合タンパク質もしくはコア抗原）］や、ポリヌクレオチドポリメラーゼを同定して位置を調べることもできる。この情報は、診断及び治療用途に有用であり得る。例えば、ワクチン調製物中に外部抗原を含めることが好ましく、又は恐らく多価ワクチンは、構造タンパク質をコードするゲノムに由来するポリペプチド、及びゲノムの他の部分に由来するポリペプチド（例えば非構造ポリペプチド）からなり得る。ＨＧＢＶ複製用の細胞培養系及び動物モデル系一般に、ＨＧＢＶの培養に適した細胞又は細胞系は、サル腎臓細胞（例えばＭＫ２及びＶＥＲＯ）、ブタ腎臓細胞系（例えばＰＳ）、ハムスター乳児腎臓細胞系（例えばＢＨＫ）、マウスマクロファージ細胞系（例えばＰ３８８Ｄ１、ＭＫ１及びＭｍｌ）、ヒトマクロファージ細胞系（例えばＵ−９３７）、ヒト末梢血白血球、ヒト付着単球、肝細胞又は肝細胞系（例えばＨＵＨ７及びＨｅｐＧ２）、胚もしくは胚細胞（例えばニワトリ胚線維芽細胞）、又は無脊椎動物、好ましくは昆虫に由来する細胞系（例えばショウジョウバエ細胞系）、更に好ましくは節足動物に由来する細胞系（例えば蚊細胞系もしくはマダニ細胞系）を含み得る。一次肝細胞を培養し、次いでこれにＨＧＢＶを感染させることも可能である。あるいは、肝細胞培養物を、感染個体（ヒト又はタマリン）の肝臓から誘導することができる。後者の場合は、ｉｎｖｉｖｏ感染させてｉｎｖｉｔｒｏ継代させた細胞系の例である。更には、種々の不死化方法を使用して、肝細胞培養物に由来する細胞系を得ることができる。例えば、（肝細胞集団の増菌前後の）一次肝臓培養物を種々の細胞と融合して、安定性を維持することができる。更には、培養物に形質転換ウイルスを感染させるか、形質転換遺伝子をトランスフェクトして、永続的な又は半永続的な細胞系を生成してもよい。更には、肝臓培養物中の細胞を融合して、ＰｅｈＧ２のような確定した細胞系にしてもよい。細胞融合方法は当業者にはよく知られており、とりわけＰＥＧ及びセンダイウイルスのような融合剤の使用を含んでいる。細胞系のＨＧＢＶ感染は、細胞内へのウイルス侵入を可能とする条件下で、細胞をウイルス調製物と共にインキュベートするような技術により達成され得ると考えられる。細胞に、単離したウイルスポリヌクレオチドをトランスフェクトさせてウイルス調製物を得ることも可能であり得る。組織培養細胞をトランスフェクトする方法は当業界では公知であり、エレクトロポレーション及びＤＥＡＥ− デキストラン又はリン酸カルシウムによる沈殿を使用する技術が含まれるが、これに限定はされない。クローニングしたＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡによるトラスフェクションでウイルスが複製され、ｉｎｖｉｔｒｏ増殖する。培養した細胞の他に、ウイルス複製に動物モデル系を使用してもよい。従って、ＨＧＢＶ複製はチンパンジー、更には例えばマーモセット及び乳児マウスで生起し得る。ＨＧＢＶ抗ウイルス剤のスクリーニングＨＧＢＶ用の細胞培養系及び動物モデル系が利用できることから、ＨＧＢＶ複製を阻害する抗ウイルス剤、特に好ましくはウイルス複製を阻害しつつ細胞増殖を可能とする物質のスクリーニングも可能となる。これらのスクリーニング方法は当業界では公知である。一般に、ウイルス複製を支える細胞培養系で抗ウイルス剤がウイルス複製の阻止に及ぼす作用、次いで感染性又はウイルス病原性の阻害、また低レベルの毒性について、抗ウイルス剤を様々な濃度で動物モデル系にて検査する。本明細書に記載するＨＧＢＶ抗原及びＨＧＢＶポリヌクレオチドの検出のための方法及び組成物は、抗ウイルス剤のスクリーニングに有用である。何故ならば、これらは、抗ウイルス剤のウイルス複製への作用の検出については、細胞プラークアッセイ又はＩＤ₅₀アッセイよりも恐らく高感度の代替手段となるからである。例えば、本明細書に記載するＨＧＢＶポリヌクレオチドプローブを使用して、細胞培養物中に産生されるウイルス核酸の量を定量してもよい。これは、感染細胞核酸を標識したＨＧＢＶポリヌクレオチドプローブでハイブリダイズ又は競合ハイブリダイズすることにより実施され得る。更には、抗ＨＧＢＶ抗体を使用して、本明細書に記載するイムノアッセイにより、細胞培養物中のＨＧＢＶ抗原を同定、定量してもよい。更には、競合アッセイにより感染細胞培養物中のＨＧＢＶ抗原を定量することが所望され得るので、本明細書に記載するＨＧＢＶ核酸配列内にコードされるポリペプチドはこれらのアッセイで有用である。一般に、ＨＧＢＶゲノム又はｃＤＮＡに由来する組換えＨＧＢＶポリペプチドを標識し、細胞培養系で産生された抗原による、前記標識ポリペプチドとＨＧＢＶポリペプチドとの結合の阻害を監視する。これらの方法は、ＨＧＢＶが細胞死を起こさずに細胞系で複製し得る場合に特に有用である。ＨＧＢＶ弱毒化株の調製本明細書に記載する組織培養系及び／又は動物モデル系を用いて、ＨＧＢＶ弱毒化株を単離することが可能であり得る。これらの弱毒化株は、ワクチンとして又はウイルス抗原の単離に有用である。弱毒化株は、細胞培養物及び／又は動物モデルに何度も継代させた後に単離することができる。感染した細胞又は個体での弱毒化株の検出は、当業界で公知の以下の方法に従って達成可能であり、検出には、ＨＧＢＶにコードされた１種以上のエピトープに対する抗体のプローブとしての使用、又は長さが少なくとも約８ヌクレオチドのＨＧＢＶ配列を含むポリヌクレオチドのプローブとしての使用が含まれ得る。これに加え又はこれに代わって、本明細書に記載するＨＧＢＶのゲノム情報を使用し、また組換え技術を使用して弱毒化株を構築してもよい。通常、ウイルス複製ではなく、病原性に関連するポリペプチドをコードするゲノムの領域を欠失させる。ゲノムを構築すれば、ＨＧＢＶに対する中和抗体を産生するエピトープを発現させることができる。次いで、変性ゲノムを使用して、ＨＧＢＶ複製を可能とする細胞を形質転換して、細胞をウイルス複製を可能とする条件下で増殖させることができる。弱毒化ＨＧＢＶ株はワクチン用としてだけでなく、ウイルス抗原の商業的産生のソースとしても有用である。何故ならば、これらのウイルスの処理は、ウイルス産生及び／又はウイルス製品の製造に係わる従業員に対してそれほど厳密な保護措置を必要としないからである。宿主及び発現制御配列ゲノムをウイルスから抽出し、ゲノムライブラリーを作成、プロービングし、クローンの配列を決定し、発現ベクターを構築し、細胞を形質転換し、免疫アッセイを実施し、培養物中で細胞を増殖させるために使用する一般的な技術は当業界では公知であり、本発明に包含する。指定の宿主と適合する適切な制御配列を使用するときには、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方を、所望のコード化配列の発現のために使用することができる。原核宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉが最も頻繁に使用される。原核生物の発現制御配列には、場合によってオペレーター部分を含むプロモーターや、リボソーム結合部位が含まれる。原核宿主と適合するトランスファーベクターは通常、アンピシリン耐性及びテトラサイクリン耐性を付与するオペロンを含むプラスミドｐＢＲ３２２や、更に抗生物質耐性マーカーを付与する配列を含む種々のｐＵＣベクターから誘導される。これらのマーカーを使用して、選択により良好な形質転換細胞を得ることができる。通常使用される原核生物制御配列には、 β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ１９８：１０５６［１９７７］）、（Ｇｏｅｄｄｅｌ等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ８：４０５７［１９８０］により報告されている）トリプトファンプロモーター系、λ誘導Ｐ１プロモーター及びＮ遺伝子リボソーム結合部位（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ等，Ｎａｔｕｒｅ２９２：１２８［１９８１］）、並びにｔｒｐ及びｌａｃＵＶ５プロモーターの配列に由来するハイブリッドＴａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２９２：１２８［１９８３］）が含まれる。前述の系は、特にＥ．ｃｏｌｉに適合し得るが、所望とあれば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株のような他の原核宿主を対応する制御配列と共に使用してもよい。真核宿主は、培養系の酵母及び哺乳動物細胞を含んでいる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓが最も一般的に使用されている酵母宿主であり、好都合な真菌宿主である。酵母適合性ベクターは、栄養要求突然変異株を原栄養性とするか又は野生型株に重金属耐性を付与して良好な形質転換細胞の選択を可能とするマーカーを保有する。酵母適合性ベクターは、２ミクロン複製オリジン（Ｂｒｏａｃｈ等，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１；３０７［１９８３］）、ＣＥＮ３とＡＲＳ１の組み合わせ、又は複製を行うための他の手段（例えば宿主細胞ゲノム内への適切な断片の取り込みをもたらす配列）を使用し得る。酵母ベクターの制御配列は当業界では公知であり、３−ホスホフィセレートキナーゼ（phosphophycera te kinase）用プロモーターを含む解糖酵素合成用プロモーターを含んでいる。例えば、Ｈｅｓｓ等，Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．７：１４９（１９６８）、Ｈｏｌｌａｎｄ等，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：４９００（１９７８）及びＨｉｔｚｅｍａｎＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０）を参照されたい。Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５（１９８１）に報告されているエノラーゼ遺伝子に由来するようなターミネーターも含まれ得る。特に有用な制御系は、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーター又はアルコールデヒドロゲネーゼ（ＡＤＨ）調節可能プロモーター、更にＧＡＰＤＨから誘導されるターミネーター、また分泌が望ましければ、酵母αファクターに由来するリーダー配列を含む系であると考えられる。更には、操作可能に連結した転写調節領域及び転写開始領域は、野生型生物で先天的に関連しないようなものであり得る。発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当業界では公知であり、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能な多数の不滅化細胞系が含まれる。これらには、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハムスター乳児腎臓（ＢＨＫ）細胞等が含まれる。哺乳動物細胞に適したプロモーターも当業界では公知であり、Ｓｉｍｉａｎウイルス４０（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、ウシ乳頭腫ウイルス（ＢＰＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来するようなウイルスプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞は更に、ターミネーター配列及びポリＡ付加配列を必要とし得る。発現を増加させるエンハンサー配列を含めてもよいし、遺伝子の増幅を誘発する配列も所望され得る。これらの配列は当業界では公知である。哺乳動物細胞の複製に適したベクターは、ウイルスレプリコン、又は非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型エピトープをコードする適切な配列の宿主ゲノム内への取り込みを確実にする配列を含み得る。ＨＣＶの哺乳動物発現系の一例は、１９９２年１月３１日出願の米国特許出願第０７／８３０，０２４号に記載されている。形質転換形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための公知の方法によって可能であり、ポリヌクレオチドをウイルス内に組み込んだウイルスによる宿主細胞の形質導入、及びポリヌクレオチドの直接取り込みを含む。選択する形質転換手順は、形質転換すべき宿主に依存する。直接の取り込みによる細菌の形質転換は一般に、塩化カルシウム又は塩化ルビジウムによる処理を使用する。Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：２１１０（１９７２）。Ｇｒａｈａｍ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：５２６（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法又はその変形を用いて、直接の取り込みによる酵母形質転換を実施してもよい。ベクター構築ベクター構築は当業界で公知の方法を使用する。一般には、市販酵素の製造業者により一般に規定されている条件下にて、適切な制限酵素で処理して、部位特異的ＤＮＡ開裂を実施する。通常、約２０μｌの緩衝溶液中の１〜１０単位の酵素を用いて３７℃で１〜２時間インキュベートすることにより、約１マイクログラム（μｇ）のプラスミド又はＤＮＡ配列を開裂する。制限酵素と共にインキュベートした後に、フェノール／クロロホルム抽出によりタンパク質を除去し、エタノールと共に沈殿させてＤＮＡを回収する。開裂断片は、当業者に公知の方法により、ポリアクリルアミド又はアガロースゲル電気泳動法を用いて分離してもよい。混合物中に存在する適切なデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で，Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１（クレノウ）を用いて付着端開裂断片をブラント末端にしてもよい。Ｓ１ヌクレアーゼによる処理を使用して、一本鎖ＤＮＡ部分を加水分解してもよい。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＡＴＰを用い、標準的な緩衝液及び温度条件下で結合する。付着端結合は、ブラント末端結合ほどＡＴＰやリガーゼを必要としない。ベクター断片を結合混合物の一部として使用するときは、ベクター断片をしばしば細菌アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）又は仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理して、５’−ホスフェートを除去し、ベクターの再結合を妨げる。あるいは、所望しない断片の制限酵素消化を使用して、結合を妨げることができる。結合混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉや、抗生物質耐性を含む方法により選択された良好な形質転換細胞のような適切なクローニング宿主内に形質転換し、次いで正しい構築についてスクリーニングする。望ましいＤＮＡ配列の構築Ｗａｒｎｅｒ，ＤＮＡ３：４０１（１９８４）が記載するような自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて、合成オリゴヌクレオチドを産生してもよい。所望とあれば、標準的な反応条件を用いて、³²Ｐ−ＡＴＰの存在下にてポリヌクレオチドキナーゼで処理して、合成鎖を³²Ｐで標識することができる。ＤＮＡ配列（例えばゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから単離したＤＮＡ配列）を、公知の方法［例えばＺｏｌｌｅｒ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．１０：６４８７（１９８２）に記載の特定部位の突然変異誘発］により改変してもよい。簡潔に言えば、改変すべきＤＮＡを一本鎖配列としてファージ内にパッケージングし、改変すべきＤＮＡ部分に相補的であり、自身の配列に所望の改変を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＤＮＡポリメラーゼで二本鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複製域を含む形質転換細菌の培養物を寒天平板培養して、プラークを得る。理論的には新しいプラークの５０％が、突然変異配列を有するファージを含み、残りの５０％は元の配列を有する。非改変配列ではなく、正しい鎖とのハイブリダイゼーションに適した温度及び条件下で、プラーク複製物を標識した合成プローブにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションにより同定された配列を回収して、クローニングする。プローブとのハイブリダイゼーションＧｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３：３９６１（１９７５）に記載の手順を用いて、ＨＧＢＶゲノム又はＤＮＡライブラリーをプロービングしてもよい。簡潔に言えば、プロービングすべきＤＮＡをニトロセルロースフィルター上に固定化し、変性し、０〜５０％ホルムアミド、０．７５ＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、それぞれ０．０２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ポリビニルピロリドン及びＦｉｃｏｌｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％ＳＤＳ並びに１００μｇ／ｍｌキャリヤー変性ＤＮＡを含む緩衝液でプレハイブリダイズする。緩衝液中のホルムアミドのパーセンテージ、及びプレハイブリダイゼーションやその後のハイブリダイゼーション工程の時間／温度条件は、必要とされる厳密度に依存する。厳密度条件が低くてもよいオリゴマープローブは一般に、ホルムアイドを低率に、温度をより低く、ハイブリダイゼーション時間をより長くして使用する。ＣＤＮＡ又はゲノム配列から誘導されるような３０又は４０個以上のヌクレオチドを含むプローブは一般に、例えば約４０〜４２℃のより高温と、例えば５０％と高率のホルムアミドを使用する。プレハイブリダイゼーションの後に、³²Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブを緩衝液に添加し、ハイブリダイゼーション条件下でフィルターをこの混合物中でインキュベートする。洗浄後、被処理フィルターをオートラジオグラフィーにかけて、ハイブリダイズしたプローブの位置を示す。元の寒天プレート上の対応位置にあるＤＮＡを所望のＤＮＡのソースとして使用する。構築の検証及び配列決定標準的なベクター構築では、結合混合物をＥ．ｃｏｌｉ株ＸＬ−１Ｂｌｕｅ又は他の適切な宿主内に形質転換し、良好な形質転換細胞を抗生物質耐性又は他のマーカーにより選択する。次いで、通常はＣｌｅｗｅｌｌ等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０：６６７（１９７２）に記載のようなクロラムフェニコール増幅の後に、Ｃｌｅｗｅｌｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６２：１１５９（１９６９）の方法で、形質転換細胞由来のプラスミトを産生する。ＤＮＡを単離し、通常は制限酵素分析及び／又は配列決定により分析する。Ｍｅｓｓｉｎｇ等，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．９：３０９（１９８１）にも記載されているＳａｎｇｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３（１９７７）のよく知られたジデオキシ法により、又はＭａｘａｍ等，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６５：４９９（１９８０）に記載の方法により、配列決定してもよい。ＧＣに富む領域で時々観察されるバンド圧縮の問題は、Ｂａｒｒ等，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：４２８（１９８６）に記載の方法により、Ｔ−デアゾグアノシンを用いて克服される。エンザイムリンクドイムノソーベントアッセイエンザイムリンクドイムノソーベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、抗原濃度又は抗体濃度を測定することができる。この方法は、酵素ラベルと抗原又は抗体との結合に依存し、結合酵素活性（生成シグナル）を定量ラベル（測定可能な生成シグナル）として使用している。酵素をラベルとして使用する方法、及びこのような酵素ラベルの例は本明細書に記載する。ＨＧＢＶ核酸配列の作成非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型物質のソースは、本明細書に記載する臨床的及び実験的基準に合致するＨＧＢＶウイルスに感染したヒト又はタマリンからの個々の血漿、血清もしくは肝臓ホモジネート又はそのプールである。あるいは、以下に記載する基準に合致する非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型肝炎に羅患した他の個体の血液をタマリンに実験的に感染させることができる。高レベルのアラニントランスフェラーゼ活性を含む個々の血漿、血清又は肝臓ホモジネート試料を多数合わせてプールを調製することができる。この活性は、ＨＧＢＶ感染による肝炎性損傷によるものである。本発明者らの実験のひとつで計算したウイルスのＴＩＤ（タマリン感染価）は４×１０⁵個／ｍｌ以上であった（以下の実施例２を参照）。例えば、高力価であることが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい血漿、血清又は肝臓ホモジネートに由来する核酸ライブラリーを以下の方法で作成する。まず血漿、血清又は肝臓ホモジネートからウイルス粒子を単離する。次いで、アリコートを緩衝溶液（例えば５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ、１００ｍＭＮａＣｌを含む緩衝溶液）中に希釈する。例えば１５，０００×ｇ、２０℃で２０分間の遠心分離により破片を除去する。次いで、当業者により慣用的に決定され得る適切な条件下で遠心分離を行って、得られた上清中のウイルス粒子をペレット化する。ウイルスゲノムを放出するために、ペレットをＳＤＳ懸濁液［例えば１％ＳＤＳ、１２０ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含み、更に２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含んでいる懸濁液］のアリコート中に懸濁させ、次いで適切な条件下で、例えば４５℃で９０分間インキュベートして粒子を破壊する。例えば０．８μｇＭＳ２バクテリオファージＲＮＡをキャリヤーとして添加し、この混合物をフェノール：クロロホルム［０．５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノール、０．１％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノロンで飽和させたフェノール］の１：１混合物で４回抽出し、次いでクロロホルムで２回抽出して核酸を単離する。水性相を例えば１−ブタノールで濃縮した後に、２．５容量の無水エタノールと共に−２０℃で一晩沈殿させる。例えばＢｅｃｋｍａｎＳＷ４１ローターにて、４０，０００ｒｐｍ、４℃で９０分間遠心分離にかけて核酸を回収し、これを水に溶解し、０．０５％（ｖ／ｖ）ジエチルピロカーボネートで処理して、オートクレーブ処理する。前記手順により得られた核酸を、例えば１７．５ｍＭＣＨ₃ＨｇＯＨで変性し、次いでこの変性核酸を鋳型として用いてｃＤＮＡを合成し、例えばＨｕｙｎｈ（１９８５、上掲）に記載の方法を用いてファージλ−ｇｔ１１のＥｃｏＲＩ部位内にクローニングする。但し、逆転写酵素により第１核酸鎖の合成中にランダムプライマーをオリゴ（ｄＴ）１２−１８に代える（Ｔａｙｌｏｒ等，［１９７６］参照）。得られた二本鎖核酸配列を、例えばセファロースＣＬ−４Ｂカラム上でのサイジングにより分別する。平均寸法が約４００、３００、２００及び１００塩基対の溶離材料をゲノムプール内にプールする。少なくとも１つのプール内のｃＤＮＡから、λ−ｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーを作成する。あるいは、病因物質がＤＮＡウイルスの場合、ゲノムＤＮＡのクローニング方法が有用であり、これは当業者には公知である。このようにして作成されたλ−ｇｔ１１ゲノムライブラリーを、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｅ型肝炎既往個体（以下で説明する基準に合致する）からの血清、血漿又は肝臓ホモジネートと特異結合し得るエピトープについてスクリーニングする。Ｈｕｙｎｇ等（上掲）の方法を用いて、約１０⁴〜１０⁷個のファージを血清、血漿又は肝臓ホモジネートを用いてスクリーニングする。¹²⁵ Ｉ又は他の適切なリポーター分子（例えばＨＲＰＯ、アルカリ性ホスファターゼ等）で放射性標識したヒツジ抗ヒトＩｇ抗血清で結合ヒト抗体を検出することができる。陽性ファージを同定して、精製する。次いで、同一方法を用い、先にＨＧＢＶ物質に感染した所定人数の各ヒトの血清との結合の特異性について、前記ファージを試験する。理想的には、ファージは、試験する血清、血漿又は肝臓ホモジネートの全て又は大半と反応するポリペプチドをコードし、ＨＧＢＶ物質やＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎について本明細書に記載した基準により“陰性”であることが確定した個体からの血清、血漿又は肝臓ホモジネートとは反応しない。これらの手順に従って、非Ａ型、非Ｂ型、非Ｃ型、非Ｄ型、非Ｅ型であると同定された患者からの血清、血漿又は肝臓ホモジネートにより免疫学的に特異認識されるポリペプチドをコードするクローンを単離することができる。以下で本発明を実施例により説明する。これらの実施例は例示的であって、本発明の範囲を限定するものではない。実施例本明細書に記載されている実施例は、ＨＧＢＶ群のウイルスの発見方法を詳細に記載するものである。該実施例は、ＨＧＢＶ群のＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃウイルスの発見をたどり得るように年代順に記載されている。一般的には、先ず伝播性及び感染性の研究が行われた。本明細書に記載されているこれらの研究及びその後の研究により、ＨＧＢＶとしてＧＢ−Ａ及びＧＢ−Ｂの２種のＨＣＶ様ウイルスの存在が実証された。さらに、これも本明細書に詳細に記載されている退化性（degenerative）プライマーを用いたその後の実験によりＨＧＢＶ−Ｃが発見された。血清研究により実証された該ウイルス群のヒトにおける罹患率、該ウイルス群のウイルス特性分析、その特定の属における他のウイルスとの関連性及びＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ及びＨＧＢＶ−Ｃの相互関連性も教示する。実施例１．ＨＧＢＶの伝播性Ａ．実験プロトコル。伝播性及び感染性研究用に、ＬＥＭＳＩＰ（Laboratory f or Experimental Medicine and Surgery in Primates，Tuxedo，New York）から１６匹のタマリン（Saguinus labiatsu）を入手した。動物全てをＬＥＭＳＩＰにより承認されたプロトコルに従ってＬＥＭＳＩＰで維持且つ監視した（注：動物１匹が自然死し、もう１匹の病弱な動物は感染力実験の開始前に安楽死させた）。血清肝酵素アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＣＤ）について、２〜３週間の間、１週間に一度又は２週間に一度得た血清試料に基づいて基準血清肝酵素値を決定した。接種に先立って各動物につき最低８つの血清肝酵素値を得た。平均肝酵素値＋標準偏差の３．７５倍に基づき、各動物についてカットオフ値（ＣＯ）を決定した。カットオフ値を超える肝臓酵素値は異常であり、肝臓が損傷を受けているとみなした。数匹のタマリンに以下に記載のように接種し、ＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤ血清レベルにおける変化を監視した。その後、監視過程の間の特定時期に、その後の実験用の血清及び組織を得るべく動物数匹を殺した。Ｂ．動物の接種（初期実験）。ＨＧＢＶを接種した９匹のタマリンから肝炎の初期急性期（接種後１９〜２４日）の間に採取した血清から、既知の感染性タマリンＧＢ血清プール（Ｈ２０５ＧＭＧパス１１として示される１１回継代）を調製した。該プールは、既に記載（J.L．Dienstagら，Nature 264，前出；E.Taborら,J．Med．V irol．5，前出）されており、関連病因物質を決定するために研究された。該プールのアリコートは、この実験研究に用いられるまでAbbott Laboratories（Nor th Chicago，IL60064）において液体窒素貯蔵条件下に維持されていた。ＨＧＢＶの他のアリコートはAmerican Type Culture Collection（A.T.C.C.），12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852から、A.T.C.C.受託番号第VR-806号の下に入手し得る。第１日目に、初期群の残りの１４匹中４匹ののタマリン、認識番号Ｔ−１０５３、Ｔ−１０４８、Ｔ−１０５７及びＴ−１０６１に、前以て１：５０に希釈しておいたプールＨ２０５、１１回継代０．２５ｍｌを静脈内接種した。これらの動物を肝酵素ＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤの変化について毎週監視した。表２は、これら４匹のタマリン（Ｔ−１０５３、Ｔ−１０４８、Ｔ−１０５７及びＴ−１０６１）に関する接種前及び接種後の肝酵素データを示す。図１〜４は、接種前及び接種後のこれら４匹のタマリンのＡＬＴレベル及びＩＣＤレベルを示している。該データが示しているように、プールＨ２０５の１：５０の希釈物を接種した４匹のタマリンのＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤにＣＯを超える有意な上昇が得られた。同日（第１日目）、１匹のタマリン（Ｔ−１０４７）に、プールされた正常タマリン血清０．２５ｍｌを静脈内接種して陰性対照として用い、もう１匹のタマリン（Ｔ−１０４２）には、プールされた正常ヒト血清を静脈内接種して追加の陰性対照とした。図５及び図６並びに表３は、２匹の対照タマリン（Ｔ−１０４７及びＴ−１０４２）の接種前及び接種後のＡＬＴ及びＩＣＤレベルを示す。データが示しているように、該２匹の対照タマリンにおいては８週の間にＡＬＴ又はＩＣＤに全く上昇が見られなかった。同日（第１日目）、１匹のタマリン（Ｔ−１０４４）に、急性肝炎の発生から約３週間後の前記外科医（ＧＢ起源）から得た回復期血清０．２ｍｌを静脈内接種した。この標本は−２０℃で貯蔵されていた〔F．Deinhardtら，J．Exper．Me d. 125:673-688(1967)〕。もう１匹のタマリン（Ｔ−１０３４）に、該回復期血清０．１ｍｌを接種した。図７及び図８並びに表４に示されているように、接種後１１週の間には、これらのタマリンの血清肝酵素に上昇が全く見られなかった。従って、これらのデータは、元の患者から採取し、−２０℃ で貯蔵されていた回復期血清には感染性ＨＧＢＶが検出されなかったことを示しており、それは、患者が感染から回復しており、且つ、ウイルスが患者の血清から除去されているか、又はウイルスタイターが−２０℃での貯蔵により検出不能なレベルにまで減少していたことを示し得る。Ｃ．その後の実験。タマリンＴ−１０５３は、接種後１週間で血清肝酵素に有意な上昇を示し、接種後１１日目に肝酵素に関して再テストを行った。１２日目に、血清肝酵素に有意な上昇が存在することが測定され、該動物をその日に殺した。その後の実験用に、血漿、肝臓及び脾臓の組織試料を得た。Ｔ−１０５３由来の血漿を以下の実施例３に記載のＲＤＡ手順用の出発物質とし、肝組織を以下の実施例８に用いた。タマリンＴ−１０４８、Ｔ−１０５７及びＴ−１０６１を血清肝臓酵素について監視した。該動物は全て、接種後２週間以内に肝臓酵素レベルが上昇したことが認められた。これらの上昇値は接種後６週間以降に見られた。３匹のタマリンは全て、接種後８４日目までに血清肝酵素レベルがＣＯを下回るレベルに減少したことが認められた。接種後９７日目に、これら３匹のタマリン（Ｔ−１０４８、Ｔ−１０５７及びＴ−１０６１）を、タマリンＴ −１０５３由来のニート血漿０．１０ｍｌ（感染性であると判明した、実施例２参照）を用いて再チャレンジし、血清肝酵素の上昇として示される肝炎が再誘発され得たかどうかを測定した。そのデータを表２、図１、図３及び図４に示す。データが示しているように、２匹のタマリン（Ｔ−１０５７及びＴ−１０６１）の血清肝酵素レベルは、接種後３週間ではＣＯを下回るレベルに留まった。１匹のタマリン（Ｔ−１０４８）は、再接種直後の２週間に血清肝酵素レベルに緩やかな上昇を示した。Ｔ−１０４８における緩やかな上昇は、ＨＧＢＶによる肝臓組織の再感染によるものか又はＨ２０５の初期接種から完全に回復していないことによるものと推定された。実施例２．感染性実験Ａ．実験プロトコル。実施例１（Ａ）に記載のようにして４匹のタマリンに関する基準読み取り値を得た。接種前に各動物について簡単に基準血清肝臓酵素（ＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤ）の値を決定した。平均肝酵素値＋標準偏差の３．７５倍に基づいて各動物についてカットオフ値（ＣＯ）を決定した。カットオフ値を超える肝酵素は異常であり、肝臓に損傷があるとみなされた。Ｂ．タマリンの接種。接種後１２日目に殺したタマリンＴ−１０５３由来の血漿（実施例１〔Ｃ〕参照）をその後の実験用の接種材料として用いた。１日目に、１匹のタマリン（Ｔ−１０５５）に、Ｔ−１０５３のニート血漿０．２５ｍｌを静脈内接種した。同日、２匹のタマリン（Ｔ−１０３８及びＴ−１０５１）に、プールされた正常タマリン血漿中に１０^-4（Ｔ−１０３８）又は１０^-5（Ｔ−１０５１）に順次希釈しておいたＴ−１０５３血漿０．２５ｍｌを静脈内接種した。同日、タマリンＴ−１０４９に、減少孔径（０．８μｍ、０．４５μｍ、０．２２μｍ及び０．１０μｍ）の一連のフィルターを介して濾過し、プールされた正常タマリン血漿に１０^-4に希釈しておいたＴ−１０５３血漿０．２５ｍｌを静脈内接種した。血清肝酵素ＡＬＴ、ＧＧＴ及びＩＣＤの変化について実施例１に記載のようにして毎週全タマリン（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８、Ｔ−１０５１及びＴ−１０４９）を監視した。表５は、これら４匹のタマリンに関する接種前及び接種後の血清肝酵素データを示す。図９は、Ｔ−１０５５の接種前及び接種後のＡＬＴ及びＩＣＤ値を示す。図９を参照すると、血清肝酵素ＡＬＴ及びＩＣＤにＣＤを超える上昇が生じたことがわかる。該タマリンを接種後１２日目に殺した。図１０及び図１１は、それぞれタマリンＴ−１０５１及びＴ−１０３８のＡＬＴ及びＩＣＤにおける接種前及び接種後の血清レベルを示す。図１０及び図１１を参照すると、接種後１１日目まで両動物の血清肝酵素ＡＬＴ及びＩＣＤに上昇が生じたことをわかる。Ｔ−１０３８を接種後１４日目に殺した。表５及び図１２は、Ｔ−１０４９に関して得られたデータを示す。表５及び図１２からわかるように、接種後１１日以内にＴ−１０４９にＣＯを超える血清肝酵素の上昇が認められた。Ｔ−１０４９に関して行われた濾過実験は、ＨＧＢＶが０．１０μｍのフィルターを通過し得ることを示し、それは、ＨＧＢＶがウイルス性であり且つ直径が０．１μｍ未満であり得ることを示唆している。さらに、Ｔ−１０３８に関して行われた感染性滴定実験は、Ｔ−１０５３血清が１ｍｌ当たり少なくとも４×１０⁵のタマリン感染量を含んでいることを示している。単一のＨＧＢＶ病原体の伝播性を示すために、タマリンＴ−１０４４に、Ｈ２０５接種７日後に採取し、正常なタマリン血清に１：５００希釈しておいたＴ− １０５７血清からなる接種材料０．２５ｍｌを接種した。接種後１４〜６３日からＡＬＴレベルにカットオフを超える緩やかな上昇（即ち、８２〜１０６の範囲の上昇）が認められた。接種後１４日目に採取し、正常なタマリン血清に１：２希釈しておいたＴ−１０４４の血清０．２５ｍｌをタマリンＴ−１０４７及びＴ−１０５６に順次接種した。先ず、接種後４２日目にＴ−１０４７及びＴ−１０５６にカットオフを超えるＡＬＴレベルの上昇が認められたが、それぞれ接種後６４日目及び９１日目に正常レベルに戻った。タマリンＴ−１０５８に、Ｔ−１０５３血清を用いてチャレンジ後２２日目に採取したＴ−１０５７のニート血清０．２５ｍｌを接種した。接種後１１２日の間にはＡＬＴレベルに上昇は認められなかった。実施例３．代表相違分析（控除ハイブリダイゼーション）Ａ．アンプリコン用二本鎖ＤＮＡの産生本明細書の上記材料及び方法に記載され、図１３に参照されている手順を用い、Ｈ２０５血清（実施例１Ｃ及び２Ｂ参照）の接種後１２日目に採取したタマリンＴ−１０５３感染性血漿（実施例１Ａ参照）由来の総核酸からテスターアンプリコンを合成した。接種前１７〜３０日の間にプールされたタマリンＴ−１０５３の接種前血漿からドライバーアンプリコンを合成した。簡単に言えば、両血漿を実施例２Ｂに記載のように０．１ μｍのフィルターを介して濾過した。次いで、市販のキット〔United States Bi ochemical(USB)，Cleveland，OH，cat.#73750〕及び担体として１０μｇの酵母ｔＲＮＡを用い、５０μｌの濾過血漿を抽出した。この核酸をランダムに開始して逆転写し、次いで市販のキットを用いランダム開始してＤＮＡ合成した。簡単に言えば、ランダムヘキサマーを用いて、製造業者に指示されたＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ’ｓ（Norwalk，CT）ＲＮＡＰＣＲキット（cat.#N808-0017）を用いて８０μｌの逆転写反応を行い、２０℃で１０分間インキュベートし、次いで４２℃で２時間インキュベートした。次いで反応を停止し、ｃＤＮＡ／ＲＮＡ重複部（duplexes）を９９℃で２分間インキュベートして変性させた。反応材料に、総量２０μｌの１０μｌの１０×ＲＰ緩衝液〔１００ｍＭのＮａＣｌ、４２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ〕、２５０ｐｍｏｌのランダムヘキサマー及び１３単位のＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）バージョン２．０ポリメラーゼ（USB，cat.#70775）を補った。反応材料を２０℃で１０分間、次いで３７ ℃で２時間インキュベートした。フェノール：クロロホルムで抽出し、エタノール沈殿させた後、製造業者により指示されたように、これらの反応の二本鎖ＤＮＡ産物を３０μｌの反応材料容量中４単位の制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ＡＩ（New Englnd Biolabs〔NEB〕，cat.#169L）で３０分間消化した。Ｂ．アンプリコンの合成Ｓａｕ３ＡＩ消化ＤＮＡを上記のように抽出、沈殿させた。反応材料を５０〜５５℃の乾燥加熱ブロックに入れ、４℃で１時間インキュベートすることにより、Ｓａｕ３ＡＩ消化産物全体を、１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で緩衝した３０μｌの反応材料容量中４６５ｐｍｏｌのＲＢｇｌ２４（配列番号１）及び４６５ｐｍｏｌのＲＢｇｌ１２（配列番号２）にアニーリングした。４００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（NEB，cat.#202S）を添加してアニーリングされた産物を連結した。１６℃で１４時間インキュベートした後、小規模のＰＣＲを行った。１０μｌの連結反応材料を、６０μｌのＨ₂Ｏ、２０μｌの５×ＰＣＲ緩衝液（３３５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）、８０ｍＭの〔ＮＨ₄〕₂ＳＯ₄、２０ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．５μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン及び５０ｍＭの２−メルカプトエタノール）、８μ ｌの４ｍＭｄＮＴＰ株、２μｌ（１２４ｐｍｏｌ）ＲＢｇｌ２４（配列番号３）及び３．７５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Per kin Elmer，cat.#N808-1012）に加えた。ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９６００サーモサイクラー（Perkin Elmer）中でＰＣＲ増幅を行った。試料を７２℃で５分間インキュベートし、連結されたアダプターの５′突出末端を充填した。試料を２５〜３０サイクル（９５℃で１分及び７２℃で３分）で増幅し、次いで７２ ℃で１０分間延長増幅した。アガロースゲルにより首尾よくアンプリコンが合成されたこと（即ち、約１００ｂｐ〜１５００ｂｐを超える範囲のＰＣＲ産物の塗抹標本）が確認された後で、テスター及びドライバーアンプリコンの大規模な増幅を行った。それぞれドライバー及びテスターの合成について先に記載されたようにして、４０の１００μｌＰＣＲ及び８つの１００μｌＰＣＲを設定した。１００μｌの反応材料当たり２μｌの小規模ＰＣＲ産物は、大規模アンプリコン産生用の鋳型としての役割を果たした。追加の１５〜２０サイクルの増幅を行うために、上記のようなサーモサイクリングを行った。次いでドライバー及びテスターＤＮＡ用のＰＣＲ反応材料をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄、Ｓａｕ３ＡＩで消化してアダプターを開裂した。テスターアンプリコンを低融点アガロースゲル上でさらに精製した。簡単に言えば、テスターアンプリコンＤＮＡ１０μｇを２％ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）ゲル（FMCBio products，Rockland，ME）上で移動させた。１５０〜１５００塩基対のフラグメントをゲルから切り出し、ゲルのスライスを、３ｍｌのＨ２Ｏ、４００μｌの０．５ＭＭＯＰＳ及び４００μｌのＮａＣｌを用い、７２℃で２０分間融解させた。製造業者により指示されたように、Ｑｉａｇｅｎ−ｔｉｐ２０（Qiagen，Inc. ，Chatsworth，CA）を用いて融解したゲルスライスからＤＮＡを回収した。Ｃ．アンプリコンのハイブリッド形成及び選択的増幅精製されたテスターＤＮＡアンプリコン約２μｌを上記のようにＮＢｇｌ２４（配列番号３）及びＮＢｇｌ１２（配列番号４）に連結した。最初の控除ハイブリッド形成のために、ＮＢｇｌプライマーセットに連結されたテスターアンプリコン（０．５μｇ）とドライバーアンプリコン（２０μｇ）とを混合し、フェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させた。４μｌのＥＥ×３緩衝液（３０ｍＭのＥＰＰＳ、２０℃におけるｐＨ８．０〔Sigma，St．Louis，MO〕、３ｍＭのＥＤＴＡ）にＤＮＡを再懸濁し、３５μ ｌの鉱油を重層した。加熱変性（９９℃で３分）させた後、変性したＤＮＡに５ＭのＮａＣｌ１μｌを加え、ＤＮＡを６７℃で２０時間ハイブリダイズした。水相を新しい管に移し、該試料に８μｌのｔＲＮＡ（５ｍｇ／ｍｌ）、次いで３９０μｌのＴＥ〔１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び１ｍＭのＥＤＴＡ〕を加えた。ハイブリダイズしたＤＮＡ溶液８０μｌを、Ｈ₂Ｏ４８０μｌ、５×ＰＣＲ緩衝液（上記）１６０μｌ、４ｍＭのｄＮＴＰ６４μｌ及びＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ６μｌ（３０単位）に加えた。該溶液を７２℃で５分間インキュベートして、連結されたＮＢｇｌ２４プライマーによって形成された５′オーバーハングを充填した。ＮＢｇｌ２４（配列番号３、２０μｌのＨ₂Ｏ中１．２４ｎｍｏｌ）を加え、反応材料をアリコート（１００μｌ／管）に分け、上記のように１０サイクルの増幅を行った。反応材料をプールし、フェノール／クロロホルムで２回抽出し、イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄して、４０μｌのＨ₂Ｏに再懸濁した。一本鎖ＤＮＡをヤエナリヌクレアーゼ（ＭＢＮ）により除去した。簡単に言えば、増幅されたＤＮＡ２０μｌを、販売業者により記載のように、４０μｌの反応材料中２０単位のＭＢＮ（NEB）で消化した。ＭＢＮ消化物に５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．８）１６０μｌを加えた。酵素を９９℃で５分間熱不活化した。８０μｌのＭＢＮ消化ＤＮＡを上記のようにしてさらに１５サイクルＰＣＲ増幅した。再び反応材料をプールし、フェノール／クロロホルムで２回抽出、イソプロパノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄、Ｈ₂Ｏに再懸濁した。次いで、増幅されたＤＮＡ（３〜５μｌ）をＳａｕ３ＡＩで消化し、上記のように抽出、沈殿させた。最終ＤＮＡペレットを１００μｌのＴＥに再懸濁した。Ｄ．引き続いてのハイブリッド形成／増幅段階上記のようにして、先のハイブリッド形成／選択的増幅材料由来のＤＮＡ１００ｎｇをＪＢｇｌプライマーセット（配列番号５及び配列番号６）に連結した。このＤＮＡ（５０ｎｇ）を２０μｇのドライバーアンプリコンと混合し、上記のようにしてハイブリッド形成及び増幅手順を繰り返したが、但し、サーモサイクリングの間の延長温度は７０℃であって、ＮＢｇｌプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）の場合の７２℃ではなく、最終増幅段階（ＮＢＮ消化後の）は２５サイクルであった。次いで２回目のハイブリッド形成−増幅産物１００ｎｇをＮＢｇｌプライマーセット（配列番号３及び配列番号４）に連結し、この材料２００ｐｇと２０μｇのドライバーアンプリコンとを混合し、上記のようにして３回目のハイブリッド形成／増幅を行ったが、最終増幅は２５サイクルであった。ＨＧＢＶ接種前及び急性期Ｔ−１０５３血漿に体して行われた代表相違分析（ＲＤＡ）から得られた産物の２％アガロースゲルを図１４に示す。図１４を参照すると、レーン１は、適切なサイズ（ｂｐ）のＤＮＡフラグメントを有する１５０ｎｇのＨａｅIII消化Ｐｈｉ−Ｘ１７４ＤＮＡマーカー（ＮＥＢ）を含んでいる。ドライバーアンプリコン（レーン２）及びテスターアンプリコン（レーン３）の複合性は、試料中に見られるＤＮＡ産物の塗抹標本によって実証されている。この複合性は、テスター配列が１回目（レーン４）、２回目（レーン５）又は３回目（レーン６）のハイブリッド形成／選択的増幅を受けると劇的に低下する。Ｅ．相違産物のクローニング相違産物を、以下のようにｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIＫＳ＋（Stratagene，La Jolla，CA，cat.#212207）のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。０．５μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIをＢａｍＨＩ（１０単位、NEB）で消化し、販売業者により指示されたように子牛腸管ホスファターゼ（１０単位、NEB）を用いて５′脱リン酸化した。プラスミドをフェノール：クロロホルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄、１０μｌのＨ₂Ｏに再懸濁した（最終濃度：１μｌ当たり約５０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII）。２回目のハイブリッド形成／増幅産物由来の４つの最大バンドを上記のようにして２％低融点アガロースゲルから切り出した。ＴａｋａｒａＤＮＡ連結反応キット（Takara B iochemical，Berkeley，CA）を用い、融解した（７２℃、５分）ゲルスライス４μｌを、５０μｌの反応材料中５０ｎｇのＢａｍＨＩ−カット、脱リン酸化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIに連結した。１６℃で３．５時間インキュベートした後、８μｌの連結反応材料を用いて、販売業者に指示されたように、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞（St ratagene）を形質転換した。アンピシリン（１５０μｇ／ｍｌ）を補ったＬＢプレート上に形質転換混合物をのせ、３７℃で一晩インキュベートした。得られたコロニーを液体培養中で増殖させ、ミニプレプ（miniprep）プラスミドＤＮＡを当該分野に記載のようにして分析し、クローニング産物の存在を確認した。２回目のハイブリッド形成／増殖段階から得られた４つの最大産物のクローニングに加えて、３回目のハイブリッド形成／増殖段階から得られた産物の全集団をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIにクローニングした。５０ｎｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔIIベクター（上記のように合成した）を、上記のようにして、５０μｌの反応材料中１０ｎｇの３回目のハイブリッド形成／増殖産物に連結した。１６℃ で２時間インキュベートした後、１０μｌの連結反応産物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉコンピテントＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞を形質転換した。得られた形質転換産物由来の６０のコロニーを増殖させ、ミニプレプＤＮＡを合成し、上記のような当該分野において公知の方法で分析した。制限エンドヌクレアーゼ消化及びドットブロットハイブリッド形成法をユニーククローンを特定するために用いた。実施例４．ＨＧＢＶゲノムの抗原領域をコードするｃＤＮＡクローンの免疫分離Ａ．クローニング材料源としての濃縮ウイルスの調製実施例３に示されている方法に加えて、以下の分離手順を用いて、ＨＧＢＢＶゲノムを分離した。３匹のタマリン（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８及びＴ−１０４９）に、実施例２に記載のタマリンＴ−１０５３から調製した血清を接種した。表５を参照すると、接種後１１日目までに３匹全てのタマリンに肝酵素値の上昇が見られた。タマリンＴ−１０５５を接種後１２日目に殺し、タマリンＴ−１０３８及びＴ−１０４９を接種後１４日目に殺した。これら３匹のタマリンそれぞれから由来の血清約３〜４ｍｌをプールし、全量約１１．３ｍｌを得た。プールされた血清を１５℃で１５分間１０，０００×ｇで遠心して清澄化した。次いでこれを連続的に０．８、０．４５、０．２及び０．１μｍの注射器フィルターに通した。次いで該濾過された材料を、ＳＷ４１−Ｔｉローター中、４℃で６８分間、４１，０００ｒｐｍで、０．３ｍｌのＣｓＣｌクッション〔密度：１０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中１．６ｇ／ｍｌ〕を介して遠心して濃縮した。約０．６ｍｌのＣｓＣｌ層を遠心後に取り出し、３つの０．２ｍｌアリコートに分け、−７０℃で貯蔵した。次いで、タマリンＴ−１０３４にこのペレット化材料（正常なタマリン血清中で調製した）の１０^-6希釈物０．２５ｍｌを接種した。先ず、接種後２週間でＴ −１０３４にＡＬＴ肝酵素値の上昇が認められ、該値はその後７週間上昇を継続し、最終的に接種後１０週までに正常化した（図３０、実施例１４を参照されたい）。この実験は、プールされたタマリン血清から濃縮した材料の感染性を示した。該材料は比較的高いタイターを有することが示されたので、このウイルス濃縮源を、以下に記載のような、ｃＤＮＡライブラリー構築用の核酸源として用いた。Ｂ．ｃＤＮＡライブラリーの構築販売業者の指示により市販のＲＮＡ抽出キット（Strata gene，La Jolla，CA）を用いて、濃縮ウイルス（上記）のアリコート（０．２ｍｌ）からＲＮＡを抽出した。最終沈殿段階の前に、試料を４つの等量のアリコートに分け、次いで５μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡの存在下に沈殿させた。これらのアリコートの中一つだけをｃＤＮＡ合成用に用いた。他のものは−８０℃で貯蔵した。製造業者に指示されたように、市販のキット（Stratagene，La Jolla，CA ）を用いて、ＲＮＡから、リン酸化され、ブラント末端化二本鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、製造業者に指示されたように、Ｔ４ＤＮＡリガーゼキット（Stra tagene，La，Jolla，CA）を用いて、１０μｌの反応材料容量中で二本鎖リンカー／プライマーをｃＤＮＡ末端（センスストランド、配列番号７；アンチセンスストランド、配列番号８）に連結した。これによって、全てのｃＤＮＡを、ＮｏｔＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素認識部位を含む同一の５′及び３′末端を有する混合物として得た〔G．Reyes及びJ．Kim，Mol．Cell．Probes 5:473-481(1991); A ．Akowitz及びL．Manuelidis，Gene 81:295-306(1989); 並びにG．Inchauspeら，Viral Hepatitis and Liver Disease，F.B．Hollingerら，Eds.，382-387ページ(1991)〕。次いで、全ｃＤＮＡがそれらの配列とは無関係に増幅されるように、リンカー／プライマーのセンスストランドオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応におけるプライマーとして用いた。この手順により、全ｃＤＮＡ集団内に存在する微量ｃＤＮＡが、効率的にクローニングされるレベルにまで増幅され、それによって出発材料内の配列を表すｃＤＮＡライブラリーが形成された。製造業者により指示されたＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲキット（Perkin-Elmer）を用いて、ＰＥ−９６００サーモサイクラー中で、センスストランドオリゴヌクレオチドプライマーの存在下に上記連結材料の１μｌアリコートに対してＰＣＲを行った（最終濃度：１μＭ；反応材料容量：５０μｌ）。以下のようにして３０サイクルのＰＣＲを行った：９４℃で０．５分間の変性、５５℃で０．５分間のアニーリング及び７２℃で１．５分間の延長。次いで、得られた産物の１μｌアリコートを上記のようにして再増幅した。次いで、最終ＰＣＲ反応産物を等量のフェノール−クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）で１回、等量のクロロホルムで１回抽出し、次いで、酢酸ナトリウム（最終濃度、０．３Ｍ）及び２．５容量の無水エタノールを加えて、ドライアイス上で１０分間沈殿させた。得られたＤＮＡペレットを水に再懸濁し、製造業者に指示されたように、制限酵素ＥｃｏＲＩ（New Englan d Biolabs）で消化した。次いで、製造業者に指示されたようにＤＮＡ結合樹脂（Prep-a-Gene，BioRad Laboratories）を用いて、消化されたｃＤＮＡを反応混合物から精製し、２０μｌの蒸留水中で溶離した。ｃＤＮＡ（８μｌ）を、３０μｌの反応材料容量中３μｇのラムダｇｔ１１ベクターＤＮＡアーム（Stratagen，La Jolla，CA）に４℃で１〜５日の間に連結した。製造業者に指示されたようにＧｉｇａＰａｃｋIIIＧｏｌｄパッケージ抽出物（Stratagene，前出）を用いて、連結材料１１μｌをファージヘッドにパッケージした。得られたライブラリーは、組換え頻度が８９．３％で、平均インサートサイズが約３５０塩基対の合計約１７３万メンバー（ＰＦＵ）を含んでいた。Ｃ．組換えＧＢｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングに用いた抗血清は、接種後に血清肝酵素レベルに上昇を示したタマリンから採取した。免疫スクリーニングには、２つの別個の抗血清プールを用いた。第１のプールは、２匹の動物（Ｔ −１０４８及びＴ−１０５１；それぞれ実施例１、表２と、実施例２、表５を参照されたい）由来の血清を含み、第２のプールは、１匹の動物（Ｔ−１０３４；図３０、実施例１４を参照されたい）由来の血清を含むものであった。用いられた特定の血清を表６に示す。ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングに用いるためにこれらの試料を選択した時点では、これらの試料は、１．４又は１．７組換えＣＫＳタンパク質（実施例１３）とのそれらの免疫反応性について試験されていなかった。従って、本明細書に示されている結果は、用いられた抗血清中のこれらの組換えタンパク質に対するＨＧＢＶ抗体の有無に関するいずれの情報とも関係なく得られたものである。組換えファージの免疫分離に用いた手順は、Young及びDavisにより記載された方法〔R.A．Young及びR.W．Davis，PNAS 80:1194-1198(1983)〕に基づき、以下のように変更を加えたものであった。一方は、Ｔ−１０４８及びＴ−１０５１からプールした抗血清を用い、他方はＴ−１０３４由来の抗血清を用いた２回の免疫スクリーニング実験を行った。いずれに場合にも、抗体とＥ．ｃｏｌｉタンパク質との非特異的相互作用を低減させるために、使用前に一次抗血清をＥ．ｃｏｌｉ抽出物に予備吸着させた。最初の実験では、Ｔ−１０４８／Ｔ−１０５１抗血清プールを用いて１２９万個の組換えファージを免疫スクリーニングした。２回目の実験では、Ｔ−１０３４抗血清を用いて３０万個の組換えファージを免疫スクリーニングした。組換えファージライブラリーをＥ．ｃｏｌｉストランドＹ１０９０_r- のローン上に置き、３７℃で３．５時間増殖させた。次いで、プレートをＩＰＴＧ（１０ｍＭ）で飽和したナイロンフィルターで覆い、４２℃で３．５時間インキュベートした。次いでフィルターを、１％のＢＳＡ、１％のゼラチン及び３％のＴｗｅｅｎ−２０（「ブロッキング緩衝液」）を含むＴｒｉｓ−塩水緩衝液中、２２℃で１時間ブロックした。次いでフィルターを一次抗血清（ブロッキング緩衝液中の１：１００希釈物）中、４℃で１６時間インキュベートした。次いで一次抗血清を取り出して次回のプラーク精製用に取って置き、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ−塩水中でフィルターを４回洗浄した。次いで、フィルターを１２５−Ｉ−標識（又はアルカリ−ホスファターゼ結合）ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch，West Grove，PAから入手可能）を含むブロッキング緩衝液中２２℃で６０分間インキュベートし、上記のように洗浄し、次いでＸ線フィルムに暴露（又はJ．Sambrookら，Molecular Cloning: A Laboratory Man ual ，第2版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989におけるような確定した手順に従って発色）した。このライブラリーから５種の免疫陽性ファージ（４−３ＢＩ、４８−１Ａ１、６６−３Ａ１、７０−３Ａ１、７８−１Ｃ１）を分離し、次いで、上記の方法を用いて３匹の感染タマリン（Ｔ−１０４８、Ｔ−１０５１、Ｔ−１０３４）由来の抗血清に対する結合特異性についてテストした。これらの組換え体は、３匹の感染タマリンそれぞれに由来する回復期血清と反応したが予備接種した血清とは反応しなかったポリペプチドをコードした（データは示さず）。組換えファージによりコードされたポリペプチドの免疫学的反応性の特異性を証明するために、ＥｃｏＲＩクローニング部位に対して５′位に位置するプライマー（配列番号９）及び３′位に位置するプライマー（配列番号１０）を用いて、ＰＣＲにより、各ｃＤＮＡをラムダファージゲノムから回収した。次いで、ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、実施例１３に記載のようにして、Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＪ０２０１に次いで連結した。該ｃＤＮＡをｐＪ０２０１のＥｃｏＲＩ部位に挿入することにより、このｃＤＮＡの翻訳読み取り枠をラムダファージクローン中にあるがままに維持した。ｐＪ０２０１発現ベクター中のサブクローンを、４−３Ｂ１．１、４８−１Ａ１．１、６６−３Ａ１．４９、７０− ３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ１．１７とした。タマリンＴ−１０３４、Ｔ−１０４８及びＴ−１０５１由来の回復期血清（１：１００希釈物）を含むこれらのｃＤＮＡを発現する培養物から調製されたＥ．ｃｏｌｉ溶解物の免疫ブロット分析（実施例１３におけるような）により、各ＣＫＳ融合タンパク質について予測されたサイズのタンパク質との特異的免疫学的反応性が示された（データは示していない）。該ｃＤＮＡそれぞれのＤＮＡ配列を決定したが、これらのクローンはＨＧＢＶ−Ｂウイルス（配列番号１１）の配列とほぼ１００％の配列同一性を有していることが見いだされた。４ −３Ｂ１．１インサート（配列番号１２及び１３）の配列は、その全体は決定されなかったが、配列決定部分は、塩基対６８３４−７４５８由来のＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１）中の配列部分との９９．５％の配列同一性を示す。クローン４ −３Ｂ１．１から得られた配列との同一性を示すＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１）配列のこの領域は、＋１読み取り枠に翻訳され、配列番号１４として配列リストに示されている。４８−１Ａ１．１インサート（配列番号１５）の配列は、塩基対４５２３−４７５２由来のＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１、実施例９を参照されたい）の配列の部分との１００％配列同一性を示す。配列番号１５に対応するＤＮＡ配列は＋１読み取り枠に翻訳され、配列番号１６として配列リストに示されている。６６−３Ａ１．４９インサート（配列番号１７）の配列は、クローン４８−１Ａ１．１の配列と実質的に１００％の配列同一性を示し、従って、配列リストにはタンパク質翻訳は示さない。７０−３Ａ１．３７インサート（配列番号１８）の配列は、塩基対６４５０−６７３２由来のＨＧＢＶ−Ｂ（配列番号１１）の配列の部分と１００％の配列同一性を示すが、但し、ＨＧＢＶ−Ｂ配列（配列番号１１）の塩基６６３０−６６３２に対応する３つの塩基対がかけている。配列番号１８に対応するＤＮＡ配列は＋２読み取り枠に翻訳され、配列番号１９として配列リストに示されている。７８ −１Ｃ１．１７インサート（配列番号２０）の配列は、クローン７０−３Ａ１．３７の配列と１００％の配列同一性を示し、従って、配列リストにはタンパク質の翻訳は示さない。これらのデータは、ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーから分離されたｃＤＮＡクローンがＨＧＢＶ病原体のゲノムから誘導され、該ライブラリーがＧＢ感染タマリン由来の血清によって免疫学的に特異的に認識されたポリペプチドをコードすることを示している。クローン４８−１Ａ１．１（「クローン４８」）４−３Ｂ１．１、６６−３Ａ１．４９、７０−３Ａ１．３７及び７８−１Ｃ１．１７は、前記のAmer ican Type Culture Collectionに寄託されている。実施例５．ＨＧＢＶクローンのＤＮＡ配列分析実施例３で得られたユニーククローンをキット形態〔Sequenase（登録商標）バージョン2.0，USB〕のジデオキシヌクレオチド鎖停止法（Sangerら，前出）を用いて配列形態した。これらの配列はオーバーラップしておらず、クローン４（配列番号２１）、クローン２（配列番号２２）、クローン１０（配列番号２３）、クローン１１（配列番号２４）、クローン１３（配列番号２５）、クローン１６（配列番号２６）、クローン１８（配列番号２７）、クローン２３（配列番号２８）、クローン５０（配列番号２９）及びクローン１１９（配列番号３０）として配列リストに示されている。クローン４、２、１０、１１、１３、１６、１８、２３、５０及び１１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．に寄託されている。クローン２はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５６、クローン４はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５７、クローン１０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５８、クローン１６はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５５９、クローン１８はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５６０、クローン２３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５６１、クローン５０はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９５６２、クローン１１はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９６１３、クローン１３はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９６１１、及びクローン１１９はＡ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号６９６１２が付与された。配列は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（Altschulら，J．Mol．Biol. 215:403-41 0〔1990〕）を用いて、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで検索した。これらの配列はいずれもＧｅｎＢａｎｋでは見つからなかったが、これは、これらの配列がまだ文献において特性分析されていないことを示している。該ＤＮＡ配列は６つの可能な読み取り枠に翻訳され、配列リスト（配列番号２１は配列番号３１〜３６に、配列番号２２は配列番号３７〜４２に、配列番号２３は配列番号４３〜４８に、配列番号２６は配列番号４９〜５４に、配列番号２７は配列番号５５〜６０に、配列番号２８は配列番号６１〜６６に、配列番号２９は配列番号６７〜７２に翻訳する）に示されている。配列番号２４は配列番号７３（実施例９に記載）に含まれ、配列番号７４〜７９に翻訳されている。配列番号２５〜３０は配列番号８０（実施例９に記載）に含まれ、配列番号８１〜８６に翻訳されている。ＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Gishら，Nature Genetics 3:266-272〔1993〕）を用い、翻訳された配列をＳＷＩＳＳ− ＰＲＯＴデータベースの検索に用いた。ここでも、これらの配列はＳＷＩＳＳ− ＰＲＯＴでは見つからず、それは、これらの配列がまだ文献において特性分析されていないことを示している。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＦＡＳＴｄｂアルゴリズムを用いて相同体を検索すると、肝炎のＣウイルスと低くはあっても幾分かの配列類似性が示される（以下の表７）。特に、クローン４（配列番号３５）、１０（配列番号４４）、１１（ＧＢ−４の残基１〜１６６、枠３〔配列番号７６〕）、１６（配列番号５０）、２３（配列番号６５）、５０（配列番号７０及び７２）並びに１１９（ＧＢ−Ａの残基９１２〜９８８、枠３〔配列番号８３〕）の翻訳は、アミノ酸レベルでの種々のＨＣＶ分離体に対する２４．１〜４５．１％の範囲の相同性がある。特に重要なのは、クローン１０（配列番号４４）の翻訳体が、ＨＣＶの推定ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対してわずかな相同性を示したことである。他の正鎖ウイルスの推定ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ中に存在する保存アミノ酸（Jiangら， PNAS 90:10539-10543〔1993〕）とクローン１０（配列番号４４）の推定アミノ酸翻訳体との比較により、他のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの保存アミノ酸残基もクローン１０（配列番号４４）中に保存されていることが明らかになった。これには、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの正準（canonical）ＧＤＤ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）シグネチャー配列が含まれている。従って、クローン１０（配列番号４４）は、ウイルス性ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするものと思われる。驚くべきことには、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを用いた場合、クローン１０（配列番号４４）のみが、ヌクレオチドレベルでＨＣＶとの配列相同性を示した。アミノ酸レベルで低いＨＣＶ相同性を有するクローン４（配列番号２１）、１６（配列番号２６）、２３（配列番号２８）及び５０（配列番号２９）並びに１１９（配列番号３０）は、ＧｅｎＢａｎｋの検索において、ＢＬＡＳＴＮでは検出されなかった。さらに、クローン２（配列番号３７〜４２）、１３（配列番号２５及び３７〜４２）並びに１８（配列番号２７及び５５〜６０）は、上記のＧｅｎＢａｎｋ又はＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴＯで検索した場合に、ＨＣＶに対する有意なヌクレオチド又はアミノ酸相同性は、下記のように示さなかった。実施例６．ＨＧＢＶクローンの外因性ＨＧＢＶクローンは、正常又はＨＧＢＶ感染タマリン肝臓ＤＮＡ、正常なヒトリンパ球ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ又はＥ．ｃｏｌｉＤＮＡには検出されなかった。これは、サザン法によりＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）及び１６（配列番号２６）について示された。さらに、全ＨＧＢＶクローンをゲノムＰＣＲで分析して、タマリン、ヒト、酵母及びＥ．ｃｏｌｉゲノムに関するＨＧＢＶ配列の外因性起源を確認した。これらのデータは実施例５に記載のＨＧＢＶ配列のウイルス性性質と一致している。Ａ．サザンブロット法分析ＨＧＢＶ感染タマリン及び正常なタマリンの肝臓ホモジネートを低速ペレット化してタマリンの肝臓の核を得た（以下に記載）。販売業者に指示されたように市販のキット（USB cat.#73750）を用いて核からＤＮＡを抽出した。タマリンＤＮＡを抽出過程の間にＲＮａｓｅで処理した。ヒト胎盤ＤＮＡ（Clontech，Palo Alto，CA）、酵母ＤＮＡ（Saccharomyces cerevisiae，Clontech）及びＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（Sigma）を市販源から得た。販売業者の指示に従って各ＤＮＡ試料をＢａｍＨＩ（NE B）で消化した。消化されたＤＮＡ（１０μｇ）及びＲＮＡ産物（実施例３Ｂからそれぞれ０．５μｇずつ）を１％アガロースゲル上で電気泳動させ、Sambrook らにより記載（ｐｐ．９．３４ｆｆ）のようにＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンメンブラン（Amersham，Arlington Heights，IL）にキャピラリーでブロットした。ＤＮＡをメンブラン販売業者により指示されたようにアルカリ処理してメンブランに固定した。メンブランをＲａｐｉｄＨｙｂ溶液（Amersham）中、６５℃で３０分間プレハイブリダイズした。ＨＧＢＶ配列の放射線標識プローブをＰＣＲにより調製した。１×ＰＣＲ緩衝液II（Perkin Elmer）、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０μＭのｄＮＴＰ、それぞれ１ μＭのクローン特異性センス及びアンチセンスプライマー（クローン２については、配列番号８７及び８８；クローン４については、配列番号８９及び９０；クローン１０については、配列番号９１及び９２；クローン１６については、配列番号９３及び９４；クローン１８については、配列番号９５及び９６；クローン２３については、配列番号９７及び９８；クローン５０については、配列番号９９及び１００）、１ｎｇのＨＧＢＶクローンプラスミド（実施例３〔Ｅ〕に記載）、６０μＣｉα−³²Ｐ−ｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）及び１．２５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を用いて５０μｌのＰＣＲを形成した。反応材料を、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及び７２℃で３０秒インキュベートして、合計３０サイクルの増幅を行い、次いで７２℃で３分間最終延長した。組み込まれなかった標識を、販売業者に指示されたようにＱｕｉｃｋ−Ｓｐｉｎ（登録商標）Ｇ−５０スピンカラム（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）により除去した。プレハイブリダイズしたメンブランに添加する前にプローブを変性させた（９９℃、２分）。プレハイブリダイズしたメンブラン（２×１０⁶ｄｐｍ／ｍｌ）に、放射線標識したプローブを加え、ＲａｐｉｄＨｙｂ（登録商標）販売業者に指示されたように、フィルターを６５℃で２．５時間ハイブリダイズした。ハイブリダイズしたメンブランを、緩やかな厳格さ（１×ＳＳＣ、６５℃で０．１％ＳＤＳ）で洗浄し、次いで増感板を用い、−８０℃で７２時間オートラジオグラフフィルムに暴露した。これらの条件は、類似の放射線標識プローブを用いて単一コピーの遺伝子を検出するために考案された。結果は、クローン２（配列番号２２）及びクローン１６（配列番号２６）配列が、正常又はＨＧＢＶ感染タマリンの肝臓由来のＤＮＡ（それぞれ図１５及び図１６、レーン１Ｂ及び３Ｂ）、ヒトＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン１Ａ）、酵母ＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン２Ａ）又はＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン３Ａ）にハイブリダイズしなかったことを示している。さらに、ドライバーアンプリコンＤＮＡ（図１５及び図１６、レーン４Ａ、実施例２．Ｂ．に記載の予備ＨＧＢＶ接種されたタマリン血漿から誘導された）の場合にもハイブリッド形成は全く検出されなかった。対比的に、テスターアンプリコン（図１５及び図１６、レーン６Ａ、実施例２．Ｂに記載の総核酸抽出及び逆転写ステップを用いた感染性ＨＧＢＶタマリン血漿から誘導された）及び３回の控除／選択的増幅の産物（それぞれ１回目、２回目及び３回目の控除／選択的増幅からの産物に関する図１５及び図１６、レーン７Ａ、８Ａ及び４Ｂ）の場合には強力なハイブリッド形成シグナルが認められた。これらのデータは、ＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）及び１６（配列番号２６）が感染源から増幅された核酸配列中に検出され、ＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）及び１６（配列番号２６）が、タマリン、ヒト、酵母又はＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ配列からは誘導されないことを示している。Ｂ．ゲノムのＰＣＲ分析さらにＨＧＢＶ配列の外因性を示し且つそれらのウイルス起源を支持するために、タマリン、ヒト、酵母及びＥ．ｃｏｌｉ由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行った。前出のJ．Sambrookらによる記載のようにして、正常なタマリンの腎臓及び肝臓組織由来のＤＮＡを合成した。酵母、アカゲザルの腎臓及びヒト胎盤ＤＮＡをClonotechから得た。Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡはSigmaから得た。販売業者に指示されたように主としてPerkin-Elmer-Cetus製のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）試薬を用いてＰＣＲを行った。各１００μｌの反応材料に対して３００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いた。ＨＧＢＶクローン化配列（クローン２については、配列番号８７及び８８；クローン４については、配列番号８９及び９０；クローン１０については、配列番号９１及び９２；クローン１６については、配列番号９３及び９４；クローン１８については、配列番号９５及び９６；クローン２３については、配列番号９７及び９８；クローン５０については、配列番号９９及び１００）由来のＰＣＲプライマーを０．５μＭの最終濃度で用いた。ＰＣＲを３５サイクル（９４℃で１分；５５℃で１分；７２℃で１分）行い、次いで、７２℃で７分の伸長サイクルを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウムを用いて核酸を直接染色した後で紫外線照射するか及び／又はサザン法によりニトロセルロースフィルターヘトランスファーした後で放射線標識プローブにハイブリダイズして視覚化した。実施例６Ａに記載のようにしてプローブを形成した。Dige ne（Belstville，MD）製のＦａｓｔ−ＰａｉｒＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ中でフィルターを３〜５時間プレハイブリダイズし、次いで１００−２００ｃｐｍ／ｃｍ²を用い、４２℃で１５〜２５時間Ｆａｓｔ−ＰａｉｒＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎＳｏｌｕｔｉｏｎ中でハイブリダイズした。 G.G．Schlauderら，J．Virol．Methods 37:189-200(1992)に記載のようにしてフィルターを洗浄し、増感板を用い、−７０℃で１５〜７２時間、ＫｏｄａｋＸ −Ｏｍａｔ−ＡＲフィルムに暴露した。図１７は、臭化エチジウム染色した１．５％アガロースゲルを示している。図１８は、クローン１６（配列番号２６）由来の放射線標識プローブにハイブリダイズした後の同一ゲルからのサザンブロット法によるオートラジオグラムを示す。正常なタマリン肝臓及び腎臓ＤＮＡに０．０５ゲノム当量（レーン１７及び１８）でスパイクされたクローン１６（配列番号２６）配列を検出することは可能であるにも拘わらず、クローン１６（配列番号２６）配列は、その外因性と一致して、ゲノムＰＣＲ分析により、タマリン（図１７及び図１８、レーン９及び１０）、アカゲザル（レーン１１）又はヒトゲノムＤＮＡ（レーン１２）中にも、酵母又はＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（データは示さず）中にも検出されなかった。さらに、ヒトドーパミンＤ１レセプター遺伝子由来のプライマー、１０００−１０１９塩基対（センスプライマー）及び１５３３−１５５２塩基対（アンチセンスプライマー）（GenBankアクセス番号：X55760、R.K．Sunaha raら，Nature 347:80-83〔1990〕）は、霊長類ゲノムＤＮＡ（タマリン腎臓、タマリン肝臓、アカゲザル及びヒトのＤＮＡに対応する図１７、レーン２、３、４及び５、）由来のドーパミンＤ１レセプターＤＮＡを首尾よく増幅し、それは、低コピー数（即ち、単一コピー）配列を検出するこの方法の有用性を示している。レーン１及び８は、それぞれドーパミンＤ１レセプター及びクローンの１６プライマー（配列番号９３及び９４）に対するＨ₂Ｏ対照である。レーン６は、ドーパミンレセプタープライマーで増幅した１００ｆｇのクローン１６（配列番号２６）プラスミドＤＮＡを含む。レーン１４、１５、１６及び２０は、それぞれ１、３、１０及び１００ｆｇのクローン１６（配列番号２６）プラスミドＤＮＡを含む。レーン７及び１９はマーカーである。上記のクローン２、４、１０、１８、２３及び５０に特異的なＰＣＲプライマーを用いて類似の結果を得た（データは示さず）。クローン２（配列番号２２）、４（配列番号２１）、１０（配列番号２３）、１８（配列番号２７）、２３（配列番号２８）及び５０（配列番号２９）はこの時点では結果が出ていない。しかし、クローン４（配列番号２１）、１０（配列番号２３）、１８（配列番号２７）及び５０（配列番号２９）配列は、タマリン、ヒト、酵母及びＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ（アカゲザルは試験しなかった）には検出されず、これは、これらの配列が試験したゲノムＤＮＡ源に対して外因性であり、これらの配列のウイルス起源を支持するものであることを示している。実施例７．タマリン血清におけるＨＧＢＶ配列の存在接種前及び急性期Ｔ−１０５３血漿のＨＧＢＶクローン配列の存在をＰＣＲにより調べた。ＨＧＢＶゲノムはＤＮＡ又はＲＮＡであり得るので、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲを行った。特に、全核酸を実施例３（Ａ）に記載のようにして血漿から抽出した。実施例６（Ｂ）に記載のようにして当量の５μｌの血漿核酸に対してＰＣＲを行い、主として製造者の指示に従いPerkin-Elmer-Cetus製のＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡＰＣＲキットを用いて、ＰＣＲ中１μＭ濃度のプライマー（クローン２については、配列番号８７及び８８；クローン４については、配列番号８９及び９０；クローン１０については、配列番号９１及び９２；クローン１６については、配列番号９３及び９４；クローン１８については、配列番号９５及び９６；クローン２３については、配列番号９７及び９８；クローン５０については、配列番号９９及び１００）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡ合成を開始した。ＰＣＲ産物の臭化エチジウムによる染色及びハイブリッド形成により、急性期Ｔ−１０５３血漿には、ＨＧＢＶクローン配列２（配列番号２２）、４（配列番号２）、１０（配列番号２３）、１６（配列番号２６）、１８（配列番号２７）、２３（配列番号２８）及び５０（配列番号２９）が存在したが、予備接種Ｔ−１０５３血漿には存在しないことが示された（データは示さず）。さらに、ＨＧＢＶクローン２（配列番号２２）、４（配列番号２１）、１０（配列番号２３）、１８（配列番号２７）、２３（配列番号２８）及び５０（配列番号２９）配列は、タマリンＴ−１０５３に注入されたＨＧＢＶ接種材料であるＨ２０５中に検出することができた（実施例ＩＢ参照）。これらの結果を表８に要約する。ＨＧＢＶクローン配列は急性期血漿においてＲＴ−ＰＣＲによってのみ検出されたことに留意されたい。ＨＧＢＶクローン配列が、ＲＮＡをｃＤＮＡに変換するための逆転写段階後に初めてＰＣＲにより急性期血漿中に検出されたという事実は、これらのクローンのあるものとＨＣＶ分離体との低い相同性、及びＨＧＢＶクローン１０（配列番号２３；実施例５）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ中に認められた保存アミノ酸をコードする配列の存在と共に、ＨＧＢＶがＲＮＡウイルスであることを示唆している。ＨＧＢＶクローン１６配列（配列番号２６）を有するタマリン血漿パネルのＲＴ−ＰＣＲ分析を行って、実験的にＨＧＢＶに感染させた他の個体中のＨＧＢＶクローン１６（配列番号２６）の存在を確認した。先に記載（G.G．Schlauderら，J．Virological Methods 37:189-200〔1992〕）のようにして、Ｈ２０５の接種材料で実験的に感染させる前と感染させた後で得られたタマリン由来の血漿２５μｌから核酸を分離した。エタノールで沈殿させた核酸を３μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ₂Ｏに再懸濁した。主として製造業者の指示に従って、Perkin-Elmer-Cetus 製のＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡＰＣＲキットを用いて、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを行った。ランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡ合成を開始した。得られたｃＤＮＡをクローン１６プライマー（配列番号９３及び９４）を用い、０．５μＭの最終濃度でＰＣＲにかけた。ＰＣＲを３５サイクル（９４℃で１分；５５℃で１分；７２℃で１分）行い、次いで７２℃で７分間延長サイクルを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、核酸を臭化エチジウムで直接染色した後で紫外線照射するか、及び／又は実施例６Ｂに記載のようにサザンブロット法によりニトロセルロースフィルターにトランスファーした後で放射線標識したプローブにハイブリダイズして視覚化した。図１９は、臭化エチジウム染色した１．５％アガロースゲルを示す。図２０は、クローン１６（配列番号２６）由来の放射線標識プローブにハイブリダイズした後の同一ゲルからのサザンブロット法によるオートラジオグラムを示す。Ｈ₂ Ｏ及びヒトの正常血清がレーン１及び２に示されている。レーン３、１９及び２０はマーカーである。レーン４、８、１２及び１６は非感染タマリン血清由来であり、レーン６、１０、１４及び１８は感染タマリン血清由来である。これらの結果は、ＨＧＢＶクローン１６配列（配列番号２６）が、タマリンＴ−１０５３の外に、ＨＧＢＶに感染した他の個体にも検出されたが、非感染個体には検出されなかったことを示している。５匹のＨ２０５感染動物由来の急性期血清をテストした。クローン１６配列（配列番号２６）は、これらの動物の中の３匹〔レーン１０、Ｔ−１０４９、接種後１４日目（ｄｐｉ）；レーン１４、Ｔ−１０５１，２８ｄｐｉ；レーン１８、Ｔ−１０５５、１６ｄｐｉ〕由来の血清中に検出された。クローン１６配列（配列番号２６）は、５匹の動物（レーン４、Ｔ−１０４８；レーン８、Ｔ−１０４９；レーン１２、Ｔ−１０５１；レーン１６、Ｔ−１０５５；Ｔ−１０５７は示さず）のいずれの接種前血清からも検出されなかった。これらの結果は、クローン１６配列（配列番号２６）が感染性ＨＧＢＶ病原体由来であり得ることを示唆している。５種の急性期血漿中の２種（レーン６、Ｔ−１０４８、２８ｄｐｉ；Ｔ−１０５７、１４ｄｐｉ、図示せず）に、クローン１６配列（配列番号２６）が不在であることは、タマリンにおけるＨＧＢＶ感染の急性分解性質とあいまったクローン１６ＲＴ−ＰＣＲの比較的低い感受性（クローン１６配列（配列番号２６）の約≧１０００コピーを検出し得ると想定される）から説明し得る。従って、２匹の陰性動物由来の急性期血漿は、用いられたＲＴ−ＰＣＲアッセイの検出レベルを下回るＨＧＢＶのタイターを含み得る。これら２匹の動物がクローン４（配列番号２１）に対して陽性であったというＲＴ−ＰＣＲによる観察結果（実施例１４）は、１つのウイルス（クローン４を含む）のＲＮＡ配列の存在及び第２のウイルス（クローン１６を含む）由来の検出可能なＲＮＡ配列の不在を反映している可能性がある。実施例８．感染タマリンの肝臓におけるHGBV配列のノーザンブロット分析 HGBVクローン配列が、急性期タマリン血漿中でのRT−PCR とH205接種とにおいて検出できたことにより、これらの配列がHGBVゲノムを起源とする可能性が高まった。さらに別のRT−PCR 検査によって、H205感染タマリン T−1053から抽出した肝臓RNA にHGBV配列が存在することが実証された（データは示されていない）。従って、HGBVゲノムのサイズを知るために、H205感染及び非感染タマリンの肝臓RNA とのノーザンブロット分析を行った。RNA 単離キット(Stratagene，La Jo lla，CA)をその推奨使用法に従って用い、H205感染タマリン T−1053の肝臓 1.2 5 g と対照非感染タマリン T−1040の肝臓 1.0 gとから全細胞RNA を抽出した。全RNA(30μg)を、0.6Mホルムアルデヒドを含む1%アガロースゲルを通して電気泳動し(R.M．Fourneyら Focus 10:5−7,[1988])、更に、上記の通りに20×SCC(pH 7.0)中で毛管作用によってHybond−N ナイロン膜(Amersham)に移した。J.Sambro okら,Molecular Cloning− A Laboratory Manual，第２版(1989)。そのRNA を上記ナイロン膜に対してUV架橋し、上記ナイロン膜を真空炉内で80℃で60分間焼き付けた。 PIPES 0.05M とリン酸ナトリウム50mMとNaCl 100 mM とEDTA 1mMと SDS 5%とを含む溶液25ml中で、60℃で２時間、このブロットに前ハイブリッド形成させた。 G.D．Vircaら,Biotechniques8:370 −371(1990)。放射能標識化DNA プローブとのハイブリッド形成の前に、上記溶液を取り除き、新鮮な溶液 10 mlを加えた。ハイブリッド形成に使用したプローブは、クローン４（配列番号21; 221 bp）とクローン 50(配列番号29; 337 bp)とヒトβ−アクチンに対応する2000 bp cDNA だった。P. Gunning，らMol．and Cell．Biol. 3:787−795(1983)。ランダムプライマー標識化キット(Stralagene，La Jolla，CA)を推奨使用法に従って用い、 [α−³²P]dATPの存在下でプローブ(50ng)を放射能標識化した。各プローブの比放射能は約10⁹cpm/μg だった。ブロットを60℃で16時間ハイブリッド形成させ、上記の通りに洗浄し(G.D．Virca ら、前出)、−80℃で Kodak X−Omat−ARフィルムに対して露出した。得られたオートラジオグラフの写真を図21A に示した。レーン1 とレーン3 とレーン5 は、T−1040からの肝臓RNA を含み、レーン2 とレーン4 とレーン６は、T−1053からの肝臓RNA を含む。レーン1 とレーン2 は、ヒトβ−アクチンcDNAプローブとハイブリッド形成し、レーン3 とレーン4 はクローン4 プローブ（配列番号21）とハイブリッド形成し、レーン5 とレーン6 はクローン50プローブ（配列番号29）とハイブリッド形成した。露出時間は、レーン1 とレーン2 とが−80℃で5 時間であり、レーン3 からレーン6 までが−80℃で56時間であった。28S リボゾームRNA の位置と18S リボゾームRNA の位置は矢印で示されている。これらのリボゾームRNA の相対サイズは、各々6333ヌクレオチドと2366ヌクレオチドである。J．Sambroo k ら、前出。クローン4 プローブ（配列番号21）とクローン50プローブ（配列番号29）は、感染タマリン(T−1053)の肝臓から抽出したRNA 中に含まれるRNA 種とハイブリッド形成した(図21A 、レーン4 とレーン6)。このハイブリッド形成可能なRNA 種のサイズは、28S リボゾームRNA と18S リボゾームRNA と比べての相対移動度に基づいて約8300ヌクレオチドと計算された。上記両プローブは同一のRNA 種とハイブリッド形成したと考えられる。上記両プローブは非感染タマリン(T−1040 )の肝臓から抽出したRNA とはハイブリッド形成しなかった(図21A 、レーン3 とレーン5)。これらの結果は、クローン4(配列番号21)配列とクローン50（配列番号29）配列とが同じ8.3Kb 転写物内に存在していることを示している。 HGBV RNAゲノムの鎖形成度(strandedness)を知るために、鎖特異性(Strand-sp ecific)放射能標識化DNA プローブを、って用い、非対称PCR によって調製した。精製クローン50 DNA（配列番号29）を、クローン50に陰性な鎖特異性プライマー（配列番号99）又はクローン50に陽性な鎖特異性プライマー(配列番号100)のどちらかを含む別々の反応の中で、1μM の最終濃度となるよう鋳型として使用した。この反応混合物は、こうした反応混合物中に通常含まれるdATPの代わりに、{α³²P −dATP](Amersham; 3000Ci/mmol )を含んでいた。上記鋳型を30回線形増幅した後に、非取込み［α³²P −dATP］を Quick− Indianapolis，IN)を推奨使用法に従って用い、取り除いた。二重鎖クローン50 DNA（配列番号29）の10倍ずつ希釈した液を含むDNA ドットブロットに放射能標識化プローブをハイブリッド形成させ、上記両プローブが概ね同等の感度を有することを認めた（データは示していない）。上記の通りに非感染タマリン T−10 40から抽出した肝臓RNA と感染タマリン T−1053から抽出した肝臓RNA とを合計で30μg 含むRNA ブロットと共に、放射能標識化プローブをハイブリッド形成させた。得られたオートラジオグラフの写真を図21B に示す。レーン1 とレーン3 は T−1040からの肝臓RNA を含み、レーン2 とレーン 4 は T−1053からの肝臓RNA を含む。レーン1 とレーン2 はクローン50に陽性な鎖プローブと共にハイブリッド形成し(即ち、陽性鎖が放射能標識化され、陰性鎖を検出した：配列番号100)、レーン3 とレーン4 はクローン50に陰性な鎖プローブと共にハイブリッド形成した（即ち、陰性鎖が放射能標識化され、陽性鎖を検出した：配列番号99）。ブロットを−80℃で18時間露出した。28S リボゾーム RNA の位置と18S リボゾームRNA の位置とが矢印で示されている。図21B に示すように、クローン50に陽性及び陰性な鎖プローブ（各々配列番号 100 と99）は、感染タマリン T−1053の肝臓から抽出した約8.3 キロベースのRN A 種とはハイブリッド形成した（図21B、レーン２とレーン４）が、非感染タマリン T−1040の肝臓から抽出したRNA とはハイブリッド形成しなかった（図21B 、レーン１とレーン3 ）。これは、上記で示したクローン4(配列番号21)及びクローン50(配列番号29)二重鎖プローブを使用して得られたノーザンブロット結果と一致していた。より強いシグナルがクローン50に陰性な鎖プローブ（配列番号99）を用いて得られた（図21B 、レーン4 対レーン2 ）ことは、感染タマリンの肝臓中に存在する優勢なRNA 種が陽性（即ち、コード化）鎖であることを示唆していた。実施例９．HGBVクローン配列の伸長Ａ． HGBV配列の生成既述の実施例3 の通りに得られ且つ実施例５の通りに配列決定されたクローンの各々は、HGBVゲノムの別々の領域から得られたと考えられた。従って、既に同定したクローンの間に残るHGBVゲノムの別の領域から配列を得るために、及び、そのRNAクローンの配列を確認するために、幾つかのPCR 移動実験(PCR walking experiment)を行った。全核酸を実施例3(A)で説明した通りに感染 T−1053血漿の50μl アリコートから抽出した。簡単に言えば、沈殿した核酸を PCRキット(Perkin −Elmer)で推奨使用法に従って標準RT−PCR を行った。簡潔に言えば、2mM MgCl₂と 1μM プライマーによる抽出核酸のランダム感作逆転写反応のcDNA生成物に対して、PCR を行った。反応物に対して35サイクルの変性−アニーリング−伸長（94 ℃、30秒；55℃、30秒；72℃、2分）を行い、その後で72℃で３分間の伸長を行った。アガロースゲル分析の前に反応物を 4℃に維持した。これらの生成物を慣用手法によりpT7 Blue T−ベクタープラスミド(Novagen)の中にクローン化した。表９は、上記反応を行った時に得られた結果を表している。 Sorensenら(J．Virol，67:7118−7124[1993])によって説明されているPCR 移動手法を変形した方法を、追加HGBV配列を得るために使用した。簡単に述べると、全核酸を感染タマリン T−1053血漿から抽出し、逆転写した。得られたcDNAを、MgCl₂2 mMを使用したことを除いてはSorensenら（前出）の手順と同様に、50 μl PCR反応物(PCR 1)中で増幅した。これらの反応物に対して35回の変性−アニーリング−伸長（94℃、30秒；55℃、30秒；72℃、 2分）を行い、その後72℃で３分間の伸長を行った。Sorensenら（前出）が説明している通りに、ストレプタビジンで被覆した常磁性ビーズ(Promega)を使用してビオチニル化生成物を単離した。Sorensenらが説明している通りに、合計で20〜35回の変性−アニーリング −伸長し、ストレプタビジンで精製した生成物に対して「入れ子(nested)」PCR( PCR 2)を行った。得られた生成物と、それらを生成するために使用したPCR プライマーとを表10に示す。これらの生成物を、慣用手法により低融点アガロースゲルから単離し、pT7 Bl ue T−ベクタープラスミド(Novagen)の中にクローン化した。上記の通りに、ウイルスゲノムRNA から5′末端配列を得るために、RNA リガーゼ仲介5′RACE(cDNA末端の高速増幅：RapidAmplification of cDNA Ends)を使用した。簡単に述べると、推奨使用法に従って使用した。ウイルスRNA の供給源は、上記の通りに抽出した急性期 T−1053血漿であった。逆転写（RT）のために使用した個々のウイルス種に固有のオリゴヌクレオチドと、第１のPCR 増幅(PCR 1)と第２のPCR 増幅(PCR 2)とを、表11に示す。結合アンカープライマーとその相補的PCR プライマーは上記製造者から提供を受けた。GeneAmp RNA PCR キット(Perkin Elmer)を使用して推奨使用法に従ってPCR を行った。 RNA リガーゼ仲介5′RACE によって生成された生成物を、上記の通りに低融点アガロースゲルから単離し、pT7 Blue T−ベクタープラスミド(Novagen)の中にクローン化した。 HGBV−B 配列の5′末端と3′末端とにおける別の配列を得るために（下記の「 HGBV内の２種類のHCV 様フラビウイルスの存在の証拠」を参照されたい）、RNA 環化実験(RNA circularization experiment)を行った。（この方法は、C.W．Man dlら(1991) Biotechniques，Vol 10(4): 485 −486 に説明されている方法に基づいている。）（沈殿中にtRNAをグリコーゲン 1μg で置き換えたことを除いて H205接種後14日目の） T−1057血漿50μl から全核酸を精製した。核酸ペレットをDEPC処理した水16.3μl の中に再溶解し、 2×TAP 緩衝液(1×=50 mM NaOAc、 pH 5.0、1 mM EDTA 、10mM 2−メルカプトエタノール、 2mM ATP)25 μl と、タバコ酸ピロホスファターゼ（20 単位;Sigma）8.7μl とを加えた。混合物を37 ℃で60分間温置した。（水で飽和させた）フェノールを使用し更にクロロホルムを使用して試料を抽出し、グリコーゲン(1μ g)の存在下でNaOAc/EtOHを用いて沈殿させた。そのペレットをDEPC水83μl 中に溶解し、10×RNA リガーゼ緩衝液 (New England Biolabs，NEB)10 μl とRNase インヒビター(Perkin Elmer)2μl とT4 RNAリガーゼ(NEB)5μl とを加えた。混合物を 4℃で16時間温置した。上記と同様にフェノールを使用し更にクロロホルムを使用して試料を抽出し、NaOAc/EtOHを用いて沈殿させた。 Superscript RT(GIBCO/BRL)をその推奨使用法に従って使用し且つ配列番号146 をプライマーとして用いる逆転写酵素(RT)反応で、結合RNA の1/10を使用した。RT反応混合物の半分を、ビオチニル化オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号146)と第２のオリゴヌクレオチドプライマー(配列番号133)との存在下でPCR1 のために上記の通り使用した。Sorensenら（前出）の通りにストレプタビジン被覆磁性ビーズを使用して、PCR1生成物を反応混合物から精製した。精製したPCR1 生成物（30μl の中から 2μl ）をPCR2のための鋳型として使用した。オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号147,154)を使用するPCR2によって、1200 bp 生成物を得、この生成物をpT7 Blue T−ベクタープラスミドの中にクローン化し、下記の通りに配列決定した。この実験からの２つの独立したクローンの配列分析によって、（一方のクローンが18個のT 残基の配列を有し、他方のクローンが27 個のT 残基の配列を有したが）既知の配列と重複する領域では100%の同一性を示し、さらに追加の塩基270 個の新たな配列とが明らかになった。上記環化実験は、標準的な3′−RACE手法又は5′−RACE手法では得られなかったHGBV−B ウイルスゲノムの5′末端と3′末端の両方からの配列を与えた。しかし、新たに得られた配列から設計したプライマーを使用して行った別のPCR 実験の後でさえ、正確な5′−3′結合部を発見することは困難だった。従って、HGBV −B RNA ゲノムの5′末端をより適切に定性するために、T−1053の肝臓から単離したRNA を使用してプライマー伸長実験を行った。実施例７で説明した通り、 T−1053の肝臓と対照（即ち、非感染）動物(T−10 40)の肝臓とから全細胞RNA を単離した。アンチセンスオリゴヌクレオチド(配列番号155)を、T ４ポリヌクレオチドキナーゼ(NEB)を使用して約9.39×10⁷ CPM/ μg の比放射能にγ−³²P −ATP で末端標識化した(Sambrook ら)。プライマーを別々の反応において T−1053肝臓RNA と T−1040肝臓RNA との30μl にアニーリングし、上記(Sambrook ら)の通りにMMLV逆転写酵素(Perkin −Elmer)を使用して伸長した。生成物を6%シークエンシングゲル上で分析した。プライマー伸長のために使用したプライマーと同一のプライマーを使用したHGBV−B 環化クローンの１つから生成したシーケンスラダー(sequence ladder)が、サイズ標準としての役割を果たした。 176bp のプライマー伸長生成物を T−1053から得た。非感染動物(T−1040)から抽出した肝臓RNA を使用したプライマー伸長では、こうした生成物は得られず、従って、HGBV−B ゲノムから得られた生成物を示した。得られたこれらの生成物の長さは、感染動物の肝臓内に存在するそれのような上記ゲノムの5′末端が、AUG 開始コドンから442 ヌクレオチド長だけ上流に位置することを示した。上記環化実験で得られた配列の3′位置を確認するために、予測される3′末端に対応するプライマーを使用してRT−PCR を行った（表２の反応1.25を参照されたい）。配列番号156 と配列番号157 とを使用した（上記の通りの）感染 T−10 53血漿のRT−PCR では450bp の生成物が得られた。これとは対照的に、配列番号 157 の相補と配列番号147 とを使用するRT−PCR では、検出可能なPCR 生成物が得られなかった（データは示していない）。これらのデータは上記ゲノムの3′ 末端がポリ T系の50ヌクレオチド長下流に位置することを示唆している。表9 、表10、表11と上記RNA 環化実験とからのクローン化生成物を、実施例５で既に説明した通りに配列決定した。興味深いことに、反応1.4 、1.6 、1.9 、 1.10、1.11のクローン化生成物がその末端において上記２つのプライマー配列の一方だけしか含まないことが発見され、このことは、これらの生成物が、誤ったランダムな合成開始事象(priming event)の結果として生じたことを示唆していた。PCR ／配列決定実験によって、生成物1.4 、1.6 、1.9 、1.10、1.11中で検出した配列が、クローン４（配列番号21）及び／又はクローン50（配列番号29）とに関連付けられた。加えて、反応の各々から得られた配列は、HCV との同一性が限定されていた。従って、これらの生成物は、PCR 生成物の一方の末端における誤った合成開始(priming)の結果ではあっても、真正のHGBV配列を含むと考えられた。反応1.14から得られた生成物も誤った合成開始の結果であると考えられた。この場合に、配列番号160 の相補が、反応1.14から得た生成物の5′末端に発見された(図22、GB−B)。GB−A 内にある配列番号161 から配列番号160 が得られているので、このことは予想外であった。しかし、反応1.14から得た生成物と反応2.8 から得た生成物との間の配列の同一性が、別のPCR ／配列決定実験（データは示していない）と共に、反応1.14が真正HGBV配列を含むことを実証した。配列番号160 の相補が配列番号162 の上流にあって、GB−B 配列に対してPCR プライマーとして働くのに十分な同一性を有することが明らかである。上記の表9 と表10と表11とに示した生成物から得られた配列と、上記RNA 環化実験から得られた配列とを、GCG Package(Version 7)プログラムを使用してコンティグ(contig)の形にアセンブルした。このアセンブルしたコンティグの概要を図22に示す。GBコンティグA(GB−A)は長さ9493bpであり、その全てが配列決定されており、配列番号163 に示す。GB−A は、クローン２（配列番号22）とクローン16（配列番号26）とクローン23（配列番号28）とクローン18（配列番号27）とクローン11（配列番号24）とクローン10（配列番号23）とを含む。配列番号163 は３つの読み可能枠に翻訳され、配列番号164−392 としての配列表の形で示されている。GBコンティグB(GB−B)は9143 bp であり、配列番号393 に示す。GB− B(配列番号393)は、クローン４（配列番号21）とクローン50（配列番号29）とクローン119（配列番号30）とクローン13（配列番号25）とを含んでいる。配列番号393 は１つの開放読み枠に翻訳され、配列番号 396 、397 として配列表の形で示されている。5′末端と3′末端とからのUTR の各々を６つの読み枠に翻訳することが可能である。Ｂ． HGBV内の２種類のHCV 様ウイルスの存在に関する証拠１．２つの互いに異なったRNA 種を表すGB−A とGB−B との証拠 GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)とHCV −1(GenBank accession#M6 7463)との比較によって、GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)とHCV−1 とが全て異なった配列であることを示す。GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)とHCV −1 との核酸配列のドットプロット分析を、GCGPackage(Version 7 )を使用して行った。21のウィンドウサイズと14のストリンジェンシー(stringen cy)とを使用して、GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)とHCV−1 とが互いに明らかに異なったヌクレオチド配列を含むことが発見された（図23）。従って、GB−A(配列番号163)及びGB−B(配列番号393)は、HCV の異なる株又は遺伝子型を表すものではなく、互いに異なる株又は遺伝子型を表すものでもない。この分析によって、限定されたヌクレオチド同一性を有する短い領域が、GB −A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)のNS3 様配列とNS5b様配列との中に、並びにHCV のNS3 配列とNS5b配列の中に発見された。しかし、推定上のNTP 結合ヘリカーゼとRNA 依存性RNAポリメラーゼの各々がNS3 とNS5bとに対応し、これが全てのフラビウイルス中に保存されているので、上記領域内のヌクレオチド同一性は驚くには値しない（下記参照）。GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393) が別々のRNA 分子を表し、これらが同じRNA 分子の別々の領域でもないということが、5′RACE 実験（上記）によって実証され、（実施例８で説明した）ノーザンブロットデータによって立証された。最初に、5′RACE 実験によって、GB−A( 配列番号163)とGB−B(配列番号393)との5′末端がそれぞれ異なることが示された。RNA 分子の5′末端は１種だけだから、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とは別々のRNA 分子を表す。第２に、クローン４とクローン50（両方とも GB−B[配列番号393]から得られた配列番号21、29、実施例８を参照されたい）を用いてノーザンブロット法によって感染タマリンの肝臓RNA 中に検出された8300 塩基のRNA 分子は、GB−B(配列番号393、9143 bp)のサイズに概ね一致した。GB −A と GB−B とが同一のRNA 分子のそれぞれ一部であるとすれば、少なくとも17,000個の塩基を有するノーザンブロット生成物がなければならない。これらのデータは、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とが、HCV の変形でもなく又は互いの変形でもない、２つの互いに異なったRNA 分子のヌクレオチド配列であることを示す。 T−1053のノーザンブロット分析とPCR 調査によれば、GB−A(配列番号163)とG B−B(配列番号393)とにそれぞれ対応する２つのRNA 種は、 T−1053の肝臓中に相等しい含量で存在するわけではないことが判明した。上記のように、いずれも GB−B(配列番号393)から得られたクローン４とクローン50（各々配列番号21、29 ）が、（実施例8 で説明した通り） T−1053の感染肝臓中に存在する8.3 kb RNA 種とハイブリッド形成した。これとは対照的に、いずれもGB−A(配列番号163)から得られたクローン２（配列番号22）とクローン10（配列番号23）とクローン16 （配列番号26）とクローン23（配列番号28）は、同一の実験において T−1053肝臓RNA とのハイブリッド形成を全く示さなかった（データは示していない）。加えて、クローン4 PCR とクローン16 PCRとが同等の感度を有することがプラズミド鋳型を使用して実証された（データは示していない）にもかかわらず、クローン16 PCRは、エチジウム染色によって T−1053肝臓RNAから生成されたcDN A上において、クローン４PCR に比べて著しく少ない生成物しか生成しなかった。これは、動物を犠牲にした時点で T−1053血漿中において発見された状況とは対照的だった。 T−1053血漿RNA から生成されたcDNA上におけるクローン４(GB −B(配列番号393 )に特異的)PCR とクローン６(GB−A(配列番号163)に特異的)PC R に関するPCR 滴定実験は、相等しい量のGB−A(配列番号163)RNA とGB−B(配列番号393)RNAとが T−1053血漿中に存在することを示唆した(実施例4 、E.2)。従って、 GB−A(配列番号163)RNA とGB−B(配列番号393)RNA とが T−1053血漿中に相等しい含量で存在していたにもかかわらず、動物を犠牲にした時点の T−10 53肝臓中には、GB−A(配列番号163)RNA よりも多い量のGB−B(配列番号393)RNA が存在すると考えられた。これらの結果はさらに、 T−1053血漿中にGB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とに対応する２つの互いに異なったRNA 分子が存在することの更に別の証拠であり、これらのRNA が必ずしも感染タマリン肝臓RN A 中に相等しい含量で存在するわけではないということを示唆した。従って、GB −A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とが単一のウイルスゲノムの別々のセグメントを形成するとは考え難い。２． GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とが２つの互いに異なるウイルスのゲノムを表すということの証拠感染力(infectivity)とPCR の検討により、GB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)のウイルス性質に関する証拠が得られる。具体的には、濾過(0.1μm)されて10^-4に希釈された又は濾過されずに10^-5に希釈された T−1053血漿を接種されたタマリン T−1049とタマリン T−1051は、いずれもクローン４(GB−B[配列番号393])配列とクローン16(GB −A[配列番号163])配列の両方に関して陽性だった。接種の前は、これらの動物は二匹ともクローン４とクローン16とに対して陰性だった（実施例４、E.4 、E.5 ）。従って、GB−A とGB−B とに対応する急性相 T−1053血漿中に含まれる２つのRNA 種を、濾過し、希釈して、他の動物に当該のGB−A(配列番号163)とGB−B(配列番号393)とのウイルスに予期される性質を維持するよう継代接種することが可能だった。GB−A とGB−B とが別個のウイルス粒子からのRNA 分子を表すことは、H205接種タマリンのPCR 調査によって明らかになった。具体的には、H205接種後にRT−PCR によって４匹のタマリンが全てクローン4(GB−B[配列番号393]) に対して陽性になった。これとは対照的に、４匹のH205接種タマリンの内の１匹 (T−1053)だけがクローン 16(GB−B[配列番号163])に対して陽性になったにすぎなかった（実施例4 、E.2 ）。従って、GB−A(配列番号163)配列は T−1048 と T−1057と T−1061には本当に存在しないと仮定し、且つ、クローン16 PCRの結果が陰性であることが感染力の低さに起因するわけではないと仮定すると、GB− B(配列番号393)配列に対応するウイルス（即ち、肝炎GBウイルスB[HGBV−B]）が、GB−A(配列番号163)配列とは無関係に単独で継代接種されうると考えられた。 T−1057からのHGBV−B のみの試料を、更に２回継代接種した（実施例４）。これらの動物では、GB−A(配列番号163)配列はRT−PCR によって検出されなかった。加えて、これらの動物において肝臓酵素のレベルが有意に上昇するとされており（実施例4 ）、このことは、HGBV−B だけでもタマリンに肝炎を発症せしめることを示した。GB−B(配列番号393)配列が検出限界未満のタマリンにおいて、GB −A(配列番号163)配列が確認された。具体的には、GB−B のみの動物(T−1048、 T−1057、 T−1061)に T−1053血漿で誘導すると、クローン16に特異的なRT−P CR によって検出されるような、GB−A(配列番号163)のみのウイルス血症が発症した。 T−1057からのGB−A のみの血漿を更に１回継代接種した（実施例４）。従って、GB−A(配列番号163)配列に対応するウイルス（肝炎GBウイルス A[HGBV−A]）はHGBV−B とは無関係に単独で複製するものと考えられた。H GBV−Bの不在下でHGBV−A の継代接種を更に続けている。現在までのところ、HG BV−A がタマリンの肝炎を引き起こすか否かは判明していない。しかし、 T−10 53誘導タマリンにHGBV−A ウイルス血症を伴う肝臓酵素のレベル上昇がないことや、 T−1057からのHGBV−A のみの血清を継代接種しても肝臓酵素のレベル上昇のないことは、タマリンにおけるHGBV−B の肝好性とは対照的である。急性相 T−1053血漿中の２種類のウイルスの存在は、H205接種物に基づくと考えられる。具体的には、実施例７のデータは、クローン16（配列番号26、GB−A[ 配列番号163]からのもの）が７匹の検査対象タマリンからの接種前の血漿中にはいずれにも存在しなかったことを示した。加えて、クローン2 、10、18、23（各々配列番号22、23、27、28、全てGB−A[配列番号163]からのもの）も、検査した HGBV接種タマリン血漿の何れにおいても検出されなかった（実施例７）。接種前のタマリンの血漿をクローン4 とクローン50（各々配列番号21、29、全てGB−B[配列番号393]からのもの）に関して検査した時にも、同様の陰性の結果が得られた。従って、HGBV− A とHGBV−B はいずれも接種前のタマリンの血漿中に存在しなかった。これに対し、上記クローンの全て（即ち、GB−A[配列番号163]からのクローン2 、10、16 、18、23と、GB−B[配列番号393]からのクローン4 、50）が、H205接種物中に検出された（表７）。興味深いことに、T−1053肝臓から作られたcDNA（上記）に見られるように、H205からランダムに合成開始された同一のcDNAを使用した場合に、GB−A(配列番号163)中の幾つかの別々のPCR 標的は全て、GB−B(配列番号39 3)中の同様のPCR 標的の場合よりも生成物が少なかった（データは示していない）。従って、当初のGB接種物であるH205中には、HGBV−A 及びHGBV−B が存在すると結論付けられた。しかし、H205中にはHGBV−A よりも多くのHGBV−B が含まれると考えられる。H205接種物中のHGBV−A が相対的に少ないことが、H205接種後に４匹のタマリンの中の１匹だけがHGBV−A に対して陽性であったこと(実施例４、E.2)の理由と考えられる。３．HGBV−A とHGBV−B とがフラビウイルス科(Flaviviridae)に属することの証拠実施例５で説明したGB−A(配列番号165 −268、270 −384，386 −392)の３つの枠翻訳生成物とGB−B(配列番号397)とをSWISS −PROTデータベースで検索すると、HCV の様々な菌株との、限定されてはいるが顕著なアミノ酸配列の相同性を示した。GB−A(配列番号164)とGB−B(配列番号393)とからの翻訳生成物は、様々なHCV 単離物（即ち、NS2 、NS3 、NS4 、NS5 ）の非構造タンパク領域に対して最も近いホモロジーを示した。例えば、図24に示されるように、フラビウイルスの推定上のNTP結合ヘリカーゼドメインにおける保存残基（＊で表す）（図24A ）と、全てのウイルス性RNA 依存性RNAポリメラーゼのRNA 依存性RNA ポリメラーゼドメインにおける保存残基（＊で表す）（図24B ）は、同様に HCV−１ NS3 及びNS5b（SWISS −PROT accession number p26664）と、GB−A(配列番号390)及びGB−B(配列番号397)の予期される翻訳生成物のいずれにも保持されていた。（ Chooら，PNAS 88:2451−2455［1991］とDomierら，Virology 158:20 −27［1987 ］を参照されたい。）従って、GB−A ウイルスとGB−B ウイルスとはいずれも機能NTP 結合ヘリカーゼ(functional NTP −binding helicase)とRNA 依存性RNA ポリメラーゼとをコードすると考えられた。しかし、GB−A(配列番号390)とGB−B(配列番号397) は、その間に完全なアミノ酸同一性があるわけではなく、及び／又は、HCV NS3 及びNS5bの他の領域内においてHCV とも完全なアミノ酸同一性がない。具体的には、図24A に示されるNS3 の残基200 個に亙って、GB−A(配列番号390、残基125 2−1449)ウイルスとHCV−１(配列番号398)は47％同一であり、GB−B(配列番号39 7 、残基1212−1408)ウイルスとHCV −１(配列番号398)は55％同一であり、GB− A(配列番号390 、残基1252−1449)ウイルスとGB−B(配列番号397 、残基1212−1 408)ウイルスは43.5％同一だった。加えて、図24B に示されるNS3 の残基 100個に亙って、GB−A(配列番号390、残基2644−2739)ウイルスとHCV−１(配列番号39 8)は36％同一であり、GB−B(配列番号397、残基2513−2612)ウイルスとHCV −１ (配列番号398)は41％同一であり、GB−A(配列番号390 、残基2644−2739)ウイルスとGB−B(配列番号397 、残基2599−2698)ウイルスは44％同一だった。HCV と比較した場合に、GB−A(配列番号390)とGB−B(配列番号397)との他の推定上の非構造遺伝子にも、ホモロジーは比較的低かった。Genbank に登録された種々のHCV 配列と比較しても、GB−A ウイルスとGB −B ウイルスとの推定上の非構造タンパク質のホモロジーの全体的レベルは、GB −A(配列番号164)とGB−B(配列番号393)の両方はフラビウイルス科の２つの互いに異なったメンバーから得られることを示唆している。フラビウイルス類は、１つのNTP 結合ヘリカーゼドメインと１つのRNA 依存性RNA ポリメラーゼドメインとに対応する単一のゲノムRNA 分子を含む。推定上のRNA ヘリカーゼドメインと推定上のRNA 依存性RNA ポリメラーゼドメインとを各々に含む２つのコンティグの存在は、急性相 T−1053血漿中の２つのHCV 様フラビウイルスの存在と一致するものである。実施例10．PCR HGBVとC 型肝炎ウイルスとの配列相関性を検出するために、PCR に基づく実験を次のように行った。様々な位置的起源からのHCV 単離体(Cha，T.−A.ら，J．C lin．Microbiol． 29:2528−2534[1991])において高度に保存されている、HCV ゲノムの5′−非翻訳領域(UTR)配列に基づくPCR プライマー(J.H．Han, PNAS 88:1 711 −1715[1991])を、H205感染タマリン T−1053肝臓RNA における類似の配列を検出するために使用した。実施例8Aで説明した通りに、全細胞RNA を感染タマリン T−1053の肝臓と非感染タマリン(T−1040)の肝臓とから抽出した。Perkin−Elmer から入手可能なキットを使用し、その推奨使用法に概ね従って、各RNA の試料30μg を逆転写しPCR 増幅した。HCV 5′−UTR の塩基 249−268 を含むアンチセンスプライマー（プライマー１）を上記逆転写酵素反応に使用した。プライマー１と、HCV 5′−UTR の塩基13−46を含むプライマー（プライマー２）とを、介在配列のPCR 増幅のために使用した。サーモサイクリング(thermocycling)の条件はCha ら（前出）による。 H205感染タマリン T−1053のHCV 5′−UTR 配列の検出感度を増大させるために、上記PCR 反応に対して、「入れ子」PCR プライマーを使用した第２の増幅反応を生じさせた。そのためのプライマーは、HCV 5′−UTR 内における上記プライマー１の配列と上記プライマー２の配列との間にある配列から得た。プライマー３はHCV 5′−UTR の塩基47−69からの配列を含み、アンチセンスプライマーであるプライマー４はHCV 5′−UTR の塩基 188−210 を含んでいた。この「入れ子」PCR 反応では、第１のPCR 反応からのPCR 生成物（反応体積合計100 μl から2μl ）をDNA 鋳型源として使用した。アニーリング温度が60℃ でなく55℃であったことを除いてサーモサイクリング条件は上記と概ね同一だった。第２のPCR 反応で得られたPCR 生成物を、アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色とを使用して所期のDNA 生成物に関して分析した。HCV 5′−UTR 配列に基づくこの所期のDNA フラグメントのサイズ（Han ら、前出）は、第１の PCR 反応の生成物に関しては 253bpであり、入れ子PCR 反応の生成物に関しては 163bpであった。所期サイズのPCR 生成物が、実施例8Aで説明したHCV 感染チンパンジーの肝臓から抽出した全細胞RNA 30μg を使用して行った対照実験において得られ（データは示していない）、これは、この実験手順でHCVの5′−UTR を検出できることを示す。しかし、 T−1053肝臓RNA 又は T−1040肝臓RNA の一方を使用した場合には、どちらの所期生成物も、生じた臭化エチジウム染色アガロースゲル上に発見できなかった（データは示していない）。このように所期の結果が得られなかったのは、(i)上記試薬の5′−UTR の配列がHCV のそれと大きく異なっていたために、使用したオリゴヌクレオチドプライマーが効率的にアニールされず、従って、PCR 増幅が不可能になったということ、又は、(ii)上記試薬に5′−UTR が欠如していたということを示唆する。どちらの場合にも、上記試薬のヌクレオチド配列がHCV のそれと大きく異なっていることが、この結果から推定される。 HCV の実験的感染の急性相中に得られたチンパンジー血漿プールから核酸を実施例７で説明した通り単離した(G.Schlauderら,J．Clin．Microbiology 29:2175 −2179[1991])。クローン16プライマー（配列番号93、94）を使用してRT−PCR を実施例７の通り行った。これらのプライマーに関する所期サイズのバンドは、臭化エチジウム染色によっても検出されず、クローン16に特異的なプローブに対するハイブリッド形成後にも検出されなかった（データは示していない）。こうした結果は、HCV に対するクローン16配列（配列番号26）の無関係性を立証する。実施例11．他の肝炎ウイルスに対するHGBV感染血清の反応性 H205接種物(T−1048、 T−1057、 T−1061)又は T−1053接種物(T−1051)を使用したHGBV接種の前と後に血清標本を得、既知の肝炎ウイルスに接触した後に検出されることが多い抗体に関する検査を行った。A 型肝炎ウイルスに対する抗体（本出願人から入手可能なHAVAB 検定を使用）と、B 型肝炎コアの核と、E 型肝炎ウイルス(HEV)（本出願人から入手可能なHEV EIA を使用）と、C 型肝炎ウイルス(HCV)（本出願人から入手可能なHCV 第２世代検査を使用）とに関して、上記標本を検査した。これらの検査は、各検査キットのパッケージに同封された説明書に従って行った。 HGBV接種の前と後のどちらにおいても、検査したタマリンは何れも、HCV 又は HEV に対する抗体に関して陽性ではなかった（表12を参照）。従って、HGBV感染は、HCV 又はHEV に対する検出可能な抗血清をもたらさなかった。上記タマリンの中の１匹(T−1061)は、HGBV接種の前と後のどちらにおいてもH AV 抗体に対して陽性であり、このことは、HAV に事前に罹患していたことを示唆した（表9 、 T−1061）。しかし、他の３匹のタマリン(T−1048、 T−1057、 T−1051)は、HGBV接種後において、HAV に特異的な抗体を全く示さなかった。従って、HGBV感染は抗HAV 反応を生じさせない。上記タマリンの中の１匹(T−10 48)は、HGBV接種の前と後のどちらにおいてもHBV 抗体に対して陰性だった。上記タマリンの中の２匹(T−1061、 T−1057)は、HGBV接種の前に陽性だった。上記タマリンの中の１匹(T−1051)は、HGBV接種の前にはHBV 抗体に対して境界近くの陽性であったが、接種後には陰性だった。こうしたデータに基づく限り、HGBV試薬による感染がHBV 核に対する免疫反応を誘導するという証明は得られない。総論的に言えば、これらのデータは、HGBV試薬が独特(unique)なウイルス剤であり、ヒト肝炎に関連した一般のウイルス性試薬の何れにも関係しないことを実証した。実施例12．HGBV感染肝臓のウェスタンブロット分析上記の実施例１と実施例２とに示したように、HGBVを接種したタマリンには肝臓酵素値の上昇が認められた。HGBVが実際に肝臓向性ウイルスである場合には、ウイルスタンパク質が感染肝臓細胞内で生成され、こうしたタンパク質に対する免疫反応が生じることが推測される。この実施例では、HGBV感染タマリンから得られた肝臓に特有(unique)のタンパク質が現れ、このタンパク質がHGBV感染後の回復期段階に得られたタマリン血清を使用するウェスタンブロットによって特異的に認識されるとすべき根拠を示す。 HGBV感染タマリン肝臓と様々な対照用のタマリン肝臓とチンパンジー肝臓とを賽の目に切り、Omni−mixer ホモジナイザーを使用してPBS 中にホモジナイズした(5mlに対して肝臓約1g)。得られた懸濁液を、遠心分離（10,000× g 、１時間、 4℃）と、 5μmフィルタと 0.8μm フィルタと0.45μm フィルタとを通す限界濾過とによって清澄化した。この清澄化したホモジネートを、100S以上の全成分のペレット化を生じさせる条件下で遠心分離した。ペレット（100S肝臓フラクション）を少量の緩衝液中に溶解し、−70℃で貯蔵した。標準的な方法と試薬（Laemmli 不連続ゲル）を使用してSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行った。100S肝臓フラクションを、SDS と 2−メルカプトエタノールとを含む試料緩衝液中に1:20に希釈し、 5分間95℃に加熱した。30 〜45分間200 ボルトで12% アクリルアミド又は 4→15% アクリルアミド線形勾配ゲル(7cm×8cm)のいずれかによって上記タンパク質を電気泳動した。標準の方法と試薬を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に電気転写(electro−tran sfer)した。標準的な方法を使用してウェスタンブロットを生じさせた。概略的に言えば、ニトロセルロース膜をTBS/Tween 中で簡単にすすぎ、 4℃のTBS/CS(100mM Tris 、150mM NaCl、10mM EDTA 、0.18% Tween −20、 4.0%仔ウシ血清、pH 8.0）中で一晩封鎖した。上記ニトロセルロース膜をMulti −screen装置の中に入れ、 6 00μg の血清を上記装置の溝の中に入れ、その後2 時間室温に維持し、一晩4 ℃で温置した。 Multi−screen装置から上記ニトロセルロース膜を取り除き、TBS/Twee（50mM Tris 、150mM NaCl、0.05% Tween −20、pH8.0 ）中で５分間ずつ３回上記ニトロセルロース膜を洗浄した。そのニトロセルロース膜をヤギ抗ヒト：HRPO抱合体(0.2μg/ml TBS/CS)15ml中で室温で１時間温置した。上記の通りに洗浄した後に、ニトロセルロース膜をTMB 酵素基質溶液中に温置し、水ですすぎ、乾燥した。犠牲時（GB接種12日後）に T−1053肝臓から単離して上記の通りに吸収転写したタンパク質は、GB接種後５週目、６週目、７週目、９週目、又は11週目から、 T−1057血清との反応時に約50〜80kDa の見掛け分子量を有する独特な抗原性タンパク質を示した。GB接種前又は接種３週後の T−1057血清と反応させた時には、上記バンドは存在しなかった。上記 T−1057血清の何れかと反応させた時に、上記バンドは、非接種タマリン（T−1040）から得られた肝臓タンパク質を含むレーン中には現れなかった。加えて、他のGB接種後の血清（GB接種後11週目の T −1048と、GB接種後 8週目の T−1051）に T−1053肝臓タンパク質を反応させた時には、同一サイズ(50〜80kDa)のタンパク質が現れたが、同じ上記動物から得た接種前血清と T−1053肝臓タンパク質を反応させた時には、この同一サイズのタンパク質は現れなかった。他のGB接種タマリンからの肝臓組織中で、又は、HCV もしくはHBV のいずれかに感染させたチンパンジーの肝臓組織の中で、上記免疫反応性バンドが検出されるかを調べるために、更に別のウェスタンブロット実験を行った。各々の場合、肝臓タンパク質を含むニトロセルロースストリップを T−1048（GB接種後5 、8 、16週目）と T−1051（GB接種後 8、12週目）とから得た血清プールと反応させた。上記プール中では、５つの血清を同等の割合で混合した。50〜80kDa の反応性タンパク質バンドを、GB接種タマリン（GB接種後14日目に得た T−1038、 T− 1049、 T−1055と、GB接種後12日目に得た T−1053）から得た全てのタマリン肝臓標本において検出した。この免疫反応性バンドは、 T−1040（非接種）から得た肝臓標本と、チンパンジー肝臓標本(CHAS−457(HCV 接種前)、CHAS−457(HCV ＋)、 CRAIG−454(HCV ＋)、MUNA−376(HBV ＋))とにおいては検出できなかった。以上総合して、これらのデータは、HGBV感染タマリン肝臓に特異的に結合する、約50〜80kDa の見掛け分子量を有する免疫原性及び抗原性タンパク質の存在を実証するものだった。このHGBV関連タンパク質の性質（即ち、ウイルスをコードするか又は宿主起源か）は現在調査中である。HGBV関連タンパク質の起源に関係なく、これらの結果は、HGBV感染がHGBV感染タマリン肝臓中に存在する抗原に対する抗体反応を誘導する事実と整合している。実施例13．CKS に基づく免疫原性HGBV−A 及びHGBV−B ポリペプチドの発現と検出Ａ． HGBV−A 及びHGBV−B 配列のクローン化クローン化ベクターpJ0200、pJ0201、pJ0202により、組換えタンパク質を CMP −KDO シンセターゼ(CKS)タンパク質に融合させた。これらのプラスミドの各々はプラスミドpBR322由来であるが、（E.coli CKSタンパク質を構成する全体で 2 48個のアミノ酸の中の最初の 239個をコードする）kdsB遺伝子フラグメントに融合した修飾ラックプロモーターと、kdsB遺伝子フラグメントの末端に融合した合成リンカーとを有する。この合成リンカーは、遺伝子挿入に要する複数の制限部位と、翻訳停止シグナルと、 trpA rho依存性転写ターミネーターとを含んでいた。このリンカー領域内の特有の制限部位は、 5′から3′方向に、 EcoRI 、SacI、KpnI、SmaI、BamHI 、XbaI、PstI、SphI、HindIIIを含んでいた。各々のプラスミドは、上記複数のクローン化部位内のいずれの読み枠の中へも挿入を可能にする。タンパク質合成のCKS 方法とCKS ベクターは、本明細書に引例として組み入れられている本出願人の米国特許第 5,124,255号に開示されており、一方、検定フォーマットと検査キットとにおけるCKS 融合タンパク質の使用は、本明細書に引例として組み入れられている本出願人の米国出願番号No．07/9 03,043に開示されている。表９と表10（実施例９）で説明した移動実験（walkingexperiment）から得られたHGBV−A 配列とHGBV−B 配列を、表13と表14に示した制限酵素（10単位、NE B ）を使用して適切な pT7Blue T−ベクタークローンから切り離し、実施例3Bで説明した通りに1%低融点アガロースゲルから精製した。プラスミドpJ0200、pJ02 01、pJ0202を同一の制限酵素（10単位、NEB ）によって消化し、細菌性アルカリフォスフォターゼ（GIBCO BRL，Grand Island，NY）で脱リン酸した。精製したH GBVフラグメントの各々を、消化し脱リン酸したpJ0200、pJ0201、pJ0202の中に結合させ、実施例3Bで説明した通りにE．coli XL1 Blueに形質転換した。標準的なミニプレプ(miniprep)分析によって、CKS/HGBV発現ベクターの形成の成功を確認した。別の２つのPCR 生成物を、特に発現のために準備した。これら２つの生成物は、4.1 、4.2 と表され、各々にHGBV−B コア領域とHGBV−A コア領域とをコードすると予想された（図22参照）。実施例９で説明したように、PCR 生成物4.1 を、プライマーコア B−s とプライマーコア B−al(配列番号708 、709)を使用して作成し、PCR 生成物4.2 を、プライマーコア A−s とプライマーコア2.2.1′( 配列番号710 、138)を使用して生成した。この4.1 センス及びアンチセンスプライマーは、末端となるように意図したEcoRI 及びBamHI 制限部位を各々に有した。上記のように、4.1PCR生成物を消化し、ゲル単離し、pJO200、pJO201、pJO202 に結合させた。4.2PCR 生成物に関するセンスプライマーは、末端となるように意図したEcoRI 制限部位を有するが、そのアンチセンスプライマーは制限部位を持たなかった。従って、この生成物を、EcoRI によって切断し、ゲル単離し、既にBamHI で消化したpJO200、pJO201、pJO202に結合させ、DNA ポリメラーゼのクレノウフラグメントとdNTPとで末端修飾し、EcoRI で消化し、当業界で公知のように細菌性アルカリフォスフォターゼで脱リン酸した。Ｂ． HGBV-A 及びHGBV-B 配列の発現トリプトン32gm/L、酵母抽出物20gm/L、NaCl 5gm/L、pH7.4 、アンピシリン10 0mg/L 、グルコース3mM を含む媒質中で振とうしながら、CKS/HGBV発現ベクターを含むE．coli XL1 Blue培養物を37℃で生長させた。この培養物が1.0〜2.0 のO D600 に達した時に、修飾ラックプロモーターからの発現を誘導するためIPTGを最終濃度1mM になるように加えた。更に３時間振とうしながら37℃で培養物を生長させ、集菌した。細胞ペレットをSDS/PAGE充填緩衝液（Tris pH6.8 62.5mM 、 SDS 2％、グリセロール 10%、2−メルカプトエタノール5%、ブロモフェノールブルー0.1mg/ml）中に10のOD600 となるよう再懸濁させ、５分間沸騰させた。調製した全細胞ライゼートのアリコートを10%SDS −ポリアクリルアミドゲル上に施し、40% メタノール／10% 酢酸中にクーマシーブルー染料0.2%を含む溶液で着色し、更に、バックグラウンドが透明になるまで16.5% メタノール／5%酢酸で脱色した。全細胞ライゼートを第２の10% SDS −ポリアクリルアミドゲル上に施し、イムノブロット検定のために電気泳動によってニトロセルロースに転写した。転写されたタンパク質を含むニトロセルロースのシートを室温で30分間封鎖溶液（Tris緩衝塩類液中の5%Carnation 無脂肪ドライミルク）中に温置し、E. coli 細胞ライゼートに対して予め封鎖されたヤギ抗CKS 血清中で室温で１時間温置し、封鎖溶液中に1:1000に希釈した。このニトロセルロースシートをTris緩衝塩類液（TBS）で２回洗浄し、その後アルカリホスファターゼ抱合ウサギ抗ヤギIgG と共に室温で１時間温置し、封鎖溶液中で 1：1000 に希釈した。このニトロセルロースシートをTBS で２回洗浄し、ニトロブルーテトラゾリウム(nitroblue telrazolium)と5 −ブロモ−4 −クロロ−3 −インドリルホスフェートとを含むTBS 中で発色させた。各フラグメントに対する適切な読み枠を、適正な予想サイズの免疫反応性CKS 融合タンパク質の発現に基づいて定め、ベクター挿入結合部分についてはDNA 配列決定によって確認した。上記フラグメント各々の適切な読み枠を決定した後に、適切な構成要素を含む培養物からの試料を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロットとによって分析した。図25A は、上記CKS 融合タンパク質全細胞ライゼートを含む２つのクーマシー染色10%SDS−ポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１とレーン 16は、左に示されるキロダルトン単位の分子量標準を含む。ゲル１（HGBV−A 試料）上の展開順序は次の通りだった：レーン2 、クローン1.17誘導前：レーン3 −15、クローン4.2 、クローン1.17、クローン1.8 、クローン1.2 、クローン1. 18(配列番号390)、クローン1.19、クローン1.20、クローン1.21、クローン1.22( 配列番号390)、クローン2.12、クローン1.5 、クローン1.23、クローン2.18、各々全て誘導３時間後。ゲル2 （HGBV−B 試料）上の展開順序は次の通りだった：レーン17、クローン4.1 誘導前：レーン18−29、クローン4.1 、クローン1.15、クローン1.14、クローン2.8 、クローン1.13、クローン1.12、クローン2.1 、クローン1. 7、クローン1.3 、クローン1.4 、クローン1.16、クローン2.12、各々全て誘導３時間後。これらのタンパク質を上記と同じ順序で２つの別の10％ゲル上に施し、上記の通りにニトロセルロースに転写した。試料を、２匹の回復期の T−1048、 T−1051からの血清のプールを使用したウェスタンブロットで次のように分析した。上記試料を含むニトロセルロースシートを封鎖溶液中に30分間温置し、E.coliライゼート 10%と、XL1 −Blue/CKSライゼート6mg/ mlと、表６（実施例４）で説明した回復期タマリン血清プールの1:100 希釈液とを含む封鎖溶液に移した。室温で一晩温置した後、上記ニトロセルロースシートをTBS 中で２回洗浄し、HRPO−抱合ヤギ抗ヒトIgG 中に室温で１時間温置し、封鎖溶液中に1:500 に希釈した。ニトロセルロースシートをTBS 中で２回洗浄し、 4 −クロロ−1 −ナフトール 2mg/mlと過酸化水素 0.02%とメタノール 17%とを含むTBS 中で発色させた。図25Bに示されているように、３つのHGBV−B タンパク質、クローン1.4 、1.7 、4.1 のCKS 融合が、タマリン血清プールとの免疫反応を示した。クローン1.7 は、HGBV−B 免疫原性領域をコードする配列(配列番号610)を含み、クローン1,4 は、同じ回復期タマリン血清プールを使用したcDNA ライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見された、２つの HGBV−B 免疫原性領域をコードする配列（配列番号12、13、18）を含んでいた。上記のパラグラフで説明した試料も、軍医GB(the surgeon GB)からの急性肝炎の発病後約３週目に得られた回復期血清の1.100 希釈液を使用して、上記の通りにウェスタンブロットによって分析した。HGBV−A とHGBV−B とからの融合タンパク質の上記血清に対する反応性を表13、14に示す。HGBV−B タンパク質では１つ(2.1 )だけがこの血清に対する反応性を示したが、この反応性は非常に低く、一方、２つのHGBV−A タンパク質(1.22[配列番号390]、2.17)はこの血清に対する高い反応性を示した。これら２つのHGBV−A タンパク質は40個のアミノ酸について共通であり、このことは、１個以上のエピトープに対する反応性を反映している可能性がある。これら２つのHGBV−Aタンパク質を、実施例16で説明した通りのELI SA 検定で使用するために選択した。第11代継代接種GB材料(H205 GB pass 11)に感染したタマリンは、幾つかのHGBV−B エピトープに対して免疫反応を示し、HG BV−A エピトープに対しては免疫反応を示さなかったが、最初のGB源からの血清は、少なくとも１つのGBV−A エピトープに対して著しい反応性を示したということは興味深い。このことは、HGBV−A が軍医GBにおける肝炎の原因であった可能性を示唆した。 1.4 、1.7 、又は2.17 ELISAS （実施例15、16を参照されたい）によってCKS/ HGBV−A 又はCKS/HGBV−B 融合タンパク質の１つ以上に対する抗体の存在を示した４つの別のヒト血清を、ウェスタンブロット分析のために選択した。これらの血清の３つ（G1−41、G1−14、G1−31）は西アフリカ「危険」集団からのものであり、４番目(341C)は、非 A−E 肝炎（エジプト）標本（これらの集団の詳細な説明については実施例15を参照されたい）からのものだった。上記のCKS 融合タンパク質の中の幾つかからの全細胞ライゼートを別の10% SDS −ポリアクリルアミドゲルに施し、上記の通りニトロセルロースに転写した。これらのブロットの各々を上記の通りに予め封鎖し、E．coli ライゼート 10%と XL1−Blue/CKSライゼート 6 mg/mlとを含む封鎖緩衝液中に1:100 に希釈したヒト血清標本の１つと共に一晩温置した。ブロットをTBS 中で２回洗浄し、HRPO抱合ヤギ抗ヒトIgG と反応させ、上記の通りに発色させた。 CKS/HGBV−B タンパク質を上記血清の２つ（G1−41、G1−14）を使用して分析し、その反応性を表13に示した。タマリン血清に対して反応性を示した上記３つのタンパク質に加えて、更に別の２つのタンパク質(1.16、2.1)が２つのヒト血清のどちらか一方に対して反応性を示した。CKS/HGBV−A タンパク質を、上記４つのヒト血清全てと分析し、これらの反応性を表14に示す。GB血清に対して反応性を示した上記２つのタンパク質に加えて、更に別の３つのタンパク質(1.5、1. 18、1.19)がヒト血清の１つ以上に対して反応性を示した。これらのタンパク質の内の２つ（1.5、1 .18）を、実施例16で説明する通りのELISA検定に使用するために選択した。ウェスタンブロットによって及び／又は２つのHGBV−A タンパク質（1.18、2.17）と１つのHGBV−B タンパク質(1.7)とに対するELISA（実施例15、16）によって反応性を示すG1−31血清が、GB−C 配列（配列番号673 、残基2274−2640）がそれから単離された血清である（実施例17）ということが特に興味深い。実施例14．免疫反応性HGBV−A 及びHGBV−B タンパク質のエピトープマッピングＡ． HGBV−B タンパク質 1.7のエピトープマッピング免疫原性領域の位置を確認するために、HGBV−B 免疫原性タンパク質1.7 内の重複サブクローンを、実施例７で説明した通り T−1053血清からのRT−PCR によって実施した。各PCR プライマーは、制限酵素消化を容易にするために5′末端側に余分の６つの塩基を有しており、その後にEcoRI 部位（センスプライマー）又はHindIII部位（アンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグメントをEcoRI/HindIII−消化p JO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通り、CKS 融合タンパク質を発現させ、タマリン T−1048/T−1051血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。1.7−1 から 1.7−5 と称する５つの重複クローンを生成した。これらのクローンは、サイズがアミノ酸 104〜110 個分の範囲にある1.7 タンパク質の領域をコードしている。各クローンを生成するために使用したPCR プライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.7 配列内の位置と、タマリン T−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に示す。cDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見された免疫原性領域（配列番号678 ）にまたがる、更に別の２つの重複クローンを生成した。 1.7−6 と 1.7−7 と称されるこれらのクローンの各々は、アミノ酸75個のポリペプチドをコードする。使用したPCR プライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.7 配列内の位置と、タマリン T−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表15に示す。アミノ酸 507個分の長さの1.7 タンパク質の中に、２つの免疫原性領域を確認した。即ち、 N末端付近の免疫原性領域は残基 1−105 の範囲内であり、上記タンパク質の中央付近の免疫原性領域は残基 1 85−410 の範囲内であった。これらの領域の各々の中に単一のエピトープ又は複数のエピトープがあるかどうかは、更に検討を要する。Ｂ． HGBV−B タンパク質1.4 のエピトープマッピング免疫原性領域の位置を確認するために、HGBV−B 免疫原性タンパク質1.4 内の重複サブクローンを、 T−1053血清からのRT−PCR によって実施した。各PCR プライマーは、制限酵素消化を容易にするために5′末端側に余分の６つの塩基を有しており、その後にEcoRI 部位（センスプライマー）又はBamHI 部位（アンチセンスプライマー）のいずれかが続いた。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグメントを EcoRI/BamHI−消化pJO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通り、CKS 融合タンパク質を発現させ、タマリン T−1048/T−1051血清を使用したウェスタンブロットによって分析した。 1.4−1 から 1.4−4 と称する４つの重複クローンを生成した。これらのクローンは、サイズがアミノ酸 137 〜138 個の範囲にある1.4 タンパク質の領域をコードしている。各クローンを生成するために使用したPCRプライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.4 配列内の位置と、タマリン T−1048/T−1051血清に対する反応性とを、表 15に示す。cDNAライブラリー（実施例４）のイムノスクリーニングによって発見された免疫原性領域にまたがる、更に別の２つの重複クローンを生成した。 1.4 −5 と 1.4−6 とで称されるこれらのクローンの各々は、アミノ酸75個の長さのポリペプチドをコードする。使用したPCR プライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、1.4 配列内の位置と、タマリン T−1048/T− 1051血清に対する反応性とを、表15に示す。残基 129−393 を含むアミノ酸 265 個から構成される配列が、アミノ酸 522個分の長さの1.4 タンパク質の中の免疫原性領域であると確認した。ライブラリーのイムノスクリーニング（実施例４）によって上記配列内に２つの非隣接免疫原性クローンを確認したので、少なくとも２つのエピトープが上記領域内に存在する可能性がある。Ｃ． HGBV−A タンパク質1.22(配列番号390)及び2.17のエピトープマッピング HGBV−A タンパク質1.22（配列番号390 ）と2.17(配列番号613)は、いずれもウェスタンブロットによってGB血清との免疫反応を示した（実施例13）。これらの２つのタンパク質はアミノ酸40個分だけ重なっているので、観察された免疫反応は、１つのエピトープによるか、又は２つ以上のエピトープの存在の結果として生じた可能性がある。完全な1.22／2.17配列はアミノ酸 641個分の長さだった。免疫原性領域を発見するために、この領域内の重複サブクローンを T−1053からRT−PCR によって実施した。各PCR プライマーは、制限酵素消化を容易にするために5′末端側に余分の６つの塩基を有しており、その後に、EcoRI 部位（センスプライマー）、又は、1.22／2.17−2 から 1,22／2.17−6 に関してBamHI 部位（アンチセンスプラィマー）のいずれかが続いた。しかし、クローン1.22／2.17−1 は内部EcoRI 部位を有するので、BamHI 部位がセンスプライマーとして使用され、HindIII部位がアンチセンスプライマーとして使用された。加えて、各アンチセンスプライマーはコーディング領域の直後に終止コドンを含んでいた。消化後に、実施例13で説明したように、各フラグメントをEcoRI/BamHI −消化（又は、1.22／2.17−1 に関してはBamHI/HindII I−消化）pJO201の中にクローン化した。実施例13で説明した通り、CKS 融合タンパク質を発現させ、GB血清を使用してウェスタンブロットによって分析した。このクローンはアミノ酸 115−116 個分のサイズ範囲の1.22/2.17 の領域をコードした。各クローンを生成するために使用したPCR プライマーと、コードされたポリペプチドのサイズと、HGBV−A ポリペプチド配列内の位置と、GB血清に対する反応性とを、表15に示す。1.22/2.17 タンパク質の中央では、免疫原性領域はアミノ酸 220個分の長さの領域に狭まっていた。これは、1.22と2.17の間のアミノ酸40個分の長さの重複領域を含み、従って、２つのタンパク質に共通する免疫反応は、共有している１つのエピトープによるか、又は複数のエピトープに起因していた可能性がある。実施例１５．ＨＧＢＶ−Ｂの血清学的研究Ａ．組換えタンパク精製手順ＣＫＳ融合タンパクを発現する細菌細胞培養物を凍結し、−７０℃で保存した。三つの構築物それぞれからの細菌細胞を解凍し、リゾチームとＤＮアーゼを用いて粉砕処理し、次いでフッ化フェニルメタンスルホニルおよびその他のプロテアーゼ阻害剤の存在下、超音波処理して個々の組換え抗原と大腸菌タンパクの混合物を得た。三つの培養物それぞれについて、不溶性の組換え抗原を遠心分離により濃縮し、一連の洗浄工程に付して非組換え大腸菌タンパクの大部分を除去した。本プロトコールで使用した洗浄液の構成は、蒸留水、５％ＴｒｉｔｏｎＸ− １００、および５０ｍＭのＴｒｉｓ（８．５）であった。得られた沈殿物をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下、溶解した。タンパク濃度を測定したあと、２−メルカプトエタノールを加え、混合物をセファクリルＳ３００樹脂を用いたゲル濾過カラムクロマトグラフィーに付し、種々のタンパクをそのサイズによって分別、分離した。各分画を集め、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した。この電気泳動で分離されたタンパクは、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色し、分子量が約７５ｋＤ（ＣＫＳ−１．７／配列番号６１０）、８０ｋＤ（ＣＫＳ−１．４／配列番号６１１）、４２ｋＤ（ＣＫＳ−４．１／配列番号６１２）に相当するタンパクの有無を調べた。該当するタンパクを含有する分画をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再度調査した。精製抗原を含有するプール分画の免疫原性および構造の完全性を、実施例１３に記載の方法に従ってニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロット法によって決定した。適当な陽性コントロールがなかったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのＣＫＳ部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって同定した。ＣＫＳ−１．７タンパク（配列番号６１０）について、組換え抗原を検出すべく抗−ＣＫＳモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、約７５ｋＤのところにシングルバンドが認められた。この結果はＣＫＳ −１．７タンパク（配列番号６１０）の予想サイズに一致している。ＣＫＳ−１．４タンパク（配列番号６１１）については、抗−ＣＫＳモノクローナル抗体によって６０ｋＤと７０ｋＤの間に四重のバンドパターンが検出された。観察されたこれらのバンドは完全長タンパクについて予想された長さより短く、恐らく欠失されたものであろうと思われる。ＣＫＳ−４．１タンパク（配列番号５２）をウェスタンブロット法で調べると、抗−ＣＫＳモノクローナル抗体によって組換え抗体が約４２ｋＤにおいてシングルバンドとして検出された。この結果はＣＫＳ−４．１タンパク（配列番号６１２）について予想されたサイズと一致している。Ｂ．ポリスチレンビーズの被覆手順上記タンパクを透析し、以下に記載のように、これらのタンパクのポリスチレンビーズ上での抗原性を評価した。これとは別に、三種の精製ＨＧＢＶ組換えタンパク（ＣＫＳ−１．７／配列番号６１０、ＣＫＳ−１．４／配列番号６１１、およびＣＫＳ−４．１／配列番号６１２）のそれぞれを用いてＨＧＢＶに対する抗体を検出すべく、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。これらのタンパクで行ったＥＬＩＳＡをそれぞれ、１．７ＥＬＩＳＡ（ＣＫＳ−１．７（配列番号６１０）組換えタンパク使用）、１．４ＥＬＩＳＡ（ＣＫＳ−１．４（配列番号６１１）組換えタンパク使用）、および４．１ＥＬＩＳＡ（ＣＫＳ− ４．１（配列番号６１２）組換えタンパク使用）とする。最初の研究においては、１／４インチのポリスチレンビーズを種々の濃度の精製タンパクで被覆（約６０ビーズ／ロット）し、無接種のタマリンからの血清を陰性コントロール、接種したタマリンからの回復期血清を陽性コントロールとして用いたＥＬＩＳＡ試験（下記）により評価した。その他のコントールとして、種々の肝炎ウイルスに対して陰性と判定された個体から得たヒト血清のプールを含めた。追加の陽性コントロールは、ビーズの被覆効率をモニターするためのＣＫＳタンパクに対するモノクローナル抗体であった。陰性コントロールシグナルに対する陽性コントロールシグナルの比が最も高くなるようにビーズの被覆条件を選択し、ビーズ被覆プロセスのスケールアッセイに用いた。四つのＥＬＩＳＡ試験のそれぞれについて、１０００ビーズからなるロットを少なくとも２ロット作成し、血清学的研究に用いた。簡単に述べると、ポリスチレンビーズを精製タンパクで被覆するにあたり、洗浄したビーズをシンチレーションバイアルに加え、ビーズを組換え抗原含有緩衝液に浸漬した（約０．２３３ｍｌ／ビーズ）。各組換え抗原につき種々の異なる濃度を用意し、これらをｐＨ５．０〜９．５の範囲に調整した種々の異なる緩衝液とともに用いて評価した。次いでバイアルを４０℃のインキュベーター中の回転装置上に２時間載置し、その後液体を吸引し、ビーズをｐＨ６．８のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次いでビーズを０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて１時間、４０℃で処理し、ＰＢＳで３回洗浄した。次に、ビーズを５％ウシ血清アルブミンでオーバーコートし、攪拌しながら４０℃、１時間でインキュベートした。ＰＢＳでさらに洗浄を繰り返した後、ビーズを５％ショ糖で２０分間室温でオーバーコートし、液体は吸引除去した。最後にビーズを空気乾燥し、ＨＧＢＶに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ試験に使用した。Ｃ．ＨＧＢＶに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡ手順ＥＬＩＳＡは間接アッセイ法で行った。即ち、血清または血漿を検体希釈剤で希釈し、固相に被覆した抗原と反応させた。洗浄工程の後、固相と結合したタマリンまたはヒト抗体を検出するために、ビーズをヒト免疫グロブリンを指向する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）標識抗体と反応させた。切捨て値を越えるシグナルを生じた検体は反応性ありとした。ＥＬＩＳＡに関する付加的な詳細を以下に記す。ＥＬＩＳＡの様式は、抗原で被覆した固相を予め検体希釈剤（動物血清と非イオン活性剤を含有する緩衝溶液）で希釈したタマリン血清と接触させるものである。この検体希釈剤の調合に当たっては、特異的抗体が抗原で被覆された固相と結合する割合を高める一方、固相に対する非特異的な免疫グロブリンの結合に起因するバックグラウンドシグナルを減少させるように調合した。具体的には、１０μｌのタマリン血清を１５０μｌの検体希釈剤で希釈し、回転攪拌した。この予備希釈された検体１０μｌを反応トレイ中のウェルに添加した後、２００μｌの検体希釈剤と抗原被覆ポリスチレンビーズを加えた。この反応トレイをダイナミックインキュベーター（アボットラボラトリーズ製）中でインキュベートした。インキュベーターは、室温で常に攪拌し続けた。１時間のインキュベーションの後、液体を吸引除去し、ビーズを含有するウェルを蒸留水で３回洗浄した（各回５ｍｌ）。次にコンジュゲート希釈剤（動物血清と非イオン活性剤を含有する緩衝溶液）で希釈したＨＲＰＯ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを２００μｌ各ウェルに添加し、反応トレイを上記のようにして再び１時間インキュベートした。液体を吸引除去し、ビーズを含有するウェルを蒸留水で上記のようにして３回洗浄した。抗原及び結合免疫グロブリンを有するビーズをウェルから除去し、各ビーズを試験管に入れ、０．３％ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩の０．０２％Ｈ₂Ｏ₂含有０．１Ｍクエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）溶液３００ μｌと反応させた。室温で３０分保持後、１ＮのＨ₂ＳＯ₄を加えて反応を停止させた。４９２ｎｍでの吸収を分光光度計で読み取った。生じた色は、試験サンプル中に存在する抗体の量と正比例する関係にあった。ＨＧＢＶエピトープに対する抗体を含まないと思われる検体とＨＧＢＶエピトープに対する抗体を含むと思われる検体とを分別するために、検体の各グループに対して予備的な切捨て値を設定した。Ｄ．感染個体の血清におけるＨＧＢＶ由来ＲＮＡの検出タマリン血清またはヒト血清／血漿中における、ＨＧＢＶ−ＲＮＡ存在下の１．７ＥＬＩＳＡおよび１．４ＥＬＩＳＡの血清反応データを相互に関連付けるために、ＲＴ−ＰＣＲを既に参照して本明細書に包含した米国特許出願第０８／２８３，３１４号の実施例７と同様に実施した。実施にあたってはＨＧＢＶのクローン化された配列に由来するオリゴヌクレオチドを使用した。オリゴヌクレオチドのＨＧＢＶ−Ｂゲノムに由来するクローン４（実施例７参照）およびＨＧＢＶ−Ａゲノムに由来するクローン１６に対する最終濃度は０．５μＭであった。Ｅ．タマリンの血清像ＬＥＭＳＩＰに収容されたタマリンから週単位で採血して血清を得、肝臓の酵素レベルを検査した。検体血清の残量はさらなる調査のためにアボットラボラトリーズに送った。１．タマリンについてのＥＬＩＳＡの結果（初期感染性の研究）４匹のタマリン（Ｔ−１０５３、Ｔ−１０４８、Ｔ−１０５７、およびＴ−１０６１）にＧＢ血清（Ｈ２０５ＧＢ継代数１１と称する）を接種した。接種後（ＰＩ）の最初１週間の間、タマリンＴ−１０５３では肝酵素の上昇が認められた。このタマリンは、ＰＩ１２日で安楽死させた。タマリンＴ−１０４８、Ｔ−１０５７、およびＴ−１０６１は、接種後２週間までの間に肝酵素の上昇を示した。この上昇はＰＩ８〜９週まで続いた（図２〜４）後、接種前のレベルに戻った。ＰＩ１４週において、これら３匹のタマリンに対し、タマリンＴ−１０５３（この個体は感染力を有することが判明している−実施例２）から得た希釈していない血清０．１０ｍｌでの再接種を行った。この３匹のタマリン（タマリンＴ−１０４８、Ｔ−１０５７、およびＴ−１０６１）の回復期の血清がＣＫＳ−１．７（配列番号６１０）組換えタンパク、ＣＫＳ−１．４（配列番号６１１）組換えタンパク、ＣＫＳ−４．１（配列番号６１２）組換えタンパクに対する抗体を有するか否かについて、ＥＬＩＳＡ（図３、４、５）を個々に行って検討した。１．７（配列番号６１０）、１．４（配列番号６１１）、４．１（配列番号６１２）、あるいは１．５（配列番号６１４）の各組換えタンパクに対する特異抗体は、どの接種前の検体からも検出されなかった。図２６に示すように、Ｔ−１０４８の血清においては、１．７および１．４ＥＬＩＳＡの試験によってＰＩ５６〜８４日で特異抗体が検出されたが、ＰＩ９７および１３７日では検出されなかった。また、Ｔ−１０４８の血清は、４．ＩＥＬＩＳＡの試験では特異抗体を検出しなかった。図２７に示すように１．７タンパク（配列番号６１０）に対する抗体がＴ−１０５７の血清においてＰＩ５６および６３日に検出されたが、ＰＩ６３日よりも後は検出されなかった。４．１タンパク（配列番号６１２）に対する抗体がＰＩ２８〜６３日に検出されたが、ＰＩ８４〜９７では検出されなかった。上記のように、各タマリンに対し、ＰＩ９７日に接種剤Ｈ２０５で再接種を行った。４．１タンパク（配列番号６１２）に対する特異抗体がＰＩ１１２日およびＰＩ１２６日に検出されたが、これは接種に対する既往反応を示唆するものである。１．４組換えタンパク（配列番号６１１）については抗体反応は認められなかった。組換え１．４タンパク（配列番号６１１）に対する特異抗体がタマリンＴ−１０６１の血清においてＰＩ８４日からＰＩ１１２日の間で検出されたが、ＰＩ１２６日以降では検出されなかった。図２８に示すように、タマリンＴ−１０６１の血清は１．７タンパク（配列番号６１０）および４．１タンパク（配列番号６１２）に対する抗体に関してＰＩ３５０日で陰性であった。２．タマリンについてのＰＣＲの結果（初期感染性の研究）タマリンＴ−１０４８およびＴ−１０５７の血清を選択し、実施例７に記載のクローン４から得たプライマーと実施例７に記載のクローン１６から得たプライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲによってＨＧＢＶ−ＲＮＡを調べた。ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによっては接種前１０日および接種前１７日の血清中のプライマーのいずれにおいても（Ｔ−１０４８）（図２６）、あるいは接種前１７、３７、５９日の血清中のプライマーのいずれにおいても（Ｔ− １０５７）（図２７）検出されなかった。Ｔ−１０４８については、ＨＧＢＶ− ＲＮＡが、ＰＩ７〜１３７日の間に得た１７の異なった血清のうちの１５に関してクローン４からのプライマーを用いて検出された。ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、ＰＩ７〜９７日の期間に得た１０種血清のいずれかにあっても、クローン１６から得たプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによっては検出されなかった。Ｔ−１０５３の血漿を接種すると、接種後８日および４０日の期間に採取した血清５検体のうち４検体がクローン１６に対して陽性であった。Ｔ−１０５７については、ＲＴ −ＰＣＲの結果が陽性であったのは、図２７に示すようにＰＩ７日から２８日に採取した４検体で、クローン４からのプライマーを用いたものであった。各検体に対して行ったＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＰＩ２８日後においては弱いハイブリダイゼーションシグナルを示した２８７日目を除いては、クローン４に対して陰性であった。ＰＩ７日〜９７日に得たＴ−１０５７の６つの検体のいずれもが、クローン１６からのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲが陽性であった。しかしながら、Ｔ−１０５３の接種後８日〜８５日の間の血清は、クローン１６からのプライマーの使用で陽性であった。３．タマリンについてのＥＬＩＳＡの結果（力価検定／伝播性の研究）実施例２に記載のように、タマリンＴ−１０５３の血清を４匹のタマリンに接種した。これら４匹のタマリンのうち３匹を疾病の急性期（ＰＩ１２日から１４日の間）に安楽死させた。これら３匹のタマリンについて得たＲＴ−ＰＣＲの結果を以下に記す。生き残ったタマリン（Ｔ−１０５１）は最初ＰＩ１４日までに肝酵素値が上昇し、この上昇値は少なくともＰＩ８週まで持続した。タマリンＴ −１０５１の検体を１．７ＥＬＩＳＡおよび１．４ＥＬＩＳＡで試験した。結果を図２９に示す。特異抗体は接種後の最初の４１日間に採取された血清においても接種前の血清においても検出されなかった。しかしながら、１．４タンパク（配列番号６１１）および１．７タンパク（配列番号６１０）に対する抗体反応がＰＩ４９日とＰＩ１１３日の間に、また４．１タンパク（配列番号６１２）に対する抗体反応がＰＩ２８日とＰＩ１０５日の間に認められた。タマリンはＰＩ１１３日目に安楽死させた。タマリン（Ｔ−１０３４）は、実施例１および表４に記載のように最近罹患した肝炎感染から回復しつつある患者（最初のＧＢ源）の潜在的感染性血清０．１ｍｌで前に接種したものである。肝酵素値の上昇はＴ−１０３４において接種後の約１０週間認められなかった。この理由からタマリンＴ−１０３４は付加的研究において使用できるであろうと決定した。タマリンＴ−１０３４はＨＧＢＶ調製物で接種した。このＨＧＢＶ調製物は、タマリンＴ−１０５３の血清を予め接種した３匹のタマリン（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８、Ｔ−１０４９）の血清プールから実施例４？？の記載に従って調製したものである。これらの３匹のタマリン（Ｔ−１０５５、Ｔ−１０３８、Ｔ−１０４９）に、実施例２の記載に従ってタマリンＴ−１０５３から調製した血清を接種した。ＰＩ１１日までには３匹のタマリン全てで肝酵素の上昇が認められた。ＰＩ１２日目にタマリンＴ−１０５５を殺した。タマリンＴ−１０３８とタマリンＴ−１０４９はＰＩ１４日目に殺した。これらのタマリンの血清をプールして、清澄化し、濾過した。この濾過したものの１０^-6希釈物（健常タマリン血清中に調製）０．２５ｍｌをタマリンＴ−１０３４に接種した。Ｔ−１０３４に接種後２週間で肝酵素ＡＬＴ値の上昇が最初に認められ、続く７週間の間上昇値を保ち、最後に接種後１０週までに正常化した。図３０に示したように１．４（配列番号２２）組換えタンパクに対する特異抗体応答がＰＩ４９日に最初に検出され、ＰＩ５６日〜１１８日の間検出され続けた。４．１（配列番号５２）組換えタンパクに対する抗体応答はＰＩ４９日に最初に検出され、ＰＩ５６日〜７７日の間検出され続けた。但しＰＩ８４日から１１８日の間は検出されなかった。１．７（配列番号６１０）組換えタンパクに対する抗体応答はＰＩ５６日に最初に検出され、ＰＩ６３日〜１１８日の間検出され続けた。タマリンはＰＩ１１８日目に殺した。実施例２に記載のように、タマリンＴ−１０４４は、Ｈ２０５で接種した７日後にＴ−１０５７からの血清で接種した。この接種物はクローン４プライマーで検出された配列に対してのみ陽性であった。クローン１６プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲでＰＩ１４日から６３日の間、切捨て値を越えるゆるやかなＡＬＴ値の上昇が見られた。前述のように、１．７（配列番号６１０）組換えタンパクに対する特異抗体応答は、ＰＩ６３日〜８４日の間、検出された。４．１（配列番号６１２）組換えタンパクに対する抗体応答や、１．４（配列番号６１１）組換えタンパクに対する抗体応答は検出されなかった。タマリンは、ＰＩ１６１日目に殺した。４．タマリンについてのＰＣＲの結果（力価検定／伝播性の研究）接種に先立つ８週目の週にＴ−１０４９とＴ−１０５５から採取した血清および接種の日にＴ−１０３８から得た血清は、クローン１６（配列番号２６）およびクローン４（配列番号２１）に対し、ＲＴ−ＰＣＲ陰性であった。タマリンＴ −１０４９とタマリンＴ−１０５５はクローン４の配列（配列番号２１）に対して接種の１週間後、ＲＴ−ＰＣＲ陽性であった（クローン１６のＰＣＲは実施しなかった）。殺す日に先立つ、Ｔ−１０４９（ＰＩ１４日）並びにＴ−１０５５（ＰＩ１１日）は、クローン４（配列番号２１）およびクローン１６の配列（配列番号２６）のいずれに対しても、ＲＴ−ＰＣＲ陽性であった。タマリンＴ−１０３８は、殺す日（ＰＩ１４日）には、両プライマーのいずれでも陽性であった。図３０から判るように、Ｔ−１０３４は、接種後に採取した（ＰＩ７日）最初の血清サンプルについてクローン４プライマーで検出された配列に対しＲＴ−ＰＣＲ陽性で、ＰＩ７０日まで陽性でありつづけた。ＰＩ１１２日に採取したサンプルは陰性であった。これらのサンプル全てはクローン１６プライマーによるＲＴ−ＰＣＲで陰性であった。接種前の７０日目および１０１日目に採取したサンプルは両プライマーのいずれでも陰性であった。タマリンＴ−１０５１に関する図２９から判るように、ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、接種の８週間前に採取した血清サンプルにおいては、両プライマー（上記のクローン４とクローン１６からのもの）のいずれによっても検出されなかった。ＨＧＢＶ−ＲＮＡは、ＰＩ７日〜６９日の間に採取した６種の血清において、クローン４からのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで検出されたが、ＰＩ７７、８４、９１、あるいは１０５日に採取した血清では検出されなかった。接種後に採取した９つのサンプルにおいて、クローン１６からのプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲでＨＧＢＶ−ＲＮＡが検出された。図７に示すように、Ｔ−１０４４は、接種後（ＰＩ７日）に採取した最初の血清サンプルにおいては、クローン４プライマーで検出された配列に対し、ＲＴ−ＰＣＲ陽性であり、ＰＩ６３日まで陽性でありつづけた。ＰＩ７７日〜１１９日の間に採取したサンプルは陰性であった。これらのすべてのサンプルは、クローン１６プライマーに対してＲＴ−ＰＣＲ陰性であった。接種の４２日前に採取したサンプルは、両プライマーのいずれに対しても陰性であった。タマリンＴ−１０４７とＴ−１０５６に対し、ＰＩ１４日に採取したＴ−１０４４血清を接種した。これらの両動物からＰＩ７日〜６４日の間に採取した９種のサンプルは、クローン４プライマー（配列番号８と９）によるＲＴ−ＰＣＲは陽性であったが、クローン１６プライマーでは陰性であった。タマリンＴ−１０５８に、Ｔ−１０５３血清による誘発の２２日後に採取した無希釈のＴ−１０５７血清を接種した。この接種物は、クローン１６プライマーで検出された配列に対して陽性であったが、クローン４プライマーでのものには陰性であった。この動物から採取した血清サンプルを、ＧＢＶ−配列［クローン１６、クローン２、クローン１０、クローン１８］およびＧＢ−Ｂ配列［クローン４およびクローン５０］に由来するプライマーを用いて試験した。接種の９日前に採取したサンプルは、全てのプライマーでいずれも陰性であった。ＰＩ１４日に採取したサンプルはクローン１０と１８のプライマーのみで陽性であった。ＰＩ２１日に採取したサンプルはクローン１６、１０、および１８のプライマーのみで陽性であった。ＰＩ２８日に採取したサンプルはクローン１８のプライマーのみで陽性であった。ＰＩ３５日に採取したサンプルはクローン２、１６、および１８のプライマーのみで陽性であった。ＰＩ４１日に採取したサンプルはクローン１６および１８のプライマーのみで陽性であった。クローン４およびクローン５０からのプライマーでは、試験した全サンプルが陰性であった。５．タマリンによる血清学的研究のまとめ５匹のタマリンに対し、ＨＧＢＶの種々の調製物を接種すると、接種後２週間までに肝酵素が上昇を始めた。この上昇値は続く６〜８週間の間持続した。一以上のＨＧＢＶ組換え抗原、１．７、１．４、および４．１に対する特異抗体の応答が５匹全部のタマリンで観察された。いずれの場合も抗体はまず、ＰＩ６から１０週で検出され、さらに２週間から７週間の間持続した。一般に、抗体レベルはピークに達し、次いで引き続く数週間の内に急速に下降した。抗体は、肝酵素の値が正常値に戻った後しばらくして検出可能となることがわかる。このことは、抗体の産生がウイルス感染の消散において何らかの作用をしていることを示唆するものである。６．タマリンでのＰＣＲ研究のまとめゲノムウォーキング実験の結果は、クローン４（配列番号２１）とクローン１６（配列番号２６）が別々のＲＮＡ分子上にあることを示唆している。我々は従前、ウイルスゲノムには異なる２種類が存在し、その一つは一部にクローン４（配列番号２１）を含有しもう一つは一部にクローン１６（配列番号２６）を含有する、という仮説を提起した。ある動物がクローン４からのプライマーで陽性でクローン１６からのプライマーでは陰性であるという事実が観察されたことは、ウイルスゲノムに異なる２種類が存在することを支持するものである。しかしながら、クローン１６（配列番号２６）の配列が感染タマリンの内のあるものでは検出できなかったことは、クローン１６のプライマーセットとクローン４のプライマーセットとの感度の下限の違いを反映している、という議論もできるかもしれない。もしこの後者の可能性が正しいとするならば、両方のプライマーともに陽性のタマリンは、これら二つのプライマーセットに関し、感度の差を示すはずである。上記の結果は二つのウイルス種の存在によって説明されるのであって二つのプライマーセットの感度の差によるものではない、という立場を補強するため、タマリンＴ−１０５７とＴ−１０５３のｃＤＮＡの一連の希釈列を用いてＰＣＲを実施した。Ｔ−１０５７血清はクローン４プライマーの血清当量５ ×１０^-3μｌで陽性、５×１０^-4μｌで陰性であった。Ｔ−１０５７血清を２０ μｌという多量で用いてＲＴ−ＰＣＲをクローン１６プライマーで行ったが、結果は陰性であった。もしこの差が二つのプライマーセット（クローン４対クローン１６）の相対感度に帰するのであれば、他の検体もＰＣＲ試験を行ったとき４０００倍もの高い終点希釈を示すであろうと予測される。しかしながら、Ｔ−１０５３血清に由来するｃＤＮＡは、クローン４（配列番号２１）およびクローン１６（配列番号２６）の両クローンの配列に対し、いずれも血清当量２．５×１０^-4μｌで陽性で、２．５×１０^-5μｌで陰性であることが判った。よってこの結果はプライマーセットの感度の差では説明できず、ｃｏｎｔｉｇＢ−クローン４（配列番号２１）およびｃｏｎｔｉｇＡ−クローン１６（配列番号２６）配列が、Ｔ−１０５７においては少なくとも４０００倍異なる力価であるがＴ−１０５３では略等しい力価であるような別個のウイルスゲノムの上に存在する、という仮定と整合する。すなわちこのデータは、異なる検体において異なる相対終点力価を有する別個の二つのウイルスの存在と整合するものである。ＨＧＢＶ−Ｂによるウイルス血症のみで肝酵素レベルの上昇を引き起こすのに十分であって、ＧＢＶ−Ａのみのウイルス血症段階では肝酵素レベル上昇は認められない、という観察結果から、ＨＧＢＶ−Ｂが恐らくこれらのタマリンにおける肝炎の原因物質であったことがわかった。ＨＧＢＶ−Ｂ抗原に対する免疫応答は、精々接種後１５０日という短期間出現した。これに対する説明としては、これらのＥＬＩＳＡアッセイにおいて選定されたエピトープが、免疫応答が生成する主エピトープからのものではなかったということが考えられる。他の説明として、タマリンにおいては肝炎誘発は長期間の応答を必要とする重症ではない、ということも考えられる。これは、急性期に殺した、あるいは急性期の少し後で自然死した動物において、肝臓の炎症が軽症ないし非重症に止まった（結果は示さない）という組織学的証拠と整合する。この研究で記載した６匹の動物の内の５匹において、ＰＩ１１２日までにＨＧＢＶ−Ｂによるウイルス血症が散退した。一方、タマリンＴ−１０４８は１３６日間ウイルス血症から回復せず、死亡時（ＰＩ１３７日）にウイルス血症が認められた。ＧＢＶ−Ａ配列に陽性であった４匹の動物中で、３匹は、ＧＢＶ−Ａ配列が最初に出現してから７７日後までにウイルス血症の解消をみた。これに対し、タマリンＴ−１０６１は、犠牲に供されるまでの２４５日間、ウイルス血症が認められた。加えて、タマリンＴ−１０５１は、犠牲に供されるまで（ＰＩ１１３日）ウイルス血症であったが、この持続するウイルス血症が最初にＴ−１０５３血漿で接種したことによるものか、あるいはその６９日後にＴ−１０５３血漿で追加接種した結果によるものかは不明である。ＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂの両方に陽性であった６匹の動物のピークＡＬＴの平均値は、ＨＧＢＶ−Ｂのみに陽性の４匹の動物の平均値より高かった。加えてピーク値に達するのは、平均してＧＢＶ−Ｂのみに陽性の動物よりもＧＢＶ−ＡおよびＧＢＶ−Ｂの両方に陽性の動物における方が早かった。これらの結果は、肝炎の強さは両剤が相当量で存在することに関係するかもしれないことを示唆している。タマリンＴ−１０４７とＴ−１０５６へのＧＢＶ−Ｂの追加継代接種において肝酵素値の上昇がＧＢＶ−Ｂウイルス血症でほとんどなかったことが観察されたが、この結果は、タマリンにおいては両剤がＡＬＴレベルの主たる上昇をもたらすのに必須ではないかという仮説を支持する。ＨＧＢＶ −Ｂ単独を用いた継代接種に加え、Ｔ−１０５８に接種物ＨＧＢＶ−Ａを接種した時の初期の結果は、クローン４とクローン５０のプライマーで検出可能なＧＢ −Ｂ配列の不在によって示されるように、ＨＧＢＶ−Ａは検出可能なＨＧＢＶ− Ｂがなくとも独立に伝染しうることを示唆している。Ｆ．ヒト集団でのＨＧＢＶへの暴露を示すための実験手順種々のヒト集団から検体を得て、ＨＧＢＶ−Ｂに由来する組換えタンパクを用いた三種の別個のＥＬＩＳＡによってＨＧＢＶに対する抗体の有無を調べた。実施例１５Ｂのようにして１．７ＥＬＩＳＡにおいてはＣＫＳ−１．７組換えタンパク（配列番号６１０）で固相を被覆し、１．４ＥＬＩＳＡにおいてはＣＫＳ− １．４組換えタンパク（配列番号６１１）で固相を被覆し、また４．１ＥＬＩＳＡでは４．１組換えタンパク（配列番号６１２）で固相を被覆して用いた。実施例１５Ｅでも記したように、ＨＧＢＶで接種したタマリンでは、これらのタンパクに対して特異的ではあるが短い抗体応答が認められた。この検出可能な免疫応答の短期的な性質からすると、結果が陰性のヒト集団においてＨＧＢＶに対して従前暴露された可能性がないとはいえない。ヒトの検体で行った血清学的研究は二重の目的を有するものであった。第一の目的は、種々のヒト集団における本発明のＨＧＢＶ組換え抗原に対する抗体の血清学的存在を決定することであった。これらの研究は次の（１）〜（３）のテストを含む：（１）ＨＧＢＶへの暴露に関し「低リスク」と考えられる集団（例えば合衆国における健康なボランティアの血液ドナーの人々）；（２）ＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる集団（例えば経静脈麻薬使用者や血友病患者の検体は、非経口的に伝播した肝炎ウイルス（ＨＢＶおよびＨＣＶ）に対して血清反応がしばしば陽性となる；発展途上国に居住する個体からの検体は、経腸的に伝播したウイルス（ＨＡＶおよびＨＥＶ）に対して血清反応がしばしば陽性となる；（３）既知の肝炎ウイルス（ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶ、またはＨＥＶ）への暴露や、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）やエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）などの肝炎関連のその他のウイルスへの暴露には関連のない、「非Ａ−Ｅ−肝炎」を有する個体から得た検体グループ。非Ａ−Ｅ−肝炎という一般的呼称に属するグループのメンバーの一部はＨＥＶに対する抗体に関してはテストされていない場合がある。よって、１．７、１．４、あるいは４．１ＥＬＩＳＡで反応性を有した非Ａ−Ｅ群のすべての検体について、ＨＥＶ−ＥＬＩＳＡアッセイ（本出願人から入手可能）を行った。抗ＨＥＶは、三つの地域（パキスタン、アメリカ合衆国、およびニュージーランド）からのサンプルで以下に記載するように陽性の結果となった。ＨＧＢＶに対する暴露に関し「低リスク」と考えられる集団よりも、ＨＧＢＶに対する暴露の「リスクあり」の集団や非Ａ−Ｅ肝炎を有する個体における方が、より高い血清学的存在率がみられることが予想される。本血清学的研究の第二の目的は、一以上のＨＧＢＶエピトープに対する抗体について陽性であることが判った検体ＲＴ−ＰＣＲで調べ、ウイルスが血清中に存在するかどうかを決定することであった。ＨＢＶおよびＨＣＶは数カ月あるいは数年も持続するウイルス血症の疾病状態を、また、一般にＨＡＶやＨＥＶは一般に数週間持続する短期間のウイルス血症をもたらすことはよく知られている。急性で消退しつつある肝炎である、ＨＢＶやＨＣＶ感染の場合には、ウイルス血症の段階は数週間という短期間の持続の場合もあろう。このようにＲＴ−ＰＣＲは、感染個体にウイルスが存在するという証拠を得るために用いることができる。しかしながら、ウイルス血症の状態は短期間でありうるので、ある剤に感染した個体でもその剤に関してＲＴ−ＰＣＲ陰性となることもある。Ｇ．切捨て値の決定間接方式を利用するその他のＥＬＩＳＡアッセイにおける従前の経験から、予備的な切捨て値を、研究対象のタンパクに対する抗体に関して恐らく陰性であると思われる集団から得た吸収に基づいて算出すればよいことが判明している。予備的切捨て値は、集団の平均吸収値と、集団の平均値からの１０の標準偏差との合計として計算した。切捨て値は一検査群の検査が行われるたびに用いられるものなので、切捨てを表現するより簡便な方法は、各アッセイのたびに５個重複して走らせる陰性コントロール（正常ヒト血漿プール−ＮＦＰ）から決める方法であった。１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡについては、陰性コントロールは、典型的には０．０３０と０．０６０の間の吸収を有していた。以下に記載のように、切捨て値は約０．３００から０．６００であると吸収であると計算されたが、これは陰性コントロールの値の１０倍の吸収シグナルに匹敵するものであった。よって、検体が反応性であると考えられるのは、陰性対照（Ｎ）吸収値に対するサンプル（Ｓ）の吸収値（＝Ｓ／Ｎ比）が１０．０以上であることを要する。Ｈ．追補的試験最初の試験で反応性であるとされた検体は、原則として２個重複で再試験した。もし再試験時の吸収の一あるいは二者も切捨て値より高ければ、その検体は繰り返し反応性であると考えられた。繰り返し反応性であると考えられた検体については、さらにＥＬＩＳＡのデータを補充すべく追補的アッセイを行った。十分量がある場合、繰り返し反応性検体はウェスタンブロットによって、抗体応答がＣＫＳ１．７（配列番号６１０）ＣＫＳ１．４（配列番号６１１）またはＣＫＳ４．１（配列番号６１２）抗原を指向するものであって、問題とする主タンパクとともに固相に共に被覆されていたかもしれない大腸菌タンパクを指向するものではないことを確認した。ウェスタンブロットが陽性と考えられるためには、可視的なバンドが１．７タンパク（配列番号６１０）に対して８０ｋＤ、１．４タンパク（配列番号６１１）に対して６０から７０ｋＤ、または４．１タンパク（配列番号６１２）に対して４２ｋＤにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロットはＥＬＩＳＡの感度に匹敵ないしそれを凌駕するほど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにＥＬＩＳＡのデータを捨てることはしなかった。しかしながら、陽性の結果が出れば、それはＥＬＩＳＡによって検出された反応性を補強するものである。繰り返し反応性のある検体で十分量あるものの対しては、クローン４プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ（実施例１５Ｄに記載に従って実施）を実施し、血清中のＨＧＢＶ特異性ヌクレオチド配列を同定してもよい。結果が陽性であれば、その検体はウイルス血症であることがわかり、究極的にはヒト肝炎におけるＨＧＢＶの役割を確立する一助になるであろう。しかしながら、結果が陰性であってもそれはＥＬＩＳＡの結果が誤りだったと解釈してはならない。タマリンによる研究において実施例１５Ｅに記載したように、ＲＴ−ＰＣＲの結果は感染後の最初の数週間は陽性で、その後本発明のＥＬＩＳＡで抗体がまさに検出されはじめた頃には陰性になっていた。この後の段階における検体はＲＴ−ＰＣＲ反応陰性であっても一方または両方のＥＬＩＳＡにおいて陽性であるかもしれない。Ｉ．低リスク検体における血清反応データウィスコンシン州南東部の健康なボランティア血液供与者から１００血清と１００血漿から成る集団を得て、上記のＥＬＩＳＡによって１．７（配列番号６１０）、１．４（配列番号６１１）、４．１（配列番号６１２）の各組換えタンパクに対する抗体を検査した。血清および血漿について、１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡで得られた吸収の値を別々にプロットした（図９−１４）。１．７ＥＬＩＳＡでは、血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ０．０７２［標準偏差（ＳＤ）は０．０６１］および０．０８３（ＳＤ＝０．０５５）であった。よって１．７ＥＬＩＳＡでは血清と血漿に対する仮の切捨て値はそれぞれ０．４９９および０．４６８であった。上述のように陰性コントロールの吸収値をもとにして切捨て値を表すこともできる。Ｓ／Ｎ比が１０．０を越える検体を反応性ありとした。この切捨て値を用いると、１．７（配列番号６１０）に対する抗体に対して試験した２００検体の内の０検体が反応性であった。１．４ＥＬＩＳＡでは幾つかの検体（血清集団から３種、血漿集団から６種）が０．３００を越える吸収値を示した（Ｓ／Ｎ比が６から１２、予想される切捨て値に近いかそれ以上）。再試験すると、これらの検体の９種全部が１０．０より低いＳ／Ｎ比を示した。血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ０．０７２（ＳＤ＝０．０５２）および０．１０８（ＳＤ＝０．０６２）であった。１．４ＥＬＩＳＡにおける切捨て値は、上記の式によって計算した。即ち、血清と血漿それぞれの集団に対する切捨て値はそれぞれ０．４３６および０．５４２であった。血清集団の中の一検体は、最初の試験で反応性とされたが、二重にして再試験したときには陰性であった。血漿集団の中の２検体も最初は試験で反応性とされたが、再試験では陰性であった。血漿１００検体と血清１００検体からなる第二の正常検体２００の集団を試験した。先に提案した切捨てに基づき試験すると、血漿２検体および血清２検体が繰り返し反応性であった。４．１ＥＬＩＳＡでは血清検体と血漿検体に対する平均吸収値はそれぞれ０．０７０［標準偏差（ＳＤ）は０．０３７］および０．０６３（ＳＤ＝０．０４０）であった。よって４．１ＥＬＩＳＡにおいて、血清および血漿に対する仮の切捨て値はそれぞれ０．３２９および０．５１１であった。上述のように陰性コントロールの吸収値に基づいて切捨て値を決めることもできる：Ｓ／Ｎ比が１０．０を越える検体を反応性ありとした。この切捨て値を用いると、４．１（配列番号６１２）に対する抗体について試験した１００血漿検体の内の０検体、および１００血清検体の内の０検体が最初の試験で反応性を有しているとされた。インターステート血液銀行（オハイオ州）から追加の７６０の血漿供与者の提供を受け、１．７ＥＬＩＳＡおよび１．４ＥＬＩＳＡの試験を行った。合計９検体が繰り返し反応性であった。両方のＥＬＩＳＡで同時に反応性を有する検体はなく、全９検体が１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。アメリカ合衆国に居住している血漿或いは血液提供者からの合計９６０検体について、１．７タンパクおよび１．４タンパクに対する抗体の有無を調査した。合計１３検体が１．４ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であった。１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を有する検体はなかった。以上まとめると、これらのデータは次のことを示している。すなわち、ＨＧＢＶ−Ｂからの組換え抗原を用いる一種以上のＥＬＩＳＡアッセイにおいて、これまでのＥＬＩＳＡ結果によると、アメリカ合衆国の血液提供者から採取された９６０検体のうち１３検体が抗体反応性であった。この結果からＨＧＢＶはアメリカ合衆国に固有のいわゆる風土病である可能性があると思われる。これらのデータを表１６に示す。Ｊ．肝炎に関し「リスクあり」と考えられる検体この研究でのデータを表１６に示す。（ｉ）西アフリカからの検体西アフリカから入手した１３００検体の内、合計１８１検体が一以上のＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。３種のＥＬＩＳＡ全部で繰り返し反応性の検体が１検体あった。合計４３検体が１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を有し、９１検体が１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を有し、５１検体が４．１ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を有した。１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反一応性であった６検体のうちの一つは、１．７タンパク（配列番号６１０）についてのウェスタンブロットで反応性であった。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった９検体のうちの９検体（１００％）は、１．４タンパク（配列番号６１１）に対する抗体についてのウェスタンブロットで陽性であった。一検体が両方のタンパクについてのウェスタンブロットで陽性であった。４．１ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった１２検体のうちの１２検体（１００％）は、４．１タンパク（配列番号６１２）に関するウェスタンブロットで陽性であった。繰り返し反応性であった３つの検体（１．４ＥＬＩＳＡで陽性であった一検体と、両ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットで陽性であった一検体を含む）について、クローン４からのプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって上記のようにしてＨＧＢＶ−ＲＮＡの有無を調べた。得られたデータはＨＧＢＶが西アフリカの風土病である可能性を示唆するものであった。（ii）経静脈麻薬使用者（ＩＶＤＵ）からの検体セット１：１１２検体のうち３検体が１．４ＥＬＩＳＡで陽性であった。５検体が４．１ＥＬＩＳＡで、３検体が１．７ＥＬＩＳＡで反応性であった。２サンプルが、２以上のＥＬＩＳＡで陽性であった。セット２：経静脈麻薬使用者の集団から計９９検体を採取した。この試験はイリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院（Hines Veteran's Administrati on Hospital ）で実施されたものの一部である。検体のいずれも１．７あるいは４．１ＥＬＩＳＡで反応性を有しなかった。一検体は１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性が認められた。この繰り返し反応性の検体について、クローン４からのプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって上記のようにしてＨＧＢＶ−ＲＮＡの有無を調べた。この検体はＲＴ−ＰＣＲ陰性であった。Ｋ．非Ａ−Ｅ肝炎の個体から採取した検体得られたデータを表１６にまとめて示す。非Ａ−Ｅ肝炎と診断された個体群から種々の検体集団を得て、実施例１５Ｃに従って１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡを実施した。使用した検体は次のものを含む：日本のクリニックからの１８０検体；ニュージーランドのクリニックからの５６検体；ギリシャのクリニックからの７３検体；エジプトのクリニックからの１３２検体；アメリカ合衆国テキサス州のクリニックからの６４検体（セットＴ）；ミネソタの研究センターからの７２検体（セットＭ）；米国からの６２検体（セット＃１）；パキスタンのクリニックからの８２検体；イタリーのクリニックからの１０検体（幾つかの検体は血清量の不足のため実行可能なＥＬＩＳＡアッセイすべては実施しなかった）。（ｉ）日本の検体これらの１８０検体は８５人の異なる患者からのものであった。全１８０検体のうち二つが１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。この二つの反応性を示す検体は２人の異なる患者からのものであった。上記２検体について、クローン４からのプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって前記のように検査した。陽性の検体はなかった。１．４ＥＬＩＳＡで陽性の検体はなかった。４．１ＥＬＩＳＡについては、８９検体中７検体が４．１アッセイで繰り返し反応性を示した（注：これら８９検体は２９人の異なる患者から得たものであった）。反応性の検体のうち５検体は一人の患者からのものであった。残る２検体は別の一人の患者からのものであった。（ii）ニュージーランドの検体５６検体のうち計４検体が１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡの一以上において繰り返し反応性であった。これらの内、二以上のＥＬＩＳＡで反応性を示した検体はなかった。１検体が１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であり、２検体が１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。１検体が４．１ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性であった。二つの繰り返し反応性の検体についてＰＣＲを実施した。その結果、両検体とも陰性であった。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した１検体はＨＥＶに対する抗体とも反応性を有した。（iii）ギリシャの検体７３検体中の計５検体が１．７および／または１．４ＥＬＩＳＡで抗体反応性であった。これら７３検体は計１１人の患者から採取したものであった。繰り返し反応性の５検体中２検体は、両ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示したが、これらは別々の日に同一の患者から採取したものであった。二つの繰り返し反応性を示した検体をＲＴ−ＰＣＲで調べたところ陰性であった。これらの検体のいずれも４．１ＥＬＩＳＡでは抗体反応性を有しなかった。（iv）エジプトの検体１３２検体中の計１１検体が１．７、１．４、あるいは４．１ＥＬＩＳＡで反応性を示した。８検体が１．７および１．４ＥＬＩＳＡの両方で陽性であった。９検体が１．７ＥＬＩＳＡで抗体反応性であり、９検体が１．４ＥＬＩＳＡで反応性であった。１検体は４．１ＥＬＩＳＡでは繰り返し反応性を示したが、１．７および１．４ＥＬＩＳＡでは陰性であった。１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した１検体は、ウェスタンブロットで調べると１．７組換えタンパク（配列番号６１０）に対する抗体に関し陰性であった。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した９検体中６検体は、ウェスタンブロットでは１．４組換えタンパク（配列番号６１１）に対する抗体に関し陽性であった。繰り返し反応性であったもののうち７検体についてＲＴ−ＰＣＲで試験した。どの検体も反応性を示さなかった。これら全１３２検体は２５人の異なる個体から別々の日に採取したものであった。繰り返し反応性を示した１１検体は、異なる５個体からのものであった。これらの個体中の一個体（患者＃１０１）においては、免疫応答は明白にタマリン（図３１）で観察されたそれと相似であった。図３１においてＡＬＴレベルが医者が症状を認めた時には上昇していたことに注意されたい。その後の検体ではＡＬＴレベルは低下し、１．４および１．７ＥＬＩＳＡによって抗体が検出された。抗体応答は、タマリンで観察された血清反応状況と同じく、その後数週間にわたって低下した。追加の３人の患者（２５７、２６０、および３４０）は患者＃１０１と同様の血清パターンを示した（図３２−３４参照）。これらのデータはＨＧＢＶがこれらの肝炎の症例において原因剤であるかもしれないという仮説を支持するものである。上の４人の患者からの７検体中、いずれの検体もＲＴ−ＰＣＲではＨＧＢＶ− ＲＮＡ陽性ではなかった。この結果には幾つかの理由が考えられる。第一にウイルス血症の段階は非常に短期間であるかもしれず、その場合ウイルスは最初の採血の日までに血清から除去されてしまっていた可能性がある。第二にこれらの検体が船でエジプトから輸送されてきたことから、恐らく保存・輸送の過程で凍結、解凍を経るかその他の変化を受けたことが考えられ、その結果ＨＧＢＶ−ＲＮＡの検出能力が低下した可能性がある。（ｖ）アメリカ合衆国の検体（セットＴ）アメリカ合衆国の６４検体（セットＴ）で、１．７、１．４、４．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性を有するものはなかった。（vi）アメリカ合衆国の検体（セットＭ）アメリカ合衆国の７２検体（セットＭ）のうち、計４検体が一以上のＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。２検体は１．７および４．１ＥＬＩＳＡで反応性を示した。１．７ＥＬＩＳＡのみで反応性のものが１検体、４．１ＥＬＩＳＡのみで反応性のものが１検体存在した。（vii）アメリカ合衆国の検体（セット１）非Ａ−Ｅ肝炎のアメリカ合衆国検体（セット１）５１検体中、３検体が一つまたは両ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。１検体は両ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。１検体は１．７ＥＬＩＳＡで反応性を示し、３検体は１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。両ＥＬＩＳＡで陽性の検体は、１．４組換えタンパク（配列番号２２）に対するウェスタンブロットで陽性であったが、１．７組換えタンパク（配列番号２３）では陰性であった。追加の１検体は１．４ＥＬＩＳＡで陽性、１．４組換えタンパク（配列番号６１１）に対してウェスタンブロット陽性であった。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した１検体はＨＥＶに対する抗体に反応性であった。（viii）パキスタンの検体８２検体中の計４検体が、１．４および／または１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し抗体反応性であった。両ＥＬＩＳＡで反応性を示した検体はなかった。２検体が１．７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示し、２検体が１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。１．４ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性の２検体は、ＨＥＶに対する抗体にも反応性であった。８２検体いずれも４．１ＥＬＩＳＡでは陽性でなかった。（ix）イタリーの検体１０検体いずれも、１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示さなかった。Ｌ．血清反応の結果の統計的意義これらのデータは、ＨＧＢＶタンパクに対する特異抗体（即ち１．７、１．４、または４．１ＥＬＩＳＡで抗体に繰り返し反応性を示す検体）を、調査した集団の三つのカテゴリー全部で検出できることを示している。種々の検体カテゴリー（「低リスク」、「リスクあり」、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）から得た血清学上の結果を合わせ、χ二乗検定で統計的意義について分析した。データは、ＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる個体、あるいは分類未知の肝炎と診断された個体を含むボランティア血液提供者において、抗−ＨＧＢＶの血清学的有病率を比較すると有意の差異が存在することを示した。西アフリカ検体においては血清学的有病率は１３．９％であって、これはベースライン上のグループ（表１７）と比べ、ｐ値０．０００の下で有意に高かった。同様にＩＶＤＵにおいても、結果をボランティア提供者のデータと比較した時、統計的に有意の差が存在した（ｐ値＝０．０００）。日本、ニュージーランド、アメリカ合衆国、エジプト、およびパキスタンを含む国々については、アメリカ合衆国のボランティア血液提供者に比べ、非Ａ−Ｅ肝炎患者において抗体の存在に有意の差が存在した。Ｈ．まとめこれらのデータは、本明細書に記載の種々のＥＬＩＳＡが、日本、ニュージーランド、アメリカ合衆国、エジプト、およびパキスタンを含む様々な地域におけるヒトの肝炎診断に有用である可能性を示唆している。これらのデータは、試験した検体の全カテゴリーにおいてＨＧＢＶに対する抗体の血清学的存在を過小に評価しているように思われる。さらなるＨＧＢＶエピトープが発見され、評価されるにつれ、現在は診断を下すことができない患者において肝炎を診断するにあたり、ＨＧＢＶゲノム（群）に基づく試験の有用性がより重要なものとなることが期待される。注：これらの最初の研究ではＲＴ−ＰＣＲの結果は陰性であったが、その後のデータから血清反応陽性の個体の血清でフラヴィ様ウイルス配列が見いだされた。上に記載したように、２種以上のＨＧＢＶ株が存在する。これらは本発明の範囲内のものと考えられ、これを「肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）」と呼ぶ。実施例１６．ＨＧＢＶ−Ａの血清学的研究Ａ．組換えタンパク精製手順ＣＫＳ融合タンパクを発現する細菌細胞を凍結し、−７０℃で保存した。各ＧＢＶ−Ａ構築物からの細菌細胞を解凍し、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ構築物について記載したようにして粉砕処理した。さらに、組換えタンパクを、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクについて記載したようにして精製した。この精製手順で収集した分画を電気泳動で分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色して、分子量が約６０ｋＤ（ＣＫＳ−１．５／配列番号６１４）、６５ｋＤ（ＣＫＳ−２．１７／配列番号６１３）、５５ｋＤ（ＣＫＳ−１．１８／配列番号３９０）、および６６ｋＤ（ＣＫＳ−１．２２／配列番号３９０）に相当するタンパクの有無を調べた。該当するタンパクを含有する分画をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再度調査した。精製抗原を含有するプール分画の免疫原性および構造の完全性を、実施例１３に記載の方法に従ってニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロット法によって決定した。適当な陽性コントロールがなかったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのＣＫＳ部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって同定した。ＣＫＳ−１．５タンパク（配列番号６１４）について、組換え抗原を検出すべく抗−ＣＫＳモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、約６０ｋＤのところにシングルバンドが認められた。この結果はＣＫＳ−１．５タンパク（配列番号６１４）の予想サイズに対応している。同様にＣＫＳ−２．１７タンパク（配列番号６１３）、ＣＫＳ−１．１８タンパク（配列番号３９０）およびＣＫＳ−１．２２タンパク（配列番号３９０）も、イムノブロット法で調べた結果予想されたサイズを有していた。Ｂ．ポリスチレンビーズの被覆手順上記タンパクを透析し、実施例１５の記載に従って、これらのタンパクのポリスチレンビーズ上での抗原性を評価した。Ｃ．ＨＧＢＶに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの手順各種ＥＬＩＳＡは実施例１５の記載に従って実施した。Ｄ．感染個体の血清におけるＨＧＢＶ−ＲＮＡの検出各ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した検体について、実施例１５のセクションＤの記載に従ってＨＧＢＶ−ＲＮＡの有無を調べた。Ｅ．タマリンの血清像すべてＨＧＢＶ−Ａゲノム由来のＣＫＳ１．５タンパク、ＣＫＳ２．１７タンパク、ＣＫＳ１．１８タンパク、あるいはＣＫＳ１．２２タンパクを用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて、タマリンからの血清はいずれも特異免疫反応を示さなかった。しかしながら、先の実施例に記載のように、感染タマリンの内のあるものではＨＧＢＶ−ＡのＲＮＡが検出された（実施例１５中タマリンの血清像についてのまとめ参照）。Ｆ．ヒト集団についての血清学的研究のための実験手順実施例１５では、ＨＧＢＶ−Ｂに由来する組換え抗原を用いたＥＬＩＳＡによって種々のヒトの集団におけるＨＧＢＶ−Ｂに対する抗体の存在を評価した。その後、同じ検体の多くについて、ＣＫＳ１．５組換えタンパク（配列番号６１４）を用いた１．５ＥＬＩＳＡ、ＣＫＳ２．１７組換えタンパク（配列番号６１３）を用いた２．１７ＥＬＩＳＡ、ＣＫＳ１．１８組換えタンパク（配列番号３９０）を用いた１．１８ＥＬＩＳＡ、およびＣＫＳ１．２２組換えタンパク（配列番号３９０）をそれぞれ用いたＥＬＩＳＡによって、ＨＧＢＶ−Ａに対する抗体の有無を調べた。各タンパクは実施例１５のように固相に被覆して用いた。実施例１５に記載のように、ＨＧＢＶを接種された回復期のタマリン５匹全部が、ＨＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクに対して特異的抗体反応を示したが、短期間しか持続しなかった（１．７、１．４、および４．１ＥＬＩＳＡで検出）。１．５、２．１７、１．１８、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡにおいては、どのタマリンも検出可能な抗体反応を示さなかったが、西アフリカからのヒト検体の幾つかは、ウェスタンブロットでこれらの組換えタンパクの一以上のものについて特異的抗体反応を示し、ある外科医（ＧＢ剤の供給者）の提供になる肝炎発症２２日目に採取した検体の一つは、ウェスタンブロットで試験したとき２．１７組換えタンパクに対する特異的抗体反応を示した（実施例３参照）。本実施例では、様々なヒトの集団において抗体を検出するに際しての、１．５、２．１７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳＡの有用性を評価した。Ｇ．切捨て値の決定１．５、２．１７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳＡにおける切捨て値を、実施例１５に記載のようにして決定した。Ｈ．追補的試験実施例１５に記載したように、最初反応性を示した検体については、原則として再試験を行った。ある検体が２回目も反応性を示した場合、ＥＬＩＳＡによるデータをさらに補充すべく追加の試験（例えばウェスタンブロット）を実施した。ウェスタンブロットの結果が陽性と考えられるためには、観察可能ななバンドが１．５タンパク（配列番号６１４）に対して６０ｋＤ、２．１７タンパク（配列番号６１３）に対して６５ｋＤ、１．１８タンパク（配列番号３９０）に対して５５ｋＤ、および１．２２タンパク（配列番号３９０）に対して６６ｋＤにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロットはＥＬＩＳＡの感度に匹敵ないしはそれを凌駕するほど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにＥＬＩＳＡのデータを捨てることはしなかった。しかしながら、陽性の結果が出れば、それはＥＬＩＳＡによって検出された反応性を補強するものである。実施例１５で記載したように、繰り返し反応性のある検体で十分量あるものの対しては、プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ（実施例１５の記載に従って実施）を実施し、血清中のＨＧＢＶ特異性ヌクレオチド配列を同定してもよい。Ｉ．低リスク検体における血清学的データ計２５２本の血漿検体をオハイオ州のインターステート血液銀行から入手し、１．５組換えタンパク（配列番号６１４）を用いた１．５ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査した。この集団での平均吸収値は０．０３６（ＳＤ＝０．０２２）であった。切捨て値は０．１６８と計算された。これはＳ／Ｎ比＝１０．０に対応する。７６０本の血漿検体（切捨て値決定のために用いた２５２検体を含む）について、１．５ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査した。繰り返し反応性を示す検体はなかった。加えて、１００本の血漿検体をウィスコンシン州南東部から入手し、１．５ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査した。繰り返し反応性を示す検体はなかった。このように、１．５タンパクに対する抗体の存在を示す証拠はアメリカ合衆国の血液提供者においては見いだされなかった。２００本の検体をウィスコンシンの血液提供者から入手し、２．１７組換えタンパク（配列番号６０）を用いる２．１７ＥＬＩＳＡによって抗体の有無を検査した。この集団での平均吸収値は０．０５８（ＳＤ＝０．０２５）であった。切捨て値は０．２０８と計算された。これはＳ／Ｎ比＝１０．０にほぼ対応する。検体の一つは繰り返し反応性を示した。このように、アメリカ合衆国の血液提供者（Ｎ＝２００）における血清学的有病率(seroprevalence)は比較的低かった。上のパラグラフに記載のものと同じ２００検体について、１．１８および１．２２ＥＬＩＳＡで抗体の有無を検査した。どの検体も繰り返し反応性を示さなかった。このように、ボランティアの血液提供者からの検体については、１．５、２．１７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳＡから判断するかぎり、ＨＧＢＶ −Ａタンパクに関して抗体陽性であるという証拠はなかった。Ｊ．肝炎に関し「リスクあり」と考えられる検体この研究でのデータを表１８にまとめて示す。（ｉ）西アフリカからの検体１３００検体の内、５８検体が１．５ＥＬＩＳＡで反応性を示した。繰り返し反応性であった１８検体のうちの１２検体は、１．５タンパク（配列番号６１４）に対する抗体についてのウェスタンブロットで陽性であった。８１７検体中４３検体が２．１７ＥＬＩＳＡで反応性であった。これらの繰り返し反応性の検体については、２．１７タンパク（配列番号６１３）に対する抗体に関するウェスタンブロットは行わなかった。８１７検体中６検体が１．２２ＥＬＩＳＡで反応性であった。３５３検体中９検体が１．１８ＥＬＩＳＡで反応性であった。２．１７ＥＬＩＳＡで反応性の２１検体をウェスタンブロットで試験したところ、１３検体が反応性であった。１．１８ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性の８検体がウェスタンブロットで陽性であった。これらのデータはＨＧＢＶが西アフリカの風土病である可能性を示唆するものである。（ii）経静脈麻薬使用者からの検体経静脈麻薬使用者の集団から全１１２検体を採取した。この試験はイリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院で実施されたものの一部である。１検体は２．１７ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性が認められた。追加の１検体は１．１８ＥＬＩＳＡで反応性を示した。これらの検体のいずれも１．５あるいは１．２２ＥＬＩＳＡでは陽性ではなかった。Ｋ．非Ａ−Ｅ肝炎の個体から採取した検体得られたデータを表１８にまとめて示す。非Ａ−Ｅ肝炎の個体群から種々の検体集団（実施例１５Ｋに記載）を得て、１．５、２．１７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳＡ（実施例１５Ｃに記載）を実施した。幾つかの検体は血清量の不足のため全部のＥＬＩＳＡアッセイは実施しなかった。（ｉ）日本の検体８９検体中の計４検体は、１．５ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した。そのうちの３検体は１個人から、１検体は別の個人からのものであった。１．５ＥＬＩＳＡ、１．１８ＥＬＩＳＡ、および１．２２ＥＬＩＳＡで陰性であった１検体は、２．１７ＥＬＩＳＡでは反応性を示した。１．１８ＥＬＩＳＡで反応性を示した検体はなかった。これらの検体は、１．２２ＥＬＩＳＡでは検査しなかった。（ii）ニュージーランドの検体５６検体のうち１．５ＥＬＩＳＡで反応性を示したものはなかった。これらの検体は２．１７ＥＬＩＳＡ、１．１８ＥＬＩＳＡ、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡでは検査しなかった。（iii）ギリシャの検体６７検体（１０人の患者からのもの）のいずれもが１．５、２．１７、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡでは反応性を示さなかった。（iv）エジプトの検体１３２検体中に１．５ＥＬＩＳＡに反応性の検体はなかった。検査可能であった１３２検体中、計７検体が２．１７ＥＬＩＳＡで反応性を有した。これらの検体は急性の非Ａ−Ｅ肝炎患者２５名からのものであった。２５名の患者のうち３名が２．１７ＥＬＩＳＡで肝炎の発症のあと１日以上たったとき血清反応陽性であった。１．１８、あるいは１．２２ＥＬＩＳＡで反応性の検体は存在しなかった。（ｖ）アメリカ合衆国の検体（セットＭ）７２検体のいずれも１．５ＥＬＩＳＡで反応性を示さなかった。７２検体中３検体は１．１８ＥＬＩＳＡで反応性を示した。２検体が２．１７ＥＬＩＳＡで、また４検体が１．２２ＥＬＩＳＡで反応性を示した。２サンプルは一以上のＥＬＩＳＡで反応性を示した。（vi）アメリカ合衆国の検体（セットＴ）６４検体のいずれも１．５、１．２２、あるいは２．１７ＥＬＩＳＡで反応性を示さなかった。１検体は１．１８で反応性を有した。（vii）アメリカ合衆国の検体（セット１）６２検体中の計３検体が一以上のＧＢＶ−ＡのＥＬＩＳＡで反応性を示した。２．１７および１．２２ＥＬＩＳＡの両者で繰り返し反応性を示したものが１検体存在した。２．１７ＥＬＩＳＡのみに反応性の検体が１検体あり、別の１検体は１．２２ＥＬＩＳＡのみに反応性を示した。１．５あるいは１．１８ＥＬＩＳＡに反応性の検体は存在しなかった。上に述べたように、２以上のＨＧＢＶ株があり、あるいは、２以上の別種のウイルスを本明細書に記載の配列によって表すことができる。それらは本発明の範囲内のものと考えられ、これを「肝炎ＧＢウイルス（ＨＧＢＶ）」と呼ぶ。Ｌ．血清反応の結果の統計的意義これらのデータによって、ＨＧＢＶ−Ａタンパクに対する特異抗体（即ち１．５、２．１７、１．１８および１．２２ＥＬＩＳＡで抗体に繰り返し反応性を示す検体）は、ＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる個体および非Ａ−Ｅ肝炎と診断された個体において検出されたが、アメリカ合衆国のボランティアからも売血者からもそれほど高頻度には検出されることがなかったことが示された。表１９において、種々のカテゴリーの検体（表１８の「低リスク」、「リスクあり」、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）からの血清反応の結果を合わせ、χ二乗検定で統計的意義について分析した。表１８は検査した検体の総数におけるＨＧＢＶタンパクに対する抗体の血清学的存在をまとめたものであるが、これと異なり、表１９のデータは、異なる個体（人）からの結果を示している。ＧＢＶ−ＡのＥＬＩＳＡについては、抗−ＨＧＢＶの血清学的存在をボランティア血液提供者とＨＧＢＶへの暴露に関し「リスクあり」と考えられる個体（西アフリカ、但しＩＶＤＵではないもの）との間で比較すると、有意の差（ｐ値＝０．０００）が存在することを示している。加えて、ボランティアの血液提供者と比較した場合、エジプトとアメリカ合衆国における非Ａ−Ｅ肝炎患者におけるＨＧＢＶ−Ａに対する抗体の血清学的存在には、統計的に有意の差があった。このデータは、ＨＧＢＶ−Ａに対する暴露と非Ａ −Ｅ肝炎とに関連があることを示唆している。注：これらの最初の研究ではＲＴ −ＰＣＲの結果は陰性であったが、その後のデータによって血清反応陽性の個体の血清においてフラヴィ様ウイルス配列が見いだされた（実施例１９参照）。Ｍ．まとめこれらのデータは、本発明に記載のＥＬＩＳＡが西アフリカに居住している個体および非Ａ−Ｅ肝炎の個体において抗体を検出するのに有用であることを示唆するものである。西アフリカの個体群においては肝炎に罹患するリスクは比較的高い。人々のほぼ８５％近くが肝炎Ｂウイルスに対する抗体に血清反応陽性であり、約５％が肝炎Ｃウイルスに対する抗体に陽性である。これらのデータは、試験した検体の全カテゴリーにおいてＨＧＢＶに対する抗体の血清学的存在を過小に評価しているように思われる。さらなるＨＧＢＶエピトープが発見され、評価されるにつれ、現在は診断を下すことができない患者において肝炎を診断するにあたり、ＨＧＢＶゲノム（群）に基づく試験の有用性がより重要なものとなることが期待される。実施例１８．ヒトにおけるＧＢ関連ウイルスの同定Ａ．理論ＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂの両者のエピトープが同定された（実施例３）。これらを血清学的マーカーとして用いてヒトの血清および血漿サンプルをスクリーニングした（実施例５および６）。これらのマーカーのうちの幾つかについての血清学的活性と非Ａ−Ｅ肝炎の発症頻度との間に顕著な相関があったが、これはＨＧＢＶ−Ｂがヒトにおける非Ａ−Ｅ肝炎の病因物質であることを示唆している（実施例５Ｇ）。しかしながら、ＧＢヒト血清をウェスタンブロットで分析してみるとＨＧＢＶ−Ｂエピトープに対する反応性は示されなかった（実施例３）。そのかわり、ＧＢヒト血清に少なくとも一つのＨＧＢＶ−Ａエピトープが同定された。これはＨＧＢＶ−ＡがＧＢにおける肝炎の病因物質であったことを示唆するものである。ＨＧＢＶ−Ａ配列もＨＧＢＶ−Ｂ配列も、ＲＴ−ＰＣＲでは非Ａ− Ｅ肝炎の患者では同定されなかった（実施例５Ｅ）。そこで非Ａ−Ｅ肝炎に罹患しているヒトにおけるＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ感染の証拠を定める必要がいまだ残っている。ヒト血清あるいは血漿源におけるＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ配列の同定が失敗に終わったことには幾つかの要因が考えられる。第一に、我々がＲＴ−ＰＣＲによって検査したのは限られた数のＨＧＢＶ−Ａ血清陽性および／またはＨＧＢＶ−Ｂ血清陽性サンプルであって、これらのサンプルの多くは保存歴が不明である。よってこれらのサンプル中に存在したウイルス性のＲＮＡが不適当な保存の影響を受けた可能性がある。第二に、ＧＢ感染は自然に快癒するように見受けられる。そのため、ＧＢ配列が感染した個体の血清中に存在する期間幅は非常に狭い可能性がある。即ちＧＢ配列を含有する血清サンプルを得る機会は極端に低いものとなろう。最後に、ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ配列を探すにあたって、限られた数のＰＣＲプライマーセットを用いたことが挙げられる。ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−ＢはＲＮＡウイルスであるため、突然変異の率が高い傾向がある（ホランドら（１９８２年）サイエンス２１５：１５７７−１５８５）。即ち、検査したヒト血清中のＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ配列が我々のＰＣＲプライマーの配列とは異なっていて、そのためＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂが検出されない可能性がある。ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂのゲノムの変異性のために我々のＰＣＲ研究においてこれらのウイルスが妨害された可能性を示すため、ＨＧＢＶ− Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂの高度に保存されたＮＳ３様の領域（図１７参照）に合わせ、変性ＰＣＲプライマーを設計配置した。これらの高度に保存された領域がウイルスの複製サイクルにおいて必要な機能を果たしているからである。よってこれらの配列はＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂ変異体においても保存されているはずである。この領域内に設計配置されたＰＣＲプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲによってＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−ＢのゲノムＲＮＡを検出できるはずである。加えて、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＣＶ配列を特異的に増幅することのできる変性ＰＣＲプライマーを設計すれば、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢおよびＨＣＶに関連するウイルスから得た配列を増幅することができるかもしれないと我々は判断した。よって、もし別々のＨＧＢＶ−Ａ関連ウイルスまたはＨＧＢＶ−Ｂ関連ウイルスの抗原と交差反応する抗体が存在するために、ヒトの血清および血漿サンプル（実施例５および６）で血清反応があまり検出されなかったのであるならば、我々はこれらのＧＢ関連ウイルスから配列を得ることができるであろう。［これはニコルと彼の同僚が最近米国南西部における急性呼吸器疾患の大流行に関連する特殊なハンタウイルスを同定するために採用した実験手法に類似のものである。ニコルら、サイエンス２６２：９１４−９１７（１９９３）］Ｂ．肝炎ＧＢウイルスＣ（ＨＧＢＶ−Ｃ）のＮＳ３様領域のクローニングウイルス感染のモデルでは、感染の初期段階でウイルス血症が起こり、これがウイルスタンパクに対するＩｇＭ抗体の検出と相関していることが多い。実施例５、６で記載したように、ＨＧＢＶ−Ａ及びＨＧＢＶ−Ｂに由来する組換えタンパクに対するＩｇＧ抗体が検出された検体は、ＥＬＩＳＡにおいて免疫反応性を有していた。更に追加のＥＬＩＳＡを実施し、ＩｇＭ抗体がこれらのタンパクについて検出されるかどうかを調べた。西アフリカの個体（実施例５Ｅ−ｉ）の血清反応陽性の検体の内のあるものは、組換えタンパクに対するＩｇＭ抗体に関して反応性であった（データ省略）。これらの検体はウイルスを含有する可能性が高いと考えられた。加えて、急性肝炎に罹患しているＨＧＢＶ−Ａ陽性およびＨＧＢＶ−Ｂ陽性のエジプトの個体（実施例５Ｆ−vii ）で、ＨＧＢＶ−ＡまたはＨＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクに対するＩｇＭ抗体が検出されない検体についても、急性肝臓疾患はウイルスの存在と関連している可能性があることから検査を実施した。これらのサンプルの核酸について、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、及びＨＣＶ−１の各配列を増幅する変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いて“半入れ子”（hemi-nes ted）ＲＴ−ＰＣＲを実施した。使用機器はＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＲＮＡＰＣＲキット（パーキンエルマー製）を用い、製造業者の使用説明書に従って実施した。簡単に言えば、増幅の第一セットは、２ｍＭのＭｇＣｌ₂および１μＭのプライマーｎｓ３．１−ｓとｎｓ３．１−ａ（配列番号はそれぞれ６７１および６７２）で抽出した核酸のランダム−プライムド逆転写反応によるｃＤＮＡ産物について行った。反応物に対し、変性−アニーリング−伸展［（９４℃、３０秒；３７℃、３０秒；２分かけて７２℃；７２℃、３０秒）を３サイクル行い、次いで（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０秒）を３７サイクル行う］を４０回行い、最後に７２℃で１０分間伸展させた。反応が終了したものは、４℃で保存した。増幅の第二セットは、最初のＰＣＲ産物の４％を鋳型として使用し、ｎｓ３．１−ｓおよびｎｓ３−ａ（配列番号はそれぞれ６７１および６７３）を“ヘミネスティッド”プライマーセットとして用いた他は上記と同様であった。ＰＣＲの第一及び第二のセットの産物をゲル濾過で分析した。西アフリカの１サンプルは、約３８６ｂｐ（ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、またはＨＣＶ産物の予想されるサイズ）にぼやけた半入れ子反応に由来するＰＣＲ産物を有していた。この産物を、本技術分野の書物に記載されているｐＴ７ブルーＴ−ベクタープラスミド（ノヴァゲン製）にクローニングした。このクローンから得た配列（ＧＢｃｏｎｔｉｇＣ［ＧＢ−Ｃ］、配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）をＧＢｃｏｎｔｉｇＡ（ＧＢ−Ａ、配列番号１６３、残基４４３８−４８０４）、ＧＢｃｏｎｔｉｇＢ（ＧＢ−Ｂ、配列番号３９３、残基４２１８−４５８７）、およびＨＣＶ−１（配列番号３９８）と比較した。図３６は、これらの配列のヌクレオチド配列を示し、一方、表２０はこれらの配列間の％相同性を示す。図３６と表２０に示すように、ＧＢ−Ａ、ＧＢ−Ｂ、およびＨＣＶ−１のヌクレオチドの比較の結果、これらの配列は４７．９９〜６１．６６％互いに類似している。このことは、これらのウイルスのＮＴＰ結合性ヘリカーゼに存在する保存されたアミノ酸残基を考えると特に驚くべきことではない（実施例２Ｂ３、図１７Ａ）。西アフリカのサンプル（ＧＢ−Ｃ、配列番号６７３、残基２２７４− ２６４０）から得たＮＳ３ＰＣＲ産物のヌクレオチドと他のウイルスのヌクレオチドを比較すると、ＧＢ−Ａ（配列番号１６３、残基４４３８−４８０４）、ＧＢ−Ｂ（配列番号３９３、残基４２１８−４５８７）、およびＨＣＶ−１（配列番号３９８）からのＮＳ３配列に関連しているが、明確に異なっていることが示唆されている。ウィスコンシン配列分析パッケージ（バージョン８）中の核酸およびタンパクデータベースとＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）とのＢＬＡＳＴＩＮおよびＢＬＡＳＴＸ解析の結果、ＨＣＶの株の幾つかは配列の同一性に限界があることが判明した。ヌクレオチドおよびアミノ酸に関するもっとも高いＰ値（すなわち偶然に配列が整合した確率）はそれぞれ１．９× １０^-20と５．３×１０^-31であった（データ省略）。以上を合わせると、これらのデータは、ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）がＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂおよび我々がここでＨＧＢＶ−Ｃと標記するＨＣＶに関連するユニークなＧＢ様のウイルスに由来するものであるかもしれないことを示唆している。Ｃ．ＧＢ−Ｃは外因性であるＧＢ−Ｃ配列に対するＰＣＲプライマーを用い、上記のように、即ち例えば実施例６Ｂに記載の手順によって、この配列がヒト、アカゲザル、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＥ．ｃｏｌｉのゲノム中に検出されるかどうかを決定した。ＰＣＲはパーキン−エルマー−シータスのＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）を使用し、基本的に製造者の指示書に従って実施した。即ち、３００ｎｇのゲノムＤＮＡを各１００μｌの反応物に対して使用した。ＰＣＲプライマー（配列番号６７５および６７６）を最終濃度１．０μＭで使用した。ＰＣＲは４０サイクル行い（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０秒）、次いで７２℃で１０分間伸展させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで核酸を直接染色したのちＵＶ照射で可視化し、さらにサザントランスファーでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフィルターに移してから放射標識プローブとハイブリダイズした。図３７は、ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）から調製した放射線標識プローブとハイブリダイズした後、ＰＣＲ産物をサザンブロットして得たＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ（モレキュラー・ダイナミクス社、カリフォルニア州サニーヴェイル）である。ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３）は、３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ中にＧＢ−Ｃプラスミド鋳型の〜３５０ｆｇ（１ゲノムコピー当量、レーン５）および〜３５ｆｇ（０．１ゲノムコピー当量、レーン６）が検出された以外、ヒト（図１９、レーン１）、アカゲザル（レーン２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（レーン３）、Ｅ．ｃｏｌｉ（レーン４）の各ゲノムＤＮＡには検出されなかった。（レーン７は〜３．５ｆｇ［０．０１ゲノムコピー当量］のＧＢ−Ｃプラスミド鋳型からのＰＣＲ産物を３００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ中に含有する。）このように、０．１ゲノムコピー当量を検出できるゲノムＰＣＲを使用してもＧＢ−Ｃ（配列番号６７３）はヒト、アカゲザル、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびＥ．ｃｏｌｉのゲノム中に検出できない。この結果は、ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３）が外因性（即ちウイルス性）起源であるという予想と一致している。Ｄ．ＧＢ−Ｃは追加のヒト血清サンプル中に検出できる追加のＨＧＢＶ−ＡおよびＨＧＢＶ−Ｂ免疫反応性ヒト血清サンプルにＲＴ− ＰＣＲを適用し、ＧＢ−Ｃ配列の存在について調べた。実施例７に記載のように、血清サンプルから抽出した核酸をランダムヘキサマーで逆転写し、ｃＤＮＡに対して３５−４０サイクルの増幅を行い（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、３０−９０秒）、次いで７２℃で１０分間伸展させた。ＧＢ−Ｃに特異的なＰＣＲプライマー（ｇ１３１−ｓｌとｇ１３１−ａｌ、配列番号６７５と６７６）を濃度１．０μＭで使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで核酸を直接染色したのちＵＶ照射で可視化し、サザンブロットでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフィルターに移してから放射標識プローブとハイブリダイズした。西アフリカからの計４８本のＨＧＢＶ−免疫陽性サンプルを試験した。ＧＢ−Ｃが同定された最初のサンプルを含む西アフリカからの８サンプルは、ＧＢ−Ｃ配列に陽性であることがＲＴ−ＰＣＲで判った。ＧＢ血清反応陰性の西アフリカ血清サンプルを計１０本試験したが、いずれも検出可能なＧＢ−Ｃ配列は有していなかった。陽性サンプル４本からのＰＣＲ産物をクローニングし、前記のように配列決定した。１５６にわたるヌクレオチドを調べた所、試験した４クローンの内の２つがＧＢ−Ｃ配列（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）と同一であり、２クローン（配列番号６７７および６７８）がＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）と８８．４％および８３．６％相同の配列を含有していた（図３８）。しかしながら、ヌクレオチドレベルにおけるダイバージェンスにもかかわらず、各クローンは非常に類似しており、配列番号６７８の予想された翻訳中にはただ一つのアミノ酸の相違が見られただけであることが、予想された翻訳で示された。ギリシャ、エジプトおよびアメリカ合衆国の非Ａ−Ｅ肝炎の個体から追加の血清サンプルを得て、前記のようにしてＧＢ−Ｃ配列について検査した。これらのサンプルはいずれもＧＢ−Ｃ配列は含有していなかった。サンプル中にＧＢ−Ｃ配列が検出されなかったことには幾つかの理由が考えられる（上記、理論の項参照）。しかしながら、ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）と二つのＧＢ−Ｃ変異体（配列番号６７８と６７７）との間における上述の配列変化は、もし密接に関連している西アフリカからのＨＧＢＶ−Ｃがヌクレオチドレベルで１５．１％異なることがあるならば、ＧＢ−Ｃに特異的なＰＣＲプライマー（ｇ１３１− ｓｌ、ｇ１３１−ａｌ、配列番号６７５と６７６）が地理的に別個の隔離体であるＧＢ−Ｃウイルスと、検出可能なＰＣＲ産物を産生するほどには十分ハイブリダイズしないかもしれないことを示唆している。この場合、ゲノムのより高度に保存された領域（５’ＵＴＲ）に設計されたＰＣＲプライマーによって、ＧＢ− Ｃ配列を西アフリカ血清サンプル中に検出できるかもしれない。Ｅ．ＨＧＢＶ−Ｃ配列の伸展実施例２Ａに記載のＰＣＲウォーキング法によって追加のＧＢ−Ｃ配列を得た。即ち、当初ＧＢ−Ｃ（配列番号６７３、残基２２７４−２６４０）を同定するために用いた西アフリカのヒト血清から全核酸を抽出した。この核酸を前記のようにして逆転写した。その結果得られたｃＤＮＡを、２ｍＭのＭｇＣｌ₂を用いたこと以外はソレンセンらによって記載された方法に従って５０μｌのＰＣＲ反応物（ＰＣＲ１）中で増幅した。反応物を３５サイクルの変性−アニーリング− 伸展工程（９４℃、３０秒；５５℃、３０秒；７２℃、９０秒）に付し、次いで７２℃で１０分間伸展させた。ソレンセンらによって記載された方法に従ってストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（プロメガ社）によってビオチン化産物を単離した。次いでソレンセンらの記載する方法に従ってこのストレプトアビジンで精製した産物に上記と同じ全３５サイクルの変性−アニーリング−伸展によってネスティッドＰＣＲ（ＰＣＲ２）を行った。得られた産物およびこれを精製するために用いたＰＣＲプライマーを表２１に示す。さらに、上記のＰＣＲ１の条件下でオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号６６９および６７０）を用いて１．３ｋｂ産物（Ｃ．１６）を生成した。この産物を表２１に記載のものと共にアガロースゲルから単離し、本技術分野で周知の方法によってｐＴ７ブルーＴ−ベクタープラスミド（ノヴァゲン社）中にクローニングした。クローニングした産物は、実施例５に記載のようにして配列決定した。ＧＣＧパッケージ（バージョン７）のプログラムによって配列を組み立てた。構築されたｃｏｎｔｉｇの概略を図３９に示す。ＧＢ−Ｃは長さが９０３４ｂｐで、その全長が配列決定された。これを配列番号４００−６０６に示す。これらの配列番号は三つの前進翻訳フレームと対応している。実施例１９．ＣＫＳに基づいた発現と免疫原性ＨＧＢＶ−Ｃポリペプチドの検出実施例１７（表１３）に記載のウォーキング試験で得たＨＧＢＶ−Ｃ配列を、実施例１３の記載にしたがって表２２（１０ユニット、ＮＥＢ）に掲載の制限酵素を用いてＣＫＳ発現ベクターｐＪＯ２００、ｐＪＯ２０１およびｐＪＯ２０２にクローニングした。追加のＰＣＲクローン２種、Ｃ３／２およびＣ８／１２、も発現した（図３９）。配列番号６８１のプライマーによってＰＣＲ産物Ｃ３／２を生成し、ＰＣＲ産物Ｃ８／１２と配列番号６８５の補体を、実施例９の記載に従ってプライマー（配列番号６９３とその補体）を用いて生成した。このＰＣＲ産物を前記のようにしてｐＴ７ブルー中にクローニングし、次いで表２２に掲載した制限酵素で遊離させ、上記のｐＪＯ２００、ｐＪＯ２０１およびｐＪＯ２０２中にクローニングした。一以上のＣＫＳ／ＨＧＢＶ−ＡあるいはＣＫＳ／ＨＧＢＶ−Ｂ融合タンパクに対する抗体の存在が１．７、４．１、または２．１７ＥＬＩＳＡ（実施例１５、１６参照）によって示唆された二つのヒト血清を選択し、ウェスタンブロットによって分析した。これらの血清のうちの一つ（２４０Ｄ）は非Ａ−Ｅ肝炎（エジプト）の個体からのものであり、他方（Ｇ８−８１）は西アフリカの個体のものでＨＧＢＶへの暴露について「リスクあり」（実施例１５参照）のものであった。ＣＫＳ／ＨＧＢＶ−Ｃ融合タンパクを発現し、これを前記のようにしてニトロセルロースシートに移した。記載されたようにブロットをプレブロックし、１０％のＥ．ｃｏｌｉ溶解物と６ｍｇ／ｍｌのＸＬ１−ブルー／ＣＫＳ溶解物を含有するブロッキングバッファーで１：１００に希釈されたヒト血清サンプルの一つで一夜インキュベートした。ブロットはＴＢＳで２回洗浄し、ＨＲＰＯ−接合ヤギ抗−ヒトＩｇＧと反応させ、上記のように展開させた。結果を表２２に示す。ＨＧＢＶ−Ｃタンパクの内この二つの血清の一方あるいは他方と反応性を示したものがいくつかあり、その三つ（Ｃ．１、Ｃ．６、Ｃ．７）を選んでＥＬＩＳＡアッセイ（実施例２０参照）に付した。このようにして、ＨＧＢＶ−Ａおよび／またはＨＧＢＶ−Ｂタンパクと反応性を示すことが既に判っているサンプルは、ＨＧＢＶ−Ｃタンパクとも反応することが判明した。三つのＨＧＢＶウイルスからの複数のタンパクとの反応性は、ウイルス間でエピトープが共有された結果の交差反応によるものであるかもしれない。あるいは、これは複数種のウイルスの感染によるものかもしれず、さらにはその他の同定されていない要因によるものである可能性もある。実施例２０．ＧＢＶ−Ｃの血清学的研究Ａ．組換えタンパク精製手順ＣＫＳ融合タンパクを発現する細菌細胞を凍結し、−７０℃で保存した。各ＧＢＶ−Ｃ構築物からの細菌細胞を解凍し、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ構築物について記載したようにして破砕処理した。さらに、組換えタンパクを、実施例１５でＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクについて記載したようにして精製した。この精製手順で収集した分画を電気泳動で分離し、クーマシーブリリアントブルーＲ２５０で染色して、分子量が約７５ｋＤ（ＣＫＳ−Ｃ．１／配列番号４０４）、７１ｋＤ（ＣＫＳ−Ｃ．６／配列番号４０４）、および４９ｋＤ（ＣＫＳ −Ｃ．７／配列番号４０４）であるタンパクの存否を調べた。予想された分子量のタンパクを示すバンドが、ＣＫＳ−Ｃ．６およびＣＫＳＣ．７組換えタンパクについて観察された。ＣＫＳ−Ｃ．１タンパクについては、予想された分子量７５ｋＤの所ではなく、分子量６２ｋＤに対応する箇所にバンドが認められた。なぜ予想されたバンドと観察されたバンドが異なるのかは不明である。興味の対象のタンパクを含有する分画をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって再度調査した。精製抗原を含有するプール分画の免疫原性および構造の完全性を、実施例１３に記載の方法に従ってニトロセルロースに対する電子移動およびイムノブロット法によって決定した。適切な陽性対照がなかったため、組換えタンパクは、各融合タンパクのＣＫＳ部分に対するモノクローナル抗体との反応性によって同定した。ＣＫＳ−Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）の組換え抗原を検出すべく抗− ＣＫＳモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット法で調べると、約６５ｋＤのところにシングルバンドが認められた。この結果はＣＫＳ−Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）の予想サイズの７５ｋＤとは異なっている。なお、ＣＫＳ− Ｃ．６タンパク（配列番号４０４）およびＣＫＳ−Ｃ．７タンパク（配列番号４０４）については、イムノブロット法で調べた結果予想されたサイズを有していた。Ｂ．ポリスチレンビーズの被覆手続き上記タンパクを透析し、実施例１５の記載に従って、これらのタンパクのポリスチレンビーズ上での免疫原性を評価した。Ｃ．ＨＧＢＶに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡの手順各種ＥＬＩＳＡは実施例１５の記載に従って実施した。Ｄ．感染個体の血清におけるＨＧＢＶ−ＲＮＡの検出各ＥＬＩＳＡで繰り返し反応性を示した検体について、実施例１５のセクションＤの記載に従ってＨＧＢＶ−ＲＮＡを調べた。Ｅ．タマリンの血清像ＨＧＢＶ−Ｃゲノム由来のＣＫＳＣ．１タンパク、ＣＫＳＣ．６タンパク、あるいはＣＫＳＣ．７タンパクを用いたＥＬＩＳＡアッセイにおいて、タマリンからの血清はいずれも特異的免疫反応を示さなかった。実施例１５中のタマリンの血清像についての記載参照。Ｆ．追補的試験実施例１５に記載したように、最初反応性を示した検体については、典型的には再試験を行った。ある検体が繰り返し反応性を示した場合、ＥＬＩＳＡによるデータをさらに補充すべく追加の試験（例えばウェスタンブロット）を実施することができる。ウェスタンブロットの結果が陽性と考えられるためには、観察可能なバンドがＣ．１タンパク（配列番号４０４）に対して６５ｋＤ、Ｃ．６タンパク（配列番号４０４）に対して７１ｋＤ、またはＣ．７タンパク（配列番号４０４）に対して４９ｋＤにおいて検出される必要がある。ウェスタンブロットはＥＬＩＳＡの感度に匹敵しあるいはそれを越えるほど最適化されていないので、陰性の結果が出ても直ちにＥＬＩＳＡのデータを捨てることはしなかった。しかしながら、陽性の結果が出ればそれはＥＬＩＳＡによって検出された反応性を補強するものである。実施例１５で記載したように、繰り返し反応性のある検体で十分量あるものに対しては、ＲＴ−ＰＣＲ（配列番号８と９に対応するプライマーを用い、実施例１０の記載に従って実施）によって血清中のＨＧＢＶ−Ｃ特異性ヌクレオチド配列を同定することができる。Ｇ．実験手順実施例１５では、種々のヒト個体群におけるＨＧＢＶ−ＢとＨＧＢＶ−Ａに対する抗体の存在を評価するために、ＨＧＢＶ−Ｂからの組換え抗原を使用したＥＬＩＳＡを利用した。実施例１４に記載したように、固相の上に被覆したＣＫＳ −Ｃ．１組換えタンパク（配列番号４０４）を用いたＣ．１ＥＬＩＳＡ、ＣＫＳ −Ｃ．６組換えタンパク（配列番号４０４）を用いたＣ．６ＥＬＩＳＡ、およびＣＫＳ−Ｃ．７組換えタンパク（配列番号４０４）を用いたＣ．７ＥＬＩＳＡを利用し、ＨＧＢＶ−Ｃに対する抗体についての試験を同じ検体の多くについて行なった。実施例１５に述べたように、ＨＧＢＶを接種した回復期にあるタマリンの５匹全てが、（１．７、１．４および４．１ＥＬＩＳＡを用いて検出されたように）ＨＧＢＶ−Ｂ組換えタンパクに応答する特異的ではあるが短命の抗体を産生した。Ｃ．１、Ｃ．６およびＣ．７ＥＬＩＳＡに応答する検出可能な抗体を産生したタマリンはなかったが、ヒトの検体の幾つかは、ウエスタンブロット法（実施例１３参照）によって試験したとき、Ｃ．１、Ｃ．６およびＣ．７組換えタンパクに反応する特異的な抗体を産生した。本実施例では、種々のヒト個体群における抗体を検出する上でのＣ．１、Ｃ．６およびＣ．７ＥＬＩＳＡの有用性を評価した。Ｈ．切捨て値の決定Ｃ．１、Ｃ．６およびＣ．７ＥＬＩＳＡの切捨て値を実施例１５に記載したようにして決定した。Ｉ．低リスク検体を用いて得た血清学的データウイスコンシン州南西部に住む健康なボランティアのドナーから１００本の血清と１００本の血漿を含む集団を得るとともに、Ｃ．１ＥＬＩＳＡにおけるＣＫＳ−Ｃ．１（配列番号４０４）タンパク、Ｃ．６ＥＬＩＳＡにおけるＣＫＳ−Ｃ．６（配列番号４０４）タンパク、およびＣ．７ＥＬＩＳＡにおけるＣＫＳ−Ｃ．７（配列番号４０４）タンパクを含むＨＧＢＶ−Ｃからの三種の組換えタンパクに対する抗体について試験を行なった。Ｃ．１ＥＬＩＳＡについては、血清および血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ０．０４９（標準偏差（ＳＤ）＝０．０４０）と０．０３８（ＳＤ＝０．０２９）であった。血清と血漿についての切捨て値はそれぞれ０．２１４と０．２８６と計算された。上記のように、切捨て値は、陰性対照の吸収値の関数として表すこともでき、１０．０を越えるＳ／Ｎ値を有する検体は反応性であると考えられた。この切捨て値を用いたところ、１００の血漿検体にはＣ．１タンパク（配列番号４０４）に対する抗体に初期反応性および繰り返し反応性がみとめられたものはなく、１００の血清検体の内の一つでは、Ｃ．１タンパク（配列番号４０４）に対する抗体に初期反応性および繰り返し反応性が認められた。Ｃ．６ＥＬＩＳＡについては、血清および血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ０．１０２（標準偏差（ＳＤ）＝０．０４６）と０．１０５（ＳＤ＝０．０４７）であった。１０以上のＳ／Ｎ値を有する検体が反応性であると判断されるように切捨て値を設定した。この切捨て値を用いたところ、３個の検体（２個は血清の集団からで、１個は血漿の集団から）ではＣ．６タンパク（配列番号４０４）に対する抗体に対して繰り返し反応性がみとめられた。Ｃ．７ＥＬＩＳＡについては、血清および血漿の検体の平均吸収値が、それぞれ０．０６１（標準偏差（ＳＤ）＝０．０４０）と０．０５０（ＳＤ＝０．０５５）であった。１０以上のＳ／Ｎ値を有する検体が反応性であると判断されるように切捨て値を設定した。この切捨て値を用いたところ、Ｃ．７タンパク（配列番号４０４）に対する抗体に対して繰り返し反応性であると考えられる検体は無かった。したがって、米国人の血液提供者（Ｎ＝２００）の約１％にＣ１、Ｃ６またはＣ．７タンパクに対する抗体が存在することが証明された。Ｊ．肝炎に対し「リスクあり」と考えられる検体この研究のデータを表２３にまとめて示す。（ｉ）西アフリカからの検体１３７個の検体の内の計２０個が、ＧＢＶ−Ｃタンパクを用いたＥＬＩＳＡの一種またはそれ以上において反応性であった。９７個の内の合計１２個がＣ．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であることが認められ、５２個の内の３個がＣ．６ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であることが認められ、１３７個の検体の内の５個がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であることが認められた。Ｃ．１において反応性であった検体の内の３個をウエスタンブロット法で試験し、反応性であることが分かった。これらのデータは、ＨＧＢＶが西アフリカの風土病であることを示唆している。（ii）経静脈麻薬使用者の検体イリノイ州シカゴのハインズ退役軍人管理病院において行なわれた研究の一環として、経静脈麻薬使用者の集団から合計１１２個の検体を得た。１１２個の検体の内の計２個が一種またはそれ以上のタンパクに対して繰り返し反応性を有していた。１個の検体がＣ．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であることがみとめられ、１個の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であることがみとめられた．Ｃ．６ＥＬＩＳＡにおいて陽性であった検体は無かった。Ｋ．非Ａ−Ｅ肝炎の個体から得た検体この研究のデータを表２３にまとめて示す。非Ａ−Ｅ肝炎を有する個体から種々の検体の集団（実施例１５．Ｋに記載）を得、１．５、２．１７、１．１８、および１．２２ＥＬＩＳＡ（実施例１５．Ｃに記載）によって試験した。検体の量が不十分であったため、検体の全てを全てのＥＬＩＳＡにおいて試験できなかった。（ｉ）日本の検体合計８９個の検体の内、Ｃ．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であるとみとめられたものは無かった。検体の量が少なかったため、Ｃ６またはＣ．７ＥＬＩＳＡでの抗体についての試験は行なわなかった。（ii）ギリシャの検体合計６７個の検体をＣ．１およびＣ．７ＥＬＩＳＡを用いて試験した。反応性のみとめられた検体は無かった。（iii）エジプトの検体１３２個の検体の内の計１８個が一つ以上のＥＬＩＳＡにおいて反応性であるとみとめられた。Ｃ．１ＥＬＩＳＡにおいて反応性であるとみとめられたものは無かった。計１５個の検体がＣ．６ＥＬＩＳＡにおいて反応性であるとみとめられ、３個の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて反応性であるとみとめられた。（iv）米国の検体（Ｍセット）合計６個の検体が一以上のＥＬＩＳＡにおいて反応性であると認められた。２個の検体がＣ．１ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であると認められた。４個の検体がＣ．６ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であると認められた。Ｃ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性の検体は無かった。（ｖ）米国からの検体（Ｔセット）６４個の検体の内で、Ｃ．１ＥＬＩＳＡまたはＣ．６ＥＬＩＳＡにおいて反応性であると認められたものは無かった。１個の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であった。（vi）米国の種々の臨床現場からの検体（セット１）総計すると、６２個の検体の内の３個が一以上のＥＬＩＳＡで反応性であると認められた。１個の検体がＣ．１ＥＬＩＳＡおよびＣ．６ＥＬＩＳＡの両方において繰り返し反応性であると認められた。２個の検体がＣ．７ＥＬＩＳＡにおいて繰り返し反応性であると認められた。上記のように、ＨＧＢＶには二以上の株が存在する可能性があり、即ち二以上の別個のウイルスを本明細書に開示した配列によって表すことができる。これらは本発明の範囲内であると考えられ“肝炎ＧＢウイルス（“ＨＧＢＶ”）”と称す。Ｌ．血清反応の結果の統計的意義これらのデータは、ＨＧＢＶに晒されるリスクがあると考えられる個人、および非Ａ−Ｅ肝炎であると診断された個人からは、ＨＧＢＶ−Ｃタンパク（即ち、Ｃ．１、Ｃ．６およびＣ．７ＥＬＩＳＡの抗体に対して繰り返し反応性である検体）に特異的な抗体が検出され、米国からのボランティアまたは売血血液提供者からはこれらの抗体が低い割合で検出された。表２４に、種々のカテゴリーの検体（表２３に示す“低リスク”、“リスク有り”、および非Ａ−Ｅ肝炎患者）について得られた血清反応の結果をグループ分けして示し、χ二乗検定によって統計的意義を分析した。試験した検体の総数におけるＨＧＢＶタンパクに対する抗体の血清学的にみた存在をまとめた表２３のデータと異なり、表２４のデータは、異なる個体（人）について得られた結果を反映している。ＧＢＶ−ＣのＥＬＩＳＡについては、そのデータは、ボランティアの血液提供者における抗ＨＧＢＶの血清学的にみた存在と、ＩＶＤＵではなくＨＧＢＶに晒される“リスクあり”と考えられる個体（西アフリカ）との比較においては有意差（ｐ値＝０．０００）があることを示している。また、エジプトと米国の非Ａ−Ｅ肝炎に罹患している個体におけるＨＧＢＶ −Ｃに対する血清学的にみた抗体の存在は、ボランティアの血液提供者と比較した場合、統計的有意差があった。これらのデータによれば、ＨＧＢＶ−Ｃに晒されることは非Ａ−Ｅ肝炎と関連していることが示唆される。注：これらの初期の研究ではＲＴ−ＰＣＲの結果は陰性であったが、その後に得られたデータによって、血清学的に陽性の個体（実施例１９参照）の血清におけるフラヴィ様ウイルス配列が判明した。実施例２１．非Ａ−Ｅ肝炎のヒトにおけるＨＧＢＶ−Ｃの存在ＨＧＢＶ−Ｃに特異的なＥＬＩＳＡの生成により、非Ａ−Ｅ肝炎に罹患している患者の免疫的に陽性の血清（ＨＧＢＶ−Ｃ血清学の実施例）を同定できるようになった。この血清を、非Ａ−Ｅ肝炎であると立証された個体（表２５）から得た幾つかの免疫的に陽性のＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｂと共に、ＨＧＢＶ−Ｃ配列についてＲＴ−ＰＣＲによって試験した。ＨＧＢＶ−Ｃの異型もなるべく検出できるよう、第１回目の増幅において変性ＮＳ３オリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを行ない、これに続き、ネスト化されたＧＢ−Ｃ特異性プライマーを用いて第２回目の増幅を行なった。具体的には、第１回目の増幅は、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、および１μＭのプライマーｎｓ３．２−ｓ１、ｎｓ３．２−ａ１（配列番号はそれぞれ７１１と７１２）を使用し、実施例６で述べたようにして調製された血清ｃＤＮＡ製品を用いて行なった。反応物に対して変性− アニーリング−伸展を４０回繰り返し〔（９４℃で３０秒、３７℃で３０秒、２分間かけて７２℃に温度上昇、７２℃で３０秒）というサイクルを３回繰り返し、その後（９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒）のサイクルを３７回〕、これに続き７２℃で１０分間伸展を行なった。得られた反応物を４℃に維持した。第２回目の増幅は、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、１μＭのＧＢ−Ｃ特異性のプライマー（配列番号６７５と６７６）、および鋳型としての４％の第１のＰＣＲ製品を使用して行なった。第２回目の増幅では、増幅すべき鋳型との塩基対の不適合を含んでいるようなオリゴヌクレオチドプライマーを有する特定の生成物をも増幅するために設計された温度循環計画を採用した〔Ｒｏｕｘ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１６：８１２〜８１４（１９９４年）〕。即ち、反応は、温度循環（９４℃で２０秒、５５℃（各サイクル毎に０．３℃低下）で３０秒、７２℃で１分）を４３回行なった後、（９４℃で２０秒、４０℃で３０秒、７２℃で１分）で１０回行い、最終伸展を７２℃で１０分行なった。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法により単離し、臭化エチジウムを用いて核酸を直接染色した後、紫外線照射によって可視化し、サザントランスファーでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフィルターに移した後、ＧＢ−Ｃに対する放射線標識化プローブにハイブリダイゼーションを行なった。ＰＣＲ産物を、当分野において述べられたようにクローン化するとともに配列決定した。上記の方法を用い、ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ −Ｃ．７を得た。これらの配列は、８２．１〜８６．６％の割合でＧＢ−Ｃ（配列番号４００、塩基４１６７〜４３６５）と相同である。図４０は、予期されたコドントリプレットにおける、ＧＢ−Ｃと相同な領域に整合したＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ−Ｃ．７の配列の相違を示す。この図に示すように、ヌクレオチドの相違の殆どは、ＧＢ−Ｃからのアミノ酸の変化を引き起こさない。このアミノ酸レベルでの全体的な配列の維持は、ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ−Ｃ．７が同じウイルスの異なった株であるＨＧＢＶ−Ｃから得られたものであることを示唆している。さらに、ヌクレオチドレベルでの配列の相違の程度は、これらのＰＣＲ産物が以前に同定されたＧＢ−Ｃ配列の何れかによる汚染の結果生じたものではないことを示している。これらの個体の内の三つ（ＧＢ−Ｃ．４、ＧＢ−Ｃ．５、ＧＢ−Ｃ．６、およびＧＢ−Ｃ．７源）については、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、またはＣ型肝炎に感染している証拠はなかった。病因が未知の肝炎に罹患している個体におけるＧＢ−Ｃ配列の存在は、ヒト肝炎の原因物質の一つがＨＧＢＶ−Ｃであることを示唆している。個体の内の２つ（ＧＢ−Ｃ．４とＧＢ−Ｃ．５を含んでいる）については経時的試料が利用可能であった。これらの試料中のＨＧＢＶ−Ｃの配列を追跡するために、クローン特異性のＲＴ−ＰＣＲを開発した。即ち、血清から抽出した核酸を、実施例７において行なったようにランダムヘキサマーによって逆転写した。得られたｃＤＮＡを、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒の条件での増幅を４０回行い、その後、伸展を７２℃で１０分行なった。ＧＢ−Ｃ．４とＧＢ−Ｃ．５に特異的なＰＣＲプライマー（ＧＢ−Ｃ．４−ｓ１とＧＢ−Ｃ．４− ａ１、またはＧＢ−Ｃ．５−ｓ１とＧＢ−Ｃ．５−ａ１）を１．０μＭの濃度で使用した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動法により単離し、臭化エチジウムを用いて核酸を直接染色した後、紫外線照射によって可視化し、サザントランスファーでＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロンフィルターに移した後、放射線標識プローブにハイブリダイズした。急性非Ａ−Ｅ肝炎に罹患しているエジプト人の患者の血清においてＧＢ−Ｃ．４が見いだされた。この患者はＨＧＢＶ−Ａタンパクについ血清反応陽性であった（ＨＧＢＶ−ＡＥＬＩＳＡの実施例参照）。このエジプト人の患者から得た５個の一連の試料のＲＴ− ＰＣＲはウイルス血症を示し、これは血清ＡＬＴ値が正常になった後少なくも２０日の間持続した（表２６）。血清ＡＬＴが正常になった後におけるＧＢ−Ｃ配列の存在は、人によっては慢性の感染につながることを示唆した。しかし、この患者の試料はそれ以上は得られなかったため、ＨＧＢＶ−Ｃの慢性化について結論を出すことはできない。この問題を解決するため追加の試料を求めている段階である。ＧＢ−Ｃ．５は、肝炎に関連する再生不良貧血に罹患していたカナダ人の患者から得た。この患者の各試料は、Ｃ．７ＥＬＩＳＡにおいて血清学的に陽性であった（実施例２０）。カナダ人の患者から再生不良貧血の間（症状の顕出後１３日目）および死亡時（１４日目、図４１）において得た試料から、ＧＢ−Ｃ．５特異性のプライマー（ＧＢ−Ｃ．５−ｓ１とＧＢ−Ｃ．５−ａ１）を用いてＧＢ −Ｃ．５を検出した。しかし、ＧＢ−Ｃ．５特異性のＰＣＲは、症状の発生時（０日目、急性肝炎）および３日目（肝不全）においてＧＢ−Ｃ．５配列を検出できなかった。したがって、最初の試料中にＧＢ−Ｃ．５が検出限界以下のレベルで存在していたか否かは不明である。もし、存在していたとしたら、ＨＧＢＶ−Ｃは、その患者の再生不良貧血の原因物質であったであろう。しかし、ＧＢ−Ｃ．５は、再生不良の危期においてのみＲＴ−ＰＣＲによって検出されたため、ＧＢ−Ｃ．５は、貧血の対処のために投与された血液製品から混入したものかもしれない。この場合、再生不良貧血へのＨＧＢＶ −Ｃの関連はＨＣＶと類似したものであろう〔ヒブス（Hibbs ）ら、ＪＡＭＡ、２６７、２０５１〜２０５４（１９９２年）〕。ＨＧＢＶ−ＣとＨＣＶとの関係が遠いことに鑑み、ＨＣＶ感染を検出するための現在の方法により、ＨＧＢＶ−Ｃを含むヒトの試料を認識できるか否かは興味の対象であった。ＨＣＶに暴露または感染した個体の通常の検査法は、ＨＣＶ− １の３つまたはそれ以上の領域から得た抗原を利用する抗体試験によるものである。この試験により、殆どの個体におけるＨＣＶの既知の遺伝子型の全てに対する抗体を検出できる〔サカモトら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５、１７６１〜１７６８（１９９４年）、スチュイバー（Stuyver ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７４、１０９３〜１１０２（１９９３年）〕。ＨＣＶのための第２世代のＥＬＩＳＡを、実施例１０（表２５）に記載されたＨＧＢＶ−Ｃを含む試料に対して実施した。ＨＧＢＶ−Ｃを含む４つの試料の内の一つがＨＣＶ抗原に対して血清反応陽性であった。ＨＣＶに対して血清反応陰性のヒト血清中の限られたものだけが、非常に感度の高いＲＴ−ＰＣＲアッセイにより、ＨＣＶゲノムＲＮＡに対して陽性であることが示された〔スギタニ、１９９２年、＃６５〕。類似のＲＴ−ＰＣＲアッセイ（実施例９に記載されたような）は、血清反応陽性の試料中のＨＣＶウイルス血症の存在を確認した。しかし、血清反応ＨＣＶ陰性の試料にはＨＣＶウイルス血症であるものは存在しなかった。したがって、ＨＧＢＶ−Ｃ配列を含む４つの個体の内の一つはＨＣＶ感染の証拠を有しているものの、ＨＣＶの存在に関する本アッセイは、ＨＧＢＶ− Ｃの存在を正確に予測できなかった。この一人のＨＣＶ陽性の患者はＨＧＢＶ− Ｃにも感染していたようである。この患者の肝炎がＨＣＶ、ＨＧＢＶ−Ｃ、または両方のウイルスの存在によるものであったかは不明確である。同じ患者においてＨＣＶとＨＧＢＶ−Ｃが発見されることは、これらの感染を受ける共通のリスクが存在することを示唆するものであろう。上記のＰＣＲ手順を使用し、１９９４年に２人のボランティアの米国人提供者から得た血液の“正常（normal）”ユニット中に、ＧＢ−Ｃ配列（図４１に示した先のＧＢ−Ｃ分離株と〜８５％相同、データは示していない）を同定した。これらのユニットは、試験の結果ＨＢＶ、ＨＣＶについて陰性であるとされ、正常な血清ＡＬＴ値を有していた。しかし、これらのユニットは１．４ＥＬＩＳＡでの試験の結果、陽性とされた。免疫的にスクリーニングされた〜１０００ユニットの内の少なくとも２つの“正常”血液ユニットにＨＧＢＶ− Ｃが発見されたことは、このウイルスが現在、米国の血液供給に存在していることを示唆している。しかし、我々はＨＧＢＶタンパクから開発されたＥＬＩＳＡおよびＨＧＢＶ配列からのヌクレオチドプローブを使用して、これらの血液ユニットを同定できることを示す。種々のＨＧＢＶ配列（図４１）には、多数の配列のバリエーションがあることに留意しなければならない。ウイルス性の核酸に対するＰＣＲに基づくアッセイは、非常に敏感ではあるものの、オリゴヌクレオチドプライマーとウイルス鋳型との間の配列の一致に依存する。したがって、本研究で利用したＰＣＲプライマーは、種々の分離物において十分保存されていないＨＧＢＶ−Ｃゲノムの領域に位置していたため、試験したＨＧＢＶ−Ｃウイルス血症の試料の全てを、ここで採用したＲＴ−ＰＣＲによって検出できなかったのであろう。ＨＣＶ５’の翻訳されていない領域中に発見されたように〔チャ（Ch a ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９、２５２８〜２５３４（１９９１年）〕、ＨＧＢＶ−Ｃゲノムの良く保存された領域からのＰＣＲプライマーを利用することにより、ＨＧＢＶ−Ｃウイルス血症の試料をより正確に検出できるようになろう。実施例２２．配列の比較と系統的分析ヌクレオチドと予測したアミノ酸配列の比較、即ちアライメントを行なうことによってウイルスの近親性の程度についての情報を得ることができる。ＨＧＢＶ配列と他のウイルスの配列とのアライメントを行なうことにより、配列間の類似性と相同性の程度を量的に評価することができる。この情報は、ＨＧＢＶウイルスの分類のための原理を開発するのに使用できる。一般に、二つのアミノ酸配列の間の類似性の計算は、アライメント中のアミノ酸対の側鎖の間の類似度程度に基づいて行なわれる。類似度は、アミノ酸の側鎖の物理化学的特徴、即ち、寸法、形状、電荷、水素結合の能力、および化学的反応性に基づいている。即ち類似したアミノ酸は類似の物理化学的特徴を備えた側鎖を有している。例えば、フェニルアラニンとチロシンは共に芳香性の側鎖を含んでおり、したがって化学的に類似であると見做すことができる。アミノ酸の化学についての議論は基礎的な生化学の教科書、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、ルバート・スタイヤー（Lu bert Stier）編、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９８８年に見ることができる。整列した２つのアミノ酸配列の間の相同性の計算は、一般的にアライメント中の同一のアミノ酸対の数を計数し、この数をアライメント中の配列の長さで割るという算術計算である。アミノ酸配列のアライメントに使用する方法と同様に、アライメントした２つのヌクレオチド配列の間の相同性の程度の決定は、アライメント中の同一のヌクレオチド塩基対の数を計数し、この数をアライメント中の配列の長さで割るという算術計算である。アラインした２つのヌクレオチド配列の間の類似性の計算は、アライメント中の種々の位置における対になった（即ち、整合した）対の間における遷移および転換に対して時として異なる値を用いる。しかし、一対のヌクレオチド配列間の類似性と相同性の点数は通常非常に接近しており、即ち１〜２％以内である。前に述べたように、ＨＧＢＶ作用物質とＣ型肝炎遺伝子型のアミノ酸配列の間の相同性は限られたものである。ＨＧＢＶ作用物質とＨＣＶとの間の近親性の程度をより精度良く決定するために、ＨＧＢＶ−Ａ、ＢおよびＣの全体的な大きな開放読み枠（ＯＲＦ）の配列、および幾つかの代表的なＨＣＶ分離物の大きなＯＲＦのアミノ酸配列を用いてアミノ酸配列アライメントを行った。さらに、ヌクレオチドレベルにおけるＨＧＢＶ作用物質とＨＣＶの間の近親性の程度は、ＨＧＢＶ−Ａ、ＢおよびＣの全体的なゲノムヌクレオチド配列、および幾つかの代表的なＨＣＶ分離物の全体的なゲノムヌクレオチド配列を用いて決定した。アミノ酸配列とヌクレオチド配列の間のアライメントは、５３７１１、ウイスコンシン州マジゾン、サイエンスドライブ５７５にあるジェネティック・コンピュータ・グループ社から入手可能なウイスコンシン配列分析パッケージ（バージョン８）のプログラムＧＡＰを用いて行なった。ギャップ作成とギャップ延長のペナルティーは、核酸配列のアライメントに対してはそれぞれ５．０と０．３であり、アミノ酸配列の比較に対してはそれぞれ３．０と０．１であった。ＧＡＰプログラムは、アラインされている２つの配列の間の百分率で表した類似性と相同性の程度を計算するために、ニードルマン（Needleman ）とワンシュ（Wunsch）のアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３〜４５３、１９７０年）を使用している。選択された数の主要なＣ型肝炎のウイルス（ＨＣＶ）遺伝子型のヌクレオチド配列とアミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋから入手した。これをそれらの登録番号とともに下記に示す。大きな開放読み枠（即ち推定の前駆体ポリタンパク）の予想されるアミノ酸配列と、上記ＨＣＶ遺伝子型の各々とＨＧＢＶ分離物との間のヌクレオチド配列との間の対毎の比較結果を表２８と２９にそれぞれ示す。各ＨＣＶ分離物の遺伝子型の指定を一番上の行に示す。この遺伝子型の指定は、シモンズ・ピー（Simmon ds，P ）ら（１９９４年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９、１３２１〜１３２４に記載されたＨＣＶ分離物のための命名法に基づく。表２８に示すデータは、ＨＣＶ遺伝子型の間におけるアミノ酸配列の相同性の下限が６９％であることを示している。この値は、シモンズら〔シモンズ・ピー（Simmonds，P ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９、１３２１〜１３２４（１９９４年）〕が示した値に非常に近い。シモンズらは、２つの主要な群からの８個の完全なＨＣＶゲノムのコード化領域を比較して、６７．１％〜６８．６％のアミノ酸配列の類似度を示した。しかし、この著者は、類似度を計算した方法を記載しなかった。この値（６９％）は、ＨＣＶ −Ｊ８と他の主要なＨＣＶ分離物との比較についてオコモト（Okomoto ）ら〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８８、３３１〜３４１、１９９２〕が報告した値にも非常に近い。しかし、これらの研究者も、相同性を計算した方法を述べなかった。ＨＧＢＶポリタンパク配列と各ＨＣＶ遺伝子型との比較は、ＨＧＢＶによってコードされたポリタンパクの配列は、ＨＣＶポリタンパク（表２８）の何れのものに対しても３３％以下の相同性しか示さないことを明らかにしている。ヌクレオチド配列（表２９）の比較により、任意のＨＧＢＶと任意のＨＣＶ分離物との間では最大で４４．２％の相同性があり、これに対し、ＨＣＶの分離物の間では最小でもヌクレオチド配列の相同性が６４．９％である。したがって、ＨＧＢＶ−Ａ、ＢおよびＣとＨＣＶとの間では、そのヌクレオチドと予想されるアミノ酸配列の相同性が、既知のＨＣＶ遺伝子型について確立された相同性の範囲から大きく外れたものであるため、ＨＧＢＶウイルスはＣ型肝炎ウイルスの遺伝子型であると考えることはできない。Ｃ型肝炎ウイルスとＧＢ型肝炎のウイルスとの間の関係は、それらのアラインされたヌクレオチド、推定されたアミノ酸配列（即ち、大きな開放読み枠）、またはこれらの配列の一部について系統的分析を行なうことによって調べることができる。この方法をＣ型肝炎ウイルスに適用したところ、ＨＣＶ分離物の可変性により配列の６つの均等に発散した主グループを描写することが示された〔シモンズ・ピー（Simmonds，P ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３年）７４、２３９１〜２３９９およびシモンズ・ピー(Simmonds，P)ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４年）７５、１０５３〜１０６１〕。この分析の結果、Ｃ型肝炎ウイルスのための命名法が確立された〔シモンズ・ピー(Simmonds，P）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９、１３２１〜１３２４（１９９４年）〕、この命名法では、分離物を配列間の進化論的隔たりに基づいて遺伝子型に分類している。ＧＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスとの間の系統的関係を決定するために、ＮＳ３の推定ヘリカーゼ遺伝子およびＮＳ５Ｂの推定ＲＮＡ−依存ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）内のアミノ酸配列のアライメントを行なった。また、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ内の他のウイルスからの関連する配列、およびヘリカーゼ遺伝子およびポリメラーゼ遺伝子内においてＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅのメンバーに対する進化論的近親性を有することが示されているウイルスもアライメントに含めた〔クーニン・イー・ヴイ(Koonin，E．V.)およびドルジャ・ブイ・ヴイ(Dolia，V．V)（１９９３年）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８、３７５〜４３０、およびクーニン・イー・ヴイ(Koonin，E． V.)（１９９１年）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２、２１７９〜２２０６〕。アミノ酸配列のアライメントは、ウイスコンシン配列分析パッケージ（バージョン８）のプログラムＰＩＬＥＵＰを用いて行なった。アラインされた一対の配列の間の系統的な距離は、ジェイ・フェルセンスタイン（J．Felsenstein）〔フェルセンスタイン・ジェイ（１９８９年）、Ｃｌａｄｉｓｔｉｃｓ５、１６４〜１６６〕のご好意により提供を受けたＰＨＹＬＩＰパッケージ（バージョン３．５ｃ、１９９３年）のＰＲＯＴＤＩＳＴプログラムを用いて決定した。この計算した距離は、プログラムＮＥＩＧＨＢＯＲ（隣接結合設定）を使用して系統図（phylogenetic trees）を組み立てるのに使用した。プログラムＤＲＡＷＴＲＥＥを用いて系統図をプロットした。使用したウイルスの配列とそれらに対応するゲンバンク登録番号を表３１に示す。ヘリカーゼ、ＲｄＲｐ、または完全な大きな開放読み枠内で行なったアライメントのための各ＨＣＶ遺伝子型と各ＨＧＢＶウイルスとの間の旋回距離を、表３２、３３および３４にそれぞれ示す。ＨＣＶ遺伝子型と、ＨＧＢＶウイルスおよび表３０に列挙した他のウイルスとの間で計算した距離は示していない。ヘリカーゼ、ＲｄＲｐ、または完全な大きな開放読み枠配列のアミノ酸アライメントについて作られた系統図を図４２、４３および４４にそれぞれ示す。ＨＧＢＶ−Ａ、ＢおよびＣの、ＮＳ５Ｂ領域内でコードされた、推定ＲｄＲｐと、幾つかのＨＣＶ遺伝子型のＲｄＲｐ、伝染性ウイルス二種、幾つかの代表的なフラヴィウイルス、および幾つかのポジティプストランドのＲＮＡ植物ウイルスとの間でのアミノ酸配列のアライメントは、それらがポジティプストランドＲＮＡウイルスのＲｄＲｐに関連する保存された配列の特色を有することを示した（データは示していない）。類似の分析に基づき、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｂでコードされたヘリカーゼは、これらのポジティプストランドのＲＮＡウイルスのヘリカーゼと著しい相同性を示す（データは示していない）。例外は、ヘリカーゼ遺伝子を保有していないと推定されるＣＡＲＭＶ、ＴＣＶ、およびＭＮＳＶである〔グイレー・エッチ(Guilley，H)ら、（１９８５年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３、６６６３〜６６７７〕。これらの結果は、以前の系統的分析によって示された、これらのウイルスのヘリカーゼとＲｄＲｐ遺伝子のスーパーグループへの関連に鑑みると予期できない結果ではなかった〔クーニン・イー・ヴイ（Koonin，E．V．）およびドルジャ・ブイ・ヴイ（Dolja，V ．V）（１９９３年）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８、３７５〜４３０〕。しかし、ヘリカーゼまたはＲｄＲｐ配列（表３０および３１）の配列に基づくＨＧＢＶ分離物とＨＣＶ分離物の間の系統的距離の調査は、これら２群の間には相当な隔たりがあることを示している。計算された隔たりは、ＨＣＶ遺伝子型の間における近い関係を示し、２つの遺伝子型の間での最大距離は０．３６９６（ＲｄＲｐ距離）である。しかし、ＨＧＢＶ−Ａ、−Ｂ、または−ＣとＨＣＶ群の任意のメンバーとの間のＲｄＲｐから計算された距離は、０．９６０４２〜１．４６２６１である。同様に、任意の２つのＨＣＶ遺伝子型についてのヘリカーゼアライメントから計算された値は０．０４４５５５〜０．１９７０６の範囲であるのに対し、ＨＣＶ群の任意のメンバーとＨＧＢＶ−Ａ、−Ｂ、または−Ｃとの間の距離は０．６９１３０〜０．８７１２０の範囲である。また、ＨＣＶ遺伝子型とＧＢウイルスの完全な大きな開放読み枠の予想されるアミノ酸配列のアライメントは、ＨＣＶ分離物の進化論的隔たりの範囲は狭く（０．１７９１８〜０．３９６４６）、一方、任意のＧＢウイルスと任意のＨＣＶ分離物の間の距離は最小でも１．６８６５０であることを示す。したがって、ＧＢ肝炎ウイルスは、Ｃ型肝炎ウイルスの遺伝子型が示す範囲から外れた進化論的隔たりを示す。ＨＧＢＶおよびＨＣＶの配列の系統的分析は、“ＨＣＶ配列からのＨＧＢＶ配列のダイバージェンスをＨＣＶ配列の間でのダイバージェンスとどの様にして比較できるか？特に、ＨＣＶ配列相互のダイバージェンスよりもＨＣＶ配列からのＨＧＢＶ配列のダイバージェンスの方が少ないのであろうか？”という疑問に答えようとするものである。もしＨＣＶ配列相互のダイバージェンスよりもＨＧＢＶ配列のＨＣＶ配列からのダイバージェンスが小さいとしたら、満足しなければならない条件は、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、および／またはＨＧＢＶ−Ｃの配列が、ＨＣＶ配列の最も距離的に関連する対と同じ程度に、ＨＣＶ配列の少なくとも一つと接近していることである（即ち、任意のＨＧＢＶ配列から任意にＨＣＶ配列までの最小距離は、ＨＣＶ配列の間で観察される最大値と等しいか小さい）。現在の配列データはこの条件を満たしていない。表３１（ＲｂＲｐアライメント）においては、最小ＨＣＶ−ＨＧＢＶ距離は、最大ＨＣＶ−ＨＣＶの距離の２．８３倍であり、表３２においては、最小ＨＣＶ−ＨＧＢＶ距離は、最大ＨＣＶ−ＨＣＶの距離の３．５１倍である。したがって、データは、ＨＧＢＶ配列は、前に特徴づけしたＨＣＶ群のメンバーによってダイバージェンスが制限された群のメンバーであるとする着想を支持するものではない。これらの相対距離は、ブートストラップに基づく試験を用いて調べることができる〔エフロン・ビー（Efron，B．）（１９８２年）、“ジャックナイフ、ブートストラップ、および他の再サンプリング計画”、ＳｏｃｉｅｔｙＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ、フィラデルフィヤ、エルトン・ビー(Elton，B.)およびゴング・ジー（Gong，G.）、１９８３年）“ジャックナイフ、ブートストラップ、およびクロスバリデーションの楽しい研究”Ａｍ．Ｓｔａｔ．３７、３６〜４８〕。ブートストラップサンプリングから得られた結果を表３２に示す。この表は、ＨＣＶ−ＨＧＢＶのダイバージェンス（全てのＨＣＶ−ＨＧＢＶ距離の内の最小値）のＨＣＶダイバージェンス（全てのＨＣＶ−ＨＣＶ距離の内の最大値）に対する比較を示すもので、ＰＲＯＴＤＩＳＴプログラムを用いて計算したＰＡＭ距離に基づいている。配列アライメントにおけるカラムの１０００のブートストラップ再サンプリングにおいて、ＨＣＶ間の最大のダイバージェンスは、ＨＣＶ配列からのＨＧＢＶ配列のダイバージェンスの最小値を越えることは無かった（表３２）。したがって、２つの分離した遺伝子からのコード領域のアライメントに基づく個々の測定においては、ＨＣＶ遺伝子型の遺伝子配列のダイバージェンスの範囲内にＨＧＢＶの配列が入るという例は一つもない。慎重気味に推測するとしても、ＨＧＢＶのためのデータを、ＨＣＶ配列と同じ配列プールから引き出せる可能性は１００，０００に一つ未満である。本研究で利用したＨＣＶ配列が、ＨＣＶ遺伝子型の最も大きくダイバージェンスしたものを代表していると仮定すると、これらの結果は、ＨＧＢＶ−Ａ、Ｂ、およびＣがＨＣＶの遺伝子型でないことを示している。また、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｃの間の関係は、それらのＨＧＢＶ−Ｂに対する関係に比べより近いようであり、これは、ＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ｃが異なったウイルスの系列を代表するものであることを示唆している。同様にＨＧＢＶ−Ｂは、その独自のウイルス系列を代表する唯一のものである。分析されたウイルス配列の間の相対旋回距離は、図４５および４６に示した根のない系統図を調べることによって容易に明らかになる。系統図において枝の長さは進化論的距離に比例している。ＨＣＶウイルスが近い進化論的関係を持つことは明らかであり、分析を行なうにあたりコード化されたゲノム配列の一部を使用するか、ゲノムの全体を使用するかを選択することと一致している（図４４）。ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃと、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅの他のメンバーとの間のダイバージェンスの程度が大きいことは、Ｃ型肝炎ウイルスに最も緊密に関係しているものの、ＧＢ作用物質はＨＣＶの遺伝子型とは考えることはできず、実際にはフラヴィウイルス科内の新しいグループを代表するものであろうことを示している。本発明は、試験試料中におけるＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃの存在を決定するための試薬と方法を提供するものである。本明細書に記載したＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃに特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド（またはその断片）、またはこれらのポリペプチドおよびポリヌクレオチドから産生される抗体は、一般に使用されているアッセイ用試薬と組み合わせることができ、また上記のウイルスに対する抗体を検出するための本アッセイ手順に組み込むことができ、これは本発明の範囲内と考えられるものである。あるいは、本明細書に記載したＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃに特異的なポリヌクレオチドまたはポリペプチド（またはその断片）、またはこれらのポリペプチドおよびポリヌクレオチド（またはその断片）から産生される抗体は、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、およびＨＧＢＶ−Ｃウイルスを検出するためにそれぞれ別個に使用できる。本発明の他の用途または変種は、本明細書の開示を検討すれば当業者にとって明らかなもである。したがって、本発明は添付の請求の範囲のみによって限定されることを意図するものである。 Detailed Description of the Invention Non-A non-B non-C non-D non-E hepatitis reagents and methods of their useBackground of the Invention The present invention is directed to a group of infectious viral agents, particularly those that cause hepatitis in humans. Polynucleotides derived from the crow virus group, and the polypeptides encoded by them Peptides, antibodies that specifically bind to such polypeptides, and such materials. Related to diagnostic agents and vaccines used. Hepatitis is received from a donor by blood transfusion, organ transplantation and hemodialysis. It is one of the most important diseases that can be transmitted to humans. Hepatitis also affects contaminated food and It can also be transmitted by ingestion of water and contact with other people. Viral hepatitis is a unique It contains a group of viral substances that carry the virus gene and replication mode, It is known that hepatitis is induced by varying the degree of liver damage depending on the route. acute Viral hepatitis includes yellow scars, liver tenderness, and aspartate transaminase (A ST), alanine transaminase (ALT) and isocitrate dehydrogena Specific diseases including elevated liver transaminase levels such as Sometimes clinically diagnosed, but clinically apparent There is a possibility that it will not be realized. As a viral hepatitis substance, hepatitis A virus (H AV), hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), hepatitis delta type Virus (HDV), Hepatitis E virus (HEV), Epstein-Baruwi Rus (EBV), and cytomegalovirus (CMV). Donated blood that became available in the late 1960s was converted to HBV surface antigen (HBsA g) specific serum assays to screen for the presence of Giving good results in reducing the incidence of post-transfusion hepatitis (PTH) However, PTH still occurs at a significant rate. H. J. Alter et al.,Ann. Int. Med . 77: 691-699 (1972); J. Alt er,Lancet ii: 838-841 (1975). Researchers Viruses known to cause hepatitis in humans (HAV, HBA , CMV and EBV) cause viral hepatitis regardless of exposure to “non-A non He started looking for a new substance named "Hepatitis B" (NANBH). For example, M. Feinstone et al.,New Engl. J. Med. 292: 767- 770 (1975); Anonymous editor,Lancet ii: 64-65 (1975); B . N. Fields F.F. B. Hollinger and D.M. M. Knipe et al.Virology , Raven Press, New York, pp2239. See 2273 (1990). Multiple episodes of acute NANBH in intravenous drug users; post-transfusion NANBH Innate post-infection latency of acquired patients; chimpanzee cross-attack (cross-c results of the experiment; ultrastructural liver pathological analysis of infected chimpanzees; and And some epidemiological and experimental findings, including differences in resistance to chloroform in simulated patients. Evidence indicates the presence of one or more parenterally infected NANB agents. J. L . Dienstag,Gastroenterology 85: 439-46 2 (1983); L. Dienstag,Gastroenterology y 85,743-768 (1983); B. Hollinger et al.,J. Infect. Dis . 142: 400-407 (1980); Chisa ri's D. W. Bradley,Advances in Hepatiti s Research , Masson, New York, pp. 268-280 (1984); and D.I. W. Bradley et al.J. Info ct. Dis . 148: 254-265 (1983). Serum samples obtained from surgeons who developed acute hepatitis were tamarin (Saguinus). It has been shown that hepatitis is induced by inoculation of the (types). Four tamari All four of them developed elevated liver enzymes within a few weeks after inoculation, It turns out that a substance in the serum of a doctor may have induced hepatitis in tamarin. Various This hepatitis becomes an infectious agent by being serially passaged in non-human primates. Therefore, it was found that the substance was viral, and the filtration experiment showed that this substance was viral. It has been shown. Infectious substances causing hepatitis in the above surgeons and tamarins It was named "GB substance". F. Deinhardt et al.,J. Exper. Med . 125: 673-688 (1967); Dien hardt et al.J. Exper. Med. , Supra; E. Tabor et al.J. Me d. Virol . 5: 103-108 (1980); O. Whiting ton et al.,Viral and Immunological Disease s in Nonh uman Primates , Alan R .; Liss, Inc. , New York, pp. 221-224 (1983). That the GB substance may be a substance which induces NANBH in human, and GB The substance is shown to be unrelated to known NANBH substances studied in various laboratories. However, no definitive and final studies on GB substances are known. However, no viral material has been discovered or characterized molecularly. F. Deinhardt et al.,Am. J. Med. Sci. 270: 73-80 ( 1975); L. Dienstag et al.,Nature264: 260- 261 (1976). Furthermore, E. Tabor et al.J. Med. Virol. , Mentioned above E .; Tabor et al.J. Infect. Dis. 140: 794-797 (1 979); O. Whittington et al., Supra; Karaya nnis et al.Hepatology 9: 186-192 (1989). In earlier studies, GB material was unrelated to any known human hepatitis virus. It was said that. S. M. Feinstone et al.,Science 182: 1 026-10 28 (1973); J. Provost et al.,Proc. Soc. Exp. B iol. Med . 148; 532-539 (1975); L. Melnic k,Intervirology 18: 105-106 (1982); W . Holmes et al.,Nature 243: 419-420 (1973); and , F. Deinhardt et al.,Am. J. Med. Sci. , Above. However , Whether the GB substance is a virus that induces hepatitis infection in humans, or Once activated by B serum, once activated, it can be easily passaged to other tamarins. The question was whether they were potential tamarin viruses that induce hepatitis. Ma In addition, a small part of marmosets inoculated with GB-positive serum did not clinically develop hepatitis ( (4 out of 52, 7.6%), such animals may have innate immunity. Therefore, it was also shown that the GB material could be marmoset virus. W. P . Parks et al.J. Infect. Dis. 120: 539-547 (196 9); P. Parks et al.J. Infect. Dis. 120: 548-5 59 (1969). Morphological studies are unclear, and in one report, immunoelectron microscopy studies. In the survey, the GB substance was found to be the structure of parvovirus. Shown to form an immunocomplex with a size distribution of 20-22 nm, similar to However, other studies have shown that immunopositives obtained from liver homogenates of GB-positive tamarins. 34-36 nm agglomerates with an icosahedral symmetry structure (aggre , and the GB substance is reported to be a calici-like virus. . For example, J. D. Almeida et al.Nature 261: 608-609 ( 1976); L. Dienstag et al.,Nature, See above. Two types of liver, HCV mainly caused by parenteral infection and HEV that is enterally infected A virus that causes inflammation has recently been discovered and reported. For example, Q. L. C hoo et al.Science 244: 359-362 (1989), G.I. Kuo ,Science 244: 362-364 (1989), published European patent application. No. 0318216 (published March 31, 1989), G.I. R. Reyes ,Science 247: 1335-1339 (1990). HCV , Most of PTH that seems to be caused by NANBH substance and suddenly not due to blood transfusion It is involved in many of the sex NANBH. Anonymous,Lancet 335: 1 431-1432 (1990); L. Dienstag,Gastroen terology 99: 1177-1180 (1990); J. A lter et al.JAMA 264: 2231-2235 (1990). NAN in blood supply system by detecting HCV antibody in donor sample 70-80% of BH-infected blood is excluded, but the detection and detection of HCV will Flame infections are not completely prevented. H. Alter et al.,New En g. J. Med . 321: 1494-1500 (1989). Another in the recent literature Hepatitis Substances in PTH and Population Acquired Unrelated to PTH Acute and / or Chronic The question was whether it could be the cause of hepatitis. For example, 1988-1990 Of 181 patients monitored in a prospective clinical specimen survey in France The investigator described 18 PTH cases in total. These 18 patients Thirteen of them were vulnerable to Was negative. For the authors, the potential weight of non-A non-B non-C type substances that cause PTH The necessity was inferred. V. Thiers et al.,J. Hepatology 18: 3 4-39 (1993). 1985-198 Of the 1,476 patients monitored in another study conducted in Germany in 8 , 22 recorded PTH cases were not associated with HBV or HCV infection. T . Peters et al.,J. Med. Virol. 39: 139-145 (1993 ). Substances derived from a new group of unique viruses that cause hepatitis, such as porinuk Reotide, recombinant and synthetic polypeptides encoded therein, such polypeptides Antibodies that bind specifically to peptides and diagnostic agents and vaccines using such substances It would be advantageous to identify and provide an agent. With such substances, acute and / or Or the ability of medical institutions to more accurately diagnose chronic viral hepatitis To detect non-A, non-B and non-C hepatitis in donated blood and organs Would be able to provide safer blood and organs.Summary of the Invention The present invention is selective for the hepatitis GB virus (HGBV) genome or its complement. Or a purified polynucleotide derived from HGBV capable of hybridizing to Fragments of HGBV-A, HGBV-B and HGBV- The amino acid sequence selected from the group consisting of C has a consensus rate (ide) of at least 35%. ntity), more preferably 40% concordance rate, even more preferably 60% concordance rate , Most preferably a polyprotein containing an amino acid sequence with 80% identity Purified polynucleotide characterized by a positive-strand RNA genome containing an encoding open reading frame (ORF) Providing cleotide or a fragment thereof. Furthermore, hepatitis GB virus (HG BGB) from the HGBV capable of selectively hybridizing to the genome or its complement Derived recombinant polynucleotides or fragments thereof are also provided. Wherein said nucleotide encodes at least one epitope of HGBV Sequence and the recombinant nucleotides include HGBV-A, HGBV-B and And an amino acid sequence selected from the group consisting of HGBV-C and at least 35% An open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing an amino acid sequence having a lethality. ) Is included in the positive-strand RNA genome. Such recombinant polynucleotide is recombinant Host cell which is contained in the vector and is transformed with the vector. To achieve. The present invention further comprises the hepatitis GB virus (HGBV) genome. Or a HGBV recombinant polynucleotide containing a nucleotide sequence derived from Fragment contained in a recombinant vector, and Host cell transformed with the above sequence, wherein the sequence encodes an epitope of HGBV. HGBV recombinant polynucleotides or fragments thereof. HG BV recombinant polynucleotides include HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. An amino acid sequence having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive chain R containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing a mino acid sequence Characterized by the NA genome. The present invention is derived from hepatitis GB virus (HGBV). A recombinant expression system comprising an open reading frame of DNA or RNA, said open reading frame Contains the sequence of HGBV genome or cDNA, and the open reading frame is desired Recombinant Expression Systems Operatively Linked to Control Sequences Compatible with Other Hosts In addition, the cells transformed with the recombinant expression system and the cells transformed with the recombinant expression system. Providing a polypeptide produced at least about 8 amino acids in length. The invention further provides hepatitis GB virus (HGBV) polypeptides or flags thereof. Mention preparation, namely HGBV- Amino acid sequence selected from the group consisting of A, HGBV-B and HGBV-C Consistency of at least 35%, more preferably 40%, still more preferably 60. An open reading frame encoding a polyprotein containing an amino acid sequence having a percent identity ( ORF) -containing positive-strand RNA genome characterized by an amino acid sequence or its fragment A purified HGBV comprising a recombinant polypeptide comprising a component is provided. Polyclonal Antibodies and monoclonal antibodies, and at least one hepatitis GB virus (H GBV) fusion polypeptides comprising polypeptides or fragments thereof, eukaryotic Or has an amino acid sequence capable of forming particles when produced in a prokaryotic host A liver comprising a non-HGBV polypeptide and at least one HGBV epitope Particles immunogenic to H. GB (HGBV) infection and HGBV-A, H An amino acid sequence selected from the group consisting of GBV-B and HGBV-C and at least Also reads a polyprotein containing an amino acid sequence with 35% identity Hepatitis GB virus (HG) characterized by a positive-strand RNA genome containing an open frame (ORF) A polynucleotide probe for BV) is provided. At least one hepatitis GB virus (HGBV) epitome An assay kit and method for producing a polypeptide comprising Amino acids selected from the group consisting of GBV-A, HGBV-B and HGBV-C A polyprotein containing an amino acid sequence having at least 35% identity with the sequence Polypeptides characterized by a positive-strand RNA genome containing an encoding open reading frame (ORF) Host cell transformed with an expression vector containing the coding sequence Assay kits and methods comprising cubating are also provided. Furthermore, Testing, including methods using phase, recombinant or synthetic peptides, or probes Methods of detecting HGBV nucleic acids, antigens and antibodies in a sample are also provided. In addition, Chin, hepatitis GB virus (HGBV) infected tissue culture proliferating cells, immune response Immunogen comprising at least one HGBV epitope in a sufficient amount to produce Hepatitis G, which comprises administering to the individual a sex polypeptide or fragment thereof Also provided are methods of producing antibodies to the B virus (HGBV). Furthermore, poly Diagnostic reagent containing nucleotides or polypeptides or fragments thereof Is also provided.Brief description of the drawings Figures 1-12 show the amount of individual tamarin liver enzymes (ALT or ICD) (mU / (ml) is plotted against time (weeks after inoculation). In the graph, ALT CO indicates the cutoff value of ALT, and ICD OD indicates the cutoff value of ICD. It shows the value. here, Figure 1 shows a graph of Tamarin T-1053, FIG. 2 shows a graph of Tamarin T-1048, FIG. 3 shows a graph of Tamarin T-1057, FIG. 4 shows a graph of Tamarin T-1061, FIG. 5 shows a graph of Tamarin T-1047, FIG. 6 shows a graph of Tamarin T-1042, FIG. 7 shows a graph of Tamarin T-1044, FIG. 8 shows a graph of Tamarin T-1034, FIG. 9 shows a graph of Tamarin T-1055, FIG. 10 shows a graph of Tamarin T-1051, FIG. 11 shows a graph of Tamarin T-1038, FIG. 12 shows a graph of Tamarin T-1049. FIG. 13 is a representational difference analysis used to identify clones. 3 shows a flow chart of the steps involved in the conference analysis (RDA). FIG. 14 shows the typical difference between the plasma of tamarins before inoculation and acute HGBV infection. Of the product obtained by analysis (RDA) with ethidium bromide 2.0% agarose gel Show Figure 15 was obtained with the first three subtractions / hybridizations Of genomic DNA, amplicon DNA, and product The autoradiogram of the lot is shown. FIG. 16 is the same autoradiogram as shown in FIG. 15, except that A radiolabeled probe was used. FIG. 17 shows the results of polymerase chain reaction (PCR) amplification products derived from genomic DNA. Shown is a 1.5% agarose gel stained with thidium bromide. Figure 18 shows the results obtained by Southern blot of the 1.5% agarose gel of Figure 17. Shows a tradiogram. Figure 19: RT from normal human serum and pre-inoculation and acute tamarin plasma -Ethidium bromide staining of PCR product shows a 1.5% agarose gel. FIG. 20 shows the oatla obtained on a Southern blot of the same gel shown in FIG. Shows a geogram. 21A and 21B show uninfected tamarin and HGBV infected tamarin. Autoradiography of Northern blots of total cellular RNA extracted from marine liver Indicates rum. FIG. 22 shows that each recombinant polynucleotide isolate is present in contiguous RNA species. FIG. 23A-C show dot plot analysis of nucleic acid sequences. here, FIG. 23A shows a dot blot comparison of HGBV-A; Figure 23B shows a dot blot comparison of HGBV-B; FIG. 23C shows a dot blot comparison of HGBV-A vs. HGBV-B. 24A-B show the following conserved residues. FIG. 24A shows the prediction of HGBV-A, HGBV-B and HCV-1 NS3. Shows conserved residues in the putative NTP-binding helicase domain of constant translation products; FIG. 24B shows HGBV-A, HGBV-B and HCV-1 NS5b. The conserved residues of the RNA-dependent RNA polymerase domain of the putative translation product are shown. 25A-B show CKS fusion protein whole cell lysates. Coomassie stained 10% SDS-polyacrylamide gel is shown. 3 CKS fusions The combined protein is immunoreactive with HGBV-infected tamarin sera. 26 to 30 show the liver fermentation of individual tamarins for 1) hours (weeks after inoculation). Amount of elementary (ALT) (mU / ml) (shown by solid line); 2) CKS-1.7 recombinant tag ELISA absorption value of protein (indicated by black circles connected by a dotted line); 3) CKS-1. 4 ELISA absorption value of recombinant protein (indicated by a white circle connected by a dotted line); 4) C ELISA absorption value of KS-4.1 recombinant protein (indicated by + connected by dotted line) 5) Negative PCR result using the primer of SEQ ID NO: 21 (indicated by a white square) ); 6) Positive PCR results using the primer of SEQ ID NO: 21 (indicated by a square in the middle black) 7) Negative PCR result using the primer of SEQ ID NO: 26 (marked with white diamonds) 8) Positive PCR result using the primer of SEQ ID NO: 26 (diamond in middle black) 9); 9) Inoculation data (indicated by arrowheads). here , FIG. 26 shows a graph of Tamarin T-1048; Figure 27 shows a graph of Tamarin T-1057; FIG. 28 shows a graph of Tamarin T-1061; Figure 29 shows a graph of Tamarin T-1051; FIG. 30 shows a graph of Tamarin T-1034. Figures 31 to 34 show liver enzymes of human test samples for 1) time (weeks after inoculation). Amount of (ALT) (mU / ml) (shown by a solid line); 2) CKS-1.7 recombinant tan ELISA absorption value of protein (indicated by black circles connected by dotted lines); 3) CKS-1.4 Plot the ELISA absorption values of recombinant proteins (indicated by white circles connected by dotted lines) It is the graph which did. here, FIG. 31 shows a graph of patient 101; Figure 32 shows a graph of patient 257; FIG. 33 shows a graph of patient 260; FIG. 34 shows a graph of patient 340. Figure 35 shows conserved residues. here, FIG. 35A shows that Contig. A, Contig. B and HCV-1 N Conserved residues of the putative NTP-binding helicase domain of the putative translation product of S3 are shown; FIG. 35B shows that Contig. A, Contig. B and HCV-1 N Conserved residues in the RNA-dependent RNA polymerase domain of the putative translation product of S5b Show. FIG. 36 shows Nuk of HGBV-A, HGBV-B, HGBV-C and HCV-1. Reotide alignment is shown. FIG. 37 shows the results after hybridizing with a radiolabeled probe derived from GB-C. PhosphoImage (Mol obtained from Southern blot of PCT products of (Electrical Dynamics, Sunnyvale, CA). FIG. 38 shows the nucleotide alignment of HGBV-C with two variant clones. FIG. 39 shows the outline of Contig after the assembly of HGBV-C. FIG. 40 shows the nucleotide alignment of HGBV-C with four variant clones. FIG. 41 shows the results obtained using a radiolabeled probe derived from Canadian patient GB-C.5. Southern block of PCT products produced from Canadian hepatitis patients after bridging Toho's PhosphoImage (Molecular Dynamics, Su (nynyvale, CA). FIG. 42 is a phylogenetic tree generated from the alignment of the helicase domains of the described viruses. Is shown. FIG. 43 shows SCOTT, RNA dependence of the described viruses. 1 shows the phylogenetic tree generated from the alignment of RNA polymerase domains. Figure 44. Alignment of large open reading frames (putative precursor polyprotein) of the described viruses. The phylogenetic tree generated from is shown.Details of the Invention The present invention is a newly identified etiological agent of non-A, non-B, non-C, non-D, and non- Substances that induce hepatitis E, collectively called "hepatitis GB virus" or "HGBV" Provide a characterization method. The present invention provides a method for determining the presence of a HGBV etiological agent, H Infected serum, plasma or liver homogenate from a GBV infected human or tamarin individual Obtaining the etiological nucleic acid produced from the ginate, which has not previously been isolated. Detecting newly synthesized antigens from the genome of rustic substances and comparing them to non-infected individuals Provide a method to select clones that produce products found only in infected individuals . The portion of the nucleic acid sequence derived from HGBV was used to determine the presence of HGBV in the test sample. And as a probe for isolating natural variants. Take A HGBV antigen polypeptide encoded by the sequence within the HGBV genome. Sequences can be obtained, standard for diagnostic tests or Produces polypeptides useful as reagents and / or as components of vaccines You can also. At least one epitope contained within such a polypeptide sequence Monoclonal and polyclonal antibodies against H for which such a nucleic acid sequence is derived for the screening of therapeutic drugs and antiviral substances Useful for isolation of GBV material. Isolation and sequence of other parts of the HGBV genome Determination also uses probes or PCR primers derived from such nucleic acid sequences Therefore, the diagnosis and / or treatment of HGBV is therefore possible. Probe and polypep of HGBV that would be useful as prophylactic and therapeutic agents Cido can be produced. According to one aspect of the invention, a purified HGBV polynucleotide, a recombinant HGB V polynucleotide, recombinant polynucleotide containing sequences derived from HGBV genome Rheotide, a recombinant polypeptide encoding an HGBV epitope, of HGBV A synthetic peptide encoding an epitope or any of the above recombinant polypeptides is included. Recombinant vectors and host cells transformed with such vectors. Provided. These recombinant and synthetic peptides are single They can be used alone or in combination, or they can be used as an HGBV epitope. It can also be used with other substances. In another aspect of the invention, purified HGBV, a purified HGBV-derived polypeptide Preparation, purified HGBV polypeptide, epitope contained in HGBV and immunization Purified polypeptides that include epitopes that are logically identical are provided. In yet another aspect of the invention, engineered control sequences that are compatible with the desired host. Derived from the HGBV genome or HGBV cDNA, which is ligated Recombinant expression system containing an open reading frame (ORF) of DNA, The transformed cells and the polypeptide produced by the transformed cells are provided. Provided. Another aspect of the invention is at least one recombinant HGBV polypeptide, HGB. At least one comprising a sequence derived from the V genome or HGBV cDNA Recombinant polypeptide, at least one recombinant polypeptide comprising an HGBV epitope Peptide, comprising at least one fusion polypeptide comprising HGBV polypeptide . The invention further provides at least one epitope of HGBV For producing a monoclonal antibody that specifically binds to at least one HG Purified preparation of a polyclonal antibody that specifically binds to a BV epitope, and Methods of using such antibodies are provided, including diagnostic, prophylactic and therapeutic applications. In yet another aspect of the invention, the particles are shaped when produced in a eukaryotic host. Non-HGBV polypeptide having a possible amino acid sequence, and HGBV epitope Particles are provided that are immunogenic to HGBV infection, including and. Further provided are polynucleotide probes for HGBV. The present invention is directed to HGBV-derived polynucleotites in suitable containers. A reagent that can be used to detect the presence and / or amount of about 8 or Polynucleotide containing HGBV-derived nucleotide sequence consisting of more nucleotides Reagent containing a reotide probe; presence of HGBV antigen and / or in a suitable container Or a reagent for detecting the amount, which is an antibody against the HGBV antigen to be detected And a presence of an antibody against the HGBV antigen in a suitable container and And / or a reagent for detecting the amount, which is present in the HGBV antigen Contains epitope A kit is provided that includes a reagent that includes a polypeptide. For different assay formats Other kits are also provided by the invention described herein. In another aspect of the invention, at least one HGBV epitope attached to a solid phase Containing a polypeptide and an antibody against HGBV epitope attached to a solid phase And the like. Furthermore, a sequence encoding a polypeptide containing the HGBV epitope is used. A host cell transformed with an expression vector containing the sequence is used to express the polypeptide. HGBV epitope consisting of incubating under conditions that allow development And a HGBV epitaxy produced by the method. Also included in the invention is a polypeptide comprising a taupe. The invention further provides a recombinant or synthetic polypeptide of the invention and an antibody of the invention, Provides assays for use in various formats, all of which may use signal-generating compounds I do. Also provided is an assay that does not use signal-generating compounds to provide a means of detection Is done. All assays described are typically either antigens or antibodies or both. The test sample is contacted with at least one reagent of the present invention. Few At least one antigen / antibody complex is formed and the presence of the complex is detected. Including. Such an assay will be described in detail. Immunogenic peptide containing HGBV epitope or inactivated preparation of HGBV Or a vaccine for treating HGBV infection comprising an attenuated preparation of HGBV, and Uses and / or synthetic recombinant vaccines expressing HGBV epitopes The use of peptides is also included in the invention. These immunogenic pep Combinations of tides can be used (eg, recombinant antigens, synthetic peptides and native widow). The rustic antigen cocktail is administered at the same time or at different times). Among these Some of these can be used alone, or can be supplemented by later giving a separate immunogenic epitope. There are things you can do. Furthermore, the present invention provides a method for producing an antibody against HGBV. Thus, the individual has sufficient amount of HGBV to elicit an immune response in the inoculated individual. Also included is a method comprising administering an isolated immunogenic polypeptide containing an epitope It is. In addition, tissue culture expanded cells infected with HGBV are also provided by the present invention. In yet another aspect of the invention, the unidentified feeling A method for isolating a DNA or cDNA derived from a chromogenic genome is provided. However, the method uses a representational difference analysis. erence analysis, RDA) This will be described later.Definition As used herein, referred to as "hepatitis GB virus" or "HGBV" The term is a viral species that causes non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis in humans. , And attenuated strains or defective interfering particles derived therefrom are generically indicated. this In addition, acute viral hepatitis infected by contaminated food, drinking water, etc. Human contact (including sexual activity, respiratory and parenteral route transmission) or intravenous drug use Also included is hepatitis due to HGBV that is transmitted by the drug. According to the method of the present invention, It is possible to identify an individual who has acquired HGBV. Individually, especially HGBV isolates Notated as "HGBV-A", "HGBV-B" and "HGBV-C". This specification In the book the HGBV genome consists of RNA. HGBV nucleotide sequence and From the analysis of the deduced amino acid sequence, this virus group was identified as the Flaviridae family. Similar to It is clear that it has a genomic organization. Basically, though not absolutely The International Committee based on the similarities tee on the Taxonomy of Viruses Millie of Flavivirus, Pestivirus and Hepatitis C Group It is recommended to consist of three genera. Looking for similarities at the amino acid level, hepatitis G The sequence of the B virus subclone is a little but part of that of the hepatitis C virus. It turns out that it is similar to. The information given here classifies other strains of HGBV Enough to do. There is some evidence that HGBV-C is not a genotype of HCV. ing. First, the presence of HCV antibodies was tested in serum containing HGB-C sequences. Was. Routine detection methods for individuals exposed or infected with HCV are based on HCV-1 origin. It relies on antibody testing with antigens derived from more than two regions of origin. Take The test may detect antibodies to known genotypes of HCV (eg Sak amoto et al.J. Gen. Virol. 75: 1761-1768 (1994) ) And Stuyver et al.,J. Gen. Virol . 74: 1093-1102 (1993)). HCV specific EL ISA failed to detect serum containing GB-C sequence in 6 out of 8 cases Was. Second, some human sera that are seronegative for HCV antibodies have a high R T-PCR assay showed positive for HCV genomic RNA (Sugitani,Lancet 339: 1018-1019 (1992) )). In this assay, HCV was detected in 7 out of 8 sera containing HGB-C sequences. No RNA could be detected (Table A). That is, serological assay and molecular HGBV-C is not a genotype of HCV by any of the assays. Part of the putative translation product of HGB-C in the helicase region was identified as HGBV-A, HGB Homology regions of V-B, HCV-1, and another member of Flaviviridae HGBV-C was found to be a HCV glu It is found to be more closely related to HGBV-A than other members of the group. Evolutionary distance ( Evolutionary distance) HGBV-C showing 0.42 The sequence of HGBV-A is similar to that of HGBV-C and HGBV-B, which show an evolution distance of 0.92. Not far apart (Table 33, below). Immediately HGBV-A and HGBV-C are members of one subgroup of GB virus. And consider HGBV-B to be a member of one subgroup by itself. available. Phylogenetic analysis of helicase sequences from various HCV isolates And they form a small group of branches with a maximum evolution distance of 0.20. It can be seen (Table 32, below). Compare HCV group with HGBV group Then the minimum evolutionary distance of any two sequences from each group is 0.69. I understand. The phylogenetic tree shown in FIG. 42 was created using the above distance values. these Due to the relatively high degree of divergence of the virus, GB virus is simply a hepatitis C group. A unique phylogenetic group rather than a type or subtype within You can see that it will be composed. Sequence information derived from a small part of the HCV virus genome The phylogenetic analysis used showed the acceptance of assigning new isolates to genotype groups. Has been shown to be a possible method (Simonds et al.,Hepatolo gy 19: 1321-1324 (1994)). Recent analysis shows that typical H Using a sequence consisting of 110 amino acids in the helicase gene derived from CV isolate If they do, Appropriately classified into subtypes (Simonds et al.,J. Gen. Virol. 75 : 1053-1061 (1994)). Therefore, the evolutionary distance shown is probably G It correctly reflects the high degree of divergence between B and hepatitis C viruses. In a prior patent application, "HGBV strains are identifiable at the polypeptide level , HGBV strains have a homology of 40% or more at the polypeptide level, preferably about 60% or more. The above is homologous, and more preferably about 80% or more is homologous. " "phase The term "same", although used, refers to two polynucleotides or polypeptides. Ambiguous when it indicates the degree of relatedness of the tide sequence, and actually indicates evolutionary relatedness. It is an incentive. According to recent practice in the art, the term "homology" is no longer Not used, and instead "similarity" and / or "one Two polynucleotides or the term "identity" is used The degree of relatedness of polypeptide sequences is indicated. Amino acid sequence “similarity” and Methods for determining / and “identity” are known in the art and include, for example, Direct determination of the mino acid sequence and comparison or deduction of it with the sequences given herein The nucleotide sequence of the HGBV genomic material Determine (usually via a cDNA intermediate) and determine the amino acid sequence encoded in it. For example, the columns are determined and the corresponding regions are compared. Generally, "match" means each Nucleotide sequence of HGBV and another strain of nucleoside at appropriate places on the genome Cide sequence or HGBV amino acid sequence exactly matches the amino acid sequence of another strain Means to do. In general, "similarity" means that HGBV has an appropriate location. It means that the amino acid sequence of another strain exactly matches the amino acid sequence of Amino acids have the same or similar chemical and / or physical properties, such as charge or charge. Or has hydrophobicity. (The Genetics Computer Gro Up, Madison, Wisconsin, 53711) Wi Sconsin Sequence Analysis Package, bar Two programs depending on the program that can be used in John 8, for example, the GAP program The identity and similarity between two polynucleotides or sequences of two polypeptides. Can be calculated. Other programs that calculate the percent match and similarity between two sequences are also in the field. Is known. Furthermore, HGBV-A, HGBV-B or HGBV-C The following parameters were used alone or in combination in identifying strains of obtain. The HGBV strain is preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more. Since it is considered that there may be a transmissible relationship, HGBV-A, HGBV-B and Is the nucleotide sequence between HGBV-C and one strain of these hepatitis GB viruses. The overall row concordance rate is estimated to be about 45% or greater. Further, the HGBV strain is preferably about 40% or more, more preferably about 60% or more, More preferably, it is considered that there may be a genetic association of about 80% or more, HGBV-A genome and that of a strain of HGBV-A at the amino acid level It is estimated that the overall sequence identity will be about 35% or greater. Furthermore, two or more consecutive Consists of at least about 13 nucleotides, which will be given in the combination of sequences. There is a corresponding continuous array. Also, the HGBV strain is preferably about 40% or more, more preferably Preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more. It is considered that the genome of HGBV-B and the genome of a strain having HGBV-B It is estimated that the overall sequence identity at the amino acid level is about 35% or higher. Change A combination of two or more consecutive sequences The corresponding contiguous sequence of at least 13 nucleotides that would be given by There are columns. The HGBV strain is preferably about 40% or more, more preferably about 60%. % Or more, and more preferably about 80% or more. From the amino acid sequence of the genome of HGBV-C and the genome of a strain with HGBV-C. It is estimated that the overall sequence identity at the bell will be about 35% or higher. Furthermore, two or more At least about 13 nucleotides as would be given in the combination of the above contiguous sequences. There is a corresponding continuous array of code. Proliferation, identification of HGBV and possible strains thereof by the compositions and methods of the invention , Detection and isolation are possible. In addition, the compositions and methods of the present invention provide HGBV Enables the production of diagnostic agents and vaccines against various strains that may exist, It is useful for the screening process of antibacterial substances. Information is provided by the virus taxonomy Will be sufficient to identify other strains belonging to We have identified HGBV as the present specification. I think it encodes the sequences contained in the book. Assay for the presence of such sequences Methods are known in the art, eg ligase chain reaction (LCR), polymer Amplification methods such as Lase Chain Reaction (PCR) and hybridization Is mentioned. Moreover, such sequences may find immunogenic viral epitopes. Including a reading frame. This epitope is compared to other known hepatitis inducing viruses, It is unique to HGBV. Epitope uniqueness is the immunological response to HGBV Sex and lack of immunological reactivity to hepatitis A, B, C, D and E viruses Therefore, it can be determined. Methods for determining immunological reactivity are known in the art , For example radioimmunoassay (RIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELI) SA), hemagglutination (HA), fluorescence polarization immunoassay (FPIA). However, some examples of suitable methods are described herein. Derived from a particular sequence, eg, HGBV cDNA or HGBV genome A "polynucleotide" refers to a region of a particular nucleotide sequence, Similar or complementary, approximately at least about 6 nucleotides, preferably Preferably at least about 8 nucleotides, more preferably at least about 10 nucleotides. 12 nucleotides, more preferably at least about 15-20 nucleotidies Refers to a polynucleotide sequence consisting of the sequence Area that induces polynucleotides The region sequences are unique to the HGBV genome. It is preferably similar or complementary to the columns. Sequence unique to the HGBV genome Whether it is complementary or similar to can be determined by methods known to those skilled in the art. specific As a method to determine the uniqueness of the sequence of, for example, comparison with the sequence in the data bank Can be done. The region from which the sequence can be derived includes, but is not limited to, a specific ept The coding region, as well as the untranslated and / or untranscribed regions. Derivative polynucleotides are not necessarily physically derived from the nucleotide sequence of HGBV. The salt of the region that induces the polynucleotide need not be, but is not limited to. Chemical synthesis, replication, or reverse transcription based on the information provided by the sequence Can be generated by any method, including transcription. Furthermore, combinations of regions corresponding to specific sequences The amount can be changed by a method known in the art depending on the intended use. A "polypeptide" derived from a particular nucleic acid sequence or HGBV genome, or An "amino acid sequence" is an amino acid sequence identical to the polypeptide encoded in the sequence. A polypeptide having an acid sequence, or at least 3-5 amino acids, more preferably Preferably at least 8 to 10 amino acids, more preferably 15 to 20 amino acids. Consisting of a noic acid in the array A portion of said polypeptide which is immunologically compatible with the encoded polypeptide Point to. As used herein, a "recombinant polypeptide" is at least of origin or Or by manipulation of the related polypeptide in its native or library form. Not related to all or part and / or other than those to which it is naturally associated A genomic, semi-synthetic or synthetic polypeptide linked to a polynucleotide means. Recombinant or derived polypeptides are not necessarily specific nucleic acid sequences of HGBV Or need not be translated from the HGBV genome. Recombinant or derived polypeptide From a chemically synthesized or recombinant expression system, or from mutant HGBV It can also be produced by any method, including isolation. The term "synthetic peptide" as used herein is known to those of ordinary skill in the art. By polymeric forms of amino acids of any length, which can be chemically synthesized by the method. Scarecrow Synthetic peptides are useful for various purposes. The term "polynucleotide" as used herein refers to ribonucleo Nucleic acid in polymeric form of any length, either tide or deoxyribonucleotide Means ochido I do. This term refers only to the primary structure of the molecule. The term thus includes double-stranded and single-stranded. It includes single-stranded DNA and double-stranded and single-stranded RNA. Furthermore, methylation and / or Modified or modified by capping, as well as unmodified form of the polynucleotide. Nucleotides are also included. "HGBV containing a sequence corresponding to cDNA" means that HGBV is a specific DNA It is meant to include polynucleotide sequences that are similar or complementary to the sequences within. The The degree of similarity or complementarity to the cDNA is greater than about 50%, preferably at least It is about 70%, more preferably at least about 90%. Corresponding sequence length is small At least about 70 nucleotides, preferably at least about 80 nucleotides, and Preferably it is at least about 90 nucleotides. Correspondence between HGBV and cDNA It can be determined by methods known in the art, eg Direct comparison with the described cDNA or hybridization with single-stranded nuclease Digesting, determining the size of the digested fragments, and the like. "Purified viral polynucleotide" means that the viral polynucleotide is naturally Substantially contains the relevant polypeptide Ie less than about 50%, preferably less than about 70%, more preferably about 9% Refers to the HGBV genome or fragments thereof that does not contain less than 0%. Virus po Methods for purifying a oligonucleotide are known in the art and include, for example, chaotro Use a chaotropic agent to destroy the particles and perform ion exchange chromatography. Polynucleotides by chromatography, affinity chromatography, density sedimentation Separating the octide and the polypeptide may be mentioned. "Purified virus Polypep "Tide" is substantially free of cellular components with which the viral polypeptide is naturally associated. I.e. less than about 50%, preferably less than about 70%, more preferably about 90% By HGBV polypeptide or fragments thereof is meant, which does not include less than. Refining Methods are known to those of skill in the art. As used herein, "polypeptide" refers to a molecular chain of amino acids, It does not refer to a product of a particular length. Therefore, peptides, oligopeptides and Proteins are included in the definition of polypeptide. However, the term Post-expression modifications of peptides such as glycosylation, acetylation, phosphorylation etc. are included Not. "Recombinant host cell", "host cell", "cell", "cell" System "," cell culture ", and microorganisms or higher eukaryotes cultured as unicellular material Other similar terms referring to cell lines are recipes for recombinant vectors or other transferred DNA. Cell that can be or has been used as an It also includes the original progeny of the original cell that was killed. As used herein, a "replicon" refers to a polynucleotide within a cell. A plasmid, chromosome, or virus that behaves as an autonomous unit of replication. Means the genetic element of interest. That is, the replicon replicates under its own control obtain. A "vector" is one in which another polynucleotide segment is replicated and / or expressed. It is a replicon added to obtain. The term "regulatory sequence" directs the expression of the coding sequences to which they are attached. Refers to the polynucleotide sequence required to The characteristics of the control sequences depend on the host organism. different. In prokaryotic cells, regulatory sequences are generally promoters and ribosome binding sites. Positions and terminators, in eukaryotic cells control sequences are generally promoters. , A terminator, and optionally an enhancer. Therefore, "control distribution Line " The term shall include at least all components whose presence is necessary for expression. Furthermore, it may comprise additional components, if present, which are advantageous, for example leader sequences. "Operably linked" is a relationship in which the above components can function as expected. Refers to the situation. Thus, for example, a control "operably linked" to a coding sequence The sequence is designed so that the coding sequence is expressed under conditions compatible with the control sequences. It is connected. The term "open reading frame" or "ORF" refers to a polynucleotide that encodes a polypeptide. Refers to the region of the cleotide sequence. This region can be part or all of the coding sequence. Can be given as a Ding sequence. A "coding sequence" is an mRNA when placed under the control of appropriate regulatory sequences. A polynucleotide sequence that is transcribed into and / or translated into a polypeptide is there. The boundaries of the coding sequence are: the translation initiation codon at the 5'end and the 3'end. It is determined by a certain translation termination codon. Limited coding sequence But includes mRNA, cDNA, and recombinant polynucleotide sequences. You. The term "immunologically identifiable with / as" Is unique to, and unique to, certain polypeptides, usually HGBV proteins. Refers to the presence of certain epitopes and polypeptides. Immunological agreement (id Entity) can be determined by antibody binding and / or competition for binding. Scarecrow Methods are known to those of skill in the art and are described herein. Epitope uniqueness Sex encodes an epitope in known databanks, such as GenBank Computer search for the desired polynucleotide sequence or other known It can be determined by comparing the protein and the amino acid sequence. As used herein, "epitope" refers to an antigenic determinant of a polypeptide. means. Probably the epitope consists of 3 amino acids that are unique to the epitope. It may be included in an interstitial arrangement. Usually the epitope is at least 5 such amino acids And more commonly consists of at least 8-10 amino acids. Spatial arrangement Are known in the art, such as X-ray crystallography and two-dimensional nuclei. Magnetic resonance is mentioned. Since the antibody recognized a specific epitope contained within the polypeptide, When bound, the polypeptide is "Immunologically reactive" with antibodies. Immunological reactivity depends on antibody binding, especially Antibody binding rates and / or known polypeptides containing epitopes for the antibody It can be determined by competition for binding using tide as a competitor. The polypeptide Methods for determining whether immunologically reactive with an antibody are known in the art. It is known. As used herein, "immunogenic polypeptide containing HGBV epitopes. The term "do" refers to native HGBV polypeptides or fragments thereof, as well as By other means, such as chemical synthesis or expression of the polypeptide in a recombinant microorganism. The polypeptide thus produced. The term "transformation" refers to the introduction of a foreign polynucleotide into a host regardless of the method of insertion. Refers to insertion into cells. For example, direct uptake, transduction or f-mating ( f-matting) is included. The foreign polynucleotide is a non-integrated vector, For example, it can be maintained as a plasmid or integrated into the host genome. You can also. “Treatment” refers to prophylaxis and / or medical treatment. The term "individual" as used herein also refers to animals, especially mammalian species. But not limited to livestock, It includes athletics, primates and humans, but in particular the term refers to tamarins and humans. As used herein, "positive chain" (or "+") refers to a polypeptide. Nucleic acid containing the sequence to be encoded. "Negative strand" (or "-") is the sequence of the "positive" strand A nucleic acid containing a sequence complementary to The "positive strand genome" of a virus, whether it is RNA or DNA, is Is single-stranded and encodes a viral polypeptide. A "test sample" is the source of the analyte (eg, the antibody or antigen of interest). Refers to the components of the individual. Such ingredients are known in the art. For inspection sample Include biological samples that can be tested by the methods of the invention, including human and animal body fluids. , Eg, whole blood, serum, plasma, cerebrospinal fluid, urine, lymph, as well as respiratory tract, gastrointestinal tract And various exudates of the genitourinary tract, tears, saliva, milk, white blood cells, myeloma, etc. Include biological fluids such as cell culture supernatants, fixed tissue samples, fixed cell samples. Can be "Purified HGBV" refers to cell constituents to which viruses are normally associated, and infected tissues. Other types of viruses that may be present Refers to a preparation of HGBV isolated from sucrose. Those skilled in the art will know how to isolate the virus. Are known and include, for example, centrifugation and affinity chromatography. . "PNA" is a process, such as an assay that determines the presence of a target. Refers to "peptide nucleic acid analogs". PNA is an RNA target Is an electrically neutral substance for DNA. For example, instead of a DNA probe The PNA probe used in the assay is not available when using the DNA probe. Gives an advantage that is not possible. These advantages include manufacturability, large-scale labeling, and reproducibility. , Stability, insensitivity to changes in ionic strength, and use of DNA or RNA The resistance to enzymatic degradation present in the method used may be mentioned. PNA is Fluo Label with signal-generating compounds such as rescein, radionuclides, chemiluminescent compounds, etc. Can be. Thus PNA can be used in the method instead of DNA or RNA. obtain. Although described herein are assays that use DNA, but are not Use PNA instead of RNA or DNA with appropriate changes to the reagent Is also within the ordinary range.General purpose Specific recombinant proteins, synthetic peptides, or purified viral polypeptides of the invention Once the peptide has been produced, its recombinant or synthetic peptides can be used to transform HGBV into A unique assay as described herein for detecting the presence of an antigen or antibody against Can be developed. Also, using such a composition, the desired immunization of HGBV can be achieved. Recombinant protein or synthetic peptide that specifically binds to a biological epitope Can be used to develop monoclonal and / or polyclonal antibodies You. At least one polynucleotide of the invention has been used in the art. It is also conceivable to develop a vaccine according to known methods. The reagents used in the assay should be the monoclonal antibodies used in the assay. Or a mixture of monoclonal antibodies or (recombinant or synthetic) polypeptide A sample containing one or more containers, each containing a reagent such as a vial or bottle. It is believed that it may be provided in the form of a test kit. Buffers known to those skilled in the art, Any other component may be included in such a test kit. “Solid phase” (“solid support”) is known to those skilled in the art and is well known in the art of reaction tray wells. Wall, test tube, polystyrene beads, Magnetic beads, nitrocellulose strips, membranes, particulates (eg latex particles ), Erythrocytes of sheep (or other animals), duracytes, etc. . The "solid phase" is not limiting and can be selected by a person skilled in the art. That is, latte Particles, particles, magnetic or non-magnetic beads, membranes, plastic tubes, Icrotiter well wall, glass or silicon chip, sheep (or other Erythrocytes of suitable animals), and duracytes are all suitable examples. Pep Suitable methods for immobilizing tide on a solid phase include ionic, hydrophobic and covalent bonds. Interaction and the like. As used herein, "solid phase" means insoluble Or any material that may be rendered insoluble by subsequent reactions. The solid phase is It can be selected for its inherent ability to attract and fix prey. Alternatively, the solid phase can be It may retain a co-receptor that has the ability to attract and fix the prey. Auxiliary The receptor has an opposite charge from the capture agent itself or a charged substance attached to the capture agent. A charged material having Alternatively, the receptor molecule is immobilized (attached) on a solid phase. Is attached to the capture agent and has the ability to immobilize the capture agent through a specific binding reaction. It can also be a specific binding member. The capture agent is solid-phased by the receptor molecule before or during the assay It can be indirectly bonded to the material. Solid phase is plastic, derivatization plus Tic, magnetic or non-magnetic metal, test tubes with glass or silicon surfaces, Icrotiter wells, sheets, beads, microparticles, chips, sheep (or other Suitable animals) erythrocytes, duracytes, as well as other structures known to those of skill in the art. Can be successful. The solid phase has sufficient porosity that the detection antibody is accessible and suitable for binding the antigen. It is also possible that the material is composed of any suitable porous material having a suitable surface affinity. It is within the range of the light. Generally, a microporous structure is preferable, but a gel structure is present in the hydrated state. Materials that do may also be used. Such useful solid supports include natural polymer charcoal hydrates. And their synthetically modified, cross-linked or substituted derivatives such as agar, agarose, Bridged alginic acid, substituted cross-linked guar gum, especially cellulose ester with nitric acid and carboxylic acid. Tellur, mixed cellulose esters, cellulose ethers; nitrogen-containing natural polymers , Proteins and derivatives including, for example, cross-linked or modified gelatin; Limmers such as latex and rubber; suitable porous structures Polymers that can be manufactured to have structures such as polyethylene, polypropylene Vinyl polymers, including vinyl, polystyrene, polyvinyl chloride, polyvinyl acetate, and Its partially hydrolyzed derivatives, polyacrylamide, polymethacrylate, the above poly Copolymers and terpolymers of condensates, such as polyesters, polyamides, and Other polymers, eg polyurethanes or polyepoxides; porous inorganic materials, eg For example, alkaline earth metal and magnesium sulphates or carbonates (eg Um, calcium sulfate, calcium carbonate), alkali and alkaline earth metals, Luminium and magnesium silicates; and aluminum or silicon Oxides or hydrates of eg clay, alumina, talc, kaolin, zeoli Glass, silica gel or glass (these materials are used together with And mixtures or copolymers thereof, such as existing Graft copolymers obtained by initiating the polymerization of synthetic polymers on natural polymers Examples include polymers. All of these materials are films, sheets, or It can also be used in any suitable shape such as a sheet, paper, glass, plastic Such as film or fiber It can also be coated, adhered or laminated to a suitable inert carrier. The porous structure of nitrocellulose is suitable for a wide range of reagents, including monoclonal antibodies. On the other hand, it exhibits excellent absorption and adsorption properties. Nylon has similar properties, Suitable for a beam. The porous solid support as described above has a thickness of about 0.01-0.05. It is considered to be in the form of sheets of mm, preferably about 0.1 mm. Wide pore size The range can be varied, but about 0.025 to 15μ, especially about 0.15 to 15μ Preferably it is. The surface of such a support is covalently bound to the support by the antigen or antibody. It can be activated by a chemical treatment that causes synergism. Generally not well understood Adsorption on the porous material by a strong hydrophobic force prevents the antigen or antibody from being absorbed. Reversibly coupled. Suitable solid supports include US Pat. No. 227,272. It is also described in the book. An “indicator” is an external means attached (attached) to a specific binding member of HGBV. A "signal generator" capable of or capable of producing a measurable signal detectable by "Compound" (label). As used herein, "specific binding member" Is a specific binding pair, that is, one molecule is chemically Or a member of two molecules that specifically binds to a second molecule via physical means Means In addition to being an antibody member of a specific binding pair for HGBV, an indicator Is a hapten-antihapten system, such as biotin or antibiotin, avidin or Is biotin, carbohydrate or lectin, complementary nucleotide sequence, effector Molecule or receptor molecule, enzyme cofactor and enzyme, enzyme inhibitor or enzyme, etc. And The immunoreactive specific binding member is Assigned to HGBV, capture agent in competitive assay, and indirect assay. An antibody, an antigen, or an antibody / antigen complex capable of binding any specific binding member possible. Various possible “signal-generating compounds” (labels) include chromogens, enzyme Catalysts, luminescent compounds such as fluorescein and rhodamine, dioxetanes Chemiluminescent compounds such as, acridinium, phenanthridinium and luminol Objects, radioactive elements, direct visible labels. An example of an enzyme is alkaline phos Fatase, horseradish peroxidase, β-galactosidase, etc. It is. The choice of a particular sign is not limiting, and the sign is by itself. Alternatively, it can generate a signal in combination with one or more other substances. The present invention provides assays that use specific binding members. In this specification A "specific binding member" is a specific binding pair, that is, one molecule is chemically bound. Two different molecules that specifically bind to a second molecule via physical or physical means Members. Therefore, antigen and antibody specific binding of common immunoassays In addition to the pair, other specific binding pairs are biotin and avidin, carbohydrate and lectic , Complementary nucleotide sequences, effector and reporter molecules, cofactors and enzymes. Examples thereof include enzymes, enzyme inhibitors and enzymes. The specific binding pair also contains the original specific binding. Members that are paired analogs, eg, analyte analogs, may also be included. Immune response Sex-specific binding members include those formed by recombinant DNA molecules. , Antigens, antigen fragments, monoclonal and polyclonal antibodies and antibodies Fragments, complexes of these are mentioned. As used herein, The term "puten" is capable of binding to an antibody but not to a carrier protein. Partial antigen or non-protein binding member that cannot otherwise induce antibody formation Point to. As used herein, "analyte" is a detection that may be present in a test sample. It should be a substance. The analyte has a naturally specific binding member (eg, (For example, an antibody) is present or a specific binding member can be prepared against it Can be. That is, the analyte is one or more specific binding members in the assay. A substance that can bind to a bar. As “analyte”, any antigenic substance, ha Examples include butenes, antibodies, and combinations thereof. As a member of a specific binding pair And the analyte can be detected by its natural specific binding partner (pair). , For example, as a member of a specific binding pair, the intrinsic factor Protein, folate-binding protein was used to measure folic acid, and charcoal was used. Lectins are used as members of specific binding pairs to measure hydrates. Subject Substances include proteins, peptides, amino acids, nucleotide targets, etc. No. Other embodiments using various other solid phases are also contemplated and are within the scope of this invention. It is. For example, a co-pending application corresponding to EP 0326100 US Patent Application No. 150,278 and US Patent Application No. 375. 029 (European Patent Application Publication No. 0406473). This article describes an ion trapping method that fixes an immobilizable reaction complex using a loaded polymer. Used according to the invention, free of fast solution-phase Can carry out epidemiological reactions. An immobilizable immune complex is a polyelectrolyte with a negative charge. Of anion / immunocomplex and a pre-treated positively charged porous matrix Separation from the rest of the reaction mixture by ionic interactions, EPO patent application Co-pending U.S. Patent Application No. 921,9 corresponding to Kay 0,273,115 Documents including those described for chemiluminescent signal measurements such as those described in No. 79. It can be detected using the various signal generating systems described. Further, the method of the present invention is an automated and semi-automatic method in which the solid phase is composed of (magnetic or non-magnetic) fine particles. It may also be adapted for use in systems using particulate technology, including automated systems. like this As a system, EPO Patent Application Publication Nos. 0 425 633 and 0 42 U.S. Patent Application No. 425,651, each of which is hereby incorporated by reference. The detailed description and those described in the specification of No. 425, 643 are mentioned. Scanning probe microscope (SPM) for immunoassay When used, the monoclonal antibodies of the invention can be readily adapted. Scanning probe In a microscope, especially an atomic force microscope, the capture phase, For example, by attaching at least one monoclonal antibody of the present invention to a solid phase, Use a probe microscope to detect possible antigen / antibody complexes on the surface of a solid phase . Scanning tunneling microscopy is often used to detect antigen / antibody complexes. Eliminates the need for labels that would normally have to be used in the immunoassay system of. this Such a system is described in pending US patent application Ser. No. 662,147. Peculiar SPM can be used in many ways to monitor dynamic binding reactions. One fruit In one embodiment, one member of the specific binding partner (monochrome of the invention Analyte-specific substance (analogue antibody) is attached to a surface suitable for scanning. Suffered The attachment of the analyte-specific substance can be carried out using a method known to those skilled in the Alternatively, it can be carried out by adsorption on a test piece composed of a solid phase on a metal surface. Alternatively, For test pieces made of derivatized plastic, metal, silicon, or glass solid phase Specific binding partner (analyte-specific substance) can also be covalently bound . Covalent attachment methods are known to those of skill in the art. And various means for irreversibly binding a specific binding partner to the test strip. Trial If the specimen is silicon or glass, before attaching the specific binding partner It is necessary to activate the surface. Triethoxyaminopropylsilane (Sigma a Chemical Co. , St. Louis, MO), Tri Ethoxyvinylsilane (Aldrich Chemical Co., Milw aukee, WI) and (3-mercapto-propyl) -trimethoxysilane ( Sigma Chemical Co. , St. Activities such as Louis, MO) Reactions such as amino, vinyl and thiol using activated silane compounds A sexual group can be introduced. Binding partners using such activated surfaces Can be attached directly (in the case of amino or thiol) and the activity The surface of glyceride is further coated with glutaraldehyde, bis (succinimidyl) suberate, S PPD9 (succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate), SMCC (succinimidyl-4- [N-maleimidomethyl] cyclohexane- 1-carboxylate), SIAB (succinimidyl [4-iodoacetyl] Aminobenzoate) and SMP B (succinimidyl 4- [1-maleimidophenyl] butyrate) The binding partner can also be released from the surface by reacting with the linker. Vinyl group is It can be oxidised to give a means of covalent attachment, or to a specific binding partner. To polymerize various polymers such as polyacrylic acid that can provide multiple attachment points It can also be used as an anchor. Oxidation of various molecular weights on the amino surface It can also be reacted with strans to give hydrophilic linkers of various sizes and binding capacities. it can. As an example of oxidizable dextran, Dextran T-40 (molecule Amount 40,000 daltons), Dextran T-110 (molecular weight 110,00) 0 Dalton), Dextran T-500 (molecular weight 500,000 Dalton) , Dextran T-2M (Molecular weight 2,000,000 Daltons) Available from Pharmacia), or Ficoll (molecular weight 70,0) 00 Dalton) (Sigma Chemical Co., St Louis, (Available from MO). In addition, a US patent pending on January 29, 1988 Permit application No. 150,278 and July 7, 1989 application No. 375,02 Method and chemistry described in No. 9 Using a substance to test for specific binding partners using polyelectrolyte interactions It can also be fixed to the surface of. The preferred method of attachment is by covalent bonding . To minimize non-specific binding after attaching specific binding members The surface may be further treated with serum, protein, or other blocking agent. In order to verify that the surface is suitable for the assay, it should be You may scan with. The scanning method should not change the specific binding properties of the test piece. I do. A variety of other assays, including "sandwich" immunoassays and probe assays. You can use the sey format. For example, the monoclonal antibody of the present invention may be assayed in various assays. Used in the system to determine the presence of HGBV protein in the test sample, if any Can be determined by Fragments of such monoclonal antibodies provided May be used. For example, in high-speed assay formats, solid phase coated poly Lonal or monoclonal anti-HGBV antibody or fragment thereof or Contacting a combination of these antibodies with a test sample that may contain HGBV protein, A mixture is formed. When this mixture is sufficient to form the antigen / antibody complex Incubate between and under conditions. HGB with a signal-generating compound attached A monoclonal or polyclonal antibody that specifically binds to the V region or Of the antigen / antibody complex, including an indicator comprising a fragment of To form a second mixture. This second mixture is used as antibody / antigen / antibody Incubate for a time and under conditions sufficient to form the complex. In inspection sample The presence of HGBV antigen present on the solid phase and captured on the solid phase, if any, By detecting the measurable signal produced by the signal producing compound Is judged. The amount of HGBV antigen present in the test sample depends on the signal generated. Proportional. Alternatively, a polyclonal or monoclonal anti-H bound to a solid support GBV antibody or fragment thereof or combination of these antibodies, and test sample Monochrome with a signal-generating compound attached, which specifically binds to HGBV antigen Internal or polyclonal antibodies or fragments thereof or these antibodies To form a mixture. This mixture is The time and conditions are sufficient to form the antigen / antibody complex. To incubate. HGBV tamper present in the test sample and captured on the solid phase The presence of a protein is a measure produced by the signal-producing compound, if any. It is determined by detecting the possible signals. HGB present in the test sample The amount of V protein is proportional to the signal generated. In yet another assay format, one or a combination of two or more of the present invention may be used. A clonal antibody is used as a competitive progeny for detecting an antibody against the HGBV protein. Can be used as a cable. For example solid phase HGBV proteins alone or in combination Can be coated. Then suspected of containing antibodies to HGBV antigen The test sample is a signal generating compound and at least one monoclonal antibody of the invention. The test sample and the indicator and the solid phase, or the indicator and the solid phase, together with the indicator including , Incubated for a time and under conditions sufficient to form an antigen / antibody complex . The decrease in binding of the monoclonal antibody to the solid phase can be measured quantitatively. Non-A, non-B From non-C, non-D, non-E hepatitis-negative test samples Anti-HGBV antibody in the test sample if a decrease in signal can be measured compared to It turns out that there exists. In yet another detection method, the monoclonal antibody or polychrome of the present invention is used. Each of the null antibodies to H in fixed tissue pieces and fixed cells by immunohistochemical analysis. It can be used for the detection of GBV antigens. Such antibodies are directly labeled (fluorescein, Colloidal gold, horseradish peroxidase, al Potassium phosphatase, etc.) or (using the various labels exemplified herein) ) Cytochemical analysis that tracks the history of disease by labeling with a second labeled anti-species antibody It is within the scope of the present invention. In addition, the monoclonal antibody is similar to CNBr-activated Sepharose Specific HG that binds to cells and is derived from cell cultures or biological tissues such as blood and liver Used for affinity purification of BV protein, recombinant or native virus HG BV antigens and proteins can also be purified. The monoclonal antibody of the present invention is useful for the production of chimeric antibodies for therapeutic purposes and other It can also be used for similar purposes. Monoclonal antibodies or fragments thereof for detecting HGBV antigen Can be provided individually. The monoclonal antibodies provided herein (and A combination thereof) with at least one anti-HGBV antibody of the invention. Each in a mixture or "cocktail" with antibodies to other HGBV regions Can be used together as a component with binding specificity. That is, this cocktail is H In addition to the HGBV genome, the monoclonal antibody of the present invention against GBV protein Other Monocloners for Antigenic Determinants Antibody. Polyclonal antibodies or fragments thereof that can be used in such assay formats To the specific HGBV region or other HGBV protein used in the assay. It should bind specifically. The polyclonal antibody used is of mammalian origin. Preferably human, goat, rabbit or sheep anti-HGBV polyclones. Internal antibodies may be used. Most preferably, the polyclonal antibody is rabbit polyclonal. Ronal anti-HGBV antibody. The polyclonal antibody used in the assay is It can be used alone or as a cocktail of polyclonal antibodies. Used for assay format Cocktails are monoclonal antibodies or polys with different HGBV specificities. Since they consist of either clonal antibody, they are useful for diagnosis, evaluation and And prevention, and to study the differentiation and specificity of HGBV proteins. Uses synthetic, recombinant or natural peptides common to all HGBV viruses That the HGBV group of viruses may be detectable in the assay Are considered and are within the scope of the invention. HGBV-A, HGBV-B, HGBV- C, as well as various proteins from other HGBV viruses. Various synthetic, recombinant or natural peptides that identify pitopes are used in the assay format. It is also within the scope of the invention that it can be used. In the latter case, coating them on one solid phase Alternatively, each peptide may be coated on a separate solid phase, such as microparticles, and They can be combined to form a mixture of peptides that can later be used in the assay. Yes. Such assay format variations are known to those of skill in the art and are described below. In another assay format, the presence of antibodies and / or antigens to HGBV Can be detected in a simultaneous assay as follows. The test sample is attached to the solid phase A first analyte capture agent comprising a first binding member specific for the first analyte, and A second analyte comprising a first binding member for the second analyte attached to the second solid phase. Simultaneous contact with the analyte capture agent thereby forming a mixture. This mixture Form a capture agent / first analyte complex and a capture agent / second analyte complex Incubate for sufficient time and conditions to complete. Formed in this way The complex is bound to the first analyte-specific binding pair labeled with a signal-generating compound. The indicator containing the member and the second analyte labeled with the signal-generating compound Contains members of a heterogeneous binding pair Contact with an indicator to form a second mixture. This second mixture is added to the capture agent / first Form analyte / indicator complex and capture agent / second analyte / indicator complex Incubate for sufficient time and conditions to allow Presence of one or more analytes Is one of the indicators of the presence of one or more analytes in the test sample. Or detects signals generated in relation to complexes formed on both solid phases It is determined by In this assay format, derived from a human expression system Protein derived from a mammalian expression system as described herein. It can be used similarly to the monoclonal antibody produced from the cytoplasm. Such assay system Is a pending U.S. patent application corresponding to European Patent Application Publication No. 0473065. 07 / 574,821, the title of the invention "Simultaneous As say for Detecting One Or More Analyze es ". In yet another assay format, recombinant proteins and / or synthetic peptides are used. Can be used to detect the presence of anti-HGBV in the test sample. For example, Attached at least one recombinant protein or synthetic peptide Incubate with solid phase. To form the antigen / antibody complex React for sufficient time and conditions. After incubation, antigen / antibody complex Is detected. Indicators can be used to facilitate detection depending on the assay system chosen . In another assay format, test samples are prepared as described herein. Contacted with the solid phase having the recombinant protein or synthetic peptide attached thereto, More preferably, it is labeled with an indicator and is specific for the protein. Contact with reclonal antibody. Sufficient time for the antibody / antigen complex to form And after incubation under conditions, the solid phase is separated from the free phase and the HGBV antibody The label as an indicator of presence is detected in the solid or free phase. Tamper of the present invention Other assay formats using cellular quality are also envisioned. To them, the inspection sample Contact with a solid phase having at least one antigen derived from a source, solid phase and test Incubate the sample for a time and under conditions sufficient to form the antigen / antibody complex. Labeled antigen derived from a second source different from the first source and then the solid phase Including contact with. For example,E. FIG. coliDerived from a primary source such as Capture the recombinant protein on the solid phase Used as a source, the test sample is added to the solid phase thus prepared, (IeE. FIG. coliOther than) as a part of the indicator To use. Similarly, combine the recombinant antigen on the solid phase with the synthetic peptide in the indicator phase. It can also be done. An antigen specific to HGBV derived from the first source is used as a capture antigen Assays Using and Using Antigens Specific to HGBV from Different Second Sources The format is also conceivable. Various combinations of recombinant antigens, as well as synthetic peptides and purified viruses. The use of loose proteins is included in the scope of the present invention. Such an assay that Others are described in US Pat. No. 5,254,458 in the name of the Applicant, Is hereby incorporated by reference. In other assay systems, HG containing the viral genome (or fragment thereof) Antibodies and viral proteins specific for BV virus particles or subvirus particles Specific binding by contact with (peptide etc.) (polyclonal, monochrome (Natural or natural) antibody is used. The captured particles are then Is analyzed by a method such as PCR, and whether the viral genome is present in the test sample You can judge whether. A test that can be analyzed according to the method Examples of the test sample include blood, liver, sputum, urine, feces, saliva and the like. Such antigen capture The advantage of using the catch amplification method is the use of specific antibodies to determine the viral genome in the test sample. Can be separated from other molecules. Such a method is described in pending US patent application no. 8 / 141,429. Although the present invention has been described in the case of using a solid phase, the antibody and protein of the present invention have been described. Reagents such as peptides and peptides could also be used in non-solid phase assay systems. You. Such assay systems are known to those skilled in the art and are also within the scope of the invention. AndMaterials and methods General method Unless otherwise stated, the practice of the present invention may include molecular biology, microbiology, recombinant DN. A. Well-known techniques and methods conventional in the field of A and immunology are used. This Such techniques are detailed in the literature. For example, J. Sambrook et al.Mole color Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spri ng Harbor, N.N. Y. (1989); N. Glo ver version,DNA Cloning, Volumes I and II(19 85); J. Gait edition,Oligonucleotide Synthese sis , (1984); D. Edited by Hames et al.,Nucleic Acid Hybridization , (1984); D. Edited by Hames et al.,Tra nscription and Translation , (1984); I. Freshney edition,Animal Cell Culture, (198 6);Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986); Perbal,A Practical Gu idea to Molecular Cloning , (1984); Series ,Methods in Enzymology, Academic Pres s, Inc. J., Orlando, Florida; H. Miller et al.,Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.M. Y. (1987); Wu et al., M. methods in Enzymolog y, Vol. 154 and 155; edited by Mayer et al.,Immunological Methods In Cell and Molecular Biolo gy , Academic Press, London (1987); Scope s,Protein Purification: Principles an d Practice 2nd Edition, Springer-Verlag, N .; Y. ; And D.I. Weir et al.,Handbook Of Experimental Immunology , Vol. I-IV (1986); Lisitis yn,Science 259: 946-951 (1993). The reagents and methods of the present invention provide improved representative difference analysis as described herein. Thus isolated plasma, serum or serum of an HGBV infected individual, either tamarin or human. Or a group of highly related nucleotide sequences present in liver homogenate. It becomes feasible by doing so. This group of nucleotide sequences is Not hybridize to genomic DNA or tamarin genomic DNA, HGBV infected individuals Presence only in the liver (or liver homogenate), plasma or serum of the body, and And because it does not exist in GenBank, It is not of human or tamarin origin. Furthermore, the sequences are HAV, HB Sequences that are significant within the V, HCV, HDV and HEV genomes and that are significant at the nucleic acid level. The level of concordance is so low that it is not considered significant even for translation products. HGB Infectious sera, plasma or liver homogenates derived from V-infected humans are Includes tide sequence, but does require serum, plasma or liver homogenate from uninfected humans Does not contain an array. Infected livers containing some of these polynucleotide sequences Blot analysis revealed that they were large RNAs of similar size to the viral genome. It can be seen that it is derived from the transcript. Serum, plasma from humans infected with HGBV or Is from an uninfected human, although the liver homogenate contains an antibody that binds to this polypeptide Serum, plasma or liver homogenate of is free of antibodies to this polypeptide, Such antibodies elicit in individuals after acute non-A, non-B, non-C, non-D and non-E infection Have been. Based on these, the sequences are non-A, non-B, non-C, non-D and non-E. Possibly a viral sequence that causes or is associated with hepatitis C . By using this nucleic acid sequence group, non-A, non-B caused by HGBV infection can be obtained. Diagnosed with non-C, non-D, non-E hepatitis Screen blood donors, donated blood, blood products and individuals for infections DNA probes and polypeptides that are useful in doing so can be constructed. For example , From the sequence, eg virus in the serum of a subject suspected of carrying the virus Hybridization probes or PCR probes to detect the presence of the genome It is useful as a limer, and also the presence of virus in blood donated DNA of about 8 to 10 or more nucleotides useful for Gomer can be synthesized. It is generated by the nucleic acid sequence group when HGBV is infected. A HGBV-specific polypeptide useful as a diagnostic reagent for the presence of Total and manufacturable. An antibody to a purified polypeptide derived from the nucleic acid sequence It can also be used to detect viral antigens in infected individuals and blood. Take As a vaccine against HGBV with nucleic acid sequences and for producing antibodies It becomes possible to design and produce a polypeptide which can be used, and then Can be used for disease prevention and / or treatment of HGBV infected individuals. Such nucleic acid sequences also allow for further characterization of the HGBV genome. You. Poly derived from such sequences Separate duplicate genomic or cDNA libraries using nucleotide probes Screening for nucleic acid sequences and using it to obtain overlapping sequences Can be. Even if the genome is segmented, the segments lack consensus sequences If not, this method can be used to obtain whole genome sequences. However, if the genome is segmented, RDA cloning as described. Iterating process is repeated to modify as described below, or λ-gt11 is modified as described below. Repeat the serological screening process to isolate the clones described below, or , Other segments of the genome by isolating the genome from purified HGBV particles Can be obtained. CDNA sequences and polypeptides derived from the above sequences, as well as such polypeptides Antibodies to peptides are also useful for isolating and identifying HGBV causative agents. For example HGBV epitope contained in a polypeptide derived from such a nucleic acid sequence Antibodies against were used in an affinity chromatography-based method to Rus can be isolated. Alternatively, the antibody may be used and the Irus particles can also be identified. In the isolated virus particle Viral antigens and genomic material can be further characterized. Further sequencing the HGBV genome, further characterizing the HGBV antigen And induced by HGBV by information obtained by characterizing the genome For the diagnosis, prevention and treatment of non-A, non-B, non-C, non-D, non-E hepatitis Alternative probes and polypeptides that can be used for screening blood stained and blood related products Peptides and antibodies can be designed and synthesized. Antigens, antibodies and polynucleotides derived from the genome from which such nucleic acid sequences are derived If a probe for HGBV containing reotide is obtained, the biological properties of HGBV It allows the development of tissue culture systems that are specifically used for characterizing. Once Once this is known, anti-virus that preferentially inhibits HGBV replication or its infection. It is believed that new therapeutic methods could be developed based on rustic compounds. One method used to identify and isolate the etiological agent of HGBV is described in N. Li sitsyn et al.Science. 259: 946-951 (1993) A known method known as Reproducibility Difference Analysis (RDA) as reported The GB substance was cloned / isolated by a modified method. This method is a deduction hybrid Based on the principle of quantification, the DNA differences between two complex mammalian To roast. In summary, this method uses two test genomes (corresponding target "Tester" (including the sequence) and "Driver" (corresponding to normal DNA) Distinctly. The description of Lisitsyn et al. For RDA is similar to complex DNA. Limited to identifying and cloning DNA differences between backgrounds. this These differences are present in particular cell lines, blood, plasma or tissue samples and are non-infectious. Any large DNA virus absent in the cystic system, blood, plasma or tissue samples (eg ≧ 25,000 DNA base pairs). HGBV is ≤10,000 bases Shown in the prior literature to be a small virus containing the DNA or RNA genome of The RDA protocol has been modified to detect small viruses. . The main steps of the method are described below and shown in FIG. In summary, Step 1 uses a commercial kit to collect all nucleic acids (DNA and RNA) To isolate. RDA requires that the samples be highly consistent. Ideal In the tes Target and driver nucleic acid samples should be obtained from the same source (animal, human, etc.) . If highly relevant, use non-identical materials as tester and driver nucleic acid sources May be used. Randomly initiated reverse transcription of RNA followed by random Double-stranded DNA is produced from all nucleic acids by DNA synthesis initiated by. This process Double-stranded single-stranded RNA virus and single-stranded DNA virus can be used for RDA It is converted into a DNA molecule. Unknown virus is one of DNA or RNA genome DNA alone or RN as described in the literature. The A-only extraction procedure can be used to generate double-stranded DNA. In step 2, tester and driver nucleic acids are amplified, pre-inoculated and infectious plasma source A large amount of material (ie tester amplicons and Liver amplicon). This is a restriction enzyme with a 4 bp recognition site. Double-stranded DNA prepared as above with a donase (eg Sau3AI) Reached by cleaving. The DNA fragment was added to the oligonucleotide Connect to the cable (set # 1). End-fill with a DNA fragment to increase PCR Width. After PCR amplification, oligonucleosides Tide adapter (set # 1) with restriction endonuclease digestion (eg Sau3 Large amount to be removed by AI) and subsequently used in the subtractive hybridization method The tester and driver nucleic acids of. The purpose of the stage 3 experiment is to integrate DNA unique to the tester genome. This combines subtractive hybridization and dynamic integration as a single step Can be reached by In summary, the oligonucleotide adapter set (# 2 or # 3) is ligated to the 5'end of the tester amplicon. Tester ampli Mixture and excess driver amplicons are mixed, denatured and hybridized for 20 hours. Let it ize. Large numbers of sequences commonly conserved between tester and driver DNA Anneals during this time. In addition, the sequence unique to the tester apri To However, due to the limited hybridization time, some The single-stranded tester and driver DNA remain. In step 4, the 3'ends of the reannealed tester and driver DNA were labeled. Fill with thermostable DNA polymerase at elevated temperature as described in. tester A reannealed sequence unique to A was linked on both strands of the annealed sequence. Including adapter. Thus the 3'end filling of these molecules results in two DNA strands. A sequence complementary to the PCR primer is generated above. Therefore, these DNA species Is exponentially amplified when subjected to PCR. In contrast to this, testers and dry A relatively large amount of hybrids containing sequences that are commonly conserved between bar amplicons Offspring (ie one strand is derived from the tester amplicon and one strand is a driver amplicons (Derived from the precon) is linearly amplified by PCR. This is (tester 3'end including adapter sequence in which only strands (from amplicon) are linked Sequence complementary to the PCR primer on the strand whose packing is derived from the driver adapter This is because it only occurs. In step 5, PCR was used for 10 amplification cycles to quantitatively determine the double-stranded DNA of interest. Increase the amount. The reannealed tester array increased exponentially as described in step 4. Conserved sequences that are wide and commonly conserved between tester and driver anneals are linear Is amplified to. In step 6, 1 using mung bean nuclease as described in the literature The remaining single-stranded DNA is removed by double-stranded DNA nuclease digestion. In step 7, the double-stranded DNA remaining after nuclease digestion is further supplemented by 15-25 Uccle PCR amplification. Finally, in step 8, these DNA products are cleaved with restriction endonucleases Remove the ligonucleotide adapter. Then, these DNA products are Steps using oligonucleotide adapters that were not used in the Uccle RDA Start on floor # 3) for next round of amplification or Clone and analyze further. The RDA method is a modification of the reproducibility difference analysis known to those skilled in the art. Pre-inoculation and infection The method was modified to isolate viral clones from a sex serum source. These variants Is described below for the preparation of tester and driver DNA amplicons. . First of all, the starting material is the genomic DNA of mammalian cells as previously reported. Infectious pre-inoculated biological blood sample obtained from tamarin, not double-stranded DNA obtained from A. It was the total nucleic acid extracted from the sample. Other biological samples (eg organs, tissues, gall) Juice, feces or urine) as a nucleic acid source for testers and driver amplicons May be generated. Second, the amount of starting nucleic acid is more substantial than described in the literature. Is a small amount. Third, a restriction endonuclease having a 4 bp recognition site instead of 6 bp Lease was used. This is substantially different from the prior art. Lisitsyn et al. In accordance with the teachings of It is effective because it reduces the degree of complexation of (ie deducted) DNA. In the prior art, the genome was fractionated using a restriction enzyme having a 6 bp recognition site. . These restriction endonucleases cleave about every 4000 bp. On the other hand, conventional Under the PCR conditions described in the art, the amplification dimension of the sequence is <1500 bp. Therefore, a complex species (for example, a gel) of DNA fractionated with a restriction enzyme that recognizes a 6 bp sequence is used. No.) subsequent PCR amplification results in size ≦ 1 after restriction endonuclease digestion. An amplicon containing a fraction of 500 bp of DNA is produced. RDA This reduction in DNA complexity is necessary for the hybridization step to be performed effectively. It is reported that (estimated to be 10-50 times) is necessary. Low complexity Otherwise, unique sequences in the tester will hybridize effectively during the subtraction step Therefore, these unique sequences could be indexed during subsequent PCR steps of RDA. Amplified Not done. Isolates relatively small viruses when the complexity of nucleic acid sequences undergoing RDA decreases It is difficult to use RDA to do this. Two 6bp recognitions within 1.5kb of each other The probability of a site being present is fairly low, so small (≤10 kb) viruses can be isolated. It may not work (Table 1). On the other hand, the present inventors have shown that the restriction If the RDA test DNA is to be fractionated using endonuclease, a small virus It was found that RDA is useful for cloning the clones. As shown in Table 1, 4b The amplicons based on the p-recognition site enzyme have a 4 bp recognition site about every 250 bp. Any small, such as a restriction endonuclease with fragmented DNA The virus almost certainly contains several fragments. On the other hand, almost all DNA species All are <1500 bp after digestion with 4 bp recognition restriction endonuclease ie Because it is PCR-amplified, an amplicon will be as complex as the nucleic acid source from which it was generated. Seems reasonable. Relative viral sequence copy number refers to any specific or internal sequence It is expected that there will be more than the number of pe The Ils sequence forms a double-stranded molecule during the hybridization step (step 3 above) It should be possible. Therefore, these sequences are exponentially amplified as described above. Relative viral sequence copy numbers approaching background or endogenous nucleic acid sequence copy numbers Since it recognizes overlapping 6 bp sequences (eg BstYI or HincII) and Use a restriction endonuclease that cleaves every 1000 bp, or A few restricted end-nuks that recognize columns Rease can be used simultaneously to fractionate DNA before amplification by PCR Be inferred. Thus eliminating the viral sequences from the tester amplicon The amplicon undergoing RDA is moderately reduced in complexity while minimizing risk. Can be made. The utility of this method is the infectious tamarins described herein. Demonstrated by cloning the HGBV sequence from plasma.Immunoscreens for identifying HGBV immunoreactive epitopes Immunoscreening, as described below, also performed additional additions to identify HGBV sequences. It was a means. Criteria within the following parameters with acute or chronic HGBV infection Use individual serum, plasma or liver homogenates or pools from matched individuals. To isolate viral particles. Genome live with nucleic acids isolated from these particles As a template for the construction of cDNA libraries for rally and / or viral genomes To use. The putative HGBV particles were isolated and known to those skilled in the art as λ-gt11 or the like. Used to construct genomic and / or cDNA libraries on similar systems The procedure for this will be described below. λ-gt11 is a fusion protein with β-galactosidase. Specific expression of the inserted cDNA as a lipid peptide and Vector developed for screening large numbers of recombinant phages It is. λ-gt11 cDNA generated from a cDNA pool containing cDNA A library with sera from non-A, non-B, non-C, non-D and non-E hepatitis history individuals Screen for coding epitopes capable of specifically binding . V. Hunyh et al. Glover,DNA Cloning Tech Niques; A Practical Approach , IRL Pre ss, Oxford, England, pp. 49-78 (1985). I want to be About 10⁶-10⁷Individual phages to identify positive phages , After purification, tested the specificity of binding to serum from each individual previously infected with HGBV material. To test. For patients who meet the criteria below and do not meet these criteria Phage that selectively bind non-existent serum or plasma are suitable for subsequent testing. is there. By using the method of isolating overlapping nucleic acid sequences, addition of A clone containing the specific upstream and downstream HGBV sequences is obtained. Within the isolated clone Of the HGBV nucleic acid sequence to be encoded Analyzing the octido sequence to determine if the composite sequence contains one long continuous ORF . Sequences recovered from HGBV sequences as described herein (and their complements) ) And sequences or any part thereof may be prepared using synthetic methods, Combining synthetic methods with partial sequence recovery using a method similar to that described in May be prepared. This description describes the genome corresponding to the complete HGBV genome or It relates to a method by which the cDNA sequence can be isolated. However, these Other methods for isolating the rows will be apparent to those of skill in the art and are considered to be within the scope of the present invention. Done.Strain deposit Replication strains from the HGBV nucleic acid sequence library (clones 2, 4, 10, 16, 18, 23 and 50) are 1 as of February 10, 1994 under the Budapest Treaty. 2301 Parklawn Drive, Rockville, Maryla American Type Culture Co located at nd 20852 30 years from the date of deposit, 5 years from the latest request for sample distribution Or the duration of the U.S. patent, whichever is longer. It is. The above deposited strains and all other deposited materials described herein are provided for convenience. However, it is not necessary to practice the invention in light of the teachings herein. The HGBV cDNA sequence in all deposited material is incorporated herein by reference. . The plasmid has the following A. T. C. C. I was given a deposit number. Clone 2 is A . T. C. C. Deposit no. 69556, clone 4 is A. T. C. C. Deposit number 6 9557, clone 10 is A. T. C. C. Deposit Number 69558, Clone 16 Is A. T. C. C. Deposit no. 69559, clone 18 is A. T. C. C. Deposit No. 69560, clone 23 is A. T. C. C. Deposit number 69561, Claw 50 is A. T. C. C. Deposited number 69562. Replication strains from the HGBV nucleic acid sequence library (clones 11, 13, 48 and 119) is 12301 P as of April 29, 1994 under the Budapest Treaty. arklawn Drive, Rockville, Maryland 208 American Type Culture Collecti located at 52. 30 years from the date of deposit, 5 years from the latest request for sample distribution, or the United States Patent Will be retained for the longest of the lifetimes of In the above-mentioned deposited strain and this specification All other deposited materials described are provided for convenience only and are not incorporated into the teachings herein. In view of this, it is not necessary for implementing the present invention. HGBV cDN in all deposited materials The A sequences are incorporated herein by reference. The plasmid has the following A. T. C . C. I was given a deposit number. Clone 11 is A. T. C. C. Deposit number 696 13, clone 13 is A. T. C. C. Deposit number 69611, clone 48 is A . T. C. C. Deposit no. 69610, clone 119 is A. T. C. C. Deposit number No. 69612. Additional strains from the HGBV nucleic acid sequence library (clone 4-B1.1, 66 -3A1.49, 70-3A1.37 and 78-1C1.17) are Budapest strips. 12301 Parklawn Dri as of July 28, 1994 Ameri, Ve, Rockville, Maryland 20852 deposited at can Type Culture Collection, 30 years, 5 years from the latest sample request, or the duration of the US patent Either is stored for the longest period. Above The deposits and all other deposited materials described herein are provided for convenience only, It is not necessary to practice the present invention in light of the teachings herein. Of all deposited materials The HGBV cDNA sequence is incorporated herein by reference. The plasmid is The following A. T. C. C. I was given a deposit number. Clone 4-B1.1 is A. T . C. C. Deposit no. 69666, clone 66-3A1.49 is A. T. C. C . Deposit no. 69665, clone 70-3A1.37 is A. T. C. C. Deposit number No. 69664, clone 78-1C1.17 is A. T. C. C. Deposit number 696 63 was awarded. Clone pHGBV-C Clone # 1 is 1994 1 under the Budapest Treaty 12301 Parklawn Drive, Rockville as of January 8 e, American Type Cu, Maryland 20852 The latest sample deposited for 30 years from the date of deposit Storage for 5 years from the request for sale or the term of the US patent, whichever is the longest. Is done. The above deposited strains and all other deposited materials described herein are presented for convenience. And is not necessary to practice the invention in light of the teachings herein. . pHGBV-C Clone # 1 is A. T. C. C. Deposited number 69711. All deposited materials The HGBV cDNA sequence therein is incorporated herein by reference.Preparation of viral polypeptides and fragments Availability of a nucleic acid sequence allows the polypeptide to be encoded on either strand It is possible to construct an expression vector encoding the antigenic active region of These anti The original active region is, for example, a polynucleotide binding protein or a polynucleotide Melase and other viruses required for viral particle replication and / or assembly In addition to the non-structural region of the virus containing proteins, for example, the envelope (coat) Alternatively, it may be derived from the structural region of the virus which contains the core antigen. The desired polypeptide Is a genomic or cDNA fragment produced by conventional restriction digestion or synthetic methods. Obtained from a clone, for example β-galactosidase (β-gal), Such as xidodismutase (SOD) or CMP-KDO synthetase (CKS) It is ligated into a vector that can include a portion of the fusion sequence. Poly containing SOD fusion sequences Methods and vectors useful for the production of peptides are published EP 1 October 1986 O 0196056, CKS Methods and vectors useful for the production of polypeptides containing the fusion sequences of It is described in Published EPO 03311961 dated March 13. Either direction Any desired portion of the nucleic acid sequence containing an open reading frame in the strand of Obtained as a recombinant protein such as a mature or fusion protein, or as a HGBV gene Providing a polypeptide encoded by nom or cDNA by chemical synthesis You can also A signal sequence that allows secretion, whether in fused or mature form Nucleic acid sequence encoding the desired polypeptide, whether or not It can be ligated to an expression vector suitable for the host in question. True nucleus in the art Both recombinant and prokaryotic host systems can be used to form recombinant proteins. The detailed list lists some of these hosts. Then lyse cells or medium from polypep Tide is isolated and purified to the extent required for its intended use. Purification is a method known to those skilled in the art And salting out, ion exchange resin chromatography, and Finity chromatography, centrifugation and the like can be used. This Una polypeptide is used as a diagnostic agent or passive immunotherapy Can be used for Furthermore, antibodies against these polypeptides are Useful for isolating and identifying V particles. HGBV antigen from HGBV particles Can also be isolated. These viral particles are found in H in tissue culture or in infected individuals. It can be grown in GBV infected cells.Preparation of antigenic polypeptide and binding to solid phase The antigenic regions or fragments of a polypeptide are relatively small, usually about 8-10. Amino acid length or less. Antigenic region even with fragments of about 5 amino acids Can be characterized. These segments correspond to regions of the HGBV antigen obtain. By using the HGBV genomic or cDNA sequence as a basis, HG A nucleic acid sequence encoding a short segment of a BV polypeptide, a fusion protein or It can be expressed recombinantly as an isolated polypeptide. These short a The mino acid sequence can also be obtained by chemical synthesis. Chemically synthesized small poly The peptide is suitable so that the resulting synthetic polypeptide provides the correct epitope. Suitable carrier content when positively located and too small to be antigenic Can be bound to a child. Coupling methods are known to those of skill in the art, and non-limiting examples include N − Sukushin Imidyl-3- (2-pyridylthio) propionate (SPDP) and succin Imidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) is used. By adding a cysteine residue, sulfhydryl Polypeptides lacking a nucleoside group can be modified. These substances are A disulfide bond between a peptide cysteine residue on one and the other protein Via the ε-amino or other free amino group on lysine in the other protein Generates an amide bond. Various such disulfide / amide-forming substances are known It is. Other bifunctional coupling agents form thioesters rather than disulfide bonds. To achieve. Many of these thioether formers are commercially available and known to those skilled in the art. is there. The carboxy group is succinimide or 1-hydroxy-2-nitro- It can be activated by binding with 4-sulfonic acid sodium salt. Any carrier that does not itself induce the production of antibodies harmful to the host Can be used. Suitable carriers include, in particular, proteins, polysaccharides (Eg latex functionalized Sepharose, agarose, cellulose, cellulose Beads), polymeric amino acids (eg po Liglutamic acid, polylysine, amino acid copolymer) and inactive virus particles Can be mentioned. Examples of protein substrates include serum albumin, blue mussel Hemocyanin, immunoglobulin molecule, thyroglobulin, ovalbumin, rupture Mention may be made of wind toxins and other proteins known to those skilled in the art.Preparation of hybrid particle immunogen containing HGBV epitope The immunogenicity of HGBV epitopes depends on the particle-forming protein (eg, HBV surface anti-protein). By preparing in a fused or linked mammalian or yeast system (as in It can also be converted. HGBV epitome was added to the sequence encoding the particle-forming protein. The construct in which the group is directly linked is a hybrid immunogenic to the HGBV epitope. Generate code. Furthermore, all prepared HGBV containing epitopes specific for HGBV All vectors have different degrees of immunogenicity. Particle formation containing HGBV sequences Particles constructed from proteins are immunogenic for HGBV and HBV. Hepatitis B surface antigenS. cerevisiaeAnd formed in mammalian cells Were confirmed to bind to the particles and the formation of these particles The immunogenicity of It has been reported to strengthen. P. Valenzuela et al.Nature 298: 334 (1982); Valenzuela et al. Millm an et al.,Hepatitis B, Plenum Press, pp. 225 -236 (1984). The construct may include an immunodominant epitope of HBsAg. Such constructs have been reported to be expressible in yeast, and A hybrid comprising a heterologous viral sequence is disclosed. For example, EPO 1st 74,444 and EPO 174,261. These constructs Can be expressed in mammalian cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells It has also been reported. Michelle et al.International S ymposium on Virtual Hepatitis , 1984. I want to be In HGBV, the part of the sequence encoding the particle-forming protein is replaced by H It can be replaced with a codon encoding a GBV epitope. In this replacement, To mediate aggregation of units to form immunogenic particles in yeast or mammals Unnecessary regions were deleted, thus eliminating additional HG from competition with HGBV epitopes. BV antigen sites can be eliminated.Vaccine manufacturing The vaccine is based on the HGBV nucleic acid sequence or the HGBV genome corresponding to the nucleic acid sequence. It can be prepared from one or more incoming immunogenic polypeptides or nucleic acids. Wa Kutin may include a recombinant polypeptide that includes an epitope of HGBV. these The polypeptide may be expressed in bacteria, yeast or mammalian cells, or It may be isolated from a virus preparation. Various structural proteins protect against HGBV It is also envisioned that it may contain an epitope of HGBV that induces the body. Thus, this Synthetic peptides can also be used in the production of these vaccines. Therefore, H Polypeptides containing at least one epitope of GBV in HGBV vaccine Can be used alone or in combination. In addition, nonstructural proteins and structures Protein-building protects against viral pathogenicity, even if it does not produce neutralizing antibodies Is expected to be available. In view of the above, multivalent antibodies against HGBV include one or more structural proteins and / or May include one or more non-structural proteins. These vaccines are for example recombinant H Polypepti isolated from GBV polypeptides and / or virus particles And / or synthetic peptides. These immunogenic epitopes are Can be used together, ie recombinant proteins, synthetic peptides and / or Can be used as a mixture of polypeptides isolated from viral particles, These vaccines can be administered at the same or different times. In addition, It may also be possible to use inactivated HGBV for the protein. Such inactivation is Ruth lysate may be prepared and will result in inactivation of hepatitis-like viruses by those skilled in the art. By other means, such as treatment with organic solvents or surfactants, or It may be carried out by formalin treatment. The present invention also discloses an attenuated HGBV strain preparation. I do. Proteins in HGBV that can cross-react with other known viruses Therefore, there is a shared epitope between HGBV and other viruses, Expected to provide protective antibodies against one or more of the diseases caused by these pathogens Is done. It is expected that a multipurpose vaccine can be designed based on this belief. The preparation of vaccines containing at least one immunogenic peptide as active ingredient It is known to the trader. Typically, such vaccines are in solution or suspension. As an injection Prepared. Solid forms suitable for solution in, or suspension in, liquid prior to injection can also be manufactured. is there. The preparation may be emulsified or the protein may be encapsulated in liposomes. Active immunogenic ingredients are often pharmaceutically acceptable excipients compatible with the active ingredient. Mix with excipients. Non-limiting examples of suitable excipients include water, saline, dext Sucrose, glycerol, ethanol, etc., and various amounts of these excipients You may use it in combination. Vaccines also include wetting agents, emulsifiers, pH buffers and And / or may also contain minor amounts of auxiliary substances such as adjuvants that enhance the efficacy of the vaccine You. For example, such adjuvants include aluminum hydroxide, N-acetate. Cyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-DMP), N -Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11 687, also referred to as nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-ii. Soglutaminyl-L-alanine-2- (1 ', 2'-dipalmitoyl-sn-g Lysero-3-hydroxyphosphoryloxy) ethylamine (CGP 19835 A, also known as MTP-PE) and RIBI (MPL + TDM + CWS) 2% square Ren / Tween-80 (registered trademark) Marjeon is one of them. Is the efficacy of adjuvants different as well? HGBV antigen sequences resulting from administration of a polypeptide in a vaccine consisting of Can be determined by measuring the amount of antibody to the immunogenic polypeptide containing Can be. Vaccines are usually administered by intravenous or intramuscular injection. Suitable for other administration methods Another painful formulation is the suppository, which in some cases may be an oral formulation. For suppositories, Non-limiting examples of conventional binders and carriers are polyalkylene glycols. And triglycerides. Such suppositories are about 0.5% to about 10%, It may preferably be formed from a mixture containing from about 1% to about 2% active ingredient. You. Oral formulations include, for example, pharmaceutical grades of mannitol, lactose, starch, steaers. Magnesium phosphate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate, etc. It contains commonly used excipients such as These compositions include solutions, suspensions, Postcards in the form of tablets, pills, capsules, sustained release formulations or powders, about 1 It may contain from 0% to about 95%, preferably from about 25% to about 70% active ingredient. The proteins used in the vaccine should be in neutral or salt form Can be incorporated into a vaccine. Pharmaceutically acceptable salts include (free peptide Formed with amino groups and) inorganic acids (eg hydrochloric acid or phosphoric acid) or organic acids (vinegar Acid, oxalic acid, tartaric acid, maleic acid) and acid addition salts known to those skilled in the art. Other salts can be used. Salt formed with free carboxyl groups is inorganic Base (eg sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, hydroxide Calcium, iron (III) hydroxide, etc. and organic bases (eg isopropylamine, (Trimethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine, procaine) and And other bases known to those skilled in the art. Vaccine is administered in a manner compatible with the dosage form and in a prophylactically and / or therapeutically effective amount Is done. The dose is generally about 5 μg to about 250 μg of antigen at one time, , Depending on the ability of the patient's immune system to synthesize antibodies and the degree of protection desired. Required to administer Precise amounts of active ingredient required also depend on the judgment of the prescribing physician and will vary from patient to patient. vaccine May be given in a single dose schedule or in multiple dose schedules Good. In multiple administration, after carrying out the primary vaccination process in 1 to 10 divided doses Maintain and / or enhance the immune response Second administration is performed after the period necessary for the treatment, for example, 1 to 4 months, and is required by the individual In some cases, it will be given several months later. Dosing regimen requires at least some individuals It depends on the judgment of the prescribing physician. Wakuchi containing immunogenic HGBV antigen Is expected to be co-administered with other immunomodulators, eg immunoglobulins .Production of antibody against HGBV epitope Polyclones were prepared using immunogenic peptides prepared as described herein. Null or monoclonal antibody. When producing polyclonal antibodies , At least one selected mammal (eg mouse, rabbit, goat, horse, etc.) Immunizing with an immunogenic polypeptide having an HGBV epitope of. Immunization Serum from the selected animals was collected after an appropriate incubation time and subjected to known procedures. To process. Serum containing polyclonal antibody against HGBV epitope When the antibody contains antibodies to other antigens, for example, immunoaffinity chromatography Polyclonal antibodies can be purified by matography. Polyclaw Methods for producing and processing null antibodies are known to those of skill in the art, and in particular Mayer And Walker,Immun electrical Methods In Cell and Molec lar Biology , Academic Press, London (19 87). Polyclonal antibodies were used in mammals previously infected with HGBV. You can also get from things. Sensitive to HGBV using affinity chromatography Method for Purifying Antibodies to HGBV Epitope from Sera of Stained Individuals An example is given here. A person skilled in the art should also produce a monoclonal antibody against the HGBV epitope. Can be. General methods for producing such antibodies are well known and include, for example, Ko. hler and Milstein,Nature 256: 494 (1975). It is listed in J. G. FIG. R. Hurrel,Monoclonal Hybr idoma Antibodies: Techniques and Appl ications , CRC Press Inc. , Boco Raton, F L. (1982). T. Mimms et al.,Virology 176: 604-619 (1990). Immortalized antibody production Cell system can be created by cell fusion and Direct transformation of B lymphocytes with E. coli DNA or Epstein-Barr virus It can also be prepared by other methods such as transfection with. As well M. Schreier et al., Hybridoma Technologies, sco. pes (1980) Protein Purification, Princi plus and Practice, 2nd Edition, Springer-Verla g, New York (1984); Hammerling et al., Monocl. onal Antibodies and T-Cell Hybridoma s (1981); Kennet et al., Monoclonal Antibody. See es (1980). An example of the use and technology of monoclonal antibodies is US National Patent Applications No. 748,292, 748,563, 610,175, 648 , 473, 648, 477 and 648, 475. Monoclonal and polyclonal against the HGBV epitope thus developed Internal antibodies are useful in diagnostic and prognostic applications, and neutralizing antibodies are used in passive immunotherapy. Useful. Monoclonal antibodies specifically produce anti-idiotypic antibodies Can be used for These anti-idiotype antibodies are desirable for protection It is an immunoglobulin that has an "internal image" of the antigen of the infectious agent that is involved. For example, A . Nisonoff et al.Clin. Immunol. Immunopath. 2 1: 397-406 (1981) and Dreesman et al.,J. Infect. Dis . 151: 761 (1985). Idiotai like this Methods for eliciting antibodies to antibodies are known to those of skill in the art and are described, for example, by Grych et al.Na cure 316: 74 (1985); MacNamara et al.,Science e 226: 1325 (1984); and Uytdehaag et al.,J. Immu nol . 134: 1225 (1985). These anti-idio Type antibodies are also useful for treating HGBV infection and elucidating the immunogenic regions of HGBV antigens. Can be for.Diagnostic oligonucleotide probe and kit Using the predetermined portion of the isolated HGBV nucleic acid sequence as a substrate, the HGBV genome and Hybridize, identify viral agents, further characterize the viral genome, and Oligomers of about 8 nucleotides or more useful for detecting viruses in affected individuals Can be excised or produced synthetically. For HGBV polynucleotide Native or derived probe of the single viral sequence by hybridization. It is a length that enables detection. 6-8 nucleotides may be a manageable length However, a sequence of 10 to 12 nucleotides is preferable, and a sequence of about 20 nucleotides is the maximum. May also be preferred. These sequences are derived from regions lacking heterogeneity Is preferred. These probes include automated oligonucleotide synthesis methods. It can be prepared using conventional standard methods. Any of the HGBV genome A single part complement would be satisfactory. Perfect complementarity means that if the fragment length increases It may be unnecessary but is desirable for use as a probe. When used as a diagnostic reagent, a test sample to be analyzed such as blood or serum May be processed, for example in a sample The contained nucleic acid is extracted. Nucleic acid obtained from the sample is subjected to gel electrophoresis or other sizes. Separation techniques may be used, or nucleic acid samples may be dot blotted without size separation. Good. The probe is then labeled. Suitable for attaching the label to the probe Labels and methods are well known in the art and may be Radioactive label, biotin, fluorescence and Chemiluminescent probes are included, but are not limited to. Examples of these labels are Many are disclosed herein. The nucleic acid extracted from the sample is then analyzed with the appropriate Treat with labeled probe under varying hybridization conditions. The probe can be perfectly complementary to the HGBV genome. Therefore Usually, highly stringent conditions are desirable to avoid false positives. However, The stringent condition is that the probe is complementary to a region of the HGBV genome lacking heterogeneity. Should only be used if The stringency of hybridization is wash Some factors in the procedure (eg temperature, ionic strength, time and formamide concentration) Determined by For example, J. See Sambrook (supra). Yes Hybridization is several different techniques It can be performed by surgery. Amplification can be performed, for example, by ligase chain reaction (LCR), Realized by polymerase chain reaction (PCR), Q-β replicase, NASBA, etc. Can be given. The HGBV genomic sequence has, for example, about 10²-10^ThreeRelatively low level of individual sequences / ml It is believed that they may be present in the serum of infected individuals. High at this level In a hybridization assay, a ligase chain reaction or a polymerase chain reaction It may be necessary to use such amplification techniques. Such techniques are well known in the art. is there. For example, the "biobridge" system uses terminal deoxynucleotide transfer. An unmodified 3'-poly-dT-tail is added to the nucleic acid probe using a enzyme ( Enzo Biochem. Corp .. ). Plow with poly-dT-tail To the target nucleotide sequence and then to biotin-modified poly-A. Hybridize. Furthermore, the analyte is combined with the enzyme-labeled oligonucleotide. Annealing to a complementary single-stranded DNA probe, the resulting tailed double-stranded DNA hybridization that hybridizes to elementary labeled oligonucleotides Assay in European Patent No. 124221 Have been described. European Patent No. 204510 discloses that the analyte DNA is Having a probe (eg, poly-dT-tail) and a tail of the probe Has a sequence (for example, poly-A sequence) that hybridizes to Hybridization assay for contacting a possible amplifier chain Is described. This technique first targets about 10 target HGBV sequences in serum.⁶Distribution Amplifying to rows / ml. This is Saiki et al.Nature 324: 163 (1986). Then amplified The sequence is then sequenced using a hybridization assay as is known in the art. Can be detected. A diagnostic kit containing probe nucleic acid sequences that can be labeled Can be packaged. Alternatively, for labeling without labeling the probe The components may be included in the kit. The kit also includes specific hybridization Other appropriately packaged reagents or materials required or desirable for the protocol, eg For example, it may include standards and instructions for performing the assay. Other known amplification methods that can be used in the present invention include:PNAS USA 87:18 74-1878 (1990) AndNature: 350 (No. 6313): 91-92 (1991) So-called "NASBA" or "3SR" technology and Q-β replicas that have been discussed , But is not limited to these. Using the reagents described herein, fluorescence in situ hybridization ( "FISH") can also be carried out. In situ hybridization is , A tissue, a cell, or a tissue whose morphology is not impaired by the nucleic acid hybridization method Chromosomes are collected to identify the presence of special genetic information and the location of the information in individual cells. It consists of demonstrating the location. This requires homogenization of cells and extraction of target sequences Since it is not present, the exact location and distribution of the sequence within the cell population is known. In-sit high Hybridization can identify sequences of interest that are concentrated in cells and Can identify the type or fraction of cells in a heterogeneous cell population containing the sequence. D NA and RNA can be detected with the same assay reagents. PNA to FIS It can be used in the H method to detect the target without amplification. Hope signal increase If desired, use multiple fluorophores to increase signal and increase method sensitivity. Can be. Use a large number of oligonucleotides Various FISH methods are known, including one-step or conventional multi-step methods. these Type of method by various means (eg flow cytometry and image analysis) It is within the scope of the invention that it can be automated.Immunoassay and diagnostic kit A polypeptide that immunoreacts with serum, including an HGBV antibody and a complex thereof, and Antibodies to HGBV-specific epitopes in these polypeptides were both tested in biological tests. Presence of HGBV antibody or presence of virus and / or viral antigen in sample It is useful in an immunoassay for detecting. Design variations of these immunoassays Often suffering from these variations are known in the art. These variants are books Described in the specification. The immunoassay uses only one viral antigen (eg HGBV nucleus). Derived from clones containing acid sequences or from HGBV nucleic acid sequences in these clones HGBV Geno that is the source of composite nucleic acid sequences, or nucleic acid sequences in these clones Polypeptides derived from murine) can be used. Alternatively, this immunoassay May be used in combination with viral antigens derived from these sources . Immunoassays are, for example, Internal antibodies or polyclonal antibodies against different viral antigens may be used . The assay can be a competitive assay, a direct reaction assay or a sandwich type assay. Based on, but is not limited to. Assay uses solid phase Or by any other method that does not use immunoprecipitation or solid phase . Assays that use labels as signal-generating compounds and examples of these labels Are described herein. Signal is further described in pending US Patent Application No. 608,84. 9th, 070, 647, 418, 981 and 687, 785. Increase using biotin and avidin as listed, enzyme label or biotin anti-biotin system May be wide. Recombinant poly containing an epitope derived from the immunodominant region of HGBV Peptides are useful for detecting viral antibodies in biological test samples of infected individuals obtain. Antibodies may also be useful in distinguishing between acute and non-acute infections Can be Suitable material (eg HGBV epitope or HGBV epitope Polypeptides of the present invention, including antibodies, are added to other reagents or materials necessary to carry out the assay. Packaging in a suitable container, along with the reagents and appropriate assay instructions More, immunodiagnosis containing appropriate reagents Produce a kit suitable for. Designing assay formats using recombinant proteins as detailed herein Can be. Although the present inventors have described the CKS protein, the Various methods using other expression systems such as oxidodismutase (SOD) etc. Fusion proteins that can be used in, for example, immunoassay antigens, immunogens for antibody production It is also considered possible to produce Specific analytes in human test samples (eg Assay method to detect the presence of antibodies against infectious agents (such as Rus) , Human test samples with at least one recombinant protein (polypeptide) Incubate in contact with the coated solid phase. Antibodies are present in the test sample Then, the antibody forms a complex with the antigen polypeptide and is immobilized on the solid phase. Duplicate After the formation of the coalescence, the solid phase is washed to remove unbound substances and reagents. Instructing the complex React with drug and incubate under time and conditions for second complex formation You. Detect the generated signal to determine the CKS recombinant polypeptide in the test sample. Examine the presence of antibodies against it. Signal generation above cut-off value in test sample Shows that an antibody against the analyte is present. Enzymatic With such multiple indicator reagents, the amount of antibody present is proportional to the signal produced. I do. Depending on the type of test sample, the test sample may be diluted with an appropriate buffer reagent Alternatively, it may be concentrated or may be left untouched (“neat”) and contacted with the solid phase. An example For example, it is common to test prediluted serum or plasma samples or to test samples such as urine. It is preferred to concentrate the material to determine the presence of antibody and / or the amount of antibody present . In addition, the infectious agent under investigation is directed against various antigenic epitopes of the viral genome. Before testing for the presence of antibodies against specific infectious agents using CKS fusion proteins More than one recombinant protein can be used in the assay format described. Therefore, the epitope within the specific viral antigen region and other Using a recombinant polypeptide containing an epitope derived from the original region, 1 Increased sensitivity, and perhaps even greater sensitivity, than using polypeptides derived from species epitopes. It would be preferable to provide a high isomerism assay. Such an assay is , Can be used as a confirmatory assay. This particular app The Say method allows a known amount of test sample to form a recombinant protein / antibody complex. Less than enough time and conditions And a known amount of at least one solid coated with one recombinant protein. Contact with the phase. A known amount of complex under appropriate conditions for the time to initiate the reaction Contact with the appropriate indicator reagent from. Compare the signal generated to the negative test sample, Examine the presence of antibodies against the analyte in the test sample. Some kind of particles Each recombinant protein used in the assay is Adheres to the above fine particles and a mixture of the above fine particles produced by combining various coated fine particles And can be optimized for each assay. A variation of the above assay format is to detect the presence of antibodies to each analyte. CKS recombinant proteins of various analytes attached to the same or different solid phase for Quality (eg, an infectious agent with one infectious agent coated on the same or different solid phase) CKS recombinant protein specific to the original region) Infection with (or both) uptake with CKS recombinant protein specific for Examples include detecting the presence of a substance. As another assay method, a CKS recombinant protein containing an antigen epitope is used. , Useful in competitive assays such as neutralization assays. To perform a neutralization assay Is a virus Solubilize recombinant polypeptides showing epitopes in the antigenic region of infectious agents such as , Mix with sample diluent to a final concentration of 0.5-50.0 μg / ml. Required A known amount of test sample (preferably 10 μl) diluted by Then, 400 μl of test diluent containing recombinant polypeptide is added. Hope The mixture may then be pre-incubated for about 15 minutes to 2 hours. Then Add the solid phase coated with the CKS recombinant protein described in the detailed document to the reaction well. Incubate at about 40 ° C for 1 hour. After washing, a known amount of indicator reagent, such as Add 200 μl of peroxidase-labeled goat anti-human IgG in binding diluent, Incubate at 40 ° C for 1 hour. After washing, use the enzyme conjugate as described above. When adding an enzyme substrate (eg OPD substrate), add ink for 30 minutes at room temperature. To incubate. Stop the reaction by adding a terminating agent such as 1N sulfuric acid to the reaction wells. Let Read absorbance at 492 nm. Trials containing antibodies against specific polypeptides In the test sample, signal generation due to competitive binding between the peptide and the antibody in solution was Decrease. The percentage of competitive binding is determined by the sample in the presence of recombinant polypeptide. Absorbance values of Can be calculated in comparison to the absorbance value of a sample assayed in the absence of the polypeptide it can. Therefore, the sample in the presence of recombinant protein and the absence of recombinant protein The resulting difference in signal from the sample below is used to determine the presence or absence of antibody. It will be used as a scale. Another assay method is immunodot blot assay Quality can be used. Immunodot blot assay system A panel of purified recombinant polypeptides juxtaposed on a solid phase carrier is used. Manufacture Contact the immobilized solid phase carrier with the sample to target recombinant proteins (other specific binding members) The specific antibody (specific binding member) is captured to form a specific binding member pair. Captured The antibody is detected by reacting with the indicator reagent. US patent issued on August 2, 1988 In the device described in Japanese Patent Application No. 07 / 227,408, the reflectance optics It is preferable to quantitate the conjugate-specific reaction using a cell assembly. Related rice National patent applications 07 / 227,586 and 07 / 227,590 (both 19 (Filed on August 2, 1988) is further filed by the present applicant, and is hereby incorporated by reference. U.S. Pat. No. 5,075,077 (filed Aug. 2, 1988) No. 07 / 227,272) to immunodot assay. It describes specific methods and devices that are useful in practicing. In short, the nitro cell Loose-based test cartridges are treated with multiple antigenic polypeptides. Each poly The peptide is contained within the specific reaction zone on the test cartridge. All anti After the original polypeptide is placed on the nitrocellulose, the Block excess binding sites. The test cartridge is then contacted with the test sample to Make sure that each antigenic polypeptide in each reaction zone reacts if the test sample contains the appropriate antibody To After the reaction, wash the test cartridge and use well known and appropriate reagents. , Identify any antigen-antibody reaction. Described in patents and patent applications cited in this specification As has been said, the whole process can be automated. Immuno dot blot The above-mentioned patent application relating to the method and device for carrying out Incorporate in the detailed document. In order to detect the antibody against the specific antigen of the analyte in the test sample, the Use of CKS fusion proteins in assays using first and second solid phase carriers Can be. In this assay format, a first aliquot of test sample was For a time and under conditions sufficient to form a recombinant protein / analyte antibody complex , A first solid coated with a CKS recombinant protein specific for the analyte. Contact with the phase carrier. The complex is then contacted with an indicator reagent specific for the recombinant antigen. Let it. The indicator reagent is detected to detect antibodies to the recombinant protein in the test sample. Check for existence. A second aliquot of the test sample is then added to the recombinant protein / first Specific for the second antibody for a time and under conditions sufficient to form a complex of the second antibody Contacting with a second solid phase carrier coated with the CKS recombinant protein, Examine the presence of different antigenic determinants of the same analyte. The complex into an antibody of the complex Contact with a specific second indicator reagent. The signal is detected to Examine the existence of the body. Antibodies against one or both analyte recombinant proteins Presence indicates the presence of the analyte in the test sample. Same solid phase carrier It may be possible to test at times. The use of haptens is known in the art. Using CKS fusion protein It is also possible that haptens can be used on seeds to enhance assay performance. .HGBV genome, virions and viruses using probes Further characterization of the antigen The HGBV nucleic acid sequence was used to sequence the HGBV genome as well as the HGBV agent. Further information can be obtained on assay and isolation. Therefore, this knowledge is BV characteristics (eg, HGBV genome type, virus particle structure, and HGBV It is considered to be useful for the analysis of (the types of antigens constituting). With this information, additional Polynucleotide probe, polypeptide derived from HGBV genome, and H Antibodies against GBV epitopes can be obtained. These are by HGBV Diagnosis and / or treatment of onset non-A, non-B, non-C, non-D and non-E hepatitis Be beneficial to. Nucleic acid sequence information may include additional nucleic acid sequences derived from undefined regions of the HGBV genome. It is useful for designing probes or PCR primers for separation. For example, 8 A HGBV nucleic acid sequence sequence containing a sequence of 20 or more nucleotides, preferably 20 or more nucleotides. PCR primers or labels derived from the region near the 5'or 3'end of the amily Information from the HGBV genomic or cDNA library using Isolated from the nucleic acid or directly from the viral nucleic acid. Then HG The HGBV overlaps with the BV nucleic acid sequence The sequence further comprising sequences derived from a region of the genome that is not the source of the nucleic acid sequence. The column is used to identify other overlapping fragments that do not necessarily overlap with the nucleic acid sequences in the clone. A probe for determination may be synthesized. The HGBV genome is segmented Isolation of overlapping nucleic acid sequences derived from the viral genome if the consensus sequence is missing Using techniques, it is possible to sequence the entire viral genome. There Is a genomic segment from a viral genome isolated from purified HGBV particles. Characteristic analysis can be performed. HGBV particles were purified and the particles were purified during the purification procedure. Methods of detecting are described herein. Viral particles to polynucleotide genome The procedure for isolating is well known in the art. Then, the isolated genomic segment Can be cloned and sequenced. Therefore, the HGBV genome It is possible to clone and sequence regardless of its type. HGB Methods for constructing V genome or cDNA libraries are known in the art and are Vectors useful for this are also known in the art. These vectors include λ-gt 11, λ-gt10, etc. are included. Use isolated polynucleotides with appropriate restriction enzymes Digested with HGBV genome or Is the HGBV-derived nucleic acid sequence detected by the cDNA-derived probe a clone? May be isolated and sequenced. The sequence information derived from these overlapping HGBV nucleic acid sequences is the Useful for determining homosexual and heterogeneous areas. This is a different genome It may indicate the presence of strains and / or populations of defective particles. This is the technology described here. Use during isolation of HGBV during the isolation of HGBV or HGBV antigen or H in a biological sample. Also for the design of hybridization probes for detecting GBV nucleic acids Useful. The overlapping nucleic acid sequences are used to pair with a polypeptide from the HGBV genome. Expression vector may be produced. Thought to be unique to HGBV Antigens containing the identified epitopes are encoded within the nucleic acid sequence family. That is, Antibodies against these antigens were used in individuals infected with HAV, HBV, HCV and HEV. It is absent in the body and contains GenBank genomic sequences and their nucleic acid sequences and Homology to the polynucleotide sequence is considered to be small. Therefore, H Isolated from an infected individual using an antibody against an antigen encoded by a GBV nucleic acid sequence The identified non-A, non-B, non-C, non-D and non-E particles may be identified. Furthermore , These are also useful for the isolation of HGBV material. HGBV particles are for example technology based on size discrimination (eg sedimentation or Exclusion methods) or density-based techniques (eg density gradient ultracentrifugation, or Precipitation by substances such as polyethylene glycol (PEG), or anions Or cation exchange material, material that binds by hydrophobic interaction, and affinity Any of those known in the art, including chromatography on various materials such as columns) Can be isolated from the serum or cell culture of an infected individual. Isolation During the procedure, the extracted genome is hybridized with a probe derived from the HGBV nucleic acid sequence. Didzation analysis performed or encoded within the HGBV nucleic acid sequence family H by an immunoassay using an antibody against the HGBV antigen as a probe The presence of GBV can be detected. Antibodies may be polyclonal or mono May be clonal and the antibody must be purified prior to use in the immunoassay May be desired. The antibody against the HGBV antigen immobilized on the solid phase is It is useful for isolation of HGBV by finity chromatography. Immunoa Finity chromatography methods are well known in the art. And immobilizing the antibody on a solid phase so as to retain the immunoselective activity. These methods include adsorption and covalent binding. Antigen binding site of antibody is accessible The bifunctional coupling agent may include a spacer group so that it remains functional. Yes. During the purification procedure, HGBV genomic or cDNA sequence family, and overlapping HGB Using a polynucleotide derived from a V nucleic acid sequence as a probe or primer Detecting the presence of HGBV by nucleic acid hybridization or PCR and / or Or you may verify. Under conditions that cause the destruction of viral particles, for example killers The fractions are treated with detergent in the presence of a gelling agent to hybridize for the presence of viral nucleic acid. Investigate by dization technique or PCR. Individual (preferably tamarin) Infected with detached viral particles, then non-A, non-B, non-C as described herein By examining whether the symptoms of type I, non-D and non-E hepatitis are due to infection Further confirmation that the isolated particles are HGBV infection inducers may be obtained. Further characterization of the aforementioned viral particles obtained from the purified preparation can then be carried out. Can be. Purify genomic nucleic acid For example, it can be tested for sensitivity to RNAse or DNAseI. it can. Based on these studies, HGBV was identified as an RNA or DNA genome. You may investigate. Visualization by methods known in the art, for example by electron microscopy , The number of chains and their cyclicity or acyclicity are controlled by the migration and sedimentation characteristics of the density gradient You can read. From the hybridization of the HGBV genome, Negative or positive strandedness can be examined. Furthermore, genomic material If is RNA, the purified nucleic acid is cloned by a known technique (eg, reverse transcriptase). Can be sequenced. Then, using nucleic acids derived from viral particles Thus, the entire genome can be sequenced regardless of segmentation. Determination of polypeptides containing conserved sequences is accomplished by the determination of Probe selection, which leads to the isolation of the probe. Furthermore, The existing sequence is used together with the sequence derived from the HGBV nucleic acid sequence to The primers used in the column amplification system may be designed. Furthermore, the structure of HGBV The structure may be examined to isolate its components. Form and size, for example, by electron microscopy Tones You can read. Whether the antigen is present in the major viral components Is present in the isolated nucleic acid sequence and binds to the specific antigen encoded in the isolated nucleic acid sequence. Using a specific antibody as a probe, a specific viral polypeptide antigen [eg Envelope (coat) antigen or internal antigen (eg nucleic acid binding protein or co- A)), or by identifying the polynucleotide polymerase and examining its location. Wear. This information may be useful for diagnostic and therapeutic applications. For example, vaccine preparation It is preferred to include an external antigen in the entity, or perhaps the polyvalent vaccine will be Derived from the genome encoding the protein and other parts of the genome. It may consist of an upcoming polypeptide (eg a nonstructural polypeptide).Cell culture system and animal model system for HGBV replication In general, suitable cells or cell lines for culturing HGBV are monkey kidney cells (eg M K2 and VERO), porcine kidney cell lines (eg PS), hamster infant kidney cells Systems (eg BHK), mouse macrophage cell lines (eg P388D1, MK 1 and Mml), human macrophage cell lines (eg U-937), human peripheral blood White blood cells, human adherent monocytes, liver Cells or hepatocyte cell lines (eg HUH7 and HepG2), embryos or germ cells (eg Cell lines derived from chicken embryo fibroblasts) or from invertebrates, preferably insects (Eg Drosophila cell lines), more preferably arthropod-derived cell lines (Eg mosquito cell line or tick cell line). Culture primary hepatocytes, then It is also possible to infect it with HGBV. Alternatively, the hepatocyte culture , Can be derived from the liver of an infected individual (human or tamarin). In the latter case Isin vivoInfectin vitroThis is an example of a cell line that has been passaged. Furthermore, various immortalization methods can be used to obtain cell lines derived from hepatocyte cultures. Can be. For example, primary liver cultures (before and after enrichment of hepatocyte populations) can Can be fused with to maintain stability. In addition, the transformed virus Or transfecting the transforming gene to give a permanent or semi-permanent Continuous cell lines may be generated. Furthermore, cells in the liver culture are fused to produce Pe It may also be a defined cell line such as hG2. Those skilled in the art are familiar with cell fusion methods. Including the use of fusion agents such as PEG and Sendai virus, among others. I'm out. Infection of cell lines with HGBV can be carried out under conditions that allow viral entry into the cell. Cells can be achieved by such techniques as incubating the cells with a viral preparation. Conceivable. The cells are transfected with the isolated viral polynucleotide. It may also be possible to obtain a viral preparation. Transfect tissue culture cells Methods are well known in the art and include electroporation and DEAE- Techniques using precipitation with dextran or calcium phosphate are included. It is not limited to this. Tiger by cloned HGBV genome or cDNA The virus is replicated by Sfection,in vitroMultiply. Cultured thin In addition to cells, animal model systems may be used for virus replication. Therefore, HGBV The production can occur in chimpanzees as well as in marmoset and infant mice, for example.Screening for HGBV antiviral agents Since cell culture systems and animal model systems for HGBV are available, Antiviral agents that inhibit production, particularly preferably cell growth while inhibiting viral replication It is also possible to screen for substances that enable These screening methods Are known in the art. Generally virus replication Of antiviral agents on the inhibition of viral replication in a cell culture system supporting Antiviral agents for inhibition of infectious or viral pathogenicity and low levels of toxicity Are tested in animal model systems at various concentrations. HGBV antigens described herein And methods for the detection of HGBV polynucleotides include antiviral agents. Useful for screening. Because these are the antiviral drugs For detection of effects on replication, cell plaque assay or ID₅₀From the assay Is probably also a sensitive alternative. For example, the HG described herein Viruses produced in cell culture using BV polynucleotide probes The amount of nucleic acid may be quantified. This is an HGBV polynucleotide labeled with infected cell nucleic acid. Performed by hybridizing or competitively hybridizing with a rheotide probe Can be done. In addition, anti-HGBV antibodies can be used to detect the immunoassays described herein. The HGBV antigen in the cell culture may be identified and quantified by the assay. Furthermore, the competition It may be desirable to quantify HGBV antigen in infected cell cultures by combined assays Thus, the polypeptide encoded within the HGBV nucleic acid sequences described herein is Useful in these assays. General Labeled with recombinant HGBV polypeptide derived from HGBV genome or cDNA And the labeled polypeptide and HGBV polypeptide are treated with the antigen produced in the cell culture system. The inhibition of peptide binding is monitored. These methods show that HGBV causes cell death. It is particularly useful if it can be replicated in a cell line without it.Preparation of attenuated strain of HGBV Using the tissue culture system and / or animal model system described herein, weak HGBV It may be possible to isolate poisoned strains. These attenuated strains are used as vaccines Alternatively, it is useful for isolation of viral antigens. Attenuated strains are cell cultures and / or animals The model can be passaged many times before isolation. In infected cells or individuals The detection of attenuated strains of A. can be achieved according to the following methods known in the art. Include a probe of an antibody against one or more epitopes encoded by HGBV. Or a poly containing an HGBV sequence of at least about 8 nucleotides in length. The use of nucleotides as probes can be included. In addition to or instead of this Therefore, using the HGBV genomic information described herein, and using recombinant techniques. May be used to construct an attenuated strain. Usually associated with pathogenicity, not viral replication Polypep The region of the genome encoding tide is deleted. If the genome is constructed, it becomes HGBV An epitope which produces a neutralizing antibody against it can be expressed. Then denaturation The genome is used to transform cells that allow HGBV replication to It can be grown under conditions that allow loose replication. The attenuated HGBV strain is Not only for Kuching but also as a source for commercial production of viral antigens is there. Because the treatment of these viruses results in virus production and / or virus Need less rigorous protection for employees involved in manufacturing It is.Host and expression control sequences Genome is extracted from virus, genome library is created, probed, The clones are sequenced, expression vectors are constructed, cells are transformed and immunoassayed. The general techniques used to carry out the assay and grow the cells in culture are well-known in the art. Known in the art and included in the present invention. When using appropriate control sequences compatible with the designated host, prokaryotic host cells and Both eukaryotic host cells can be used for expression of the desired coding sequence. You. As a prokaryotic host,E. FIG. coliIs most often used. Prokaryotic The expression control sequence of the product may include a promoter containing an operator part in some cases, A ribosome binding site is included. Transfer vectors compatible with prokaryotic hosts Usually, a gene containing an operon that confers ampicillin resistance and tetracycline resistance. Lasmid pBR322 and a variety of sequences containing a sequence for imparting an antibiotic resistance marker Derived from the pUC vector. Use these markers for better selection A favorable transformed cell can be obtained. Commonly used prokaryotic control sequences include β-lactamase (penicillinase), lactose promoter system (Chang etc,Nature 198: 1056 [1977]), (Goeddel et al.,N ucleic Acid Res 8: 4057 [1980] reported Tryptophan promoter system, λ-inducible P1 promoter and N gene Bosome binding site (Shimatake et al.,Nature 292: 128 [1 981]), andtrpas well aslacHigh derived from UV5 promoter sequence BridTacPromoters (De Boer et al.,Proc. Natl. Aca d. Sci. USA 292: 128 [1983]). The above system EspeciallyE. FIG. coliCan be, but desired If there isBacillusShares orPseudomonasOther prokaryotes like strains The host may be used with the corresponding control sequences. Eukaryotic hosts include yeast and mammalian cells in culture.Saccharo myces cerevisiae as well asSaccharomyces carl sbergensis Is the most commonly used yeast host and It is a fungal host. Yeast compatibility vector makes auxotrophic mutants prototrophic Or imparting heavy metal resistance to the wild-type strain to enable selection of good transformed cells Carry a marker. The yeast compatible vector is a 2 micron origin of replication (Br ach, etc.Meth. Enz. 101; 307 [1983]), CEN3 and AR A combination of S1 or other means for effecting replication (eg into the host cell genome) Sequence which results in the incorporation of the appropriate fragment of Control of yeast vector Rows are known in the art and include 3-phosphophycerate kinase. te kinase) promoter is included. For example, Hess et al.J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (196 8), Holland et al.,Biochemistry 17: 4900 (1978) and Hitzeman. J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980). H olland,J. Biol. Chem. Reported at 256: 1385 (1981) Terminators such as those derived from known enolase genes may also be included. Special A useful control system for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH) promoter or alcohol dehydrogenase (ADH) controllable Promoter, terminator derived from GAPDH, and secretion is desired If so, it is considered to be a system containing a leader sequence derived from yeast α factor. You. Furthermore, the operably linked transcriptional regulatory region and transcriptional initiation region are Can be innately unrelated. Mammalian cell lines that can be used as expression hosts are known in the art and are Available from rican Type Culture Collection A large number of immortalized cell lines are included. These include HeLa cells, Chinese ham Star ovary (CHO) cells, hamster infant kidney (BHK) cells and the like are included. Suitable for mammalian cells Motors are also well known in the art and include Simian virus 40 (SV40), LA Ussarcoma virus (RSV), adenovirus (ADV), bovine papilloma virus (BPV), viral promoters such as those derived from cytomegalovirus (CMV) Data included. Mammalian cells also include a terminator sequence and a poly A addition sequence. You may need rows. Enhancer sequences that increase expression may be included or Sequences that induce offspring amplification may also be desired. These sequences are known in the art . Vectors suitable for mammalian cell replication include viral replicon or non-A type, Host Geno of Suitable Sequence Encoding Non-B, Non-C, Non-D, Non-E Epitope A sequence may be included to ensure its uptake into the system. Example of mammalian expression system of HCV Are described in US patent application Ser. No. 07 / 830,024 filed January 31, 1992. Have been.Transformation Transformation is performed by a known method for introducing a polynucleotide into a host cell. It is possible that the Includes transduction of main cells and direct uptake of polynucleotides. Choice The transformation procedure to be performed depends on the host to be transformed. Fine by direct capture Transformation of fungi generally uses treatment with calcium chloride or rubidium chloride. You. Cohen,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:21 10 (1972). Graham et al.Virology 52: 526 (197) Fermentation by direct uptake using the calcium phosphate precipitation method of 8) or its modification. Mother transformation may be performed.Vector construction Vector construction uses methods known in the art. Generally, commercial enzyme manufacturers Under the conditions generally prescribed by the institute, treat with a suitable restriction enzyme and Heterologous DNA cleavage is performed. Usually 1 to 10 units of fermentation in about 20 μl of buffer solution By incubating the sample with the substrate at 37 ° C for 1 to 2 hours, Cleaves the ram (μg) plasmid or DNA sequence. Incubate with restriction enzyme After plating, the protein was removed by phenol / chloroform extraction and DNA is recovered by precipitation with tanol. Cleavage fragments can be prepared by methods known to those skilled in the art. Separated by polyacrylamide or agarose gel electrophoresis. May be. Suitable deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) present in the mixture ) In the presence ofE. FIG. coli Attach using DNA polymerase 1 (Klenow) The end cleaved fragment may be blunt ended. Using treatment with S1 nuclease The single-stranded DNA portion may be hydrolyzed. T4 DNA ligase and ATP were used to bind under standard buffer and temperature conditions. Combine. Sticky-end ligation requires less ATP or ligase than blunt-end ligation . When using a vector fragment as part of a ligation mixture, Bacterial alkaline phosphatase (BAP) or calf intestinal alkaline phosphatase Treatment with tase removes the 5'-phosphate and prevents religation of the vector. Alternatively, restriction enzyme digestion of unwanted fragments can be used to prevent ligation. You. The binding mixture,E. FIG. coliOr selected by methods including antibiotic resistance Transform into a suitable cloning host, such as a good transformant, then Screen for new construction.Construction of the desired DNA sequence Warner,DNA 3: 401 (1984) is described. Synthetic oligonucleotides using an automated oligonucleotide synthesizer such as May be produced. If desired, using standard reaction conditions,³²Of P-ATP Treat the synthetic strands with polynucleotide kinase in the presence of³²Label with P Can be. DNA sequences (eg D isolated from genomic or cDNA libraries) NA sequence) by a known method [eg Zoller,Nucleic Acid Res . 10: 6487 (1982) Mutagenesis of Specific Site] It may be modified. Briefly, the DNA to be modified as a single-stranded sequence Is complementary to the part of the DNA that is to be packaged and modified in its own sequence. Using a synthetic oligonucleotide containing the desired modification as a primer, the DNA It is converted to double-stranded DNA with a enzyme. Transformed bacteria containing replication regions of each strand of phage The cultures of are plated on agar to obtain plaques. Theoretical new plaque 5 0% contain the phage with the mutated sequence, the remaining 50% have the original sequence You. Suitable temperature and hybridization for the correct strand, not the unmodified sequence And plaque replicas hybridize to the labeled synthetic probe under conditions. Ha Identified by hybridization The recovered sequence is recovered and cloned.Hybridization with probe Grunstein and Hogness,Proc. Natl. Acad. S ci. USA 73: 3961 (1975) using the procedure described in HGBV Nomes or DNA libraries may be probed. In short, plow The DNA to be binged is immobilized on a nitrocellulose filter, denatured, and 50% formamide, 0.75M NaCl, 75 mM sodium citrate, 0.02% (w / v) of bovine serum albumin (BSA) and polyvinyl pyro Redone and Ficoll, 50 mM sodium phosphate, pH 6.5, 0.1% Prehive with buffer containing SDS and 100 μg / ml carrier-denatured DNA Redisize. Percentage of formamide in buffer and prehybridizer The time and temperature conditions for the hybridization and the subsequent hybridization step are required. Depends on the strictness of Oligomer probes that may have low stringency requirements are In general, lower the formaldehyde, lower the temperature, and reduce the hybridization time. Use longer. 30 as derived from cDNA or genomic sequences or 40 Probes containing more than one nucleotide are generally higher than, for example, about 40-42 ° C. Use warm and high rates of formamide, for example 50%. Prehybridization After³²Add P-labeled oligonucleotide probe to the buffer and The filters are incubated in this mixture under dization conditions. Washing Then, the filter to be treated was subjected to autoradiography and hybridized. The position of the probe is shown. The DNA at the corresponding position on the original agar plate is transferred to the desired D Used as the source of NA.Construction verification and sequencing In a standard vector construction, the ligation mixture wasE. FIG. coliStrain XL-1 Blue Alternatively, transforming into a suitable host, and transforming good transformed cells with antibiotic resistance or other Select with the marker. Then usually Clewell et al.J. Bacte riol . 110: 667 (1972) increase chloramphenicol. After the width, Clewell et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62: 1159 (1969), producing transformed cell-derived plasmite I do. DNA is isolated and usually analyzed by restriction enzyme analysis and / or sequencing . Messing, etc.,Nucleic Acid Res . 9: 309 (1981). Sanger et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5 463 (1977) by the well-known dideoxy method or by Maxam et al.,M methods in Enzymology 65: 499 (1980) You may sequence by the method of. Band pressure sometimes observed in GC-rich regions The problem of shrinkage is Barr et al.Biotechniques 4: 428 (1986 ) Is overcome with T-deazoguanosine.Enzyme linked immunosorbent assay Using the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), The original concentration or antibody concentration can be measured. This method uses enzyme labels and antigens or Depends on the binding to the antibody, and the bound enzyme activity (generated signal) is a quantitative label (measurable). It is used as an effective generation signal). A method of using an enzyme as a label, and Examples of such enzyme labels are provided herein.Generation of HGBV nucleic acid sequence Source of non-A type, non-B type, non-C type, non-D type, non-E type substance Are sensitive to HGBV virus that meet the clinical and experimental criteria described herein. Individual plasma, serum or liver homogenate from stained human or tamarin or That is the pool. Alternatively, a non-A type, a non-B type, which meets the criteria described below, Experimentally infecting the blood of other individuals suffering from non-C and non-E hepatitis with tamarin be able to. Individual plasmas with high levels of alanine transferase activity, Pools can be prepared by combining multiple serum or liver homogenate samples. This activity is due to hepatitis damage due to HGBV infection. The fruit of the inventors The virus TID calculated for one of the tests was 4 × 10.^FivePieces / m 1 or more (see Example 2 below). For example, plasma that is preferably, but not necessarily, of high titer, Create a nucleic acid library derived from serum or liver homogenate by the following method . First, viral particles are isolated from plasma, serum or liver homogenate. Then Aliquot the buffer solution (eg, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM) EDTA, buffer solution containing 100 mM NaCl). For example, 15 Remove debris by centrifugation at 2,000 xg for 20 minutes at 20 ℃. I do. Centrifugation is then performed under appropriate conditions, which can be routinely determined by one of ordinary skill in the art. Thus, the virus particles in the obtained supernatant are pelletized. Release viral genome In order to prepare the pellet, the pellet was added to an SDS suspension [eg 1% SDS, 120 mM EDT A containing 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), and further containing 2 mg / ml of protein. Suspension containing Inase K], then appropriate conditions Incubate under, for example, 45 ° C. for 90 minutes to destroy particles. For example, 0. 8 μg MS2 bacteriophage RNA was added as a carrier and the mixture Phenol: chloroform [0.5 M Tris-HCl (pH 7.5), 0. 1% (v / v) β-mercaptoethanol, 0.1% (w / v) hydroxyquino Ron-saturated phenol] 1: 1 mixture four times and then chloroform. Nucleic acid is isolated by two extractions with a membrane. After concentrating the aqueous phase with eg 1-butanol Then, precipitate with 2.5 volumes of absolute ethanol at -20 ° C overnight. For example Be Centrifuge for 90 minutes at 40,000 rpm and 4 ° C in ckman SW41 rotor Nucleic acid was recovered by separation, dissolved in water, and diluted with 0.05% (v / v) diethyl. Treated with pyrocarbonate, auto Clave. The nucleic acid obtained by the above procedure is, for example, 17.5 mM CH_ThreeDenatured with HgOH Then, using this denatured nucleic acid as a template to synthesize cDNA, for example, Huynh (1985, supra) using the method described in Phage λ-gt11. Clone in place. However, during the synthesis of the first nucleic acid strand by reverse transcriptase, the random Primer with oligo (dT) 12-18 (Taylor et al., [197] 6]). The obtained double-stranded nucleic acid sequence is subjected to, for example, Sepharose CL-4B column. Sort by sizing above. Average dimensions of about 400, 300, 200 and 1 The 00 base pair eluting material is pooled in the genome pool. At least one pool A λ-gt11 cDNA library is prepared from the internal cDNA. Or If the etiological agent is a DNA virus, a method for cloning genomic DNA is useful. Yes, this is known to those skilled in the art. The λ-gt11 genomic library prepared in this manner was used for non-A type, non-B From non-C, non-C, non-E hepatitis-existing individuals (meets the criteria described below) , Epitopes capable of specifically binding to plasma or liver homogenate To clean. Using the method of Huyng et al. (Supra), about 10^Four-10⁷Of Phages are screened with serum, plasma or liver homogenate.¹²⁵ I or other suitable reporter molecule (eg HRPO, alkaline phosphatase) Etc.) can detect bound human antibodies with sheep anti-human Ig antiserum radiolabeled with it can. Positive phage are identified and purified. Then, using the same method, H Regarding the specificity of binding with serum of a predetermined number of humans infected with GBV substance, Test phage. Ideally, the phage should be serum, plasma or liver cells tested. Encodes a polypeptide that reacts with all or most of the modinate By the criteria described herein for hepatitis A, B, C, D, E hepatitis. Reacts with serum, plasma or liver homogenate from individuals who have been determined to be "sexual" do not do. Following these procedures, non-A, non-B, non-C, non-D, non-E Immunologically characterized by serum, plasma or liver homogenates from patients identified as A clone can be isolated which encodes a differentially recognized polypeptide. The present invention will be described below with reference to examples. These examples are illustrative and It does not limit the scope of the invention. Example The examples provided herein detail methods for discovering HGBV group viruses. It is described in. The examples are HGBV-A and HGBV-B of the HGBV group. And chronologically to follow the discovery of the HGBV-C virus. In general, transmissibility and infectivity studies were first conducted. As described herein These studies and subsequent studies have shown that GB-A and GB-B as HGBV. The existence of two HCV-like viruses was demonstrated. In addition, this is also detailed here Subsequent experiments with the degenerative primer described in HGBV-C was discovered. In humans of the virus group demonstrated by serum studies Prevalence, viral characterization of the virus group, other viruses in that particular genus. Relationship with Ils and interrelationship of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C Also teach sex. Example 1. Propagation of HGBV A.Experimental protocol. LEMSIP (Laboratory f or Experimental Medicine and Surgery in Primates, Tuxedo, New York) 16 Tama I got phosphorus (Saguinus labiatsu). All animals approved by LEMSIP Maintained and monitored by LEMSIP according to the specified protocol (Note: 1 animal is natural The other sick animal died and was euthanized before the start of the infectivity experiment). Serum liver fermentation Elemental alanine transaminase (ALT), γ-glutamyl transferase (GGT) and isocitrate dehydrogenase (ICD) for 2-3 weeks Serum liver enzyme levels based on serum samples obtained once a week or once every two weeks during It was determined. A minimum of 8 serum liver enzyme levels were obtained for each animal prior to inoculation. average Based on the liver enzyme value + 3.75 times the standard deviation, the cutoff value (CO )It was determined. Liver enzyme levels above the cutoff are abnormal and the liver is damaged. It was considered to be Several tamarins were inoculated as described below, ALT, G Changes in GT and ICD serum levels were monitored. Then, during the monitoring process, At fixed times, several animals were killed to obtain serum and tissue for subsequent experiments. B.Animal inoculation (initial experiment). First hepatitis from 9 tamarins inoculated with HGBV From the serum collected during the acute phase (19-24 days after inoculation) GB serum Was prepared (11 passages designated as H205 GMG pass 11). The Have already been described (J.L. Dienstag et al.,Nature 264, supra; E. Tabor et al., J. Med. V irol. 5, supra) and was studied to determine related etiological agents. The Aliquots of Abbott Laboratories (Nor th Chicago, IL60064) was maintained under liquid nitrogen storage conditions. HGB Other aliquots of V are American Type Culture Collection (A.T.C.C.), 12301 From Parklawn Drive, Rockville, MD20852, under A.T.C.C. Accession No. VR-806 Available. On day 1, 4 of the remaining 14 tamarins in the early group, identification number T-105 3, T-1048, T-1057 and T-1061, diluted 1:50 beforehand. Pooled pool H205, 0.25 ml, 11 passages was inoculated intravenously. these Animals were monitored weekly for changes in liver enzymes ALT, GGT and ICD. Table 2 shows These four tamarins (T-1053, T-1048, T-1057 and T-1 061) shows liver enzyme data before and after inoculation. 1 to 4 are before inoculation And ALT and ICD levels of these 4 tamarins after inoculation You. The data show Of 4 tamarins inoculated with a 1:50 dilution of pool H205 A significant increase over CO was obtained in LT, GGT and ICD. On the same day (1st day), one tamarin (T-1047) was pooled with normal tamarins. Inoculate 0.25 ml of marine serum intravenously and use it as a negative control. Phosphorus (T-1042) was supplemented by intravenous inoculation with pooled normal human serum. It served as a negative control. 5 and 6 and Table 3 show two control tamarins (T-104). 7 and T-1042) before and after inoculation. De As shown by the data, in the two control tamarins, ALT or Did not show any increase in ICD. On the same day (1st day), from the outbreak of acute hepatitis on one tamarin (T-1044) Approximately 3 weeks later, 0.2 ml of convalescent serum obtained from the surgeon (GB origin) was intravenously injured. Seeded This specimen was stored at -20 ° C [F. Deinhardt et al.J. Exper. Me d. 125: 673-688 (1967)]. On another tamarin (T-1034), the convalescent blood Inoculate with 0.1 ml of clear water. Inoculation, as shown in FIGS. 7 and 8 and Table 4. During the following 11 weeks, the serum liver enzymes of these tamarins were all elevated. I couldn't see it. Therefore, these data were collected from the original patient and were stored at -20 ° C. It was shown that infectious HGBV was not detected in convalescent serum stored in It means that the patient has recovered from the infection and the virus is in the patient's serum. Removed or virus titer undetectable by storage at -20 ° C Can be shown to have decreased to a certain level. C.Subsequent experiments. Tamarin T-1053 was significant in serum liver enzymes one week after inoculation And was retested 11 days after inoculation for liver enzymes. On the 12th day , It was determined that there was a significant increase in serum liver enzymes and the animals were killed on that day . Plasma, liver and spleen tissue samples were obtained for subsequent experiments. Derived from T-1053 As the starting material for the RDA procedure described in Example 3 below and liver tissue Used in Example 8. Tamarin T-1048, T-1057 and T-1061 were added to serum liver enzymes. Watched. All animals had elevated liver enzyme levels within 2 weeks after inoculation Was recognized. These elevated values were found 6 weeks after inoculation. Three tamarins All had serum liver enzyme levels up to 84 days after vaccination It was observed to have decreased to levels below CO. 97 days after inoculation, these 3 Tamarin (T-1048, T-1057 and T-1061) was used as tamarin T 0.10 ml of neat plasma from -1053 (found to be infectious, Example 2 Rechallenge with hepatitis, which is shown as elevated serum liver enzymes. It was measured whether it could be done. The data are shown in Table 2, FIG. 1, FIG. 3 and FIG. As the data show, two tamarins (T-1057 and T-1061) Serum liver enzyme levels remained below CO for 3 weeks after inoculation. One Tamarin (T-1048) slowed down serum liver enzyme levels 2 weeks after revaccination. Kana showed a rise. A gradual increase in T-1048 is due to HGBV-induced liver Either due to tissue reinfection or not fully recovered from the initial H205 inoculation. It was estimated to be due to. Embodiment 2. FIG. Infectivity experiment A.Experimental protocol. For 4 tamarins as described in Example 1 (A) A standard reading was obtained. Prior to inoculation, briefly reference serum liver enzyme (A The values of LT, GGT and ICD) were determined. Average liver enzyme value + standard deviation The cut-off value (CO) was determined for each animal based on a 3.75 fold. cut Liver enzymes above the OFF value were abnormal and were considered to be liver-damaged. B.Tamarin inoculation. Plasma derived from tamarin T-1053 killed 12 days after inoculation (See Example 1 [C]) was used as the inoculum for subsequent experiments. On the first day, 0.25 ml of neat plasma of T-1053 was added to one tamarin (T-1055). Inoculated intravenously. On the same day, to two tamarins (T-1038 and T-1051), 10 in pooled normal tamarin plasma^-Four(T-1038) or 10^-Five(T-1 051) was inoculated intravenously with 0.25 ml of T-1053 plasma which had been serially diluted. . On the same day, the tamarin T-1049 had a reduced pore size (0.8 μm, 0.45 μm, 0. 22 μm and 0.10 μm) through a series of filters and pooled 10 for normal tamarin plasma^-Four0.25 ml of T-1053 plasma diluted with Inoculated intravascularly. As described in Example 1 for changes in serum liver enzymes ALT, GGT and ICD. And weekly total tamarins (T-1055, T-1038, T-1051 and T-10 49) was monitored. Table 5 shows the pre-inoculation and contact of these four tamarins. Serum liver enzyme data after seeding are shown. FIG. 9 shows A before and after inoculation of T-1055. The LT and ICD values are shown. Referring to FIG. 9, serum liver enzymes ALT and ICD had C It can be seen that a rise above D has occurred. The tamarin was killed 12 days after inoculation. 10 and 11 show ALT of tamarin T-1051 and T-1038, respectively. And serum levels before and after inoculation in ICD. 10 and 11 By reference, the serum liver enzymes ALT and ICD of both animals increased until 11 days after the inoculation. I know what happened. T-1038 was killed 14 days after inoculation. Table 5 and FIG. Shows the data obtained for T-1049. You can see it from Table 5 and Figure 12. As shown in the figure, within 10 days after inoculation, an increase in serum liver enzyme exceeding CO was observed in T-1049. Was done. Filtration experiments performed on T-1049 showed that HGBV had a 0.10 μm filter. , Which indicates that HGBV is viral and has a diameter of It is suggested that it can be less than 0.1 μm. Furthermore, regarding T-1038 Infectious titration experiments performed showed that T-1053 serum was at least 4 x 1 per ml. 0^FiveIt is shown to contain the tamarin infectious dose of. To demonstrate the transmissibility of a single HGBV pathogen, tamarin T-1044 was labeled with H2 T-diluted 7 days after 05 inoculation and diluted 1: 500 in normal tamarin serum 0.25 ml of inoculum consisting of 1057 serum was inoculated. 14 to 63 days after inoculation To the ALT level, a gradual rise above the cutoff (ie, the range of 82 to 106) Was observed). T-1 collected 14 days after inoculation and diluted 1: 2 in normal tamarin serum Tamarin T-1047 and T-1056 were sequentially inoculated with 0.25 ml of 044 serum. did. First, on the 42nd day after inoculation, the cutoff was exceeded for T-1047 and T-1056. ALT levels were increased, but on days 64 and 91 after vaccination, respectively. Returned to normal level. Tamarin T-1058 was tested with T-1053 serum. Inoculated with 0.25 ml of T-1057 neat serum collected 22 days after the preparation. Was. No increase in ALT level was observed during 112 days after inoculation.Embodiment 3 FIG. Representative difference analysis (deduction hybridization) A.Production of double-stranded DNA for amplicon Above in this specificationMaterials and methodsAnd using the procedure described in FIG. , H205 serum (Examples 1C and 2 Tamarin T-1053 infectious plasma collected 12 days after inoculation (see B). Tester amplicons were synthesized from total nucleic acid from (see 1A). Before inoculation 17-3 Pre-inoculation plasma of tamarin T-1053 pooled during day 0 A precon was synthesized. Briefly, both plasmas were treated with 0.1% as described in Example 2B. Filtered through a μm filter. Then, a commercially available kit [United States Bi ochemical (USB), Cleveland, OH, cat. # 73750] and 10 μg of yeast as a carrier 50 μl of filtered plasma was extracted with tRNA. Start this nucleic acid randomly Reverse transcription, and then random synthesis was performed using a commercially available kit to synthesize DNA. Easy Speaking of, using the random hexamer, the manufacturer's directed Perkin Using Elmer's (Norwalk, CT) RNA PCR kit (cat. # N808-0017) Perform 80 μl reverse transcription reaction, incubate at 20 ° C. for 10 minutes, then Incubated at 2 ° C for 2 hours. Then the reaction is stopped and the cDNA / RNA overlap The duplexes were denatured by incubating at 99 ° C for 2 minutes. As a reaction material, 20 μl total volume of 10 μl of 10 × RP buffer [100 mM NaCl, 420 m M Tris (pH 8.0), 50 mM DTT, 100 μg / ml BSA], 250 pmol random hexa Mar and 13 units of Sequenase® version 2.0 polymer The supplement (USB, cat. # 70775) was added. Reaction material at 20 ° C. for 10 minutes, then 37 Incubated for 2 hours at ° C. Phenol: chloroform extracted and ethanol After precipitation, double-stranded DN of these reactions as directed by the manufacturer. 4 units of restriction endonuclease Sau3A in 30 μl reaction material volume It was digested with I (New Englnd Biolabs [NEB], cat. # 169L) for 30 minutes. B.Amplicon synthesis Sau3AI digested DNA was extracted and precipitated as above. 50 to 50 Place in a dry heating block at 55 ° C and incubate at 4 ° C for 1 hour. , Sau3AI digested product in 1 × T4 DNA ligase buffer (NEB) 465 pmol R Bgl24 (SEQ ID NO: No. 1) and 465 pmol of R Bgl 12 (SEQ ID NO: 2). . Annealed by adding 400 units of T4 DNA ligase (NEB, cat. # 202S) The ligated products were ligated. 14 at 16 ° C After incubation for hours, a small scale PCR was performed. 10 μl of ligation material To 60 μl of H₂O, 20 μl of 5 × PCR buffer (335 mM Tris ( pH 8.8), 80 mM [NH_Four]₂SO_Four, 20 mM MgCl₂, 0.5 μg / Ml bovine serum albumin and 50 mM 2-mercaptoethanol), 8μ 1 4 mM dNTP strain, 2 μl (124 pmol) R Bgl 24 (SEQ ID NO: 3 ) And 3.75 units of Ampli Taq® DNA polymerase (Per kin Elmer, cat. # N808-1012). GeneAmp (registered trademark) 9600 PCR amplification was performed in a thermocycler (Perkin Elmer). Sample at 72 ° C for 5 Incubated for minutes and filled in the 5'overhanging ends of the ligated adapters. sample For 25-30 cycles (1 min at 95 ° C. and 3 min at 72 ° C.), then 72 Extended amplification was performed at 10 ° C for 10 minutes. Successful synthesis of amplicons by agarose gel (I.e., coating of PCR products ranging from about 100 bp to over 1500 bp). A large increase in testers and driver amplicons Went wide. The synthesis of drivers and testers, respectively, was described above. Thus, 40 100 μl PCRs And eight 100 μl PCRs were set up. 2 μl per 100 μl reaction material Small-scale PCR product served as template for large-scale amplicon production . Thermocycling as described above for additional 15-20 cycles of amplification. Was performed. Then, PCR reaction materials for driver and tester DNA are prepared. Extract twice with ethanol / chloroform and precipitate with isopropanol to give 70% ethanol. The adapter was cleaved by washing with Nol and digestion with Sau3AI. Tester amplifier The recon was further purified on a low melting agarose gel. Simply put, tester 10 μg of the amplicon DNA was added to 2% SeaPlaque (registered trademark) gel (FMCBio products, Rockland, ME). Fragment of 150-1500 base pairs The gel was cut from the gel, and the gel slice was cut with 3 ml of H 2 O and 400 μl of 0. . Thaw at 72 ° C. for 20 minutes with 5MMOPS and 400 μl NaCl . Qiagen-tip20 (Qiagen, Inc., as directed by the manufacturer. , Chatsworth, CA) was used to recover DNA from the melted gel slices. C.Hybridization and selective amplification of amplicon About 2 μl of the purified tester DNA amplicon was added to the above. To N Bgl 24 (SEQ ID NO: 3) and N Bgl 12 (SEQ ID NO: 4). Tied. For the first subtractive hybridization, the N Bgl primer set Connected tester amplicon (0.5 μg) and driver amplicon (2 0 μg), extracted with phenol / chloroform, and precipitated with ethanol. I let you. 4 μl of EEx3 buffer (30 mM EPPS, pH 8. 0 [Sigma, St. Louis, MO], resuspend the DNA in 3 mM EDTA), 1 of mineral oil was overlaid. After denaturing with heat (3 minutes at 99 ° C), add 5 to the denatured DNA. 1 μl of M NaCl was added and the DNA was hybridized at 67 ° C. for 20 hours. water Transfer the phases to a new tube and add 8 μl of tRNA (5 mg / ml) to the sample, then 39 Add 0 μl TE [10 mM Tris (pH 8.0) and 1 mM EDTA]. I got it. 80 μl of the hybridized DNA solution was added to H₂O480μl, 5 × PC R buffer (above) 160 μl, 4 mM dNTP 64 μl and AmpliTaq Added to 6 μl (30 units) ® Polymerase®. 5 minutes at 72 ° C Formed by the ligated N Bgl 24 primer Filled with 5'overhang. N Bgl 24 (SEQ ID NO: 3, 20 μl of H₂1.24 nmol in O), The reaction material was divided into aliquots (100 μl / tube), and 10 cycles were performed as above. Amplification was performed. The reaction materials were pooled and extracted twice with phenol / chloroform, Precipitated with isopropanol, washed with 70% ethanol and added 40 μl H 2₂O Was resuspended. Single-stranded DNA was removed by mung bean nuclease (MBN) . Briefly, 20 μl of amplified DNA was added as described by the vendor, Digested with 20 units of MBN (NEB) in 40 μl of reaction material. 5 for MBN digest 160 μl of 0 mM Tris (pH 8.8) was added. Heat the enzyme at 99 ° C for 5 minutes Inactivated Add 80 μl of MBN digested DNA for another 15 cycles as above. PCR amplified. Pool the reaction material again and twice with phenol / chloroform. Extraction, precipitation with isopropanol, washing with 70% ethanol, H₂Resuspend in O did. The amplified DNA (3-5 μl) was then digested with Sau3AI, Was extracted and precipitated. Resuspend final DNA pellet in 100 μl TE Was. D.Subsequent hybridization / amplification steps DNA10 derived from the previous hybridization / selective amplification material as described above. 0 ng was ligated to the J Bgl primer set (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6) . This DNA (50 ng) was mixed with 20 μg of driver amplicon, The hybridization and amplification procedure was repeated as described above, except that The extension temperature during cling was 70 ° C. and the N Bgl primer set (sequence No final amplification step (after NBN digestion) instead of 72 ° C for SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) Was 25 cycles. Second round of hybridization-amplification product 10 Ligating 0 ng to the N Bgl primer set (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4), Mix 200 pg of this material with 20 μg of driver amplicons and mix as above. The third round of hybridization / amplification was performed, but the final amplification was 25 cycles. Met. Representative difference analysis performed before HGBV inoculation and on acute phase T-1053 plasma ( A 2% agarose gel of the product obtained from RDA) is shown in FIG. See Figure 14 Lane 1 then contains a DNA fragment of the appropriate size (bp) 15 Contains 0 ng of HaeIII digested Phi-X174 DNA marker (NEB) You. Driver amplicons (Lane 2) and tester amplicon (Lane 3) complexities were not observed in the sample. It has been demonstrated by a smear of the DNA product as described. This complexity is Hive in row 1st (lane 4), 2nd (lane 5) or 3rd (lane 6) Dramatically reduced upon lid formation / selective amplification. E. FIG.Cloning the difference product The difference product was cloned into pBluescriptIIKS + (Stratagene, La Jolla, CA, cat. # 212207) was cloned into the BamHI site. 0.5 μg PBluescript II from BamHI (10 units, NEB) With calf intestinal phosphatase (10 units, NEB) as directed by the person 5'dephosphorylated. Extract the plasmid with phenol: chloroform and add ethanol. Solution, washed with 70% ethanol, 10 μl H 2₂Resuspended in O (up Final concentration: about 50 ng of pBluescript II per μl). Second high The 4 maximal bands from the bridging / amplification product were 2% lower melting point as described above. It was cut out from an agarose gel. Takara DNA Ligation Reaction Kit (Takara B iochemical, Berkeley, CA), 4 μl of melted (72 ° C., 5 min) gel slice was added to 50 nl of reaction material in 50 n g of BamHI-cut, dephosphorylated pBluescript II. 1 After incubating at 6 ° C for 3.5 hours, sell using 8 μl of ligation material As instructed by the contractor,E. FIG. coliCompetent XL-1 Blue cells (St ratagene) was transformed. LB plate supplemented with ampicillin (150 μg / ml) The transformation mixture was placed on the plate and incubated overnight at 37 ° C. Got Colonies were grown in liquid culture and miniprep plasmid DNA was added. Analysis was performed as described in the art to confirm the presence of cloning products. The four largest product cloni from the second hybridisation / growth stage Plus the total population of products from the third hybridization / growth stage Was cloned into pBluescript II. 50 ng pBluescr 50 μl of the iptII vector (synthesized as above) was added as above. Ligated to 10 ng of the third hybridization / growth product in the reaction material. 16 ° C After incubating at room temperature for 2 hours, 10 μl of the ligation product was used toE. FIG. col i Competent XL-1 Blue cells Transformed. 60 colonies derived from the obtained transformation product were grown and Rep DNA was synthesized and analyzed by methods known in the art as described above. System Unique endonuclease digestion and dot blot hybridization Used to identify the loan.Example 4. Immunoisolation of a cDNA clone encoding the antigenic region of the HGBV genome A.Preparation of concentrated virus as a source of cloning material In addition to the method shown in Example 3, the following separation procedure was used to generate HGBBV The genome was isolated. 3 tamarins (T-1055, T-1038 and T-10 49) was inoculated with serum prepared from tamarin T-1053 described in Example 2. . Referring to Table 5, by the 11th day after inoculation, all 3 tamarins had higher liver enzyme levels. There was a rise. Tamarin T-1055 was killed 12 days after inoculation, and Tamarin T-1 038 and T-1049 were killed 14 days after inoculation. These three tamarins that About 3 to 4 ml of serum derived from each was pooled to obtain a total volume of about 11.3 ml. Pooh The clarified serum was clarified by centrifugation at 10,000 xg for 15 minutes at 15 ° C. Next And continuously this at 0.8, 0.45, 0.2 and 0. It was passed through a 1 μm syringe filter. The filtered material is then SW41-T 0.3 ml of CsCl at 41,000 rpm in an i rotor at 4 ° C. for 68 minutes Cushion [Density: 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM ED Concentrated by centrifugation through 1.6 g / ml in TA (pH 8.0). About 0.6m 1 CsCl layer was removed after centrifugation and divided into 3 0.2 ml aliquots, -7 Stored at 0 ° C. This pelleted material (in normal tamarin serum was then added to Tamarin T-1034). Prepared in 10)^-60.25 ml of the dilution was inoculated. First, 2 weeks after inoculation, T ALT liver enzyme level increased at -1034, and the level continued to increase for 7 weeks. And finally normalized by 10 weeks post inoculation (see FIG. 30, Example 14). No). This experiment demonstrated the infectivity of material concentrated from pooled tamarin serum Was. This material was shown to have a relatively high titer, so Using the source as a nucleic acid source for the construction of a cDNA library, as described below. Was. B.Construction of cDNA library A commercial RNA extraction kit (Strata gene, La Jolla, CA), aliquot (0.2m) of concentrated virus (above) RNA was extracted from l). Prior to the final precipitation step, the sample was placed in 4 equal aliquots. And then precipitated in the presence of 5 μg / ml yeast tRNA. these Only one of the aliquots was used for cDNA synthesis. Others stored at -80 ° C did. Commercial kits (Stratagene, La Jolla, CA) as directed by the manufacturer. ) Is used to synthesize a blunt-ended double-stranded cDNA that is phosphorylated from RNA did. The T4 DNA ligase kit (Stra) was then used as directed by the manufacturer. Tagene, La, Jolla, CA) using a double-stranded linker in a reaction material volume of 10 μl. -/ Primer at the cDNA end (sense strand, SEQ ID NO: 7; antisense Strand, SEQ ID NO: 8). As a result, all cDNA Mixed with identical 5'and 3'ends containing tI and EcoRI restriction enzyme recognition sites. It was obtained as a compound [G. Reyes and J. Kim,Mol. Cell. Probes 5: 473-481 (1991); A . Akowitz and L.L. Manuelidis,Gene 81: 295-306 (1989); and G. Inchauspe et al. ,Viral Hepatitis and Liver Disease, F.B. Hollinger et al., Eds., Pages 382-387. J (1991)]. Then the entire cDNA is The linker / primer sense strands are chosen so that amplification is independent of their sequence. Land oligonucleotide was used as a primer in the PCR reaction. this Depending on the procedure, the trace amount of cDNA present in the entire cDNA population can be efficiently cloned. CDNA that has been amplified to the desired level and thus represents the sequence in the starting material. A library was formed. Use the GeneAmp PCR kit (Perkin-Elmer) as directed by the manufacturer And used in a PE-9600 thermocycler. PCR was performed on 1 μl aliquots of the above ligation material in the presence of the otide primer. Performed (final concentration: 1 μM; reaction material volume: 50 μl). 30 as follows Cycle PCR was performed: 94 ° C. for 0.5 min denaturation, 55 ° C. for 0.5 min Annealing and extension for 1.5 minutes at 72 ° C. Then 1 μl aliquot of the obtained product The recoat was reamplified as above. The final PCR reaction product is then 1 time with phenol-chloroform (1: 1, v / v), 1 with equal volume of chloroform Extracted twice, then sodium acetate (final concentration, 0.3M) and 2.5 volumes of neat Water ethanol was added and precipitation was performed on dry ice for 10 minutes. The obtained DNA Pellets Resuspend in water and use the restriction enzyme EcoRI (New Englan) as directed by the manufacturer. d Biolabs). Then DNA-binding resin as directed by the manufacturer. (Prep-a-Gene, BioRad Laboratories) using the digested cDNA as a reaction mixture. Purified from the mixture and eluted in 20 μl distilled water. cDNA (8 μl) was added to 3 μg lambda gt11 vector in 30 μl reaction material volume. Ligated to the K.K. DNA arm (Stratagen, La Jolla, CA) at 4 ° C for 1-5 days did. GigaPack III Gold package extraction as instructed by the manufacturer 11 μl of the ligation material was applied to the phage head using the product (Stratagene, supra). It was caged. The resulting library had a recombination frequency of 89.3% and an average insert. The size of the kit contained about 1.73 million members (PFU) with about 350 base pairs. . C.Immunoscreening of recombinant GB cDNA library The antiserum used for the immunoscreening of the cDNA library was serum after inoculation. Collected from tamarins that showed elevated liver enzyme levels. For immune screening, Two separate antiserum pools were used. The first pool consists of 2 animals (T -1048 and T-1051; see Example 1, Table 2 and Example 2, Table 5, respectively. The second pool contains serum from a single animal (T-1034; FIG. 30, see Example 14)). Used The specific sera obtained are shown in Table 6. These samples were selected for use in immunoscreening a cDNA library. At the time of selection, these samples contained 1.4 or 1.7 recombinant CKS protein ( They have not been tested for their immunoreactivity with Example 13). Therefore, The results presented here indicate that these recombinant proteins in the antisera used Obtained regardless of any information regarding the presence or absence of HGBV antibodies to the quality It is. The procedure used for immunoseparation of recombinant phage was described by Young and Davis. Method [R.A. Young and R.W. Davis, PNAS 80: 1194-1198 (1983)] It has been changed as follows. One is T-1048 and T-1051 Two pools of antiserum were used, the other one was with T-1034-derived antiserum. An epidemiological screening experiment was conducted. In either case, with the antibodyE. FIG. coliTampa Primary antiserum prior to use to reduce non-specific interactions with the cytoplasm.E. FIG. co li Pre-adsorbed on extract. In the first experiment, T-1048 / T-1051 The serum pool was used to immunoscreen 1.29 million recombinant phage. 2 In the first experiment, 300,000 recombinant phages were immunized with T-1034 antiserum. Screened. Recombinant phage libraryE. FIG. coliStrand Y 1090_r- , And grown at 37 ° C. for 3.5 hours. Then plate the plate Cover with a nylon filter saturated with G (10 mM) and incubate at 42 ° C for 3.5 hours. I had a cube. Then filter the mixture with 1% BSA, 1% gelatin and 3%. In Tris-saline buffer containing Tween-20 ("blocking buffer"). Blocked at 22 ° C for 1 hour. Then filter the primary antiserum (blocking Incubated for 16 hours at 4 ° C. in 1: 100 dilution in buffer). Then Remove the primary antiserum and set aside for the next plaque purification, and add 0.1% Tween. The filters were washed 4 times in Tris-brine containing n-20. Then Phil 125-I-labeled (or alkaline-phosphatase conjugated) goat anti-human Ig Blockin containing G (available from Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) Incubation for 60 minutes at 22 ° C. in buffer, wash as above, then X Exposure to linear film (or J. Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Man ual , 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 The color was developed according to the established procedure. 5 immunities from this library Positive phage (4-3BI, 48-1A 1, 66-3A1, 70-3A1, 78-1C1) and then the above Infected tamarins (T-1048, T-1051, T-1034) using the method It was tested for binding specificity to the derived antisera. These recombinants are 3 Preinoculated sera that reacted with convalescent sera from each of the infected tamarins Encoded a polypeptide that did not react with (data not shown). To determine the immunological reactivity specificity of the polypeptide encoded by the recombinant phage. To demonstrate, a ply located 5'to the EcoRI cloning site Using the mer (SEQ ID NO: 9) and the primer located at the 3'position (SEQ ID NO: 10) , CDNA was recovered from the lambda phage genome by PCR. Then P The CR product was digested with EcoRI and as described in Example 13,E. FIG. coli It was ligated next to the expression plasmid pJ0201. The cDNA was designated as E of pJ0201. By inserting it into the coRI site, the translational open reading frame of this cDNA was lambda It was maintained as it was in the aging clone. Sub in pJ0201 expression vector The clones were cloned into 4-3B1.1, 48-1A1.1, 66-3A1.49, 70- 3A1.37 and 78-1C1. It was set to 17. Recovery from tamarin T-1034, T-1048 and T-1051 Prepared from cultures expressing these cDNAs with phased sera (1: 100 dilution) Was doneE. FIG. coliFor immunoblot analysis of lysates (as in Example 13). The specificity of each CKS fusion protein with the predicted size of the protein Immunological reactivity was shown (data not shown). Each of the cDNA The DNA sequence was determined and these clones were identified as HGBV-B virus (SEQ ID NO: It was found to have almost 100% sequence identity with the sequence of 11). 4 The sequence of the -3B1.1 insert (SEQ ID NOS: 12 and 13) was determined in its entirety. Although not sequenced, the sequencing part is HGBV-B from base pair 6834-7458. It shows 99.5% sequence identity with the sequence part in (SEQ ID NO: 11). Clone 4 HGBV-B (SEQ ID NO: 11) showing identity with the sequence obtained from -3B1.1 This region of the sequence is translated into a +1 open reading frame and the sequence listing as SEQ ID NO: 14. Is shown in. The sequence of the 48-1A1.1 insert (SEQ ID NO: 15) has the base HGBV-B from pair 4523-4752 (see SEQ ID NO: 11, Example 9) 100% sequence homology with the sequence part of Show oneness. The DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 15 is translated into a +1 open reading frame, It is shown in the sequence listing as SEQ ID NO: 16. 66-3A 1.49 insert The sequence of (SEQ ID NO: 17) is substantially 100 with the sequence of clone 48-1A1.1. It shows% sequence identity and therefore no protein translation in the sequence listing. 7 The sequence of the 0-3A1.37 insert (SEQ ID NO: 18) has base pairs 6450-67. 100% sequence identity with part of the sequence of HGBV-B (SEQ ID NO: 11) from 32 , Except that bases 6630-6632 of the HGBV-B sequence (SEQ ID NO: 11) are shown. 3 base pairs corresponding to The DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 18 is + It has been translated into two open reading frames and is given in the sequence listing as SEQ ID NO: 19. 78 -1C1.17 insert (SEQ ID NO: 20) has the sequence clone 70-3A1. It shows 100% sequence identity with the 37 sequences and therefore the sequence listing Is not shown. These data are lambda gt11 cDNA library CDNA clones isolated from the HGBV pathogen genome were derived from Brary was immunologically specifically recognized by sera from GB-infected tamarins Shown to encode a polypeptide doing. Clone 48-1A1.1 ("clone 48") 4-3B1.1,6 6-3A1.49, 70-3A1.37 and 78-1C1.17 are the above-mentioned Amer Deposited in ican Type Culture Collection. Embodiment 5 FIG. DNA sequence analysis of HGBV clones The unique clone obtained in Example 3 was used in the form of a kit [Sequenase (registered trademark) Version 2.0, USB] dideoxynucleotide chain termination method (Sanger et al., Supra) It was used for sequence morphology. These sequences do not overlap, and clone 4 ( SEQ ID NO: 21), clone 2 (SEQ ID NO: 22), clone 10 (SEQ ID NO: 23) , Clone 11 (SEQ ID NO: 24), clone 13 (SEQ ID NO: 25), clone 1 6 (SEQ ID NO: 26), clone 18 (SEQ ID NO: 27), clone 23 (SEQ ID NO: 28), clone 50 (SEQ ID NO: 29) and clone 119 (SEQ ID NO: 30) And is shown in the sequence listing. Clones 4, 2, 10, 11, 13, 16, 1 8, 23, 50 and 119 are A. T. C. C. Has been deposited with. Clone 2 A. T. C. C. Accession number 69556, clone 4 is A. T. C. C. Accession number 69557, clone 10 is A. T. C. C. Accession number 69558, Ku Loan 16 is A. T. C. C. Accession number 69559, clone 18 is A. T. C . C. Accession number 69560, clone 23 is A. T. C. C. Accession number 6956 1, clone 50 is A. T. C. C. Accession number 69562, clone 11 is A. T. C. C. Accession number 69613, clone 13 is A. T. C. C. Accession number 6 9611, and clone 119 are A. T. C. C. Consignment number 69612 is given Was. The sequence is based on the BLASTN algorithm (Altschul et al.,J. Mol. Biol. 215: 403-41 0 [1990]) was used to search the GenBank database. These arrays Neither was found in GenBank, but this However, it has not been characterized in the literature. The DNA sequence consists of 6 Sequence listing (SEQ ID NO: 21 is SEQ ID NO: 31-36) SEQ ID NO: 22 is SEQ ID NO: 37-42, and SEQ ID NO: 23 is SEQ ID NO: 43-48. SEQ ID NO: 26 is SEQ ID NO: 49-54, and SEQ ID NO: 27 is SEQ ID NO: 55-60. SEQ ID NO: 28 is SEQ ID NO: 61 to 66, and SEQ ID NO: 29 is SEQ ID NO: 67 to 72. Translated into). SEQ ID NO: 24 is SEQ ID NO: 73 (described in Example 9) Included in SEQ ID NO: 74-79 It has been translated. SEQ ID NOs: 25-30 are included in SEQ ID NO: 80 (described in Example 9) , SEQ ID NOS: 81-86. BLASTX algorithm (Gish et al.,Nature Genetics 3: 266-272 [1993]), and the translated sequence is It was used to search the PROT database. Again, these sequences are SWISS- Not found in PROT, as these sequences are still characterized in the literature. It has not been shown. Homologues using the BLASTN, BLASTX and FASTdb algorithms Searches show some sequence similarity, albeit low, with hepatitis C virus (Table 7 below). In particular, clones 4 (SEQ ID NO: 35), 10 (SEQ ID NO: 44), 11 (residues 1 to 166 of GB-4, frame 3 [SEQ ID NO: 76]), 16 (SEQ ID NO: 5) 0), 23 (SEQ ID NO: 65), 50 (SEQ ID NOs: 70 and 72) and 119 (G B-A residues 912-988, box 3 [SEQ ID NO: 83]), is translated by the amino acid level Homology in the range of 24.1-45.1% to various HCV isolates . Of particular importance is the translation of clone 10 (SEQ ID NO: 44), which is a putative R of HCV. Slight homology to NA-dependent RNA polymerase That is what I showed. In a putative RNA-dependent RNA polymerase of other positive-strand viruses Conserved amino acids present in (Jiang et al.,PNAS 90: 10539-10543 (1993)) and Claw 10 (SEQ ID NO: 44) was compared with the deduced amino acid translation product to determine the dependence on other RNAs. Conserved amino acid residues of the RNA polymerase in clone 10 (SEQ ID NO: 44) It became clear that it was saved. This includes RNA-dependent RNA polymers Canonical GDD (Gly-Asp-Asp) signature sequence It is included. Therefore, clone 10 (SEQ ID NO: 44) is a viral RNA It appears to encode a dependent RNA polymerase. Surprisingly, B Using the LASTN algorithm, only clone 10 (SEQ ID NO: 44) It showed sequence homology with HCV at the nucleotide level. Low H at the amino acid level Clone 4 (SEQ ID NO: 21), 16 (SEQ ID NO: 26), 23 with CV homology (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) and 119 (SEQ ID NO: 30) are It was not detected by BLASTN in the GenBank search. further, Clone 2 (SEQ ID NOS: 37-42), 13 (SEQ ID NOS: 25 and 37-42) aligned 18 (SEQ ID NOS: 27 and 55-6) 0) is, when searching with the above GenBank or SWISS-PROTO, No significant nucleotide or amino acid homology to HCV should be demonstrated as follows. won. Embodiment 6 FIG. Extrinsic of HGBV clones HGBV clones are normal or HGBV infected tamarin liver DNA, normal human Lymphocyte DNA, yeast DNA orE. FIG. coliIt was not detected in DNA. This These are HGBV clones 2 (SEQ ID NO: 22) and 16 (SEQ ID NO: 26). In addition, all HGBV clones were analyzed by genomic PCR Tamarin, human, yeast andE. FIG. coliExtrinsic HGBV sequence for the genome Confirmed sexual origin. These data show that the virus of HGBV sequence described in Example 5 Consistent with sexual nature. A.Southern blot analysis Low speed pellet of HGBV infected tamarin and normal tamarin liver homogenate To obtain a tamarin liver nucleus (described below). As directed by the distributor DNA was extracted from the nucleus using a commercially available kit (USB cat. # 73750). Tamarin D NA was treated with RNase during the extraction process. Human placenta DNA (Clontech, Palo Alto, CA), yeast DNA (Saccharomyces cerevisiae, Clontech) andE. FIG. c oli DNA (Sigma) was obtained from commercial sources. BamHI (NE Digested with B). Digested DNA (10 μg) and RNA products (Example 3B? (0.5 μg each) and electrophoresed on a 1% agarose gel to obtain Sambrook Hybond-N + Nylon Men as described (pp. 9.34ff). Bran was blotted with a capillary (Amersham, Arlington Heights, IL). Membrane the DNA with alkaline as directed by the membrane vendor. Fixed to Membranes in RapidHyb solution (Amersham) at 65 ° C for 3 days Prehybridized for 0 minutes. A radiolabeled probe of HGBV sequence was prepared by PCR. 1x PCR buffer Liquid II (Perkin Elmer), 2 mM MgCl₂, 20 μM dNTP, 1 each μM clone-specific sense and antisense primers (for clone 2 SEQ ID NOs: 87 and 88; SEQ ID NOS: 89 and 90 for clone 4; SEQ ID NOS: 91 and 92 for loan 10; sequence for clone 16 Nos. 93 and 94; SEQ ID NOs: 95 and 96 for clone 18; clones SEQ ID NOs: 97 and 98 for 23; SEQ ID NO: 9 for clone 50 9 and 100), 1 ng of HGBV clone plasmid (see Example 3 [E]). Description), 60 μCiα-³²P-dATP (3000 Ci / mmol) and 1.2 Using 5 Units of AmpliTaq® Polymerase (Perkin Elmer) 50 μl PCR was formed. React the reaction material at 94 ° C for 30 seconds and at 55 ° C for 30 seconds. And 72 ° C for 30 seconds for a total of 30 cycles of amplification, then Final extension at 72 ° C for 3 minutes. Labels that were not included were instructed by the vendor As described above, Quick-Spin (registered trademark) G-50 spin column (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Prehybridized men The probe was denatured (99 ° C., 2 minutes) before addition to the bran. Prehybridized membrane (2 x 10⁶dpm / ml) Add the sensible probe and you were instructed by the RapidHyb® distributor. The filter was hybridized at 65 ° C. for 2.5 hours. Hybridize Washed membrane with gentle stringency (1 x SSC, 0.1% SDS at 65 ° C) Clean, then use an intensifying screen to make an autoradiograph film at -80 ° C for 72 hours. Exposed. These conditions are duplicated in a single copy using a similar radiolabeled probe. It was devised to detect genes. result Indicates that the clone 2 (SEQ ID NO: 22) and clone 16 (SEQ ID NO: 26) sequences are positive. DNA from liver of normal or HGBV-infected tamarin (FIGS. 15 and 16, respectively). Lanes 1B and 3B), human DNA (FIGS. 15 and 16, lane 1A), yeast D NA (Figures 15 and 16, lane 2A) orE. FIG. coliDNA (Figure 15 and Figure 16, lane 3A) shows that it did not hybridize. In addition, Liver amplicon DNA (FIGS. 15 and 16, lane 4A, Example 2.B. (Derived from the pre-HGBV-inoculated tamarin plasma described in 1). No bridging was detected. In contrast, the tester amplicons (Fig. 1 5 and FIG. 16, lane 6A, Example 2. The total nucleic acid extraction and reverse transcription step described in B. Derived from infectious HGBV tamarin plasma) and 3 deductions / selections Products of selective amplification (productions from the first, second and third deductions / selective amplifications respectively) Figure 15 and Figure 16, lanes 7A, 8A and 4B) for the A bridging signal was observed. These data are for HGBV clone 2 (SEQ ID NO: 22) and 16 (SEQ ID NO: 26) in the nucleic acid sequence amplified from the infectious source Detected in HGBV clone 2 (SEQ ID NO: 22) and 16 (SEQ ID NO: 26) are tamarin, human, yeast orE. FIG. coli It shows that it is not derived from the genomic DNA sequence. B.PCR analysis of genome To further show the exogenous nature of the HGBV sequences and to support their viral origin , Tamarin, human, yeast andE. FIG. coliPCR on the derived genomic DNA Was done. J. mentioned above. Normal tamarin kidney as described by Sambrook et al. DNA from visceral and liver tissues was synthesized. Yeast, rhesus monkey kidney and human placenta DNA was obtained from Clonotech.E. FIG. coliDNA was obtained from Sigma. GeneAmp mainly from Perkin-Elmer-Cetus as instructed by the vendor PCR was performed using the (registered trademark) reagent. 3 for each 100 μl reaction material 00 ng of genomic DNA was used. HGBV cloned sequence (for clone 2 SEQ ID NOs: 87 and 88; for clone 4, SEQ ID NOS: 89 and 90; SEQ ID NOS: 91 and 92 for clone 10; SEQ ID NOs: 93 and 94; SEQ ID NOS: 95 and 96 for clone 18; No. 23, SEQ ID NOS: 97 and 9 8; for clone 50, PCR primer from SEQ ID NOs: 99 and 100) Was used at a final concentration of 0.5 μM. 35 cycles of PCR (1 min at 94 ° C; 5 5 ° C. for 1 minute; 72 ° C. for 1 minute), followed by an extension cycle at 72 ° C. for 7 minutes Was. PCR products were separated by agarose gel electrophoresis, using ethidium bromide Stain nucleic acid directly and then irradiate with UV light and / or nitrose by Southern method. After transfer to the Rulose filter, hybridize to the radiolabeled probe. And visualized it. The probe was formed as described in Example 6A. Dige Fast-Pair Hybridization made by ne (Belstville, MD) Prehybridize filters in Solution for 3-5 hours, then 1 00-200 cpm / cm²Using Fast-Pai at 42 ° C. for 15 to 25 hours Hybridized in rHybridization Solution. G.G. Schlauder et al.J. Virol. Methods 37: 189-200 (1992). The filter was washed and the intensifying plate was used, and Kodak X was used for 15 to 72 hours at -70 ° C. -Exposed to Omat-AR film. Figure 17: Ethidium bromide stained 1.5% agarose The gel is shown. Figure 18: Radiolabel from clone 16 (SEQ ID NO: 26) Southern blot analysis from the same gel after hybridizing to the probe. Shows a tradiogram. The normal tamarin liver and kidney DNA has 0.05 genome equivalents. Clone 16 (SEQ ID NO: 26) sequence spiked in quantity (lanes 17 and 18) Clone 16 (SEQ ID NO: 26) sequence, although it is possible to detect Consistent with its exogeneity, was found by genomic PCR analysis in tamarin (Fig. 17 and Fig. 18, lanes 9 and 10), rhesus monkey (lane 11) or human genomic DNA ( Lane 12) also contains yeast orE. FIG. coliIt was also tested in DNA (data not shown). It wasn't served. Furthermore, a primer derived from the human dopamine D1 receptor gene , 1000-1019 base pairs (sense primer) and 1533-1552 salt Base pair (antisense primer) (GenBank accession number: X55760, RK Sunaha) ra et al.Nature 347: 80-83 [1990]) is a primate genomic DNA (Tamarin kidney, tamarin). Figure 17, lanes 2, 3, 4, corresponding to marine liver, rhesus and human DNA. And 5,), which successfully amplified the dopamine D1 receptor DNA from Low copy number (ie single copy) array Shows the usefulness of this method to detect Lanes 1 and 8 are dopa 16 primers for the Min D1 receptor and clones (SEQ ID NOs: 93 and 94) H for₂O control. Lane 6 amplified with dopamine receptor primer Containing 100 fg of clone 16 (SEQ ID NO: 26) plasmid DNA. Leh 14, 15, 16 and 20 are claws of 1, 3, 10 and 100 fg, respectively. 16 (SEQ ID NO: 26) plasmid DNA. Lanes 7 and 19 are markers It is. PCR-PCR specific for clones 2, 4, 10, 18, 23 and 50 above. Similar results were obtained with Limer (data not shown). Clone 2 (SEQ ID NO: 22), 4 (SEQ ID NO: 21), 10 (SEQ ID NO: 23), 18 (SEQ ID NO: 27), No results were obtained for 23 (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) at this point. Yes. However, clones 4 (SEQ ID NO: 21), 10 (SEQ ID NO: 23), 18 (sequence No. 27) and 50 (SEQ ID NO: 29) sequences are Tamarin, human, yeast andE. FIG. c oli It was not detected in DNA (Rhesus monkeys were not tested), which Of these sequences are exogenous to the genomic DNA source tested, and To support the origin of doing. Example 7. Presence of HGBV sequence in tamarin serum The presence of HGBV clone sequence in pre-inoculation and acute phase T-1053 plasma was detected by PCR. I investigated more. Since the HGBV genome can be DNA or RNA, PCR and R T-PCR was performed. In particular, the total nucleic acid was plasma as described in Example 3 (A). Extracted from. For an equivalent amount of 5 μl plasma nucleic acid as described in Example 6 (B) PCR by PCR, mainly according to the manufacturer's instructions Gene from Perkin-Elmer-Cetus Amp® RNA PCR kit was used to Immers (SEQ ID NOs: 87 and 88 for clone 2; for clone 4 SEQ ID NOs: 89 and 90; SEQ ID NOS: 91 and 92 for clone 10; SEQ ID NOs: 93 and 94 for loan 16; sequence for clone 18 Nos. 95 and 96; SEQ ID NOS: 97 and 98 for clone 23; clones For 50, RT-PCR was performed using SEQ ID NOs: 99 and 100). La CDNA synthesis was initiated using the undamaged hexamer. Stain and hybridize PCR products with ethidium bromide. Due to the formation of HGBV clone sequence 2 (SEQ ID NO: No. 22), 4 (SEQ ID NO: 2), 10 (SEQ ID NO: 23), 16 (SEQ ID NO: 26), 18 (SEQ ID NO: 27), 23 (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) are present But was shown to be absent in pre-inoculated T-1053 plasma (data not shown). Not). Furthermore, HGBV clones 2 (SEQ ID NO: 22), 4 (SEQ ID NO: 21), 10 (SEQ ID NO: 23), 18 (SEQ ID NO: 27), 23 (SEQ ID NO: 28) and 50 (SEQ ID NO: 29) Sequence is HGBV inoculum infused with Tamarin T-1053 Was detected in H205 (see Example IB). These results Table 8 summarizes. The HGBV clone sequence was detected by RT-PCR in acute phase plasma. Note that it was only detected. HGBV clone sequence Detected in acute phase plasma by PCR only after reverse transcription step to convert to DNA The fact that some of these clones had a low homology with HCV isolates And RNA-dependent RN of HGBV clone 10 (SEQ ID NO: 23; Example 5) Along with the presence of sequences encoding conserved amino acids found in A polymerase, H GBV is an RNA virus It suggests. R of tamarin plasma panel with HGBV clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) HGBV in other individuals experimentally infected with HGBV by T-PCR analysis The presence of clone 16 (SEQ ID NO: 26) was confirmed. Described earlier (G.G. Schlauder et al. ,J. Virological Methods 37: 189-200 [1992]). Tamarin-derived plasma 2 obtained before and after experimental infection with seed material Nucleic acid was isolated from 5 μl. Nucleic acid precipitated with ethanol was treated with 3 μl of DEPC. Reason H₂Resuspend in O. Perkin-Elmer-Cetus primarily according to the manufacturer's instructions GeneAmp RNA PCR kit manufactured by Was. CDNA synthesis was initiated using random hexamers. The obtained cDNA Using clone 16 primers (SEQ ID NOs: 93 and 94) at 0.5 μM final PCR was performed at the concentration. 35 cycles of PCR (94 ° C for 1 min; 55 ° C for 1 min; 72 ° C. for 1 minute) followed by an extension cycle at 72 ° C. for 7 minutes. PCR product Were separated by agarose gel electrophoresis and the nucleic acid was directly stained with ethidium bromide. UV irradiation later and / or as described in Example 6B. Sea urchin transferred to nitrocellulose filter by Southern blotting It was then hybridized to a radiolabeled probe for visualization. Figure 19 shows a 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide. Figure 20 , Hybridized to a radiolabeled probe from clone 16 (SEQ ID NO: 26) 2 shows an autoradiogram by Southern blotting from the same gel after H₂ Normal O and human sera are shown in lanes 1 and 2. Lanes 3, 19 and 2 0 is a marker. Lanes 4, 8, 12 and 16 are from uninfected tamarin serum Yes, lanes 6, 10, 14 and 18 are from infected tamarin serum. these The results show that the HGBV clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) is Tamarin T-1053. , It was also detected in other individuals infected with HGBV, but not in non-infected individuals. It shows that it was not done. Tests acute-phase sera from 5 H205-infected animals I did it. Clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) was used in 3 of these animals 10, T-1049, 14 days after inoculation (dpi); Lane 14, T-1051. , 28 dpi; lane 18, T-1055, 16 dpi]. Was. Clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) shows 5 animals (lane 4, T-1048; lane 8, T-1). 049; Lane 12, T-1051; Lane 16, T-1055; T-1057. (Not shown) was not detected in any of the pre-inoculation sera. These results are Lone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) may be from an infectious HGBV pathogen Suggests. Two in five acute phase plasmas (lane 6, T-1048, 28 dp i; T-1057, 14 dpi, not shown), clone 16 sequence (SEQ ID NO: 2) The absence of 6) is not compatible with the acute degradative nature of HGBV infection in tamarins. Relatively low sensitivity of clone 16 RT-PCR (clone 16 sequence (sequence It is assumed that about ≧ 1000 copies of the number 26) can be detected). Therefore, acute phase plasma from two negative animals was used for the RT-PCR assay used. Titers of HGBV below the detection level of. These two animals are black Observation result by RT-PCR that was positive for lane 4 (SEQ ID NO: 21) The result (Example 14) shows the presence of RNA sequences of one virus (including clone 4). And the absence of detectable RNA sequences from the second virus (including clone 16) May be reflected.Embodiment 8 FIG. Northern blot analysis of HGBV sequences in the liver of infected tamarins. HGBV clone sequence was detected by RT-PCR and H205 inoculation in acute phase tamarin plasma. These sequences are likely to have their origin in the HGBV genome. Was. Extracted from H205-infected tamarin T-1053 by another RT-PCR assay. Demonstrated the presence of HGBV sequences in liver RNA (data not shown) . Therefore, in order to know the size of the HGBV genome, the liver of H205 infected and uninfected tamarins was determined. Northern blot analysis with visceral RNA was performed. RNA isolation kit (Stratagene, La Jo , H205-infected tamarin T-1053 liver 1.2. Total cellular RNA was extracted from 5 g and 1.0 g liver of control uninfected tamarin T-1040. Total RNA (30 μg) was electrophoresed through a 1% agarose gel containing 0.6 M formaldehyde. Move (RM Fourney et al.Focus10: 5-7, [1988]), and 20 × SCC (pH In 7.0) it was transferred by capillary action to a Hybond-N nylon membrane (Amersham). J. Sambro ok and others, Molecular Cloning- A Laboratory Manual, 2nd edition (1989). Up the RNA UV-crosslink the nylon film and bake the nylon film in a vacuum oven at 80 ° C for 60 minutes. I attached it. PIPES 0.05 M, sodium phosphate 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, SDS 5% The blot was prehybridized in 25 ml of a solution containing 60 ° C. for 2 hours. G.D. Virca et al., Biotechniques8: 370-371 (1990). With radiolabeled DNA probe The above solution was removed and 10 ml of fresh solution was added before the hybridization of. The probe used for hybridization was clone 4 (SEQ ID NO: 21; 221 bp) Clone 50 (SEQ ID NO: 29; 337 bp) and 2000 bp cDNA corresponding to human β-actin was. P. Gunning, et al.Mol. and Cell. Biol. 3: 787-795 (1983). Random Use the Limer labeling kit (Stralagene, La Jolla, CA) according to the recommended usage, [α-³²The probe (50 ng) was radiolabeled in the presence of P] dATP. Ratio of each probe Radioactivity is about 10⁹It was cpm / μg. Blots were hybridized at 60 ° C for 16 hours , As described above (G.D. Virca et al., Supra) and Kodak X-Omat-AR Fat at -80 ° C. Exposed to the film. A photo of the resulting autoradiograph is shown in Figure 21A. . Lane 1, lane 3, and lane 5 contain liver RNA from T-1040 and lane 2 And lane 4 and lane 6 contain liver RNA from T-1053. Lane 1 and lane 2 Hybridizes with the human β-actin cDNA probe. Lane 3 and lane 4 hybridized with the clone 4 probe (SEQ ID NO: 21). Lane 5 and lane 6 hybridize with clone 50 probe (SEQ ID NO: 29). The lid was formed. The exposure time was 5 hours at -80 ° C for lane 1 and lane 2, Lanes 3 to 6 were at −80 ° C. for 56 hours. 28S ribosomal RNA position The position of the 18S ribosomal RNA is indicated by an arrow. These ribosomal RNAs Has a relative size of 6333 nucleotides and 2366 nucleotides, respectively. J. Sambroo k et al., supra. Clone 4 probe (SEQ ID NO: 21) and clone 50 probe (SEQ ID NO: 29) Hybridized with RNA species contained in RNA extracted from the liver of infected tamarin (T-1053). (Fig. 21A, lanes 4 and 6). This hybridizable RNA Species size depends on the relative mobility of 28S and 18S ribosomal RNAs. Was calculated to be about 8300 nucleotides. Both probes are identical RNA species It is considered to have hybridized. Both of the above probes were non-infected tamarins (T-1040 ) Did not hybridize with RNA extracted from the liver (Fig. 21A, lane 3 and Lane 5). These results show that clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 50 (SEQ ID NO: No. 29) Within the same 8.3 Kb transcript as sequence Indicates that it is present. To know the strandedness of the HGBV RNA genome, the strand specificity (Strand-sp ecific) radiolabeled DNA probe, And used by asymmetric PCR. Purified clone 50 DNA (SEQ ID NO: 29) , Clone 50 negative strand specific primer (SEQ ID NO: 99) or clone 50 positive 1 μM in separate reactions containing either of the different strand-specific primers (SEQ ID NO: 100) It was used as a template so that the final concentration of This reaction mixture is Instead of dATP normally contained in compound, (α³²P-dATP] (Amersham; 3000Ci / mmol ) Was included. After amplifying the template for 30 circuits, the non-incorporation [α³²P-dATP] Quick- Indianapolis, IN) was used according to the recommended usage and removed. Double-stranded clone 50 Radioactivity was added to a DNA dot blot containing a 10-fold dilution of DNA (SEQ ID NO: 29). Hybridization of ligation probe, and both of the above probes have approximately equal sensitivity (Data not shown). Uninfected tamarin T-10 as described above Liver RNA extracted from 40 and infected tamarin T-1053 Along with RNA blot containing a total of 30 μg of extracted liver RNA, radiolabeled pro Hybridized. A photo of the resulting autoradiograph is shown in Figure 21B. Show. Lanes 1 and 3 contain liver RNA from T-1040, and lanes 2 and 3 4 contains liver RNA from T-1053. Lanes 1 and 2 are positive for clone 50 Hybridizes with strand probe (i.e., positive strand is radiolabeled and negative Strand detected: SEQ ID NO: 100), lanes 3 and 4 are clone 50 negative strand pro Hybridized with the probe (ie, the negative strand was radiolabeled and the positive strand Detected: SEQ ID NO: 99). The blot was exposed for 18 hours at -80 ° C. 28S ribosomal The position of RNA and that of 18S ribosomal RNA are indicated by arrows. As shown in Figure 21B, clone 50 positive and negative strand probes (SEQ ID NO: 100 and 99) is an RN of about 8.3 kilobases extracted from the liver of infected tamarin T-1053. Hybridized with A species (Fig. 21B, lanes 2 and 4), but uninfected Tama Phosphorus T-1040 did not hybridize with RNA extracted from liver (Fig. 21B). , Lane 1 and lane 3). This corresponds to clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone shown above. Lone 50 (SEQ ID NO: 29) double-stranded pro It was in agreement with the northern blot results obtained using the probe. Stronger signa Was obtained using a strand probe negative for clone 50 (SEQ ID NO: 99) (FIG. 21B, Lane 4 vs. Lane 2) means that the dominant RNA species present in the liver of infected tamarins It was suggested to be the positive (ie coding) strand.Embodiment 9 FIG. HGBV clone sequence extension A.Generate HGBV array A clone obtained as described above in Example 3 and sequenced as in Example 5. Each of the was considered to have been obtained from a separate region of the HGBV genome. Therefore, the same To obtain a sequence from another region of the HGBV genome that remains between the defined clones, and In order to confirm the sequence of the RNA clone, several PCR walking experiments (PCR walking experiment) was performed. Total nucleic acid was a 50 μl aliquot of infected T-1053 plasma as described in Example 3 (A). Extracted from. Simply put, the precipitated nucleic acids Standard RT-PCR was performed with the PCR kit (Perkin-Elmer) according to the recommended usage. Concise Speaking of 2mM MgCl₂Sensitized reverse transcription of extracted nucleic acid with 1 μM and 1 μM primer For the cDNA product of the reaction Then, PCR was performed. 35 cycles of denaturation-annealing-extension (94 ℃, 30 seconds; 55 ℃, 30 seconds; 72 ℃, 2 minutes), followed by extension at 72 ℃ for 3 minutes. Was. Reactions were kept at 4 ° C prior to agarose gel analysis. Customizing these products Cloned into pT7 Blue T-vector plasmid (Novagen) by manual procedure . Table 9 shows the results obtained when carrying out the above reaction. PCR transfer described by Sorensen et al. (J. Virol, 67: 7118-7124 [1993]). A modified version of the dynamic procedure was used to obtain additional HGBV sequences. In short, , Total nucleic acids were extracted from infected tamarin T-1053 plasma and reverse transcribed. The obtained cDNA , MgCl₂Similar to the procedure of Sorensen et al. (Supra) except that 2 mM was used. Amplified in a μl PCR reaction (PCR 1). 35 denaturations-animals for these reactants Ring-extension (94 ℃, 30 seconds; 55 ℃, 30 seconds; 72 ℃, 2 minutes), then at 72 ℃ Extension was carried out for 3 minutes. Strepta as described by Sorensen et al. (Supra) Isolate biotinylated products using paramagnetic beads (Promega) coated with vidin did. 20-35 total denaturations-annealing as described by Sorensen et al. -"Nested" PCR ("nested" PCR for extended and streptavidin-purified products. PCR 2) was performed. The products obtained and the PCR plates used to generate them. The immers are shown in Table 10. These products were isolated from low melting point agarose gels using conventional techniques and were isolated from pT7 Bl It was cloned into the ue T-vector plasmid (Novagen). As described above, RNA ligation was used to obtain the 5'end sequence from the viral genomic RNA. -Mediated 5'RACE (rapid amplification of cDNA ends:RapidAmplification ofcDNAEnds) Used. Briefly, Used according to recommended usage. The source of viral RNA was extracted as above The acute phase was T-1053 plasma. Individual virus species used for reverse transcription (RT) Specific oligonucleotides for the first PCR amplification (PCR 1) and the second PCR amplification (PCR 2) and are shown in Table 11. The binding anchor primer and its complementary PCR primer Supplied by the manufacturer. Using the GeneAmp RNA PCR Kit (Perkin Elmer) PCR was performed according to the recommended usage. The product produced by RNA ligase mediated 5'RACE was run at low melting point as described above. Isolated from agarose gel and placed in pT7 Blue T-vector plasmid (Novagen) Cloned. To obtain alternative sequences at the 5'and 3'ends of the HGBV-B sequence (see " Evidence for the presence of two HCV-like flaviviruses within HGBV "), RNA A circularization experiment (RNA circularization experiment) was performed. (This method is based on C.W. Man dl et al. (1991)Biotechniques,Vol 10 (4): Based on the method described in 485-486. It is based on ) (Except that tRNA was replaced with 1 μg of glycogen during precipitation) Total nucleic acid was purified from 50 μl of T-1057 plasma (14 days after H205 inoculation). Nucleic acid pellet Was redissolved in 16.3 μl of DEPC-treated water, and 2 × TAP buffer (1 × = 50 mM NaOAc, pH 5.0, 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM ATP) 25 μl Bacoate pyrophosphatase (20 units; Sigma) 8.7 μl was added. Mixture 37 Incubated for 60 minutes at ° C. Chloroform with phenol (saturated with water) Samples were extracted using NaOAc / EtOH in the presence of glycogen (1 μg). Settled. Dissolve the pellet in 83 μl DEPC water and add 10x RNA ligase buffer. (New England Biolabs, NEB) 10 μl with RNase inhibitor (Perkin Elmer) 2 μl and T4 RNA ligase (NEB) 5 μl Was added. The mixture was incubated at 4 ° C for 16 hours. Use phenol as above The sample was extracted with chloroform and precipitated with NaOAc / EtOH. Superscript RT (GIBCO / BRL) was used according to its recommended usage and SEQ ID NO: 146 1/10 of bound RNA was used in reverse transcriptase (RT) reaction using . Half of the RT reaction mixture was loaded with biotinylated oligonucleotide primer (SEQ ID NO: No. 146) and the second oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 133) in the presence of PCR1. Used as above for. Streptavidin coating as in Sorensen et al. (Supra) The PCR1 product was purified from the reaction mixture using coated magnetic beads. Purified PCR1 The product (2 μl out of 30 μl) was used as template for PCR2. Oligonu PCR2 using the Cletide primer (SEQ ID NOs: 147,154) yielded 1200 bp A product was obtained, which was cloned into the pT7 Blue T-vector plasmid, Sequenced as follows. Sequence analysis of two independent clones from this experiment (One clone has a sequence of 18 T residues and Regions that have a sequence of T residues but overlap with a known sequence. Region shows 100% identity and reveals a new sequence of 270 additional bases became. The above cyclization experiments were not obtained with standard 3'-RACE or 5'-RACE techniques The sequences from both the 5'end and the 3'end of the HGBV-B virus genome were given. Only And another PCR experiment using primers designed from the newly obtained sequence. Even after, it was difficult to find the exact 5'-3 'junction. Therefore, HGBV -B RNA isolated from liver of T-1053 to better characterize the 5'end of the genome Primer extension experiments were performed using the prepared RNA. As described in Example 7, T-1053 liver and control (ie, uninfected) animals (T-10 Total cellular RNA was isolated from the liver of 40). Antisense oligonucleotide (sequence 155), using T4 polynucleotide kinase (NEB)⁷ CPM / γ− for specific activity of μg³²It was end-labeled with P-ATP (Sambrook et al.). Primer Were annealed to 30 μl of T-1053 liver RNA and T-1040 liver RNA in separate reactions. And use MMLV reverse transcriptase (Perkin-Elmer) as described above (Sambrook et al.). And extended. The products were analyzed on a 6% sequencing gel. Primer extension HGBV-B cyclized with the same primer used for length. A sequence ladder created from one of the Played the role of. A 176 bp primer extension product was obtained from T-1053. Non-infected animal (T-1040) Primer extension using liver RNA extracted from Therefore, the product obtained from the HGBV-B genome was presented. Obtained these generations The length of the product depends on the 5'end of the genome, such as that present in the liver of infected animals. , AUG start codon was shown to be located 442 nucleotides upstream. In order to confirm the 3'position of the sequence obtained in the above cyclization experiment, the predicted 3'end RT-PCR was performed using the primers corresponding to (see reaction 1.25 in Table 2). Want). Infection T-10 (as above) using SEQ ID NO: 156 and SEQ ID NO: 157 RT-PCR of 53 plasma gave a product of 450 bp. In contrast to this, SEQ ID NO: RT-PCR using the complement of 157 and SEQ ID NO: 147 resulted in a detectable PCR product. Not obtained (data not shown). These data are 3'of the above genome This suggests that the end is located 50 nucleotides downstream of the poly T system. The cloned products from Tables 9, 10 and 11 and the above RNA cyclization experiments were tested in Example 5 Sequencing was done as previously described in. Interestingly, the reactions 1.4, 1.6, 1.9, The cloned products of 1.10 and 1.11 have the above two primer sequences at their ends. It was found to contain only one, which means that these products Suggests that it occurred as a result of a random priming event. Was. PCR / sequencing experiments were performed in products 1.4, 1.6, 1.9, 1.10, 1.11. The generated sequence is clone 4 (SEQ ID NO: 21) and / or clone 50 (SEQ ID NO: 29) Associated with. In addition, the sequences obtained from each of the reactions were identical to HCV. Was limited. Therefore, these products should only be attached to one end of the PCR product. Even if it is the result of false priming, it is considered to contain an authentic HGBV sequence. Was done. The product from reaction 1.14 was also considered to be the result of a false initiation of synthesis. Was. In this case, the complement of SEQ ID NO: 160 was added to the 5'end of the product obtained from reaction 1.14. Discovered (Figure 22, GB-B). Sequence number 160 was obtained from sequence number 161 in GB-A. This was unexpected as it is being done. However, the product obtained from reaction 1.14 And the product obtained from reaction 2.8, the sequence identity is different. Reaction 1.14 contains the authentic HGBV sequence, along with a determination experiment (data not shown) Proved. The complement of SEQ ID NO: 160 is upstream of SEQ ID NO: 162 and is included in the GB-B sequence. Apparently has sufficient identity to act as a PCR primer . Sequences obtained from the products shown in Tables 9, 10 and 11 above, and the above RNA cyclization The sequence obtained from the experiment was combined with the GCG Package (Version 7) program. Assembled in the shape of a contig. For an overview of this assembled contig As shown in FIG. GB Contig A (GB-A) is 9493 bp in length, all of which were sequenced. SEQ ID NO: 163. GB-A is clone 2 (SEQ ID NO: 22) and clone 16 (SEQ ID NO: 26), clone 23 (SEQ ID NO: 28) and clone 18 (SEQ ID NO: 27) Includes clone 11 (SEQ ID NO: 24) and clone 10 (SEQ ID NO: 23). SEQ ID NO: 163 Has been translated into three open reading frames and is presented in the form of a sequence listing as SEQ ID NOs: 164-392. Have been. GB contig B (GB-B) is 9143 bp and is shown in SEQ ID NO: 393. GB- B (SEQ ID NO: 393) was cloned with clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 50 (SEQ ID NO: 29). Includes loan 119 (SEQ ID NO: 30) and clone 13 (SEQ ID NO: 25). Sequence number No. 393 is translated into one open reading frame, SEQ ID NO: It is shown in the form of a sequence listing as 396 and 397. Of the UTR from the 5'end and the 3'end It is possible to translate each into six reading frames. B.Evidence for the presence of two HCV-like viruses in HGBV 1.Evidence for GB-A and GB-B representing two different RNA species GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) and HCV-1 (GenBank accession # M6 7463) and GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) and HCV-1 Indicates that and are all different sequences. GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: No. 393) and HCV-1 nucleic acid sequence dot plot analysis using GCGPackage (Version 7 ) Was used. 21 window sizes and 14 stringencies (stringen cy) and GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are compared to HCV-1. It was discovered that it contained very distinct nucleotide sequences (Fig. 23). Follow GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are different strains or genes of HCV. It does not represent type, nor does it represent different strains or genotypes from each other. this The analysis revealed that a short region with limited nucleotide identity was GB -NS (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) with NS3-like and NS5-b-like sequences, And found in the NS3 and NS5b sequences of HCV. However, the putative NTP binding Licase and RNA-dependent RNA polymerase correspond to NS3 and NS5b, respectively. Conserved in all flaviviruses, the nucleotide identity within the region Gender is not surprising (see below). GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) Represent different RNA molecules, and they are not different regions of the same RNA molecule. Were demonstrated by the 5'RACE experiment (above), and the Noza (described in Example 8) Evidenced by immunoblot data. First, the GB-A ( SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) were shown to have different 5'ends. Was. Since there is only one 5'end of the RNA molecule, GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: No. 393) represents a separate RNA molecule. Second, clone 4 and clone 50 (both GB-B [SEQ ID NO: 393], SEQ ID NOS: 21, 29, see Example 8) 8300 detected in liver RNA of infected tamarins by Northern blotting using The base RNA molecule was approximately in size with GB-B (SEQ ID NO: 393, 9143 bp). GB If -A and GB-B are each part of the same RNA molecule, then Must have a Northern blot product with at least 17,000 bases . These data show that GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are HCV variants. Nucleosides of two different RNA molecules that are neither shape nor variant of each other It shows that it is a tide sequence. Northern blot analysis and PCR studies of T-1053 showed that GB-A (SEQ ID NO: 163) and G-A Two RNA species respectively corresponding to BB (SEQ ID NO: 393) were found in the liver of T-1053. It was found that they do not exist in equal amounts. As mentioned above, neither Clone 4 and clone 50 obtained from GB-B (SEQ ID NO: 393) (SEQ ID NOS: 21, 29, respectively) ) Is the 8.3 kb RNA present in the infected liver of T-1053 (as described in Example 8). Hybridized with the seed. In contrast, both are GB-A (SEQ ID NO: 163) Clone 2 (SEQ ID NO: 22), clone 10 (SEQ ID NO: 23) and clone 16 obtained from (SEQ ID NO: 26) and clone 23 (SEQ ID NO: 28) showed T-1053 liver in the same experiment. It showed no hybridisation with visceral RNA (data not shown). Addition Therefore, it was confirmed that the clone 4 PCR and the clone 16 PCR had the same sensitivity. Demonstrated using a standard template (data not shown), Clone 16 PCR is a cDN generated from T-1053 liver RNA by ethidium staining. Produced significantly less product on A than clone 4 PCR . This is not the situation found in T-1053 plasma at the time of animal sacrifice. It was in contrast. Tlone of clone 4 (GB -B (specific to SEQ ID NO: 393) PCR and clone 6 (specific to GB-A (SEQ ID NO: 163)) PC A PCR titration experiment for R was performed using equal amounts of GB-A (SEQ ID NO: 163) RNA and GB-B (sequence No. 393) RNA was suggested to be present in plasma of T-1053 (Example 4, E.2). Obedience GB-A (SEQ ID NO: 163) RNA and GB-B (SEQ ID NO: 393) RNA were detected in T-1053 plasma. T-10 at the time the animal was sacrificed, even though it was present in an amount equal to 53 In the liver, the amount of GB-B (SEQ ID NO: 393) RNA was higher than that of GB-A (SEQ ID NO: 163) RNA. Was thought to exist. These results further demonstrate that GB-A (sequence No. 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) have two different RNA molecules. Is further evidence that these RNAs are not always present in the infected tamarin liver RN. It was suggested that they do not exist in equal amounts in A. Therefore, GB -A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are single It is unlikely to form separate segments of the loose genome. 2.GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are two different viruses. Evidence that it represents the genome of GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 163) were examined by infectivity and PCR. Evidence regarding the viral nature of No. 393) is obtained. Specifically, the filtration (0.1 μm) 10^-FourDiluted or unfiltered 10^-FiveInoculated with T-1053 plasma diluted to Tamarin T-1049 and Tamarin T-1051 were clone 4 (GB-B [sequence No. 393]) and clone 16 (GB-A [SEQ ID NO: 163]) sequences are positive Was. Prior to inoculation, both of these animals were shaded against clone 4 and clone 16. It was sex (Example 4, E.4, E.5). Therefore, the acute corresponding to GB-A and GB-B The two RNA species contained in phase T-1053 plasma were filtered, diluted and applied to other animals. The expected properties of the GB-A (SEQ ID NO: 163) and GB-B (SEQ ID NO: 393) viruses are shown. It was possible to subculture to maintain. GB-A and GB-B are separate Representing RNA molecules from spun particles was revealed by a PCR study of H205 inoculated tamarins. Or it becomes. Specifically, after inoculation with H205, all four tamarins were detected by RT-PCR. Clone 4 (GB-B [SEQ ID NO: 393]) Became positive for. In contrast, one of the four H205 inoculated tamarins Only (T-1053) was positive for clone 16 (GB-B [SEQ ID NO: 163]). None (Example 4, E.2). Therefore, the GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence is T-1048. Assuming that T-1057 and T-1061 do not exist, and clone 16 PCR results. Assuming that the negative fruit is not due to the low infectivity, GB- The virus corresponding to the B (SEQ ID NO: 393) sequence (ie, hepatitis GB virus B [HGBV-B]) , GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence and could be passaged alone. A sample of HGBV-B alone from T-1057 was subcultured two more times (Example 4). This GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence was not detected by RT-PCR in these animals . In addition, levels of liver enzymes have been shown to be significantly elevated in these animals. (Example 4) This indicates that HGBV-B alone causes tamarin to develop hepatitis. That was shown. GB-B (SEQ ID NO: 393) sequence is below the detection limit in tamarin, GB The -A (SEQ ID NO: 163) sequence was confirmed. Specifically, GB-B only animals (T-1048, T-1057, T-1061) induced with T-1053 plasma, RT-P specific for clone 16 GB-A (SEQ ID NO: 163) only virus, as detected by CR Semia developed. GB-A only plasma from T-1057 was further subcultured once ( Example 4). Therefore, the virus corresponding to the GB-A (SEQ ID NO: 163) sequence (hepatitis GB virus Rus A [HGBV-A]) was considered to replicate alone independently of HGBV-B. H Further passage of HGBV-A has been continued in the absence of GBV-B. So far, HG It is not known whether BV-A causes tamarin hepatitis. However, T-10 53-induced tamarins do not have elevated levels of liver enzymes associated with HGBV-A viremia And elevated levels of liver enzymes even when subcultured with serum containing only HGBV-A from T-1057. This is in contrast to the hepatophilicity of HGBV-B on tamarins. The presence of two viruses in the acute phase T-1053 plasma was considered to be based on the H205 inoculum. available. Specifically, the data of Example 7 is clone 16 (SEQ ID NO: 26, GB-A [ (From SEQ ID NO: 163] in the plasma before inoculation from the seven tamarins tested It was shown that it was not present in either. In addition, clones 2, 10, 18, 23 (each SEQ ID NOs: 22, 23, 27, 28, all from GB-A [SEQ ID NO: 163]) It was not detected in any of the HGBV-inoculated tamarin plasmas (Example 7). Before inoculation Tamarin plasma Clone 4 and clone 50 (SEQ ID NOS: 21, 29, respectively, all from GB-B [SEQ ID NO: 393] The same negative result was obtained when tested for Therefore, HGBV- Neither A nor HGBV-B was present in tamarin plasma prior to inoculation. Against this All of the above clones (ie clones 2, 10, 16 from GB-A [SEQ ID NO: 163]). , 18, 23, and clones 4, 50) from GB-B [SEQ ID NO: 393] were detected in the H205 inoculum. Issued (Table 7). Interestingly, the cDNA produced from T-1053 liver (see above) As you can see, using the same cDNA randomly synthesized from H205 In addition, some of the separate PCR targets in GB-A (SEQ ID NO: 163) were all GB-B (SEQ ID NO: 39). Less product than similar PCR target in 3) (data not shown) ). Therefore, HGBV-A and HGBV-B are present in the original GB inoculum, H205. It was concluded. However, H205 contains more HGBV-B than HGBV-A. It is believed that H205 inoculation was relatively low in H205 inoculum Only one of the four tamarins was later positive for HGBV-A. Probably the reason for Example 4, E.2). 3.Proof that HGBV-A and HGBV-B belong to the Flaviviridae family Ground Three of GB-A (SEQ ID NOs: 165-268, 270-384, 386-392) described in Example 5 Frame translation product and GB-B (SEQ ID NO: 397) of SWISS-PROT database And limited but significant amino acid sequence homology with various strains of HCV. Indicated. The translation products from GB-A (SEQ ID NO: 164) and GB-B (SEQ ID NO: 393) have been HCV isolates (ie NS2, NS3, NS4, NS5) to nonstructural protein regions It showed the closest homology. For example, as shown in Figure 24, flavivirus Conserved residues in the putative NTP-binding helicase domain of Escherichia coli (represented by *) (Fig. 24A). ) And RNA-dependent RNA polymerases of all viral RNA-dependent RNA polymerases. Conserved residues (represented by *) in the enzyme domain (Fig. 24B) are similar to HCV-1 NS3. And NS5b (SWISS-PROT accession number p26664), GB-A (SEQ ID NO: 390) and And the expected translation product of GB-B (SEQ ID NO: 397). ( Choo et al.PNAS 88: 2451-2455 [1991] and Domier et al.Virology 158: 20 −27 [1987 ]. ) Therefore, both GB-A and GB-B viruses are Noh NTP connection helicopter Case (functional NTP-binding helicase) and RNA-dependent RNA polymerase Was thought to code. However, GB-A (SEQ ID NO: 390) and GB-B (SEQ ID NO: 397) Does not have perfect amino acid identity between them and / or HCV NS3 And within other regions of NS5b also lack perfect amino acid identity with HCV. Specifically GB-A (SEQ ID NO: 390, residue 125) over 200 residues of NS3 shown in Figure 24A. 2-1449) virus and HCV-1 (SEQ ID NO: 398) are 47% identical, and GB-B (SEQ ID NO: 39). 7, residues 1212-1408) virus and HCV-1 (SEQ ID NO: 398) are 55% identical and GB- A (SEQ ID NO: 390, residues 1252-1449) virus and GB-B (SEQ ID NO: 397, residues 1212-1) 408) The viruses were 43.5% identical. In addition, the 100 NS3 residues shown in Figure 24B GB-A (SEQ ID NO: 390, residues 2644-2739) virus and HCV-1 (SEQ ID NO: 39). 8) is 36% identical and is identical to GB-B (SEQ ID NO: 397, residues 2513-2612) virus and HCV-1. (SEQ ID NO: 398) is 41% identical and GB-A (SEQ ID NO: 390, residues 2644-2739) virus And the GB-B (SEQ ID NO: 397, residues 2599-2698) virus were 44% identical. HCV and When compared, other putative non-relations between GB-A (SEQ ID NO: 390) and GB-B (SEQ ID NO: 397). Is homology relatively low for structural genes? Was. Compared to various HCV sequences registered in Genbank, GB-A virus and GB -The overall level of putative nonstructural protein homology with the B virus is GB Both -A (SEQ ID NO: 164) and GB-B (SEQ ID NO: 393) are two of the Flaviviridae each other. It suggests that it can be obtained from different members. 1 flavivirus One NTP-binding helicase domain and one RNA-dependent RNA polymerase domain Contains a single genomic RNA molecule corresponding to and. With a putative RNA helicase domain Two contigs each containing a putative RNA-dependent RNA polymerase domain Is consistent with the presence of two HCV-like flaviviruses in acute phase T-1053 plasma Things.Example 10. PCR PCR-based experiments to detect sequence relationships between HGBV and hepatitis C virus Was performed as follows. HCV isolates from various positional sources (Cha, T.-A. et al.J. C lin. Microbiol. 29: 2528-2534 [1991]), a highly conserved HCV PCR primers (J.H. Han, based on the 5'-untranslated region (UTR) sequence of nom.PNAS88: 1 711 -1715 [1991]) is a similar sequence in H205-infected tamarin T-1053 liver RNA. Used to detect. Implementation Total cellular RNA was transferred to infected liver and uninfected tamarin T-1053 as described in Example 8A. Phosphorus (T-1040) was extracted from the liver. Kit available from Perkin-Elmer 30 μg of each RNA sample was reverse transcribed and PCR-amplified according to its recommended usage. did. An antisense primer (base) 249-268 of HCV 5'-UTR Mar 1) was used for the above reverse transcriptase reaction. Primer 1 and HCV 5'-UTR A primer containing bases 13-46 (primer 2) for PCR amplification of intervening sequences Used for. Conditions for thermocycling are based on Cha et al. (Supra). You. To increase the detection sensitivity of the HCV 5'-UTR sequence of H205-infected tamarin T-1053 In addition to the above PCR reaction, a second amplification reaction using "nested" PCR primers It caused a response. The primers for this purpose are the above-mentioned primers in HCV 5'-UTR. Obtained from the sequence between the sequence of Immer 1 and the sequence of Primer 2 above. Primer -3 contains the sequence from bases 47-69 of HCV 5'-UTR and contains the antisense primer Primer 4 contained the bases 188-210 of HCV 5'-UTR. This "on In the “recon” PCR reaction, the PCR product from the first PCR reaction (100 μl total reaction volume) 2 μl) was used as the source of DNA template. Annealing temperature is 60 ℃ Thermocycling conditions were approximately the same as above, except that the temperature was 55 ° C. Was. The PCR product obtained from the second PCR reaction was subjected to agarose gel electrophoresis and bromide gel electrophoresis. The desired DNA product was analyzed using Thidium staining. HCV 5'-UTR The size of this intended DNA fragment based on the sequence (Han et al., Supra) was It is 253 bp for the product of the PCR reaction and for the product of the nested PCR reaction. It was 163 bp. The desired size of the PCR product is the HCV-infected tin described in Example 8A. In a control experiment performed with 30 μg of total cellular RNA extracted from pansy liver. Obtained (data not shown), which is the 5'-UTR of HCV in this experimental procedure. Indicates that it can be detected. However, either T-1053 liver RNA or T-1040 liver RNA Both expected products produced the ethidium bromide-stained agaro Could not be found on sgel (data not shown). Thus the desired result The results were not obtained because (i) the 5'-UTR sequence of the above reagent was larger than that of HCV. The oligonucleotide primers used efficiently anneal because they were different. That the PCR amplification is not possible, or (ii) the above reagent Suggesting that the 5'-UTR was missing. In either case Also, the nucleotide sequence of the above reagent differs greatly from that of HCV, It is estimated from this result. Nucleic acids were harvested from a chimpanzee plasma pool obtained during the acute phase of experimental HCV infection. Isolated as described in Example 7 (G. Schlauder et al., J. Clin. Microbiology 29: 2175 −2179 [1991]). RT-PCR using clone 16 primers (SEQ ID NO: 93, 94) Was performed as in Example 7. The desired size bands for these primers are It was not detected by ethidium bromide staining and was paired with a probe specific for clone 16. Was also not detected after hybridisation (data not shown). like this Results demonstrate the irrelevance of clone 16 sequence (SEQ ID NO: 26) to HCV .Embodiment 11 FIG. Reactivity of HGBV-infected sera to other hepatitis viruses Use the H205 inoculum (T-1048, T-1057, T-1061) or T-1053 inoculum (T-1051). Serum samples were obtained before and after inoculation with the used HGBV and tested after exposure to known hepatitis viruses. Tests were performed for antibodies that are frequently released. Antibodies to hepatitis A virus (Using the HAVAB assay available from the applicant) and the hepatitis B core And hepatitis E virus (HEV) (available from the applicant EIA) and hepatitis C virus (HCV) (HCV II available from the applicant) The specimens were inspected with respect to (using a surrogate test). These inspections are It was done according to the instructions included in the package Any tamarins tested, either before or after HGBV inoculation, were HCV or It was not positive for antibodies to HEV (see Table 12). Therefore, HGBV infection Did not yield a detectable antiserum against HCV or HEV. One of the above tamarins (T-1061) had H before and after HGBV inoculation. Positive for AV antibody, indicating a pre-existing HAV. Induced (Table 9, T-1061). However, the other three tamarins (T-1048, T-1057, T-1051) showed no HAV-specific antibody after inoculation with HGBV. Therefore, HGBV infection does not elicit an anti-HAV response. One of the above tamarins (T-10 48) was negative for HBV antibody both before and after HGBV inoculation. Up Two of the tamarins (T-1061, T-1057) were positive before HGBV inoculation. Up One of the tamarins (T-1051) was close to the border against HBV antibody before HGBV inoculation. Many were positive, but negative after inoculation. Based on these data, infection with HGBV reagents will result in an immune response to HBV nuclei. There is no proof to induce. In general terms, these data are HGBV trials. The drug is a unique viral agent and is a common viral agent associated with human hepatitis. It has been demonstrated that it is not related to any of the drugs.Example 12. Western blot analysis of HGBV infected liver As shown in Examples 1 and 2 above, HGBV-inoculated tamarins had liver problems. An increase in the visceral enzyme value was observed. If HGBV is actually a hepatotrophic virus, Viral proteins are produced in infected liver cells and It is speculated that an immune response will occur. In this example, obtained from HGBV-infected tamarin. A unique protein appears in the liver, which is Specific by Western blot using tamarin serum obtained in convalescent stage It shows the rationale that should be recognized. HGBV-infected tamarin liver and various control tamarin liver and chimpanzee liver Dice and homogenize in PBS using an Omni-mixer homogenizer. (5 ml about 1 g of liver). The resulting suspension is centrifuged (10,000 x g for 1 hour , 4 ° C), With ultrafiltration through a 5 μm filter, a 0.8 μm filter and a 0.45 μm filter. Clarified. This clarified homogenate is used as a pellet for all components of 100S or more. Centrifugation was carried out under conditions that caused oxidization. Low pellet (100S liver fraction) Dissolved in a volume of buffer and stored at -70 ° C. SDS polyacrylamide using standard methods and reagents (Laemmli discontinuous gel) Dogel electrophoresis (PAGE) was performed. The 100S liver fraction was analyzed with SDS and 2-mercap Diluted 1:20 in sample buffer with ethanol and heated to 95 ° C for 5 minutes. 30 12% acrylamide or 4 → 15% acrylamide linear gradient at 200 volts for ~ 45 minutes The proteins were electrophoresed by either gel (7 cm x 8 cm). Standard method And electrolysis of proteins onto nitrocellulose membrane using sfer). Western blots were generated using standard methods. Generally speaking, Rinse the nitrocellulose membrane briefly in TBS / Tween and place in TBS / CS (100 mM Tris at 4 ° C). , 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.18% Tween-20, 4.0% calf serum, pH 8.0) I blocked it overnight. Place the nitrocellulose membrane in the Multi-screen device and Place 00 μg of serum in the groove of the above device and then at room temperature for 2 hours. And incubated overnight at 4 ° C. From the multi-screen device to the above nitrocellulose After removing the membrane, TBS / Twee (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH8.0 The above nitrocellulose membrane was washed 3 times in 5 minutes each for 5 minutes. That nitro cellulo The membrane is incubated in 15 ml of goat anti-human: HRPO conjugate (0.2 μg / ml TBS / CS) for 1 hour at room temperature. Was. After washing as above, the nitrocellulose membrane was warmed in TMB enzyme substrate solution. Place, rinse with water and dry. At the time of sacrifice (12 days after GB inoculation), it was isolated from T-1053 liver and absorbed and transcribed as described above. Protein from the 5th, 6th, 7th, 9th, or 11th week after GB inoculation, A unique antigenic tag with an apparent molecular weight of approximately 50-80 kDa upon reaction with T-1057 serum. It showed a good quality. When reacted with T-1057 serum before GB inoculation or 3 weeks after inoculation , The above band did not exist. When reacted with any of the above T-1057 serum, The band contains liver proteins obtained from uninoculated tamarin (T-1040) It did not appear in the lane. In addition, other serum after GB inoculation (T -1048 was reacted with T-1053 liver protein at 8 weeks after GB inoculation (T-1051) Sometimes proteins of the same size (50-80 kDa) appeared, but obtained from the same animal Pre-inoculation serum and T-1053 liver This same size protein did not appear when the proteins were reacted. In liver tissue from other GB inoculated tamarins, or either HCV or HBV The immunoreactive band was detected in the liver tissue of chimpanzees infected with Escherichia coli. Further Western blot experiments were performed to determine if In each case Nitrocellulose strip containing liver protein was applied to T-1048 (5, 8 , 16 weeks) and T-1051 (8 and 12 weeks after GB inoculation). Was. Five sera were mixed in equal proportions in the pool. 50-80kDa reaction A sex protein band was obtained by inoculating GB-inoculated tamarin (T-1038, T- 1049, T-1055 and all tamarin livers obtained from T-1053 obtained 12 days after GB inoculation Detected in visceral specimens. This immunoreactive band was obtained from T-1040 (non-inoculated) Liver specimens and chimpanzee liver specimens (CHAS-457 (before HCV inoculation), CHAS-457 (HCV +), CRAIG-454 (HCV +), MUNA-376 (HBV +)) . Taken together, these data specifically bind to HGBV-infected tamarin liver. Immunity with an apparent molecular weight of approximately 50-80 kDa It was a demonstration of the presence of the antigenic and antigenic proteins. This HGBV-related protein Quality traits (ie virus encoding or host origin) are currently under investigation . Regardless of the origin of HGBV-related proteins, these results show that HGBV infection Consistent with the fact that it induces an antibody response to an antigen present in tamarin liver .Example 13. Expression and detection of immunogenic HGBV-A and HGBV-B polypeptides based on CKS Out A.Cloning of HGBV-A and HGBV-B sequences CMP recombinant proteins with cloning vectors pJ0200, pJ0201, and pJ0202 -Fused to the KDO synthetase (CKS) protein. Each of these plasmids Is derived from the plasmid pBR322, but the (E.coli CKS protein Fused to the kdsB gene fragment which encodes the first 239 of the 48 amino acids. Fused modified rack promoter and fused to the ends of the kdsB gene fragment. And a synthetic linker. This synthetic linker has multiple restriction sites required for gene insertion. Position, a translation stop signal, and a trpA rho-dependent transcription terminator. Was. The unique restriction site in this linker region is in the 5'to 3'direction, Contains EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, PstI, SphI, HindIII . Each of the plasmids can be inserted into any of the open reading frames within the multiple cloning sites. Allows insertion. CKS methods for protein synthesis and CKS vectors are included in this document. It is disclosed in Applicant's US Pat. No. 5,124,255, which is incorporated by way of example. On the other hand, the use of CKS fusion proteins in assay formats and test kits Applicant's U.S. Application Number No. incorporated herein by reference. 07/9 It is disclosed in 03,043. Obtained from the walking experiment described in Tables 9 and 10 (Example 9). The HGBV-A sequence and HGBV-B sequence obtained from the restriction enzymes shown in Tables 13 and 14 (10 units, NE B) was used to excise from the appropriate pT7Blue T-vector clone and used in Example 3B. Purified from a 1% low melting agarose gel as described. Plasmid pJ0200, pJ02 01 and pJ0202 were digested with the same restriction enzyme (10 units, NEB) to obtain bacterial alkaline Dephosphorylation was performed with phosphotase (GIBCO BRL, Grand Island, NY). Purified H Each of the GBV fragments was digested into dephosphorylated pJ0200, pJ0201, pJ0202 Combined with E. coli as described in Example 3B. Shaped into coli XL1 Blue The quality has changed. CKS / HGBV expression vector by standard miniprep analysis Confirmed the success of the formation. Two other PCR products were specifically prepared for expression. These two products are , 4.1, and 4.2, which code the HGBV-B core area and the HGBV-A core area, respectively. This was expected (see Figure 22). PCR product 4.1 was prepared as described in Example 9. , Primer core B-s and primer core B-al (SEQ ID NO: 708, 709) PCR product 4.2 was prepared using primer core A-s and primer core 2.2.1 ′ ( SEQ ID NO: 710, 138). This 4.1 sense and antisense Immers had EcoRI and BamHI restriction sites in each intended to be terminal . The 4.1 PCR product was digested, gel isolated, pJO200, pJO201, pJO202 as described above. Was bound. 4.2 Make sure the sense primer for the PCR product is at the end It has the intended EcoRI restriction site, but its antisense primer I didn't have it. Therefore, this product was digested with EcoRI, gel isolated and To pJO200, pJO201, and pJO202 digested with BamHI, and End-modified with Renault fragment and dNTPs, digested with EcoRI, and known in the art. Sea urchin bacterial alkaline It was dephosphorylated with phosphotase. B.Expression of HGBV-A and HGBV-B sequences Tryptone 32 gm / L, yeast extract 20 gm / L, NaCl 5 gm / L, pH 7.4, ampicillin 10 CKS / HGBV expression vector with shaking in a medium containing 0 mg / L and 3 mM glucose. E. The coli XL1 Blue culture was grown at 37 ° C. This culture has 1.0-2.0 O When D600 was reached, IPTG was added to induce expression from the modified rack promoter. The final concentration was 1 mM. Grow the culture at 37 ° C with shaking for an additional 3 hours. It was allowed to grow and the bacteria were collected. Cell pellets in SDS / PAGE loading buffer (Tris pH6.8 62.5 mM, SDS 2%, glycerol 10%, 2-mercaptoethanol 5%, bromophenol The solution was resuspended in rou 0.1 mg / ml) to an OD600 of 10 and boiled for 5 minutes. Preparation An aliquot of the whole cell lysate prepared was run on a 10% SDS-polyacrylamide gel. And colored with a solution containing 0.2% Coomassie blue dye in 40% methanol / 10% acetic acid. Then decolorize with 16.5% methanol / 5% acetic acid until the background is clear did. Whole cell lysates were run on a second 10% SDS-polyacrylamide gel and Electrophoresis was performed for the noblot assay. Transferred to trocellulose. Nitrocellulose sheet containing transcribed protein The block for 30 minutes at room temperature (5% Carnation non-fat drier in Tris buffered saline). Luk) and goat anti-CKS pre-blocked against E. coli cell lysate Incubated in serum at room temperature for 1 hour and diluted 1: 1000 in blocking solution. This nitro cell The loin sheet was washed twice with Tris buffered saline (TBS) and then alkaline phosphatase. Incubate for 1 hour at room temperature with Tase-conjugated rabbit anti-goat IgG and in the blocking solution 1: 1000. Diluted. This nitrocellulose sheet was washed twice with TBS, and Tolazolium (nitroblue telrazolium) and 5-bromo-4-chloro-3-indo Color was developed in TBS with lyl phosphate. Appropriate for each fragment Open reading frame based on expression of immunoreactive CKS fusion protein of the correct expected size The vector insert binding site was confirmed by DNA sequencing. Include the appropriate components after determining the appropriate reading frame for each of the above fragments Samples from cultures were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting. And analyzed by. Figure 25A shows the CKS fusion protein whole cell lysate. Including 2 One Coomassie stained 10% SDS-polyacrylamide gel is shown. Lane 1 and lane 16 contains the molecular weight standard in kilodaltons shown on the left. Gel 1 (HGBV-A trial The order of deployment was as follows: Lane 2, before clone 1.17 induction: Lane 3. -15, clone 4.2, clone 1.17, clone 1.8, clone 1.2, clone 1. 18 (SEQ ID NO: 390), clone 1.19, clone 1.20, clone 1.21, clone 1.22 ( SEQ ID NO: 390), clone 2.12, clone 1.5, clone 1.23, clone 2.18, each 3 hours after induction. The order of development on Gel 2 (HGBV-B sample) was as follows: Lane 17, clone 4.1 before induction: Lanes 18-29, clone 4.1, clone 1.15, Clone 1.14, Clone 2.8, Clone 1.13, Clone 1.12, Clone 2.1, Loan 1.7, clone 1.3, clone 1.4, clone 1.16, clone 2.12, respectively All 3 hours after induction. Add these proteins in two separate 10% gels in the same order as above. It was applied over and transferred to nitrocellulose as described above. Samples of 2 convalescent Western blot using a pool of sera from T-1048, T-1051 Analyzed. Warm the nitrocellulose sheet containing the above sample in the blocking solution for 30 minutes. , E. coli lysate 10% and XL1-Blue / CKS lysate 6 mg / ml and a 1: 100 dilution of the convalescent tamarin serum pool described in Table 6 (Example 4). Was transferred to the blocking solution containing. After incubating at room temperature overnight, the above nitrocellulose sheet Were washed twice in TBS, incubated in HRPO-conjugated goat anti-human IgG for 1 hour at room temperature and sealed. Diluted 1: 500 in chain solution. Wash the nitrocellulose sheet twice in TBS, 4-chloro-1-naphthol 2 mg / ml, hydrogen peroxide 0.02% and methanol 17% Color was developed in containing TBS. As shown in Figure 25B, three HGBV-B tampers CKS fusions of the cytoplasm, clones 1.4, 1.7, and 4.1, were immunoreactive with the tamarin serum pool. I responded. Clone 1.7 contains the sequence encoding the HGBV-B immunogenic region (SEQ ID NO: No. 610) and clones 1 and 4 are cDNAs using the same convalescent tamarin serum pool. The two found by immunoscreening the library (Example 4) It contained sequences encoding the HGBV-B immunogenic region (SEQ ID NOs: 12, 13, 18). The sample described in the paragraph above also shows acute hepatitis from a surgeon GB (the surgeon GB). As above, using 1.100 dilution of convalescent serum obtained about 3 weeks after the onset of Were analyzed by Western blot. Fusion tank from HGBV-A and HGBV-B Quality Tables 13 and 14 show the reactivity of the above with respect to the above serum. One in HGBV-B protein (2.1 ) Only showed reactivity to this serum, but this reactivity was very low, while Two HGBV-A proteins (1.22 [SEQ ID NO: 390], 2.17) are high against this serum It showed reactivity. These two HGBV-A proteins share about 40 amino acids. , Which may reflect reactivity towards one or more epitopes. There is a potential. These two HGBV-A proteins were labeled with ELI as described in Example 16. Selected for use in the SA test. The 11th passage GB material (H205 GB pass 11) Infected tamarins show an immune response to several HGBV-B epitopes and No immunoreactivity to the BV-A epitope, but serum from the first GB source Showed significant reactivity to at least one GBV-A epitope That is interesting. This suggests that HGBV-A was the cause of hepatitis in military physician GB. Suggested the ability. 1.4, 1.7, or 2.17 CKS / by ELISAS (see Examples 15, 16) Indicates the presence of antibodies against one or more of HGBV-A or CKS / HGBV-B fusion proteins Four other human sera were selected for Western blot analysis. these Serum 3 One (G1-41, G1-14, G1-31) is from a West African "dangerous" population, 4 The second (341C) is a non-AE hepatitis (Egypt) specimen (for a detailed description of these populations). For example, see Example 15). CKS fusion protein above Whole cell lysates from several of the 10% SDS-polyacrylamide gels And transferred to nitrocellulose as described above. Above each of these blots Pre-seal as described above and E. coli lysate 10% and XL1-Blue / CKS lysate 6 Overnight with one of the human serum samples diluted 1: 100 in sealing buffer containing mg / ml. Incubate. The blot was washed twice in TBS and reacted with HRPO-conjugated goat anti-human IgG , Developed as described above. Analysis of CKS / HGBV-B protein using two of the above sera (G1-41, G1-14) The reactivity is shown in Table 13. The above 3 which showed reactivity to tamarin serum In addition to that protein, another two proteins (1.16, 2.1) It showed reactivity to either one of the two. CKS / HGBV-A protein was added to the above 4 All four human sera were analyzed and their reactivity is shown in Table 14. React against GB serum In addition to the above two proteins that showed sex, three other proteins (1.5, 1. 18, 1.19) is human blood Reactive to one or more of the Qing. Two of these proteins (1.5, 1 .18) was selected for use in the ELISA assay as described in Example 16. We By Stan blot and / or with two HGBV-A proteins (1.18, 2.17) React with one HGBV-B protein (1.7) by ELISA (Examples 15, 16) The G1-31 serum showing sex has the GB-C sequence (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640). Of particular interest is the serum isolated from Example 1 (Example 17). Example 14. Epitope mapping of immunoreactive HGBV-A and HGBV-B proteins A.Epitope mapping of HGBV-B protein 1.7 To confirm the location of the immunogenic region, the HGBV-B immunogenic protein 1.7 Overlapping subclones were cloned by RT-PCR from T-1053 serum as described in Example 7. It was carried out. Each PCR primer has a 5'end to facilitate restriction enzyme digestion. It has an extra 6 bases on the side, followed by an EcoRI site (sense primer) Or HindIII site (antisense primer) followed. In addition, each The antisense primer contained a stop codon immediately after the coding region. After digestion, each fragment was digested with EcoRI / HindIII-digested p as described in Example 13. It was cloned into JO201. As described in Example 13, the CKS fusion protein was Expressed and by Western blot using tamarin T-1048 / T-1051 serum. And analyzed. Five overlapping clones, designated 1.7-1 to 1.7-5, were generated. This These clones contain 1.7 proteins with sizes ranging from 104 to 110 amino acids. It encodes a quality area. PCR primer used to generate each clone And the size of the encoded polypeptide And the position within the 1.7 sequence and the reactivity to the tamarin T-1048 / T-1051 serum, It shows in Table 15. Generated by immunoscreening of the cDNA library (Example 4) Two additional duplication clones spanning the immunogenic region seen (SEQ ID NO: 678). Generated. Each of these clones, designated 1.7-6 and 1.7-7, contains It encodes a polypeptide of 75 amino acids. The PCR primer used and the code The size of the polypeptide, its position within the 1.7 sequence and the tamarin T-1048 / T-1051 blood Table 15 shows the reactivity with respect to clearing. 1.7 proteins as long as 507 amino acids Two immunogenic regions were identified in. That is, the immunogenic region near the N-terminus remains. The immunogenic region near the center of the above protein is within the range of 1-105 groups and residues 1 It was within the range of 85-410. Within each of these regions a single epitope or multiple Whether there are a number of epitopes requires further investigation. B.Epitope mapping of HGBV-B protein 1.4 In order to confirm the location of the immunogenic region, the HGBV-B immunogenic protein 1.4 Overlapping subclones were performed by RT-PCR from T-1053 serum. Each PCR Limer added an extra 6 bases to the 5'end to facilitate restriction enzyme digestion. Have After that, EcoRI site (sense primer) or BamHI site (antisense primer) Either) followed. In addition, each antisense primer is coded It contained a stop codon immediately after the region. After digestion, as described in Example 13, Each fragment was cloned into EcoRI / BamHI-digested pJO201. In Example 13 As described, the CKS fusion protein was expressed and tamarin T-1048 / T-1051 serum was expressed. Was analyzed by Western blot. Called 1.4-1 to 1.4-4 4 overlapping clones were generated. These clones have a size of 137 amino acids. It encodes a region of 1.4 proteins in the ~ 138 range. Make each clone PCR primers used to generate and size of the encoded polypeptide , 1.4 position within the sequence and reactivity to tamarin T-1048 / T-1051 serum. See Figure 15. Discovered by immunoscreening a cDNA library (Example 4) Two additional duplicate clones were generated that spanned the immunogenic region. 1.4 Each of these clones, designated -5 and 1.4-6, is 75 amino acids long. Encodes a polypeptide. The PCR primers used and the encoded polypep Tide size and position within the 1.4 sequence and tamarin T-1048 / T- The reactivity with 1051 serum is shown in Table 15. Amino acid 265 containing residues 129-393 The sequence consisting of 4 immunogens is the immune protein in a 1.4 protein with a length of 522 amino acids. It was confirmed to be in the original area. Immunoscreening of libraries (Example 4) At least two non-adjacent immunogenic clones were identified in the above sequence by Also, two epitopes may be present in the above region. C.HGBV-A protein 1.22(SEQ ID NO: 390) and 2.17 epitope mapping HGBV-A protein 1.22 (SEQ ID NO: 390) and 2.17 (SEQ ID NO: 613) are both Western blotting showed immunoreactivity with GB sera (Example 13). these Since the two proteins in the two overlap by 40 amino acids, the observed immune response The response may be due to one epitope or as a result of the presence of two or more epitopes. May have occurred. The complete 1.22 / 2.17 sequence was 641 amino acids long . To find the immunogenic region, the overlapping subclones within this region were identified as T-1053. Was performed by RT-PCR. Each PCR primer facilitates restriction enzyme digestion Therefore, it has an extra 6 bases at the 5'-end, and after that, EcoRI site (se (Primer) or 1.22 / 2.17-2 Regarding 1,22 / 2.17-6, one of BamHI sites (antisense primer) continues. Was. However, clone 1.22 / 2.17-1 has an internal EcoRI site, so BamHI Site is used as the sense primer and the HindIII site is the antisense primer. Used as In addition, each antisense primer Immediately after it contained a stop codon. After digestion, each flare was treated as described in Example 13. Fragment was EcoRI / BamHI-digested (or BamHI / HindII for 1.22 / 2.17-1). I-digested) cloned into pJO201. As described in Example 13, the CKS fusion tag Proteins were expressed and analyzed by Western blot using GB sera. This clone encodes the 1.22 / 2.17 region of the 115-116 amino acid size range. I did it. The PCR primers used to generate each clone and the encoded The size of the polypeptide, its position within the HGBV-A polypeptide sequence, and its relationship to GB serum. The reactivity is shown in Table 15. 1.22 / 2.17 In the middle of the protein, the immunogenic region is It was narrowed to a region that was 220 amino acids long. This is an ami between 1.22 and 2.17 It contains an overlapping region of 40 amino acids in length, and therefore has a common immunity for the two proteins. Responses can be due to one epitope being shared or due to multiple epitopes It may have been done. Example 15. Serological study of HGBV-B A. Recombinant protein purification procedure Bacterial cell cultures expressing CKS fusion proteins were frozen and stored at -70 ° C. . Thaw bacterial cells from each of the three constructs and use lysozyme and DNase Crushed, then phenylmethanesulfonyl fluoride and other proteins In the presence of an ase inhibitor, sonicate to mix individual recombinant antigens and E. coli proteins. I got a compound. Insoluble recombinant antigen was centrifuged in each of the three cultures. More concentrated and subjected to a series of washing steps to remove most of the non-recombinant E. coli proteins Was. The composition of the washing solution used in this protocol is distilled water, 5% TritonX- 100 and 50 mM Tris (8.5). The obtained precipitate is It was dissolved in the presence of sodium silsyl sulfate (SDS). I measured the protein concentration And 2-mercaptoethanol were added, and the mixture was applied with Sephacryl S300 resin. Was subjected to gel filtration column chromatography, and various proteins were Therefore, it was separated and separated. Collect each fraction and perform SDS-polyacrylamide gel electrophoresis Analysis by SDS-PAGE. The proteins separated by this electrophoresis are Come on Coomassie Buri Stained with Liant Blue R250, the molecular weight is about 75 kD (CKS-1.7 / sequence No. 610), 80 kD (CKS-1.4 / SEQ ID NO: 611), 42 kD (CK The presence or absence of a protein corresponding to S-4.1 / SEQ ID NO: 612) was examined. Applicable Fractions containing the protein were pooled and examined again by SDS-PAGE. The immunogenicity and structural integrity of the pooled fractions containing purified antigen was determined in Example 13. Electron transfer and immunoblot to nitrocellulose according to the method described in 1. Determined by law. There was no suitable positive control, so the recombinant protein Depends on the reactivity with the monoclonal antibody against the CKS part of each fusion protein. Identified. Recombinant antigen for CKS-1.7 protein (SEQ ID NO: 610) Was detected by Western blotting using anti-CKS monoclonal antibody. A single band was observed at about 75 kD. This result is CKS This is in agreement with the expected size of the -1.7 protein (SEQ ID NO: 610). CKS-1 . 4 protein (SEQ ID NO: 611) was added to the anti-CKS monoclonal antibody. Therefore, a quadruple band pattern was detected between 60 kD and 70 kD. Observed These bands are shorter than expected for the full-length protein and are probably missing. It seems to have been lost. CKS-4.1 protein (SEQ ID NO: 52) Recombinant with anti-CKS monoclonal antibody when examined by Western blotting The antibody was detected as a single band at about 42 kD. This result is CK In agreement with the size expected for the S-4.1 protein (SEQ ID NO: 612) You. B. Procedure for coating polystyrene beads The above proteins are dialyzed and the polystyrene of these proteins is analyzed as described below. The antigenicity on the beads was evaluated. Apart from this, three types of purified HGBV recombinant Compact (CKS-1.7 / SEQ ID NO: 610, CKS-1.4 / SEQ ID NO: 611, And CKS-4.1 / SEQ ID NO: 612) for HGBV An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to detect the antibody. these The ELISA performed with the protein of 1.7 was carried out by 1.7 ELISA (CKS-1.7). (SEQ ID NO: 610) using recombinant protein), 1.4 ELISA (CKS-1.4 (SEQ ID NO: 611) using recombinant protein), and 4.1 ELISA (CKS- 4.1 (SEQ ID NO: 612) Use of recombinant protein For). In the first study, various 1/4 inch polystyrene beads were used. Coated with purified protein at a concentration of about 60 beads / lot, and inoculated with tamarin From the inoculated tamarin was used as a positive control. It was evaluated by an ELISA test (described below) used as a roll. Other controls Human serum obtained from individuals tested negative for various hepatitis viruses Including the pool. An additional positive control monitors the coating efficiency of the beads. Was a monoclonal antibody against the CKS protein. Negative controller Beads with the highest ratio of positive control signal to Coating conditions were selected and used in the scale assay of the bead coating process. Four Minimize lots of 1000 beads for each of the ELISA tests Two lots were also prepared and used for serological studies. Briefly, when coating polystyrene beads with purified protein, washing Add purified beads to scintillation vial and add beads to buffer containing recombinant antigen It was immersed in the liquid (about 0.233 ml / bead). Different for each recombinant antigen Various concentrations were prepared and adjusted to pH 5.0-9.5. It was evaluated together with the following buffer solution. Then place the vial in a 40 ° C incubator. Place on a rotating device for 2 hours, then aspirate liquid and load beads to pH 6.8. It was washed three times with phosphate buffered saline (PBS). Then add beads to 0.1% Trit The cells were treated with onX-100 for 1 hour at 40 ° C., and washed 3 times with PBS. next , Overcoat the beads with 5% bovine serum albumin and stir at 40 ° C, Incubated for 1 hour. After repeated washing with PBS, add 5 beads. % Sucrose overcoated for 20 minutes at room temperature and the liquid was aspirated off. Finally bee Air-dried and used in an ELISA test to detect antibodies to HGBV did. C. ELISA procedure for detecting antibodies to HGBV The ELISA was performed by the indirect assay method. That is, serum or plasma with a sample diluent Diluted and reacted with solid phase coated antigen. After the washing step, the particles bound to the solid phase Direct beads to human immunoglobulins to detect phosphorus or human antibodies Reacted with horseradish peroxidase (HRPO) labeled antibody. Exceeds the cutoff value The sample that generated the signal was determined to be reactive. Additional details about the ELISA The details are described below. In the ELISA mode, the solid phase coated with the antigen is preliminarily diluted with the sample diluent (animal serum and non-animal). A tamarin serum diluted with a buffer solution containing an on-activator). You. In preparing this sample diluent, a specific antibody and a solid phase coated with an antigen were used. Increases the binding rate while causing non-specific immunoglobulin binding to the solid phase. It was formulated to reduce the background signal due to it. Specifically, 1 0 μl tamarin serum was diluted with 150 μl specimen diluent and vortexed. this 200 μl after adding 10 μl of prediluted sample to the wells in the reaction tray Sample diluent and antigen-coated polystyrene beads were added. Dyna this reaction tray Incubated in Mick Incubator (Abbott Laboratories) . The incubator was constantly stirred at room temperature. 1 hour incubation After that, the liquid was aspirated off and the wells containing the beads were washed 3 times with distilled water (each 5 ml times). Then conjugate diluent (containing animal serum and non-ionic activator 200 μl of HRPO-labeled goat anti-human immunoglobulin diluted with a buffer solution). And the reaction tray was incubated again as above for 1 hour. Aspirate the liquid and wash the wells containing the beads with distilled water as above. Thus, it was washed 3 times. Well with beads containing antigen and bound immunoglobulin Each bead into a test tube and remove it from theo-Phenylenediamine dihydrochloride 0.02% H of salt₂O₂Containing 0.1 M Citrate Buffer (pH 5.5) Solution 300 It was reacted with μl. After holding at room temperature for 30 minutes, 1N H₂SO_FourTo stop the reaction I let you. Absorption at 492 nm was read on a spectrophotometer. The resulting color is the test sample The relationship was directly proportional to the amount of antibody present in the cell. Specimens that may not contain antibodies against HGBV epitopes and HGBV epitome Group of samples to separate from samples that may contain antibodies to A preliminary cutoff value was set for. D. Detection of HGBV-derived RNA in sera of infected individuals 1 in the presence of HGBV-RNA in tamarin serum or human serum / plasma . Correlation of 7-ELISA and 1.4-ELISA serum response data For the purpose of US patent application Ser. No. 08/2 already incorporated herein by reference for RT-PCR. It carried out like Example 7 of 83,314. In the implementation, HGBV black Using oligonucleotides derived from Used. The clone 4 (implemented from the HGBV-B genome of the oligonucleotide Example 7) and final concentration for clone 16 from the HGBV-A genome Was 0.5 μM. E. FIG. Tamarin serology Blood is collected weekly from tamarin contained in LEMSIP to obtain liver fermentation. The elementary level was inspected. The remaining amount of sample serum is Abbott Laboratories for further investigation I sent it to Leeds. 1. ELISA results for tamarins (study of early infectivity) 4 tamarins (T-1053, T-1048, T-1057, and T-1 061) was inoculated with GB serum (referred to as H205GB passage number 11). After vaccination ( During the first week of (PI), an increase in liver enzyme was observed in tamarin T-1053. . This tamarin was euthanized at PI 12 days. Tamarin T-1048, T-1 057, and T-1061 showed elevated liver enzymes by 2 weeks post-inoculation. . This increase continued until PI week 8-9 (Figs. 2-4) before returning to pre-inoculation levels. . At week 14 of PI, tamarin T-1053 ( This individual has been found to be infectious-from Example 2). Re-inoculation was performed with 0.10 ml of the undiluted serum obtained. These three tamarins (Tamarin T-1048, T-1057, and T-10 61) Convalescent serum is CKS-1.7 (SEQ ID NO: 610) recombinant protein, C KS-1.4 (SEQ ID NO: 611) recombinant protein, CKS-4.1 (SEQ ID NO: 6) 12) ELISA (Fig. 3) was carried out to determine whether or not the antibody was present against the recombinant protein. 4, 5) were individually conducted and examined. 1.7 (SEQ ID NO: 610), 1.4 (sequence No. 611), 4.1 (SEQ ID NO: 612), or 1.5 (SEQ ID NO: 614) No specific antibody against each recombinant protein of A. japonicum was detected in any sample before vaccination Was. As shown in FIG. 26, 1.7 and 1.4E in T-1048 serum. LISA test detected specific antibody at PI 56-84 days, but PI97 And not detected at 137 days. The serum of T-1048 was 4. IE No specific antibody was detected in the LISA test. As shown in FIG. 27, 1.7 tons Antibodies against Park (SEQ ID NO: 610) showed PI56 and PI in serum of T-1057. And at 63 days, but not after 63 days PI. 4.1 ta Information Antibodies to column no. 612) were detected on days 28-63 PI, but PI84-9 It was not detected in 7. As mentioned above, for each tamarin, inoculate PI 97th Re-inoculation was performed with the agent H205. 4.1 Specificity for protein (SEQ ID NO: 612) Antibodies were detected at PI 112 and PI 126 days, which was It is an indication of an outgoing reaction. 1.4 About the recombinant protein (SEQ ID NO: 611) However, no antibody reaction was observed. Specific antibody against recombinant 1.4 protein (SEQ ID NO: 611) is tamarin T-1 Detected in sera of 061 between PI 84 days and PI 112 days, but PI1 It was not detected after 26 days. As shown in FIG. 28, tamarin T-1061 The sera of 1.7 protein (SEQ ID NO: 610) and 4.1 protein (SEQ ID NO: 6) It was negative at 350 days PI for antibodies to 12). 2. PCR results for tamarins (study of initial infectivity) Tamarin T-1048 and T-1057 sera were selected and described in Example 7. The primer obtained from clone 4 and the clone obtained from clone 16 described in Example 7 HGBV-RNA was examined by RT-PCR using the mers. HGBV-RNA is 10 days before inoculation and 17 days before inoculation by RT-PCR. There is (T-1048) (FIG. 26) in any of the primers in the serum of the day. Or any of the primers in serum 17, 37 and 59 days before inoculation (T- 1057) (FIG. 27) Not detected. For T-1048, HGBV- RNA was associated with 15 of the 17 different sera obtained between PI 7 and 137 days. Was detected using the primer from clone 4. HGBV-RNA is a PI Any of the 10 sera obtained during the 7-97 day period, obtained from clone 16 It was not detected by RT-PCR using the different primers. T-1053 When inoculated with the plasma of the above, 5 serum samples collected during the period of 8 days and 40 days after the inoculation 4 samples were positive for clone 16. For T-1057, RT -The result of PCR was positive as shown in Fig. 27 from PI 7th to 28th. Among the 4 samples collected, the primers from clone 4 were used. Each specimen The results of RT-PCR performed on the Negative for clone 4 except on day 287, which showed an azeolysis signal Met. T-1057 obtained from PI 7 to 97 RT-PC using primers from clone 16 R was positive. However, blood between 8 and 85 days after inoculation with T-1053 Qing was positive with the use of primers from clone 16. 3. ELISA results for tamarins (titer test / transmissibility study) The tamarin T-1053 serum was exposed to 4 tamarins as described in Example 2. Seeded Three of these four tamarins were treated in the acute phase of the disease (PI 12 to 14 Euthanized during the day). RT-PCR results obtained for these three tamarins The results are listed below. The surviving tamarin (T-1051) is the first PI 14th Liver enzyme levels increased, and this level increased at least until PI 8 weeks. Tamarin T -1051 specimens were tested in the 1.7 and 1.4 ELISAs. result Is shown in FIG. Specific antibodies were found in serum collected during the first 41 days after inoculation Neither was it detected in the serum before inoculation. However, 1.4 protein ( The antibody response to SEQ ID NO: 611) and 1.7 protein (SEQ ID NO: 610) Between the 49th day of PI and the 113th day of PI, the 4.1 protein (SEQ ID NO: 612) was also paired. Antibody A reaction was observed between PI 28 days and PI 105 days. Tamarin is PI113 day I was euthanized. Tamarin (T-1034) was recently affected as described in Example 1 and Table 4. Potentially Infectious Serum of Patients Recovering from Hepatitis Infection (First GB Source) 0.1 previously inoculated with ml. Increase in liver enzyme level was observed after inoculation at T-1034. For about 10 weeks. For this reason Tamarin T-1034 is an additional It could be used in research. Tamarin T-1034 is HGBV tone Inoculated with product. This HGBV preparation was pre-treated with serum of tamarin T-1053. Three tamarin (T-1055, T-1038, T-1049) serum seeds were seeded. From Example 4? ? It was prepared according to the description in. To these three tamarins (T-1055, T-1038, T-1049), Serum prepared from tamarin T-1053 as described in Example 2 was inoculated. P By day I11, elevation of liver enzyme was observed in all three tamarins. PI 12th Tamarin T-1055 was killed in the eye. Tamarin T-1038 and Tamarin T-10 49 killed on day 14 of PI. These tamarin sera were pooled and clarified And filtered. This filtered one Of 10^-60.25 ml of the diluted product (prepared in normal tamarin serum) was used for tamarin T-1. 034 was inoculated. Two weeks after inoculation of T-1034, an increase in liver enzyme ALT value was first observed, and continued. The elevated value was maintained for 7 weeks, and finally normalized by 10 weeks after inoculation. Shown in Figure 30 As described above, the specific antibody response to the 1.4 (SEQ ID NO: 22) recombinant protein was PI4. It was first detected on day 9 and continued to be detected between days 56 and 118 of PI. 4.1 (Distribution (Row No. 52) An antibody response to the recombinant protein was first detected on day 49 PI. PI continued to be detected between 56 and 77 days. However, PI 84-118 days It wasn't served. The antibody response to the 1.7 (SEQ ID NO: 610) recombinant protein is It was first detected on day 56 of PI and continued to be detected between days 63 and 118 of PI. Tama Lynn was killed on the 118th day of PI. Tamarin T-1044 was inoculated with H205 for 7 days as described in Example 2. Later inoculated with serum from T-1057. This inoculum is clone 4 primer Only positive for the detected sequences. R using clone 16 primer Slow ALT value that exceeds the cutoff value between 14th and 63rd PI by T-PCR Was seen to rise. As described above, 1.7 (sequence number No. 610) The specific antibody response to the recombinant protein is between PI 63 days and 84 days, was detected. 4.1 (SEQ ID NO: 612) Antibody response to recombinant protein and 1 . No antibody response to the 4 (SEQ ID NO: 611) recombinant protein was detected. Tamarin was killed on day PI161. 4. PCR results for tamarins (titer assay / transmissibility studies) Serum collected from T-1049 and T-1055 in the 8th week prior to inoculation and And serum obtained from T-1038 on the day of inoculation and clone 10 (SEQ ID NO: 26) and And clone 4 (SEQ ID NO: 21) were negative for RT-PCR. Tamarin T -1049 and tamarin T-1055 are compared to the sequence of clone 4 (SEQ ID NO: 21). 1 week after inoculation, RT-PCR was positive (PCR of clone 16 was performed. There was not). T-1049 (PI 14th) and T-1055 prior to the day of killing (PI11 day) is the sequence of clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 16 (SEQ ID NO: 21). RT-PCR was positive for any of column numbers 26). Tamarin T-1 038 was positive with both primers on the day of killing (14th day of PI) . As can be seen from FIG. 30, T-1034 was first collected after inoculation (PI 7 days). RT-P for the sequence detected with the clone 4 primer in the serum sample of CR was positive and PI remained positive until day 70. Sun collected on PI112 The pull was negative. All of these samples are R with clone 16 primer It was negative by T-PCR. Suns collected on days 70 and 101 before inoculation The pull was negative with both primers. As can be seen from Figure 29 for tamarin T-1051, HGBV-RNA For serum samples taken 8 weeks before inoculation, both primers (black (From clone 4 and clone 16). HG BV-RNA was cloned in 6 sera collected between 7 and 69 days PI. Detected by RT-PCR using the primers from It was not detected in serum collected at 91 or 105 days. Collected after inoculation RT-PC with primers from clone 16 in 9 different samples HGBV-RNA was detected at R. As shown in FIG. 7, T-1044 was added after inoculation (PI 7 days). In the first serum sample collected, the clones detected with the clone 4 primer were detected. Rows were RT-PCR positive and continued to be positive up to PI 63 days. PI Samples taken between days 77 and 119 were negative. All these services The sample was RT-PCR negative for the clone 16 primer. Vaccination Sample taken 42 days ago was negative for both primers . T-10 collected on PI 14 against tamarin T-1047 and T-1056 44 sera were inoculated. 9 species collected from 7 to 64 days PI from both of these animals RT-PCR with clone 4 primers (SEQ ID NO: 8 and 9) It was positive but negative with the clone 16 primer. Tamarin T-1058 was harvested 22 days after induction with T-1053 serum. Undiluted T-1057 serum was inoculated. This inoculum is clone 16 primer Although it was positive for the sequence detected in It was negative. Serum samples taken from this animal were used for GBV-sequence [clone 16, clone 2, clone 10, clone 18] and GB-B sequence [claw. 4 and clone 50] It tested using the primer. All samples taken 9 days before inoculation Both were negative with the primers. The sample collected on the 14th day of PI is a clone Only 10 and 18 primers were positive. The sample taken on PI 21st is Only the primers of clones 16, 10, and 18 were positive. PI 28th The sample collected in 1. was positive only with the clone 18 primer. PI35 Samples collected daily are positive with clones 2, 16 and 18 primers only Met. Samples taken on the 41st day of PI are primers for clones 16 and 18 Only was positive. With the primers from clone 4 and clone 50, All samples tested were negative. 5. Summary of serological studies with tamarins Inoculation of 5 tamarins with various preparations of HGBV resulted in 2 weeks after inoculation By then liver enzymes began to rise. This elevated value persisted for the next 6-8 weeks. One or more Response of specific antibodies against the above HGBV recombinant antigens 1.7, 1.4 and 4.1 The answer was observed in all 5 tamarins. In each case, the antibody is first from PI6 It was detected at 10 weeks and lasted for another 2 to 7 weeks. Generally, antibody levels Peaks and then continues It fell rapidly within a few weeks. Antibodies will remain active for a while after the liver enzyme levels return to normal. Then, it can be detected. This means that the production of antibodies eliminates viral infection. It suggests that there is some action in San. 6. Summary of PCR research at Tamarin The results of the genome walking experiment are clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone 1 6 (SEQ ID NO: 26) is suggested to be on a separate RNA molecule. We are obedient Before, there were two different types of virus genome, one of which was clone 4 ( SEQ ID NO: 21) and another part contains clone 16 (SEQ ID NO: 26) He proposed the hypothesis that he would. One animal was positive with the primer from clone 4 The fact that the primer from clone 16 was negative was observed, It supports the existence of two different types in the viral genome. But However, the sequence of clone 16 (SEQ ID NO: 26) is one of the infectious tamarins. What was not detected was that the primer set of clone 16 and the clone set of clone 4 were It may be possible to argue that it reflects the difference in the lower limit of sensitivity from the Immerset. Not. If this latter possibility is correct, then both primers Both positive tamarins show a difference in sensitivity for these two primer sets. It should be. The above results are explained by the presence of two viral species. Reinforce the position that it is not due to the difference in sensitivity of the two primer sets To do this, use a series of serial dilutions of Tamarin T-1057 and T-1053 cDNAs. PCR was performed. T-1057 serum has a serum equivalent of clone 4 primer of 5 × 10^-3Positive with μl, 5 × 10^-Fourμl was negative. 20 T-1057 serum RT-PCR was performed with clone 16 primer using as much as 1 μl. The fruit was negative. If this difference is two primer sets (clone 4 vs. clone If it is due to the relative sensitivity of 16), when other samples were subjected to PCR, It is expected that it will show endpoint dilutions as high as 000-fold. However, T-1 CDNA derived from 053 serum was clone 4 (SEQ ID NO: 21) and clone Serum equivalent of 2.5 × 1 for both sequences of 16 clones (SEQ ID NO: 26) 0^-FourPositive with μl, 2.5 × 10^-FiveIt was found to be negative with μl. Therefore this The results cannot be explained by the difference in sensitivity of the primer sets, and the contigB-clone 4 (SEQ ID NO: 21) and contigA-clone 16 (SEQ ID NO: 26) Sequences differ at least 4000-fold in T-1057 Distinct viral genomes with titers, but approximately equal titers for T-1053 Is consistent with the assumption that it exists above. That is, this data is Consistent with the existence of two distinct viruses with different relative endpoint titers at It is. HGBV-B-induced viremia alone causes elevated liver enzyme levels Sufficient and elevated liver enzyme levels were observed in the GBV-A-only viremia stage From the observation that it is not possible, HGBV-B is probably found in these tamarins. It was found to be the causative agent of hepatitis. Immune response to HGBV-B antigen Appeared at the shortest time of 150 days after inoculation. The explanation for this is The epitopes selected in these ELISA assays generate the immune response It is possible that it was not from a major epitope. As another explanation Thus, in tamarins, hepatitis induction is not a severe condition requiring a long-term response. It is possible to say that. This may be due to killing in the acute phase or self-immediately after the acute phase. In dead animals, liver inflammation remained mild to non-severe (results shown No) and Consistent with histological evidence. In 5 of the 6 animals described in this study, HG Viralemia due to BV-B resolved. On the other hand, Tamarin T-1048 is 136 No recovery from viremia for days, and viremia was observed at the time of death (PI137 days) Was done. Of the 4 animals that were positive for the GBV-A sequence, 3 had GBV-A The viremia was resolved by 77 days after the first appearance of the line. On the other hand , Tamarin T-1061 was viremia for 245 days before being sacrificed. Admitted. In addition, tamarin T-1051 is not sacrificed (PI11). 3 days) It was viremia, but this persistent viremia was initially T-105. 3 plasma, or 69 days later, T-1053 plasma It is unclear whether the result was due to the additional vaccination in. Peak A of 6 animals positive for both HGBV-A and HGBV-B The mean value of LT was higher than the mean value of 4 animals positive for HGBV-B only. In addition, peak values were reached on average more than GBV-B only positive animals than GB Earlier in animals positive for both VA and GBV-B. These results may indicate that hepatitis intensity is present in significant amounts of both agents. Suggests not. GBV-B to Tamarin T-1047 and T-1056 The increase in liver enzyme levels was almost zero in GBV-B viremia during the subsequent subculture of It was observed that both drugs were ALT level in tamarin. We support the hypothesis that it may be essential to bring about a major rise in Le. HGBV In addition to sub-inoculation with -B alone, T-1058 was inoculated with the inoculum HGBV-A. The initial results were that GB was detectable with the primers of clone 4 and clone 50. -HGBV-A is detectable HGBV-, as indicated by the absence of the B sequence. It suggests that it can be transmitted independently without B. F. Experimental procedure to demonstrate exposure to HGBV in a human population Obtain samples from various human populations and use recombinant proteins derived from HGBV-B The presence or absence of antibodies against HGBV was examined by three separate ELISAs. Real In the 1.7 ELISA as in Example 15B, the CKS-1.7 recombinant protein was used. The solid phase was coated with Park (SEQ ID NO: 610), and CKS- in the 1.4 ELISA. 1.4 Solid phase with recombinant protein (SEQ ID NO: 611) And 4.1 recombinant protein (SEQ ID NO: 612) in 4.1 ELISA. The solid phase was coated with and used. Inoculated with HGBV as described in Example 15E Tamarin shows a specific but short antibody response to these proteins Was done. Due to the short-term nature of this detectable immune response, humans with negative results It can be said that the population may have been previously exposed to HGBV. Serological studies performed on human specimens have dual purposes. First The purpose is to obtain antibodies to the HGBV recombinant antigen of the present invention in various human populations. It was to determine the existence of scholarship. These studies are based on the following (1) to (3) Including: (1) Regarding exposure to HGBVLow riskGroup thought to be (eg For example, healthy volunteer blood donors in the United States); (2) To HGBV Groups considered “at risk” for exposure to e.g. Samples of patients with illness were tested against parenterally transmitted hepatitis virus (HBV and HCV). Often result in positive serologic reactions; specimens from individuals residing in developing countries Frequent serum reactions to enterally transmitted viruses (HAV and HEV) Become positive; (3) known Exposure to hepatitis virus (HAV, HBV, HCV, HDV, or HEV), Cytomegalovirus (CMV), Epstein-Barr virus (EBV), etc. "Non-AE-hepatitis" unrelated to exposure to other hepatitis-related viruses A sample group obtained from individuals who have A group that belongs to the general name of non-AE-hepatitis Some members of the loop have not been tested for antibodies to HEV. There is a match. Therefore, it has reactivity in 1.7, 1.4, or 4.1 ELISA. HEV-ELISA assay for all specimens of non-AE group (Available from). Anti-HEV is available in three regions (Pakistan, US Country, and New Zealand) with positive results as described below. It was a fruit. HGBV is more likely than the population that is considered "low risk" for exposure to HGBV In a “at risk” population of exposure to and to individuals with non-AE hepatitis , It is expected that a higher serological abundance will be seen. The second purpose of this serological study is to develop antibodies against one or more HGBV epitopes. The sample was found to be positive for RT-PCR, and the virus was present in the serum. Determine if present Was that. HBV and HCV are viral bloods that persist for months or years Disease state, and in general HAV and HEV generally last for several weeks It is well known to cause viremia. With acute and disappearing hepatitis In the case of HBV or HCV infection, the stage of viremia is as short as several weeks. In some cases, it may be persistent. In this way, RT-PCR shows that virus is present in infected individuals. It can be used to obtain evidence of existence. However, viral blood Since the condition of the illness may be short-term, even an individual infected with a drug may It may become T-PCR negative. G. FIG. Decide cutoff value Based on previous experience with other ELISA assays utilizing the indirect method, Preliminary cutoffs are probably negative for antibodies to the protein under study It has been found that the calculation should be based on the absorption obtained from the population considered to be. Forecast The truncated value is the mean absorption value of the population and 10 standard deviations from the mean value of the population. Calculated as a sum. The cut-off value is used each time a test group is tested. So, a simpler way to express the truncation is to have 5 duplicates for each assay. Negative run It was a method determined from control (normal human plasma pool-NFP). 1.7, For 1.4 and 4.1 ELISA, the negative control is typically It had an absorption between 0.030 and 0.060. Truncate as described below Values were calculated to be absorption at about 0.300 to 0.600, which is It was comparable to the absorption signal 10 times that of the sex control value. Therefore, Specimens considered to be reactive are samples for negative control (N) absorption values It is necessary that the absorption value (= S / N ratio) of (S) is 10.0 or more. H. Supplementary test Specimens that were found to be reactive in the first test were, in principle, retested in duplicate . If one or more of the reabsorption values are higher than the cut-off value, the sample is repeated. It was considered to be reactive again. For samples that were considered to be repeatedly reactive, In addition, a supplemental assay was performed to supplement the ELISA data. sufficient If there is a certain amount, the repeatedly reactive sample will show an antibody response by Western blot. CKS1.7 (SEQ ID NO: 610) CKS1.4 (SEQ ID NO: 611) or CKS 4.1 (SEQ ID NO: 612) The main tamper directed against the antigen, which is the problem The E. coli protein that may have been coated on the solid phase together with Confirmed that not. In order for a Western blot to be considered positive, Visible band is 80 kD, 1.4 for 1.7 protein (SEQ ID NO: 610) 60 to 70 kD for protein (SEQ ID NO: 611), or 4.1 protein It needs to be detected at 42 kD for (SEQ ID NO: 612). Wester Blots have been optimized to match or exceed the sensitivity of ELISA. Since there is no negative result, do not discard the ELISA data immediately even if a negative result appears Was. However, if a positive result is obtained, it is detected by ELISA. It also reinforces the reactivity. Clone 4 primer was used for a sufficient amount of the sample with repeated reactivity. RT-PCR (performed as described in Example 15D) using The HGBV-specific nucleotide sequence in may be identified. If the result is positive, The specimen was found to be viremia and ultimately HG in human hepatitis It will help establish the role of BV. However, the result is negative But it should not be construed as an incorrect result of the ELISA. By tamarin Conducted in research As described in Example 15E, RT-PCR results were positive for the first few weeks after infection. Then, when the antibody was just detected by the ELISA of the present invention, it became negative. It was Even if the sample in the subsequent steps was negative for the RT-PCR reaction, Or it may be positive in both ELISAs. I. Serum reaction data in low-risk samples 100 sera and 1 from a healthy volunteer blood donor in southeastern Wisconsin A population of 00 plasma was obtained and the above-mentioned ELISA gave 1.7 (SEQ ID NO: 61). 0), 1.4 (SEQ ID NO: 611), 4.1 (SEQ ID NO: 612) Were tested for antibodies to ku. For serum and plasma 1.7, 1.4, and The absorption values obtained in 4.1 ELISA were plotted separately (FIGS. 9-14). In the 1.7 ELISA, the average absorption value for serum and plasma samples is 0 respectively. . 072 [standard deviation (SD) is 0.061] and 0.083 (SD = 0.05) It was 5). Therefore, in the 1.7 ELISA, the provisional cutoff values for serum and plasma are It was 0.499 and 0.468, respectively. Negative control as described above It is also possible to express the cutoff value based on the absorption value of You. A sample having an S / N ratio of more than 10.0 was regarded as reactive. Use this rounded down value Of the 200 samples tested against the antibody against 1.7 (SEQ ID NO: 610) 0 samples were reactive. 1.4 Some samples in ELISA (3 from serum population, 6 from plasma population) Showed an absorption value of more than 0.300 (S / N ratio of 6 to 12, expected rounding down) Close to or above the value). When retested, all 9 of these samples were 10.0 It showed a lower S / N ratio. Average absorption values for serum and plasma samples are 0 . 072 (SD = 0.052) and 0.108 (SD = 0.062) . The cut-off value in 1.4 ELISA was calculated by the above formula. That is, blood The cutoffs for the clear and plasma populations are 0.436 and 0.54, respectively. It was 2. One specimen in the serum population was reactive in the first trial, but was When tested again, it was negative. Two specimens in the plasma population were initially tested Responsive, but retest negative. 100 plasma samples and 100 serum samples A second population of 200 normal specimens was tested. Tried based on the previously proposed truncation When tested, 2 plasma and 2 serum samples were repeatedly reactive. In the 4.1 ELISA, the average absorption value for serum and plasma samples was 0.2. 070 [standard deviation (SD) is 0.037] and 0.063 (SD = 0.040) )Met. Therefore, in 4.1 ELISA, the provisional cutoff for serum and plasma The discard values were 0.329 and 0.511, respectively. As described above, It is also possible to determine the truncation value based on the absorption value of the troll: S / N ratio of 10. Samples exceeding 0 were considered to be reactive. Using this truncated value, 4.1 (array number No. 612), out of 100 plasma samples tested for antibodies, and Of the 100 serum specimens, 0 specimens were considered reactive in the first test. Additional 760 Plasma Donor Offers from Interstate Blood Bank (Ohio) After receiving the test, 1.7-ELISA and 1.4-ELISA tests were conducted. 9 inspections in total The body was repeatedly reactive. Samples that are reactive in both ELISAs at the same time None, all 9 specimens were repeatedly reactive in 1.4 ELISA. A total of 960 samples from plasma or blood donors residing in the United States Then, the presence or absence of antibodies against 1.7 protein and 1.4 protein was investigated. 13 samples in total 1.4 EL Repeatedly reactive in ISA. Repeated reactivity with 1.7 ELISA None of the specimens had it. In summary, these data show the following: That is, HGB In one or more ELISA assays using recombinant antigen from V-B ELISA results up to and including 9 taken from United States blood donors Of the 60 samples, 13 were antibody-reactive. From this result, HGBV is AMERI It may be a so-called endemic disease unique to the United States. These data are shown in Table 16. J. Specimens considered “at risk” for hepatitis The data from this study are shown in Table 16. (I) Samples from West Africa Of the 1,300 specimens obtained from West Africa, a total of 181 specimens have more than one ELI Repeatedly reactive with SA. Reactive specimens from all three ELISAs There was one sample. A total of 43 specimens showed reproducibility in 1.7 ELISA and 9 One sample has repeated reactivity with 1.4 ELISA, 51 samples have 4.1 ELISA It had a reactivity with A repeatedly. One of the six specimens that were repeatedly anti-reactive in the 1.7 ELISA was 1.7 It was reactive on a Western blot for the protein (SEQ ID NO: 610). 1.4 out of 9 samples (100%) that were repeatedly reactive in ELISA Is a Western blot for antibodies to the 1.4 protein (SEQ ID NO: 611). Was positive. One sample is a Western blot for both proteins It was positive. 4.1 out of 12 samples that were repeatedly reactive in the ELISA Two specimens (100%) are western for 4.1 protein (SEQ ID NO: 612) The blot was positive. 3 specimens that showed repeated reactivity (one specimen that was positive in 1.4 ELISA) And one sample that was positive in both ELISA and Western blot). And by RT-PCR using the primers from clone 4 as described above. Then, the presence or absence of HGBV-RNA was examined. The data obtained suggest that HGBV may be endemic in West Africa. Met. (Ii) Samples from intravenous drug users (IVDU) Set 1: 3 out of 112 samples in 1.4 ELISA It was positive. 5 samples reacted with 4.1 ELISA and 3 samples reacted with 1.7 ELISA Gender. Two samples were positive in more than one ELISA. Set 2: A total of 99 specimens were collected from a group of intravenous drug users. This exam is Hines Veteran's Administrati, Chicago, Illinois on Hospital). All of the samples are 1.7 or There was no reactivity in the 4.1 ELISA. Repeat one sample with 1.4 ELISA Reactivity was observed. For this repeat-reactive sample, clone 4 Of HGBV-RNA as described above by RT-PCR using primers Existence was checked. This sample was RT-PCR negative. K. Specimens collected from individuals with non-AE hepatitis The data obtained are summarized in Table 16. Various sample populations were obtained from the population diagnosed with non-AE hepatitis, and the results are shown in Example 15C. Therefore, 1.7, 1.4, and 4.1 ELISAs were performed. The samples used are Including: 180 specimens from Japanese clinics; New Zealand clinics 56 specimens from Kuk; 73 specimens from Greek clinics; Egyptian 132 specimens from clinic; 6 from clinic in Texas, USA 4 specimens (set T); 72 specimens from Minnesota research center (set M); rice 62 specimens from the country (set # 1); 82 specimens from a Pakistan clinic; 10 samples from Tarry's clinic (some samples are viable due to lack of serum) No successful ELISA assay was performed). (I) Japanese specimen These 180 specimens were from 85 different patients. 180 samples Two of them were repeatedly reactive in the 1.7 ELISA. These two reactivities The specimens shown were from two different patients. For the above two samples, claw It was tested as above by RT-PCR using the primers from PCR4. Sun There was no sex specimen. No samples were positive by 1.4 ELISA. For 4.1 ELISA, 7 out of 89 samples were repeated in 4.1 assay Reactivity (note: these 89 samples were obtained from 29 different patients) ). Five of the reactive specimens were from one patient. 2 remaining samples Was from another patient. (Ii) New Zealand samples Out of 56 samples, a total of 4 samples are one or more of 1.7, 1.4, and 4.1 ELISA Was repeatedly reactive in. Of these, two or more ELISA None of the specimens were shown. One specimen was repeatedly reactive in 1.7 ELISA and 2 The specimen was repeatedly reactive in the 1.4 ELISA. 4.1 ELISA for 1 sample Was repeatedly reactive with. Perform PCR on two repeat-reactive samples did. As a result, both samples were negative. Repeated reactivity in 1.4 ELISA One specimen that showed the above was also reactive with the antibody against HEV. (Iii) Greek specimen 5 samples out of 73 samples are antibody reactive by 1.7 and / or 1.4 ELISA Met. These 73 specimens were collected from 11 patients in total. repeat 2 out of 5 reactive samples showed repeated reactivity in both ELISAs. Were taken from the same patient on different days. Two repeated reactivities The indicated specimen was examined by RT-PCR and was negative. Any of these specimens Also had no antibody reactivity in the 4.1 ELISA. (Iv) Egyptian samples A total of 11 samples out of 132 samples were detected by 1.7, 1.4, or 4.1 ELISA. Showed responsiveness. Eight specimens were positive in both 1.7 and 1.4 ELISA. Nine specimens were antibody-reactive in 1.7 ELISA, and 9 specimens were anti-reactive in 1.4 ELISA. It was responsive. One specimen showed repeated reactivity in 4.1 ELISA, but Negative in 7 and 1.4 ELISA. Repeated reaction in 1.7 ELISA One specimen that showed sex was analyzed by Western blotting. Negative for antibody to column no. 610). Repeated by 1.4 ELISA 6 out of 9 samples that showed reactivity were 1.4 recombinant tamper in Western blot. Positive for antibodies to sucrose (SEQ ID NO: 611). Repeatedly reactive Seven of these samples were tested by RT-PCR. All specimens show reactivity Did not. All 132 samples were collected from 25 different individuals on different days. It was. The 11 specimens showing repeated reactivity were from 5 different individuals. Was. In one of these individuals (patient # 101), the immune response was clearly It was similar to that observed with tamarin (Figure 31). Figure 31 Smell Note that ALT levels were elevated by the time the doctor recognized symptoms. Subsequent specimens had lower ALT levels, and the 1.4 and 1.7 ELISAs Antibody was detected. The antibody response was similar to the serum reaction status observed with tamarin. , Then fell over the next few weeks. An additional 3 patients (257, 260, and And 340) showed similar serum patterns to patient # 101 (see Figures 32-34). . These data indicate that HGBV may be the causative agent in these cases of hepatitis It supports the hypothesis that it does not. Of the 7 samples from the above 4 patients, all samples were HGBV- by RT-PCR. It was not RNA positive. There are several possible reasons for this result. Firstly ui The rheusemia stage may be very brief, in which case the virus is first collected. It may have been removed from the serum by the day of blood. Secondly, these inspections Since the body was transported from Egypt by ship, it is probably frozen during the process of preservation and transportation , May have undergone thawing or undergo other changes, resulting in HGBV-RN The detection ability of A may have decreased. (V) United States sample (Set T) 64 samples (Set T) from the United States, 1.7, 1.4, 4.1 ELIS None of the samples in A had repeated reactivity. (Vi) United States sample (Set M) Out of 72 samples (set M) in the United States, 4 samples in total are one or more ELIS Repeated reactivity was shown by A. Two specimens are reactive in 1.7 and 4.1 ELISA showed that. Only one sample with reactivity in 1.7 ELISA, 4.1 ELISA Only one specimen was reactive. (Vii) United States sample (set 1) 1 out of 51 United States specimens (Set 1) with non-AE hepatitis Alternatively, both ELISAs showed repeated reactivity. Repeat one sample with both ELISAs It showed reactivity. One sample shows reactivity in 1.7 ELISA and three samples show 1.4E Repeated reactivity was shown by LISA. Recombinant 1.4 specimens positive in both ELISAs Protein was positive by Western blotting (SEQ ID NO: 22), but 1 . 7 recombinant protein (SEQ ID NO: 23) was negative. 1 additional sample is 1.4 By ELISA Positive, Western blot positive for 1.4 recombinant protein (SEQ ID NO: 611) Gender. 1.4 One sample showing repeated reactivity in ELISA is against HEV It was reactive with the antibody. (Viii) Pakistan samples 4 out of 82 samples repeated in 1.4 and / or 1.7 ELISA It was antibody-reactive. None of the specimens showed reactivity in both ELISAs. 2 specimens Repeated reactivity in 1.7 ELISA, 2 samples repeated in 1.4 ELISA And showed reactivity. Two specimens that were repeatedly reactive in 1.4 ELISA were tested against HEV. It was also reactive with the antibody. None of the 82 samples were positive by 4.1 ELISA won. (Ix) Italy samples Repeated reaction in 1.7, 1.4, and 4.1 ELISA for all 10 samples Showed no sex. L. Statistical significance of serum reaction results These data show that specific antibodies against HGBV protein (ie 1.7, 1.4 , Or 4.1 specimens that repeatedly show reactivity with antibodies in ELISA). It shows that it can be detected in all three categories of groups. Various sample categories ー (“Low Results from "risk," "at risk," and non-AE hepatitis patients) Were combined and analyzed for statistical significance by the chi-square test. Data to HGBV Individuals who are considered to be "at risk" for exposure or diagnosed with hepatitis of unknown classification Prevalence of anti-HGBV in volunteer blood donors, including selected individuals Comparing the rates showed that there was a significant difference. The serological prevalence in West African specimens was 13.9%, which is Significantly higher under p-value of 0.000 compared to the group above spline (Table 17) . Similarly in IVDU, when the results were compared with data from volunteer donors. , There was a statistically significant difference (p value = 0.000). Japan, New Zealand For countries including United States, United States, Egypt, and Pakistan The presence of antibodies in non-AE hepatitis patients compared to volunteer blood donors in the United States. There was a significant difference. H. Conclusion These data were obtained by the various ELISAs described herein in New Zealand, Japan. In various regions, including Land, United States, Egypt, and Pakistan Useful for human hepatitis diagnosis Suggests a possibility. These data are available for all categories of tested specimens. Appear to underestimate the serological presence of antibodies to HGBV. You. As additional HGBV epitopes are discovered and evaluated, they are currently being diagnosed. HGBV genome (group) in diagnosing hepatitis in patients who cannot It is expected that the usefulness of tests based on () will become more important. Note: these RT-PCR was negative in the first study of Flavi-like virus sequences were found in the serum of clear positive individuals. As mentioned above, there are more than one HGBV strain. These are examples of the present invention. It is considered to be inside the box and is called "hepatitis GB virus (HGBV)".Embodiment 16 FIG. Serological study of HGBV-A A. Recombinant protein purification procedure Bacterial cells expressing the CKS fusion protein were frozen and stored at -70 ° C. Each G Bacterial cells from the BV-A construct were thawed and the GBV-B construct was tested in Example 15. Milled as described above. In addition, recombinant protein was added in Example 15 Purified as described for GBV-B recombinant protein. The fractions collected during this purification procedure were electrophoretically separated and separated by Coomassie Brilliant Stained with Roux R250, the molecular weight is about 60 kD (CKS-1.5 / SEQ ID NO: 61). 4), 65 kD (CKS-2.17 / SEQ ID NO: 613), 55 kD (CKS-1) . 18 / SEQ ID NO: 390), and 66 kD (CKS-1.22 / SEQ ID NO: 39). The presence or absence of the protein corresponding to 0) was examined. The fraction containing the protein of interest is And examined again by SDS-PAGE. The immunogenicity and structural integrity of the pooled fractions containing purified antigen was determined in Example 13. Electron transfer and immunoblot to nitrocellulose according to the method described in 1. Determined by law. There was no suitable positive control, so the recombinant protein Is each fusion Identified by reactivity with a monoclonal antibody against the CKS portion of the combined protein Was. Recombinant antigen is detected for CKS-1.5 protein (SEQ ID NO: 614) Therefore, when examined by Western blotting using anti-CKS monoclonal antibody, A single band was observed at about 60 kD. This result is CKS-1.5 It corresponds to the expected size of the protein (SEQ ID NO: 614). Similarly, CKS-2. 17 protein (SEQ ID NO: 613), CKS-1.18 protein (SEQ ID NO: 390) ) And CKS-1.22 protein (SEQ ID NO: 390) were also detected by immunoblotting. As a result of examination, it had the expected size. B. Procedure for coating polystyrene beads The above proteins were dialyzed and poly of these proteins was prepared as described in Example 15. The antigenicity on styrene beads was evaluated. C. ELISA procedure for detecting antibodies to HGBV Various ELISAs were performed as described in Example 15. D. Detection of HGBV-RNA in serum of infected individuals For the samples that showed repeated reactivity in each ELISA, the section of Example 15 was used. The presence or absence of HGBV-RNA was examined as described in Section D. E. FIG. Tamarin serology CKS1.5 protein, CKS2.17 protein, all derived from the HGBV-A genome EL using Pak, CKS1.18 protein, or CKS1.22 protein In the ISA assay, none of the sera from tamarin showed a specific immune response. won. However, as described in the previous examples, some of the infected tamarins RNA of HGBV-A was detected in E. coli (see the serum profile of tamarin in Example 15). See summary). F. Experimental procedures for serological studies on the human population. In Example 15, an ELISA using a recombinant antigen derived from HGBV-B was performed. The presence of antibodies against HGBV-B in various human populations was evaluated. So Then, for many of the same samples, the CKS1.5 recombinant protein (SEQ ID NO: 614 1.5 ELISA, CKS2.17 recombinant protein (SEQ ID NO: 613) 2.17ELISA, CKS1.18 recombinant protein (SEQ ID NO: 39) 0) with 1.18 ELISA and CKS1.22 recombinant protein (sequence Antibody against HGBV-A by ELISA using Was checked for. Each protein was coated on the solid phase as in Example 15. I used it. Convalescent tamaris inoculated with HGBV as described in Example 15. All five showed a specific antibody response to the HGBV-B recombinant protein, , Lasted only a short period (detected by 1.7, 1.4, and 4.1 ELISA ). In the 1.5, 2.17, 1.18, or 1.22 ELISA, Tamarins also showed no detectable antibody response, but human specimens from West Africa Some of these are related to one or more of these recombinant proteins on Western blots. Hepatitis caused by a surgeon (a supplier of GB drugs) One of the samples collected on day 22 of the illness was 2.1 when tested by Western blot. A specific antibody reaction against 7 recombinant proteins was shown (see Example 3). This embodiment Then, in detecting antibodies in various human populations, 1.5, 2.17 , 1.18, and 1.22 ELISAs were evaluated for their usefulness. G. FIG. Decide cutoff value Cutoff values for 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs , As described in Example 15. H. Supplementary test As described in Example 15, only those specimens that showed initial reactivity were identified. Then, as a general rule, a retest was conducted. When a sample shows reactivity for the second time, Additional tests (eg Western blot) to supplement the data from the ELISA. Was carried out. To be considered positive for Western blot results, The visible band is 60 kD for 1.5 protein (SEQ ID NO: 614), 2. 65kD for 1. 7 protein (SEQ ID NO: 613), 1.18 protein (SEQ ID NO: No. 390) and a pair of 1.22 proteins (SEQ ID NO: 390). Needs to be detected at 66 kD. Western blot is ELISA Negative result because it is not optimized to match or exceed the sensitivity of Even if it appeared, the data of the ELISA was not immediately discarded. However, If a positive result is obtained, it will reinforce the reactivity detected by the ELISA. Of. As described in Example 15, although sufficient amount of repeat-reactive analyte was obtained, In contrast, RT-PCR using primers (performed as described in Example 15) ) May be performed to identify HGBV-specific nucleotide sequences in serum. I. Serological data in low-risk samples A total of 252 plasma samples were collected from Interstate Blood in Ohio. 1.5 EL with 1.5 recombinant protein (SEQ ID NO: 614) obtained from bank The presence or absence of antibodies was examined by ISA. The average absorption value in this population is 0.036 (SD = It was 0.022). The cutoff value was calculated to be 0.168. This is the S / N ratio = Corresponds to 10.0. 760 plasma samples (252 used for cut-off value determination The samples were tested for the presence or absence of antibodies in a 1.5 ELISA. Repetitive None of the specimens showed reactivity. In addition, 100 plasma samples were collected in South Wisconsin. Obtained from the eastern part and tested for the presence of antibodies in a 1.5 ELISA. Repeated reactivity None of the specimens showed. Thus, evidence of the presence of antibodies to the 1.5 protein is in the United States. Was not found in any of the blood donors. 200 samples were obtained from a Wisconsin blood donor and 2.17 recombinant 2.17 ELISA for the presence or absence of antibodies did. The average absorption value in this population was 0.058 (SD = 0.025). Off The discard value was calculated to be 0.208. This almost corresponds to S / N ratio = 10.0. One of the samples showed repeated reactivity. Thus, blood donations in the United States In the elderly (N = 200) The seroprevalence was relatively low. For the same 200 specimens described in the paragraph above, 1.18 and 1. The presence or absence of antibodies was tested by 22 ELISA. Does any sample show repeated reactivity? Was. Thus, for samples from volunteer blood donors, 1.5, HGBV, as judged by the 2.17, 1.18, and 1.22 ELISAs There was no evidence of antibody positivity for the A protein. J. Specimens considered “at risk” for hepatitis The data from this study are summarized in Table 18. (I) Samples from West Africa Of 1,300 specimens, 58 specimens showed reactivity in 1.5 ELISA. repetition Of the 18 samples that were reactive, 12 contained 1.5 proteins (SEQ ID NO: 614). ) Was positive on a Western blot. 4 out of 817 samples Three specimens were reactive in the 2.17 ELISA. Samples with these repeated reactivity Regarding the antibody to the 2.17 protein (SEQ ID NO: 613) No tan blot was performed. Six of the 817 samples were reactive in the 1.22 ELISA. Nine of the 353 specimens were reactive in the 1.18 ELISA. 2.17ELIS When 21 specimens reactive with A were tested by Western blotting, 13 specimens reacted Gender. Eight samples that were repeatedly reactive in the 1.18 ELISA showed that Western block Was positive. These data suggest that HGBV may be endemic in West Africa It is. (Ii) Samples from intravenous drug users A total of 112 samples were collected from a group of intravenous drug users. This test is in Illinois It is part of what was done at the Hines Veterans Administration Hospital in Chicago. 1 sample is 2 . Reactivity was observed repeatedly in 17 ELISA. Additional sample is 1.18 EL Reactivity was shown by ISA. 1.5 or 1.22 EL for any of these samples It was not positive by ISA. K. Specimens collected from individuals with non-AE hepatitis The data obtained are summarized in Table 18. Various sample populations (described in Example 15K) were obtained from the non-AE hepatitis population and 1 . 5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISA (described in Example 15C) Was carried out. Some specimens Did not perform all ELISA assays due to lack of serum. (I) Japanese specimen A total of 4 samples out of 89 samples showed repeated reactivity in 1.5 ELISA. That Three of them were from one individual and one was from another individual. 1.5 EL One specimen that was negative by ISA, 1.18 ELISA, and 1.22 ELISA Showed reactivity in the 2.17 ELISA. 1.18 ELISA shows reactivity None of the specimens did. These specimens were not tested in the 1.22 ELISA . (Ii) New Zealand samples None of the 56 specimens showed reactivity in the 1.5 ELISA. these 2.17 ELISA, 1.18 ELISA, or 1.22 ELISA I didn't inspect it. (Iii) Greek specimen All 67 samples (from 10 patients) were 1.5, 2.17, or Showed no reactivity in the 1.22 ELISA. (Iv) Egyptian samples None of the 132 samples were reactive with the 1.5 ELISA. Can be inspected Of the 132 samples, a total of 7 samples were reactive in the 2.17 ELISA. These tests The body was from 25 patients with acute non-AE hepatitis. 3 out of 25 patients The name is 2.17 ELISA and seropositivity is positive when more than one day has passed after the onset of hepatitis. there were. No reactive sample in 1.18 or 1.22 ELISA Was. (V) United States sample (Set M) None of the 72 specimens showed reactivity in the 1.5 ELISA. 3 out of 72 samples The sample showed reactivity in 1.18 ELISA. Two samples are 2.17 ELISA, In addition, 4 samples showed reactivity in 1.22 ELISA. 2 samples are more than 1 EL Reactivity was shown by ISA. (Vi) United States sample (Set T) Reactivity with 1.5, 1.22, or 2.17 ELISA for all 64 samples Did not show. One specimen had a reactivity of 1.18. (Vii) United States sample (set 1) A total of 3 samples out of 62 samples showed reactivity in one or more GBV-A ELISAs. One test showed repeated reactivity in both 2.17 and 1.22 ELISA. There was a body. 2.17 ELISA has only one reactive sample and another one Showed reactivity only in 1.22 ELISA. 1.5 or 1.18 ELIS There were no specimens reactive with A. As mentioned above, there may be more than one HGBV strain, or more than one The virus can be represented by the sequences described herein. They are within the scope of the present invention. It is considered to be inside the box and is called "hepatitis GB virus (HGBV)". L. Statistical significance of serum reaction results These data show that specific antibodies against the HGBV-A protein (ie 1. Repeated reactivity with antibodies in 5, 2.17, 1.18 and 1.22 ELISAs Samples are considered to be “at risk” for individuals exposed to HGBV and non- Volante in the United States of America was detected in individuals diagnosed with AE hepatitis. Have not been detected very frequently in both blood and blood sellers. Was done. In Table 19, various Tegory samples (“Low risk”, “At risk”, and non-AE hepatitis in Table 18) The results of the serum reaction from patients) were combined and analyzed for statistical significance by the chi-square test. Was. Table 18 shows sera of antibodies against HGBV protein in the total number of samples tested. However, unlike this, the data in Table 19 It shows the results from the body (person). For GBV-A ELISA, anti-H The serological presence of GBV was assessed in association with volunteer blood donors and exposure to HGBV. Between individuals that are considered to have a disc (West Africa, but not IVDU) It is shown that there is a significant difference (p value = 0.000) when compared with. Addition By comparison to Egypt and the United States when compared to volunteer blood donors Existence of antibodies against HGBV-A in non-AE hepatitis patients in , There was a statistically significant difference. This data shows that exposure to HGBV-A and non-A -Suggested to be associated with hepatitis E. Note: RT in these first studies -The PCR result was negative, but seropositive individuals were shown by the subsequent data. Flavi-like virus sequences were found in the sera of E. coli (see Example 19). M. Conclusion These data show that the ELISA described in the present invention is resident in West Africa. Suggested to be useful for detecting antibodies in the body and in individuals with non-AE hepatitis Is what you do. The risk of developing hepatitis is relatively high in West African populations high. Nearly 85% of people are seropositive for antibodies to hepatitis B virus And about 5% are positive for antibodies to hepatitis C virus. These data are Underestimated serological presence of antibodies to HGBV in all categories of tested specimens Seems to be evaluating. Further HGBV epitopes discovered and evaluated To diagnose hepatitis in patients who are currently unable to make a diagnosis. Therefore, the usefulness of tests based on HGBV genome (s) will become more important. Is expected.Example 18. Identification of GB-related viruses in humans A. theory Both HGBV-A and HGBV-B epitopes were identified (Example 3 ). These are used as serological markers to screen human serum and plasma samples. It was cleaned (Examples 5 and 6). Some of these markers The blood There was a striking correlation between the clear activity and the frequency of non-AE hepatitis, which It has been suggested that GBV-B is the etiological agent of non-AE hepatitis in humans ( Example 5G). However, analysis of GB human serum by Western blot No reactivity was shown for the HGBV-B epitope (Example 3). So Instead, at least one HGBV-A epitope was identified in GB human serum. Was. This suggests that HGBV-A was the etiological agent of hepatitis in GB Things. Both HGBV-A and HGBV-B sequences were non-A-in RT-PCR. It was not identified in patients with hepatitis E (Example 5E). So suffered from non-AE hepatitis For evidence of HGBV-A and / or HGBV-B infection in living humans. I still need to kill it. Distribution of HGBV-A and / or HGBV-B in human serum or plasma sources There are several possible causes for the failure of column identification. First, we Limited number of HGBV-A seropositive and / or tested by RT-PCR Or HGBV-B seropositive samples, many of these samples being preserved History is unknown. So it is present in these samples Viral RNA may have been affected by improper storage. Second, G B infection appears to heal itself. Therefore, the one infected with GB sequence The duration of time present in the serum of the body can be very narrow. Ie contains a GB sequence The chances of obtaining a blood serum sample will be extremely low. Finally, HGBV-A And / or HGBV-B sequences in search of a limited number of PCR primers The use of a headset is included. HGBV-A and / or HGBV-B Is an RNA virus, it tends to have a high mutation rate (Holland et al. (1 982) Science 215: 1577-1585). That is, the tested human serum The HGBV-A and / or HGBV-B sequences in our PCR primers The sequence is different, so that HGBV-A and / or HGBV-B are detected. It may not be issued. Due to the genomic variability of HGBV-A and / or HGBV-B our P Since HGBV- may indicate that these viruses may have been interfered in CR studies. A highly conserved NS3-like region of A and / or HGBV-B (see Figure 17). ), A denatured PCR primer was designed and arranged. These highly protected The existing regions perform the necessary functions in the viral replication cycle It is. Thus, these sequences are HGBV-A and / or HGBV-B variants. It should have been preserved in. PCR PCR designed and placed in this area Immers can detect HGBV-A and / or HGBV-B by RT-PCR. Nom RNA should be detectable. In addition, HGBV-A, HGBV-B and And design degenerate PCR primers capable of specifically amplifying For example, sequences obtained from viruses associated with HGBV-A, HGBV-B and HCV We may have been able to amplify the. So if different H Cross-reacts with antigens of GBV-A-related virus or HGBV-B-related virus Due to the presence of antibodies, in human serum and plasma samples (Examples 5 and 6) If serum reactions were poorly detected, we recommend that these GB-related The sequence could be obtained from Ils. [This was recently done by Nicole and his colleagues A special hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory disease in the southwestern United States It is similar to the experimental procedure used for identification. Nicole et al., Science 2 62: 914-917 (1993)]. B. Cloning of NS3-like region of hepatitis GB virus C (HGBV-C) In a model of viral infection, viremia occurs early in the infection, which Often correlates with the detection of IgM antibodies to viral proteins. Example Recombinant proteins derived from HGBV-A and HGBV-B as described in 5, 6. Samples in which IgG antibody against Park was detected showed immunoreactivity in ELISA. Had. An additional ELISA was performed to test IgM antibodies for these proteins. I checked if it was detected. Blood of a West African individual (Example 5E-i) Some of the positive test specimens were related to IgM antibody against recombinant protein. Was reactive (data not shown). These specimens may contain viruses Was considered expensive. In addition, HGBV-A positive and H suffering from acute hepatitis GBV-B positive Egyptian individuals (Example 5F-vii), with HGBV-A or For specimens in which IgM antibody against HGBV-B recombinant protein is not detected , Acute liver disease may be associated with the presence of the virus gave. For the nucleic acids of these samples, HGBV-A, HGBV-B, and Each sequence of HCV-1 "Half-nested" (hemi-nes) using degenerate oligonucleotide primers that amplify ted) RT-PCR was performed. Equipment used is GeneAmp (registered trademark) RNA Using a PCR kit (Perkin Elmer), follow the manufacturer's instructions. gave. Briefly, the first set of amplifications was 2 mM MgCl 2.₂And 1 μM Primers ns3.1-s and ns3.1-a (SEQ ID NO: 671 and And 672) to produce cDNA by random-primed reverse transcription of the nucleic acid extracted. I went about things. For the reaction product, denaturation-annealing-extension [(94 ° C, 30 Second; 37 ° C, 30 seconds; 72 ° C over 2 minutes; 72 ° C, 30 seconds) for 3 cycles, 37 cycles of (94 ℃, 30 seconds; 55 ℃, 30 seconds; 72 ℃, 30 seconds) U] was carried out 40 times, and finally it was extended at 72 ° C. for 10 minutes. What the reaction is finished Stored at 4 ° C. The second set of amplifications used 4% of the first PCR product as template Ns3.1-s and ns3-a (SEQ ID NOs: 671 and 6 respectively) 73) was used as a “heminested” primer set there were. The products of the first and second sets of PCR were analyzed by gel filtration. One sample in West Africa is about 386bp (HGBV-A, Blurred half-nested reaction on HGBV-B, or expected size of HCV product) Had a PCR product derived from. This product is described in books in the art. Cloned into pT7 Blue T-Vector Plasmid (Novagen) Was. Sequence obtained from this clone (GBcontigC [GB-C], SEQ ID NO: 6 73, residues 2274-2640) to GBcontigA (GB-A, SEQ ID NO: 1). 63, residues 4438-4804), GBcontigB (GB-B, SEQ ID NO: 3). 93, residues 4218-4587), and HCV-1 (SEQ ID NO: 398). did. Figure 36 shows the nucleotide sequences of these sequences, while Table 20 shows Shown is the% homology between these sequences. As shown in FIG. 36 and Table 20, GB-A, GB-B, and HCV-1 As a result of comparison of leotide, these sequences were 47.99 to 61.66% similar to each other. ing. This is due to the presence of the NTP-binding helicase in these viruses. It is not particularly surprising considering the amino acid residues present (Example 2B3, FIG. 17A). West African sample (GB-C, SEQ ID NO: 673, residues 2274- 2640) and the nucleotides of the NS3 PCR product obtained from Comparing the tides, GB-A (SEQ ID NO: 163, residues 4438-4804), G BB (SEQ ID NO: 393, residues 4218-4587), and HCV-1 (sequence No. 398) and is shown to be distinctly different. You have been abducted. Nucleic acids in the Wisconsin Sequence Analysis Package (version 8) And protein database and GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-264) As a result of BLASTIN and BLASTX analysis with 0), some of the strains of HCV It has been found that there is a limit to sequence identity. Related to nucleotides and amino acids The highest P value (that is, the probability that the sequences are matched by chance) is 1.9 × 10^-20And 5.3 × 10^-31Was (data omitted). Taken together, these data represent GB-C (SEQ ID NO: 673, residue 227). 4-2640) is HGBV-A, HGBV-B and we are here HGBV-C. It is derived from a unique GB-like virus related to HCV which is designated as Suggests that it may be. C. GB-C is exogenous Using PCR primers for the GB-C sequence, as described above, ie, for example This sequence was sequenced in human, rhesus, S. cerevisiae by the procedure described in Example 6B. cerev isiae and E. It was determined if it was detected in the E. coli genome. P CR uses Perkin-Elmer-Citas GeneAmp®, Basically, it was carried out according to the manufacturer's instructions. That is, 300 ng of genomic DNA Used for each 100 μl reaction. PCR primer (SEQ ID NO: 675 And 676) were used at a final concentration of 1.0 μM. 40 cycles of PCR (9 4 ° C., 30 seconds; 55 ° C., 30 seconds; 72 ° C., 30 seconds), then extend at 72 ° C. for 10 minutes I let it show. The PCR products were separated by agarose gel electrophoresis and the nuclei were extracted with ethidium bromide. After directly dyeing the acid, make it visible by UV irradiation and further by Southern transfer After transfer to Hybond-N + nylon filter, radiolabeled probe and hive It was lysed. Figure 37 shows GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640). PCR product after hybridization with a radiolabeled probe prepared from PhosphoImage obtained by immunoblotting (Molecular Dynamics) , Sunnyvale, California). GB-C (SEQ ID NO: 673) is ~ 350 fg (1 of GB-C plasmid template in 300 ng of human genomic DNA). Genome copy equivalent, lane 5) and ˜35 fg (0.1 genome copy equivalent, Human (FIG. 19, lane 1), rhesus monkey (lane 2). ), S.P. cerevisiae (lane 3), E. E. coli (lane 4) It was not detected in nom DNA. (Lane 7 is ~ 3.5 fg [0.01 genome Copy equivalent] of the PCR product from the GB-C plasmid template with 300 ng of human Contained in nom DNA. ) Thus, 0.1 genome copy equivalent can be detected GB-C (SEQ ID NO: 673) was found to be human, rhesus, S . cerevisiae and E. Not detected in the E. coli genome. This result The fruit is exogenous (ie viral) in origin from GB-C (SEQ ID NO: 673). Is consistent with the expectation that D. GB-C can be detected in additional human serum samples RT- was added to additional HGBV-A and HGBV-B immunoreactive human serum samples. PCR was applied and checked for the presence of GB-C sequences. As described in Example 7 , Reverse-transcribe nucleic acid extracted from serum sample with random hexamer, and convert to cDNA 35-40 cycles of amplification were performed (94 ° C, 30 seconds; 55 ° C, 30 seconds; 7 (2 ° C., 30-90 seconds), and then extended at 72 ° C. for 10 minutes. Specific to GB-C PCR primers (g131-sl and g131-al, SEQ ID NOS: 675 and 67) 6) was used at a concentration of 1.0 μM. Separation of PCR products by agarose gel electrophoresis Then, the nucleic acid is directly stained with ethidium bromide and then visualized by UV irradiation. And transfer it to a Hybond-N + nylon filter before Hybridized. A total of 48 HGBV-immunopositive samples from West Africa Was tested. Eight subsamples from West Africa, including the first sample in which GB-C was identified. The sample was found to be positive for the GB-C sequence by RT-PCR. GB serum anti A total of 10 negatively transduced West African serum samples were tested, all of which were detectable G The BC sequence is Did not have. PCR products from 4 positive samples were cloned and Was sequenced as follows. I examined 156 nucleotides and found 4 Two of the loans are GB-C sequences (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) 2 clones (SEQ ID NOS: 677 and 678) were cloned into GB-C (SEQ ID NO: No. 673, residues 2274-2640) and sequences that are 88.4% and 83.6% homologous. (Fig. 38). However, divers at the nucleotide level Clones, despite being very similar, SEQ ID NO: 678 Only one amino acid difference was found in the expected translation of , Shown in the expected translation. Additional blood from non-AE hepatitis individuals in Greece, Egypt and the United States Clear samples were obtained and tested for GB-C sequences as described above. these None of the samples contained the GB-C sequence. GB-C in the sample There are several possible reasons why the sequence was not detected (see Theoretical section above). See). However, with GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640) The above sequence variation between the two GB-C variants (SEQ ID NOS: 678 and 677). If the close HGBV-C from West Africa associated with 15.1 at the nucleotide level % PCR PCR primers specific for GB-C (g131- sl, g131-al, SEQ ID NOs: 675 and 676) are geographically distinct sequestrants. Sufficient to produce a detectable PCR product. Suggests that it may not soybean. In this case, By using PCR primers designed in the conserved region (5'UTR), GB- The C sequence may be detectable in West African serum samples. E. FIG. Extension of HGBV-C sequence Additional GB-C sequences were obtained by the PCR walking method described in Example 2A. . That is, initially identify GB-C (SEQ ID NO: 673, residues 2274-2640). Total nucleic acids were extracted from the West African human serum used for this purpose. This nucleic acid Reverse transcription was done in this way. The resulting cDNA was added to 2 mM MgCl 2.₂Using Except that 50 μl of PCR reaction was performed according to the method described by Sorensen et al. It was amplified in the reaction product (PCR1). 35 cycles of denaturing the reaction-annealing- Subjected to a stretching step (94 ° C, 30 seconds; 55 ° C, 30 seconds; 72 ° C, 90 seconds), Then, it was extended at 72 ° C. for 10 minutes. According to the method described by Sorensen et al. Then biotinylated with streptavidin-coated paramagnetic beads (Promega). The product was isolated. This streptavi was then prepared according to the method described by Sorensen et al. The same 35 cycles of denaturation-annealing-extension to the gin-purified product. Therefore, nested PCR (PCR2) was performed. The product obtained and The PCR primers used for production are shown in Table 21. Furthermore, under the conditions of PCR1 above, an oligonucleotide primer (SEQ ID NO: 669 and 670) were used to generate the 1.3 kb product (C.16). This product Were isolated from the agarose gel along with those listed in Table 21 and are well known in the art. Clone into pT7 blue T-vector plasmid (Novagen) according to the method. I learned. The cloned product was sequenced as described in Example 5. GCG The sequences were assembled by the program in the package (version 7). Built 39 shows the outline of the contig. GB-C has a length of 9034 bp, The full length was sequenced. This is shown in SEQ ID NOs: 400-606. These sequence numbers The issue corresponds to three forward translation frames. Example 19.CKS-based expression and detection of immunogenic HGBV-C polypeptide The HGBV-C sequence obtained in the walking test described in Example 17 (Table 13) was Restriction fermentations listed in Table 22 (10 units, NEB) as described in Example 13. CKS expression vectors pJO200, pJO201 and pJO202 Cloned. Two additional PCR clones, C3 / 2 and C8 / 12 was also expressed (FIG. 39). PCR product with the primer of SEQ ID NO: 681 To produce PCR product C8 / 12 and the complement of SEQ ID NO: 685. It was generated using the primers (SEQ ID NO: 693 and its complement) as described in 9. The PCR product was cloned into pT7 blue as described above and then cloned into the table. 22 and released with the restriction enzymes listed above, and the above pJO200, pJO201 and It was cloned into pJO202. More than one CKS / HGBV-A or CKS / HGBV-B fusion protein The presence of antibodies against 1.7, 4.1, or 2.17 ELISA (Example 15, 16) and selected two human sera suggested by Therefore analyzed. One of these sera (240D) was treated with non-AE hepatitis (Ed. (Pt) individual, while the other (G8-81) is from West Africa. Was "at risk" for exposure to HGBV (see Example 15). . Express the CKS / HGBV-C fusion protein and use it as described above for nitro. Transferred to a cellulose sheet. Pre-block the blot as described, 10 % E. E. coli lysate and 6 mg / ml 1: 100 with blocking buffer containing XL1-Blue / CKS lysate Incubate overnight with one of the diluted human serum samples. Blot is T Wash twice with BS and react with HRPO-conjugated goat anti-human IgG, as above. Deployed. The results are shown in Table 22. HGBV-C protein shows reactivity with one or the other of these two sera There are several types, and select three of them (C.1, C.6, C.7) and ELIS A assay (see Example 20). In this way, HGBV-A and Samples already known to show reactivity with HGBV-B protein , HGBV-C protein was also found to react. Three HGBV viruses Reactivity with multiple proteins from Escherichia coli is a result of epitope sharing among viruses May be due to the cross-reactivity of. Alternatively, this is a multi-species virus Infection, and possibly due to other unidentified factors It is also possible. Embodiment 20 FIG. Serological study of GBV-C A. Recombinant protein purification procedure Bacterial cells expressing the CKS fusion protein were frozen and stored at -70 ° C. Each G Bacterial cells from the BV-C construct were thawed and the GBV-B construct was tested in Example 15 It was crushed as described above. In addition, recombinant protein was added in Example 15 Purified as described for GBV-B recombinant protein. The fractions collected during this purification procedure were electrophoretically separated and separated by Coomassie Brilliant Stained with Roux R250, the molecular weight is about 75 kD (CKS-C.1 / SEQ ID NO: 40 4), 71 kD (CKS-C.6 / SEQ ID NO: 404), and 49 kD (CKS. -C. 7 / SEQ ID NO: 404) was examined for the presence or absence of the protein. Expected molecular weight The band showing the protein of CKS-C. 6 and CKSC. 7 recombinant proteins Was observed. CKS-C. For 1 protein, the expected molecular weight is 7 A band was observed at a position corresponding to a molecular weight of 62 kD, not at 5 kD. What It is unclear if the expected and observed bands differ. Target of interest Fractions containing the protein of 5 were pooled and examined again by SDS-PAGE. . The immunogenicity and structural integrity of the pooled fractions containing purified antigen was determined in Example 13. Electron transfer and immunoblot to nitrocellulose according to the method described in 1. Determined by law. There was no suitable positive control, so recombinant protein Identified by reactivity with a monoclonal antibody against the CKS portion of the combined protein Was. CKS-C. To detect the recombinant antigen of 1 protein (SEQ ID NO: 404), anti- Approximately 65k when examined by Western blotting using CKS monoclonal antibody A single band was recognized at D. This result is CKS-C. 1 protein (SEQ ID NO: 404) is different from the expected size of 75 kD. In addition, CKS- C. 6 protein (SEQ ID NO: 404) and CKS-C. 7 protein (SEQ ID NO: 4 04) has the size expected by immunoblotting. Was. B. Procedure for coating polystyrene beads The above proteins were dialyzed and poly of these proteins was prepared as described in Example 15. Immunogenicity on styrene beads was evaluated. C. ELISA procedure for detecting antibodies to HGBV Various ELISAs were performed as described in Example 15. D. Detection of HGBV-RNA in serum of infected individuals For the samples that showed repeated reactivity in each ELISA, the section of Example 15 was used. HGBV-RNA was examined as described in Section D. E. FIG. Tamarin serology CKSC. From the HGBV-C genome. 1 protein, CKSC. 6 proteins Rui is CKSC. In an ELISA assay using 7 proteins, is tamarin None of these sera showed a specific immune response. Of tamarin in Example 15 See description for serologic features. F. Supplementary test As described in Example 15, for samples that initially showed reactivity, typically Retested. By ELISA if a sample shows repeated reactivity Perform additional tests (eg Western blot) to further supplement the data be able to. Observable for Western blot results to be considered positive Noh band is C. 65 kD for 1 protein (SEQ ID NO: 404), C.I. 6 tons 71 kD against Park (SEQ ID NO: 404), or C.I. 7 protein (SEQ ID NO: 4 49 against 04) It needs to be detected in kD. Western blot is sensitive to ELISA It's not optimized to be comparable or beyond, so even if you get a negative result We did not discard the ELISA data immediately. However, a positive result If there is a fruit, it reinforces the reactivity detected by ELISA. As described in Example 15, it is necessary to prepare a sufficient amount of the sample that is repeatedly reactive. In contrast, RT-PCR (using primers corresponding to SEQ ID NOS: 8 and 9 10) and the HGBV-C-specific nucleotide sequence in serum. The columns can be identified. G. FIG. Experimental procedure Example 15 pairs HGBV-B and HGBV-A in various human populations. E with recombinant antigens from HGBV-B to assess the presence of LISA was used. CKS coated on solid phase as described in Example 14 -C. C. using a recombinant protein (SEQ ID NO: 404). 1ELISA, CKS -C. C. using the 6 recombinant protein (SEQ ID NO: 404). 6 ELISA, and CKS-C. 7 Recombinant protein (Sequence number No. 404). Using 7ELISA, antibody against HGBV-C Previous tests were performed on many of the same specimens. As described in Example 15, H All five convalescent tamarins inoculated with GBV (1.7, 1.4 and 4.1 Responding to HGBV-B recombinant protein (as detected using ELISA) It produced specific but short-lived antibodies. C. 1, C.I. 6 and C.I. 7E None of the tamarins produced detectable antibodies in response to LISA, but human Some bodies were tested by Western blotting (see Example 13) , C.I. 1, C.I. 6 and C.I. 7 produces specific antibodies that react with recombinant proteins Was. In this example, C. elegans for detecting antibodies in various human populations. 1, C . 6 and C.I. The usefulness of 7ELISA was evaluated. H. Decide cutoff value C. 1, C.I. 6 and C.I. The cut-off value of 7 ELISA is described in Example 15. I decided. I. Serological data obtained using low risk samples 100 blood samples from healthy volunteer donors in southwestern Wisconsin If you obtain a population containing 100 plasma and Qing Momo, C.I. CKS-C. 1 (SEQ ID NO: 404) protein, C. CKS-C. 6 (SEQ ID NO: 404) protein, and C. CKS-C. H containing 7 (SEQ ID NO: 404) protein Antibodies to three recombinant proteins from GBV-C were tested. C. For 1 ELISA, the average absorption values of serum and plasma samples are 0.049 (standard deviation (SD) = 0.040) and 0.038 (SD = 0.02) It was 9). The cutoffs for serum and plasma are 0.214 and 0.28, respectively. Calculated as 6. As mentioned above, the cut-off value is expressed as a function of the absorption value of the negative control. Samples with S / N values higher than 10.0 are considered to be reactive. Was. Using this cut-off value, C. 1 protein Initial reactivity and repeated reactivity were found for the antibody against (column number 404). None, and in one of 100 serum specimens, C.I. 1 protein (SEQ ID NO: 40 Initial reactivity and repeated reactivity were observed for the antibody against 4). C. For 6 ELISA, mean of serum and plasma specimens The absorption values are 0.102 (standard deviation (SD) = 0.046) and 0.105, respectively. (SD = 0.047). Specimens with S / N values greater than 10 are reactive The cutoff value was set so that Using this cutoff value, 3 C. in the specimens (2 from the serum population and 1 from the plasma population). 6 proteins Repeated reactivity was observed for the antibody against (SEQ ID NO: 404). C. For 7ELISA, the average absorption values of serum and plasma samples are 0.061 (standard deviation (SD) = 0.040) and 0.050 (SD = 0.05) It was 5). A sample with an S / N value of 10 or more will be judged to be reactive. The cutoff value was set. Using this truncated value, C.I. 7 proteins (sequence No specimen considered to be repeatedly reactive with the antibody against won. Therefore, approximately 1% of American blood donors (N = 200) have C1, C6 or C. It has been proved that there is an antibody against the 7 protein. J. Specimens considered "at risk" for hepatitis The data for this study are summarized in Table 23. (I) Samples from West Africa A total of 20 out of 137 specimens were obtained by ELISA using GBV-C protein. Reactive in one or more. A total of 12 out of 97 C.I. 1 Repeatedly reactive in ELISA, 3 out of 52 C. Repeated reactivity was observed in 6 ELISAs and 137 Five of the body are C. Repeatedly reactive in 7 ELISA Was. C. Three of the samples that were reactive in 1 were tested by Western blotting. It was tested and found to be responsive. These data suggest that HGBV is endemic in West Africa . (Ii) Samples of intravenous drug users Part of a study conducted at the Hines Veterans Administration Hospital in Chicago, Illinois As a result, a total of 112 samples were obtained from a group of intravenous drug users. 112 inspections Two in the body have repeated reactivity with one or more proteins I was One specimen was C.I. Repeatedly reactive in 1 ELISA Stopped and one specimen was C.I. Repeated in 7ELISA It was found to be a relapsing reactivity. C. 6 positive in ELISA There was no specimen. K. Specimens obtained from individuals with non-AE hepatitis The data for this study are summarized in Table 23. Populations of various specimens (described in Example 15.K) from individuals with non-AE hepatitis. Obtained, 1.5, 2.17, 1.18, and 1.22 ELISA (Example 15.C Described in 1.). Insufficient volume of sample Could not be tested in the ELISA. (I) Japanese specimen Of the 89 samples in total, C.I. Repeatedly reactive in 1 ELISA Nothing was stopped. Due to the small amount of specimen, C6 or C.I. 7EL No testing for antibodies on ISA was performed. (Ii) Greek specimen A total of 67 specimens were C.I. 1 and C.I. Tested using 7 ELISA. Reactivity None of the specimens were stopped. (Iii) Egyptian specimen A total of 18 out of 132 samples can be used in more than one ELISA And was found to be reactive. C. Reactive in 1 ELISA Nothing was stopped. A total of 15 specimens were C.I. Reactive in 6 ELISA And three specimens were found to be C. Respected to be reactive in 7 ELISA I was stopped. (Iv) US specimens (M set) A total of 6 specimens were found to be reactive in more than one ELISA. 2 Individual specimens are C.I. Repeatedly reactive in 1 ELISA. 4 pieces Of the C.I. Repeated reactivity was observed in 6 ELISAs. C. 7 There were no repeat-reactive specimens in the ELISA. (V) Specimen from USA (T set) Of the 64 specimens, C.I. 1 ELISA or C.I. 6 Reaction in ELISA None were found to be sex. One specimen was C.I. In 7 ELISA Repeatedly reactive. (Vi) Specimens from various clinical sites in the United States (Set 1) In total, 3 out of 62 specimens were reactive with more than one ELISA Admitted. One specimen was C.I. 1 ELISA and C.I. For both 6 ELISA And is repeatedly reactive It was recognized. Two specimens were C. Repeatedly reactive in 7 ELISA Admitted. As mentioned above, there may be more than one strain of HGBV, ie more than one strain. Distinct viruses of can be represented by the sequences disclosed herein. these Is considered to be within the scope of the present invention and is referred to as "Hepatitis GB virus (" HGBV ")" You. L. Statistical significance of serum reaction results These data are for individuals considered at risk for exposure to HGBV, and And individuals diagnosed with non-AE hepatitis include HGBV-C protein (ie, C. 1, C.I. 6 and C.I. Repeated reactivity to 7 ELISA antibody Body-specific antibodies were detected and volunteers or blood donors from the United States From these, these antibodies were detected at a low rate. Table 24 shows the various categories of tests. On the body ("low risk", "at risk", and non-AE hepatitis patients shown in Table 23) The results of the serum reaction obtained for the The statistical significance was analyzed. Anti-HGBV protein resistance in the total number of specimens tested Unlike the data in Table 23, which summarizes the serological presence of the body, the data in Table 24 , To different individuals It reflects the results obtained. For the GBV-C ELISA, see the Data on the serological presence of anti-HGBV in volunteer blood donors. , Individuals considered to be at risk of being exposed to HGBV rather than IVDU (West Africa) It shows that there is a significant difference (p value = 0.000) in comparison with You. Also, HGBV in individuals with non-AE hepatitis in Egypt and the United States The presence of serological antibodies to -C was compared to that of volunteer blood donors. There was a statistically significant difference. According to these data, exposed to HGBV-C Is suggested to be associated with non-AE hepatitis. Note: these early Although the results of RT-PCR were negative in the study, the data obtained after And flavi-like virus in the serum of serologically positive individuals (see Example 19). The sequence is revealed.Embodiment 21 FIG. Presence of HGBV-C in humans with non-AE hepatitis Suffering from non-AE hepatitis due to the generation of an HGBV-C-specific ELISA To identify immunologically positive sera of patients (examples of HGBV-C serology) Became. This sera was obtained from individuals (Table 25) who were demonstrated to have non-AE hepatitis. HGBV-C with several immunologically positive HGBV-A and HGBV-B The rows were tested by RT-PCR. Detect variants of HGBV-C as much as possible To allow denatured NS3 oligonucleotide primers in the first round of amplification RT-PCR was performed using, followed by nested GB-C specificity A second round of amplification was performed using the primers. Specifically, the first amplification 2 mM MgCl₂, And 1 μM of primers ns3.2-s1, ns3. 2-a1 (SEQ ID NOS: 711 and 712, respectively) were used and were described in Example 6. It was carried out using the serum cDNA product thus prepared. Denaturation of reactants Annealing-extension was repeated 40 times [(94 ° C for 30 seconds, 37 ° C for 30 seconds, 2 Repeat the cycle of increasing the temperature to 72 ° C over a period of 30 minutes at 72 ° C for 30 seconds 3 times. , And then (94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 30 seconds) Cru 37 times], followed by extension at 72 ° C. for 10 minutes. Obtained reaction product Was maintained at 4 ° C. The second amplification was 2 mM MgCl 2.₂1 μM GB-C Specificity primers (SEQ ID NOS: 675 and 676) and 4% of the first template 1 PCR product was used. In the second round of amplification, Specifics with oligonucleotide primers that contain base pair mismatches A temperature cycling scheme designed to amplify even the products of [Roux, B io / Techniques, 16: 812-814 (1994)]. That is, The reaction was cycled by temperature (94 ° C for 20 seconds, 55 ° C (0.3 ° C decrease for each cycle)). After performing 30 times at 72 ° C for 1 minute 43 times, (94 ° C for 20 seconds, 40 ° C for 30 minutes Sec., 72 ° C. for 1 minute) 10 times, and final extension at 72 ° C. for 10 minutes. PCR The product was isolated by agarose gel electrophoresis and the nucleic acid was extracted using ethidium bromide. After direct staining, visualized by UV irradiation and Hyb by Southern transfer After transfer to an ond-N + nylon filter, a radiolabeled probe for GB-C was used. Hybridization was performed on the lobe. PCR products are described in the art. It was cloned and sequenced as described. GB-C. 4, GB-C. 5, GB-C. 6, and GB -C. Got 7. These sequences have a GB-C (distribution of 82.1 to 86.6%). Sequence number 400, bases 4167-4365). Figure 40 was expected In the codon triplet, GB-C. 4, GB-C. 5, GB-C. 6, and GB-C. 7 shows the sequence difference. This figure As shown in, most of the nucleotide differences are due to amino acid changes from GB-C. Not cause. Maintenance of the overall sequence at this amino acid level is described in GB-C. 4 , GB-C. 5, GB-C. 6, and GB-C. 7 different for the same virus It suggests that it was obtained from the strain HGBV-C. In addition, The extent of sequence differences at the cleotide level was determined by these PCR products previously identified. Shown to be not the result of contamination with any of the GB-C sequences You. Three of these individuals (GB-C.4, GB-C.5, GB-C.6, and And GB-C. 7 sources), hepatitis A, hepatitis B, or hepatitis C There was no evidence of this. GB-C in individuals suffering from hepatitis of unknown etiology Existence of array Currently, it is suggested that one of the causative agents of human hepatitis is HGBV-C. Pieces Two of the body (including GB-C.4 and GB-C.5) were tested over time. Fees were available. To trace the sequence of HGBV-C in these samples , Developed a clone-specific RT-PCR. That is, the nucleic acid extracted from serum is Reverse transcribed by random hexamers as done in Example 7. Get The prepared cDNA under the conditions of 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 30 seconds. Amplification was carried out 40 times, followed by extension at 72 ° C. for 10 minutes. GB-C. 4 and G B-C. 5 specific PCR primers (GB-C.4-s1 and GB-C.4- a1 or GB-C. 5-s1 and GB-C. 5-a1) at a concentration of 1.0 μM used. The PCR product was isolated by agarose gel electrophoresis, and ethidium bromide was isolated. The nucleic acid was directly stained with a membrane and visualized by UV irradiation, After transfer to Hybond-N + nylon filter with a spur, radiolabeling pro Hybridized to the probe. GB-C. In serum of an Egyptian patient suffering from acute non-AE hepatitis. 4 was found. This patient was seropositive for HGBV-A protein. Was (HGBV-A ELI (See SA example). RT-of 5 series of samples obtained from this Egyptian patient PCR indicates viremia, which is at least 2 after normalization of serum ALT levels It lasted for 0 days (Table 26). GB-C distribution after normalization of serum ALT The presence of rows suggested that some people could lead to chronic infections. But this No further patient samples were obtained, thus concluding on the chronicity of HGBV-C. There is no argument. Seeking additional samples to solve this problem It is. GB-C. 5 is a Canadian patient with hepatitis-related aplastic anemia Obtained from. Each sample of this patient had a C.I. 7 Serologically positive in ELISA (Example 20). Between Canadian patients and aplastic anemia (13 after onset of symptoms) Day-) and at time of death (day 14, FIG. 41), GB-C. 5 GB with specificity primers (GB-C.5-s1 and GB-C.5-a1) -C. 5 was detected. However, GB-C. 5-specific PCR is used when the symptoms occur ( On day 0, acute hepatitis) and day 3 (liver failure) GB-C. 5 sequences can be detected Didn't come Therefore, in the first sample, GB-C. 5 is below the detection limit It is unknown whether it existed in. If you If present, HGBV-C is the causative agent of the patient's aplastic anemia. Would have been However, GB-C. 5 is RT-P only in the critical period of defective reproduction Since it was detected by CR, GB-C. 5 was given to treat anemia It may have come from blood products. In this case, HGBV for aplastic anemia The -C association may be similar to HCV [Hibbs et al., JAMA, 267, 2051-2054 (1992)]. To detect HCV infection in view of the distant relationship between HGBV-C and HCV It is of interest whether the present method of recognizing human samples containing HGBV-C can be recognized. Was the subject of The usual test for individuals exposed or infected with HCV is HCV- By an antibody test utilizing antigens from three or more regions of 1. You. This study tested all known HCV genotypes in most individuals. Antibody can be detected [Sakamoto et al., J. Gen. Virol. 75, 1761 1768 (1994), Stuyver et al. Gen. Viro l. 74, 1093 to 1102 (1993)]. Second generation E for HCV LISA is described in Example 10 (Table 25). It was carried out on the sample containing HGBV-C. 4 samples containing HGBV-C One of them was seropositive for the HCV antigen. Serum anti-HCV Only a limited number of response-negative human sera were very sensitive RT-PCR assays. Sei showed positive for HCV genomic RNA [Sugitani , 1992, # 65]. Similar RT-PCR assay (described in Example 9 Have confirmed the presence of HCV viremia in seropositive samples. I However, none of the serum-reactive HCV-negative samples had HCV viremia. won. Therefore, one of the four individuals containing the HGBV-C sequence is HCV-sensitive. Although there is evidence of staining, the present assay for the presence of HCV was HGBV- The presence of C could not be predicted accurately. This one HCV-positive patient is HGBV- It seems that C was also infected. Hepatitis in this patient is HCV, HGBV-C, It is unclear whether was due to the presence of both viruses. In the same patient The discovery of HCV and HGBV-C in humans is a common risk for these infections. It would suggest that ku exists. Using the PCR procedure above, two volunteers in 1994 A GB-C distribution in a "normal" unit of blood obtained from an American donor Column (~ 85% homologous to the previous GB-C isolate shown in Figure 41, data not shown) ) Was identified. These units tested negative for HBV and HCV. And had a normal serum ALT value. But these units are . As a result of the test in 4 ELISA, it was determined to be positive. Immunologically screened ~ HGBV-in at least two "normal" blood units of ~ 1000 units The discovery of C indicates that the virus currently exists in the US blood supply. And suggests. However, we have an ELISA developed from HGBV protein And nucleotide probes from the HGBV sequences were used to Indicates that the The various HGBV sequences (Figure 41) have numerous sequence variations. You have to keep in mind. PCR-based assays for viral nucleic acids Is very sensitive, but with oligonucleotide primers and viral templates Depends on the sequence match between and. Therefore, the PCR primer used in this study Is not well preserved in various isolates HGBV-C virus tested because it was located in a region of the HGBV-C genome All of the blood samples could not be detected by the RT-PCR employed here Will. As it was discovered in the untranslated region of HCV 5 '[cha (Ch a) et al., J. Clin. Microbiol. , 29, 2528-2534 (1 991)], PCR primers from a well-conserved region of the HGBV-C genome. By using this, it is possible to detect HGBV-C viremia samples more accurately. Will be able to Embodiment 22 FIG. Sequence comparison and systematic analysis Comparing nucleotides and predicted amino acid sequences, that is, performing alignment Can provide information about the degree of virus affinity. HGBV By aligning the sequences with those of other viruses, similarities between the sequences Sex and homology The degree of sex can be quantitatively evaluated. This information is the classification of HGBV virus Can be used to develop principles for. Generally, a class between two amino acid sequences Similarity calculations are based on the degree of similarity between the side chains of the amino acid pairs in the alignment. Done. The similarity is a physicochemical characteristic of the side chain of an amino acid, that is, size, shape, It is based on charge, hydrogen bonding ability, and chemical reactivity. I.e. similar ami No acids have side chains with similar physicochemical characteristics. For example, phenylara Both nin and tyrosine contain aromatic side chains and are therefore chemically similar. Can be considered. A discussion of amino acid chemistry is taught in basic biochemistry. Textbooks, for example, Biochemistry, Third Edition, Lubert Steyer (Lu bert Stier), W. H. Freeman and Company, Newyo Can be seen in 1988. Homology between two aligned amino acid sequences The sex calculation generally counts the number of identical amino acid pairs in the alignment and Is an arithmetic calculation that divides by the length of the sequence being aligned. Amino acid sequence Two aligned nucleotide sequences, similar to the method used for ligation Determining the degree of homology between the Count the number of tide base pairs and divide this number by the length of the sequence being aligned. It is a technical calculation. Calculation of the similarity between two aligned nucleotide sequences is done by Between paired (ie matched) pairs at various positions in the license Sometimes different values are used for transitions and transitions. But a pair of nucleos The similarity and homology scores between the tide sequences are usually very close, ie 1-2% or more. It is within. As previously mentioned, between the HGBV agonist and the hepatitis C genotype amino acid sequence The homology of is limited. The degree of intimacy between HGBV agonists and HCV In order to more accurately determine the degree, the overall large of HGBV-A, B and C Open reading frame (ORF) sequences and large O of some representative HCV isolates Amino acid sequence alignment was performed using the RF amino acid sequence. In addition, Nuku The degree of closeness between HGBV agonists and HCV at the reotide level was determined by HG BV-A, B and C overall genomic nucleotide sequences, and some representatives Was determined using the entire genomic nucleotide sequence of a typical HCV isolate. amino An alignment between the acid sequence and the nucleotide sequence is 53711, Wisconsin Madison, Scienced Available from Genetic Computer Group, Inc. at Live 575 Using the program GAP of the Wisconsin sequence analysis package (version 8) I did it. The gap creation and gap extension penalties are related to nucleic acid sequence alignment. Ment is 5.0 and 0.3 respectively, for comparison of amino acid sequences Were 3.0 and 0.1, respectively. GAP programs are aligned To calculate the degree of similarity and homology expressed as a percentage between two sequences, the knee The algorithm of Needleman and Wunsch (J. Mol. B. iol. 48, 443-453, 1970). Nucleotides of a selected number of major hepatitis C virus (HCV) genotypes Sequences and amino acid sequences were obtained from GenBank. This is their registration number Both are shown below. The predicted amino acid sequence of a large open reading frame (ie putative precursor polyprotein) A sequence and a nucleotide sequence between each of the above HCV genotypes and an HGBV isolate; The comparison results for each pair between the two are shown in Tables 28 and 29, respectively. Gene of each HCV isolate The type specification is shown in the top line. The genotype designation is Simmons Pee ds, P) et al. (1994) Hepatology, 19, 1321-1324. Based on the described nomenclature for HCV isolates. The data presented in Table 28 shows the amino acid sequence homology between HCV genotypes. It shows that the lower limit is 69%. this The values are based on Simmons et al. (Simmonds, P) et al., Hepatology. , 19, 1321-1324 (1994)]. Simon Z. et al. Compare the coding regions of eight complete HCV genomes from two major groups. And showed a degree of amino acid sequence similarity of 67.1% to 68.6%. But this The author did not describe how the similarity was calculated. This value (69%) is HCV -Comparison of J8 with other major HCV isolates Okomoto et al. [V irology, 188, 331-341, 1992] near. However, these investigators also did not describe how the homology was calculated. HG A comparison of the BV polyprotein sequence with each HCV genotype is coded by HGBV. The sequence of the generated polyprotein corresponds to that of any of the HCV polyproteins (Table 28). However, it is revealed that the homology is 33% or less. nucleotide Comparison of the sequences (Table 29) shows that between any HGBV and any HCV isolate. There is a maximum of 44.2% homology, compared to the lowest among HCV isolates. Also has a nucleotide sequence homology of 64.9%. Therefore, HGBV-A, Between B and C and HCV the predicted nucleotide The amino acid sequence homology is that of a homology established for a known HCV genotype. HGBV virus is a hepatitis C virus It cannot be considered genotyped. The relationship between the hepatitis C virus and the hepatitis GB virus is their alignment. Selected nucleotide, deduced amino acid sequence (ie, large open reading frame), or Or by performing a systematic analysis on some of these sequences it can. When this method was applied to hepatitis C virus, the variability of HCV isolates Have been shown to describe six equally divergent main groups of sequences [Simo Simmonds, P., et al. Gen. Virol. (1993) 74 2391-2399 and Simmonds, P. et al. Gen. V irol. (1994) 75, 1053-1061]. As a result of this analysis, C type A nomenclature for the hepatitis virus was established [Simmonds, P. et al. Hepatology, 19, 1321-1324 (1994)], this nomenclature The method classifies isolates into genotypes based on the evolutionary separation between sequences. To determine the systematic relationship between hepatitis GB virus and hepatitis C virus , Putative helicase gene of NS3 and putative RNA-dependent RNA-po of NS5B. Alignment of amino acid sequences within Limerase (RdRp) was performed. Also, F Related sequences from other viruses in Laviviridae, and helicers Flaviviridae within the ze gene and the polymerase gene. Viruses that have been shown to have evolutionary closeness to the bar also align Included in [Koonin, E.V.] and Dolja V.V. Lee (Dolia, V.V.) (1993), Crit. Rev .. Biochem. Mol . Biol. 28, 375-430, and Koonin, E.V. V.) (1991), J. Gen. Virol. 72, 2179-2206]. Amino acid sequence alignments can be performed using the Wisconsin Sequence Analysis Package (Barge 8) program PILEUP. Aligned pair The systematic distance between rows is determined by J. Felsenstein (F. Järssenstein J (1989), Cladistics 5, 164 ~ 166] courtesy of PHYLIP Package (version 3.5c, 1993) PROTDIST program Was determined. This calculated distance is the program NEIGHBOR (adjacent join Settings) were used to assemble phylogenetic trees. Step The phylogenetic diagram was plotted using the program DRAWTREE. Of the virus used The sequences and their corresponding Genbank accession numbers are shown in Table 31. Helicase, Rd Rp, or each HC for alignment done in a completely large open reading frame The turn distances between the V genotype and each HGBV virus are shown in Tables 32, 33 and 34. Are shown below. HCV genotype and HGBV virus and listed in Table 30. The calculated distances from other viruses are not shown. Helicase, RdRp, Or strains designed for complete large open reading frame amino acid alignments The figures are shown in Figures 42, 43 and 44, respectively. Putative RdRp encoded in NS5B region of HGBV-A, B and C And several HCV genotypes RdRp, two infectious viruses, some typical Flaviviruses and some positive-strand RNA plant viruses The alignment of amino acid sequences with Having features of conserved sequences related to RdRp of land RNA virus (Data not shown). Based on similar analysis, HGBV-A and HG The helicase encoded by BV-B is the RNA of these positive strands. It shows significant homology with the viral helicase (data not shown). The exception is , CARMV, TCV presumed not to carry the helicase gene, and MNSV [Guilley, H) et al. (1985) Nucle ic Acids Res. 13, 6663-6677]. These results are Helicase and RdRp signatures of these viruses have been demonstrated by previous systematic analysis. This was not an unpredictable result in view of the relationship of the gene to the supergroup. -Koonin, E.V. and Dolja, V. . V) (1993), Crit. Rev .. Biochem. Mol. Biol . 28, 375-430]. However, helicase or RdRp sequences (Table 30 and And 31) based systematic adjustment of the systematic distance between HGBV and HCV isolates. Surveys have shown that there is a considerable separation between these two groups. Calculated distance Tari indicates a close relationship between HCV genotypes and The maximum distance between genotypes is 0.3696 (RdRp distance). But H RdRp between GBV-A, -B, or -C and any member of the HCV group? The calculated distance is 0.96042-1.46261. Similarly, any The value calculated from the helicase alignment for the two HCV genotypes is 0 . The range is 044555 to 0.19706, whereas any member of the HCV group The distance between the bar and HGBV-A, -B, or -C is 0.69130-0.8. The range is 7120. In addition, the HCV genotype and the GB virus were completely released. Alignment of predicted amino acid sequences in open reading frames is based on evolutionary HCV isolates. The separation range is narrow (0.17918 to 0.39646), while any GB The distance between Ils and any HCV isolates should be at least 1.68650. Show. Therefore, GB hepatitis virus is a range of genotypes of hepatitis C virus. Shows an evolutionary distance outside the fence. A systematic analysis of the sequences of HGBV and HCV can be found in "HGBV distribution from HCV sequences. How to compare column divergence with divergence between HCV sequences Can you compare? In particular, from the HCV sequences rather than the divergence between the HCV sequences HGBV Is there less sequence divergence? To answer the question Is what you do. If the HGBV sequence is If the divergence from the HCV sequence is small, you have to be satisfied The conditions are that the sequence of HGBV-A, HGBV-B, and / or HGBV-C is At least one of the HCV sequences, to the same extent as the most distance-related pair of HCV sequences. (Ie from any HGBV sequence to any HCV sequence) The minimum distance to is equal to or less than the maximum observed between the HCV sequences). Present Current sequence data does not meet this requirement. Table 31 (RbRp alignment) In, the minimum HCV-HGBV distance is 2.8 of the maximum HCV-HCV distance. 3 times, and in Table 32, the minimum HCV-HGBV distance is the maximum HCV-H. It is 3.51 times the CV distance. Therefore, the data shows that the HGBV sequence is The members of the group whose divergence was limited by the members of the characterized HCV group It does not support the idea of being a member. These relative distances can be determined using bootstrap based tests. Can [Efron, B.] (1982), "Jackknife, bootstrap, and other resamples. Planning ", Society Industrial and Applied Mathematics, Philadelphia, Elton B. And Gong, G., 1983) “Jackknife, Bootstra Up, and a fun study of cross validation "Am. Stat. 37, 36. ~ 48]. The results obtained from bootstrap sampling are shown in Table 32. This The table shows the divergence of HCV-HGBV (for all HCV-HGBV distances Minimum of) HCV divergence (maximum of all HCV-HCV distances Values) and calculated using the PROTDIST program. Based on PAM distance. 1000 booths of columns in sequence alignment The maximum divergence between HCVs in Tostrap resampling is Does it exceed the minimum divergence of HGBV sequence from HCV sequence? (Table 32). Therefore, an array of coding regions from two separate genes Mentor-based individual measurements include diversification of HCV genotype gene sequence There is no example that the HGBV sequence falls within the range of jens. Absent. Even with a cautious guess, the data for HGBV was converted to HCV sequences. There is less than one in 100,000 possibilities to draw from the same sequence pool. The HCV sequence used in this study is the largest divergence of HCV genotype. Assuming that they are representative of these, these results are HGBV-A, B, And C are HCV genes It is not a type. Also, the relationship between HGBV-A and HGBV-C is It seems to be closer than their relationship to HGBV-B, which is HGB Shown that VA and HGBV-C represent different viral strains. I am inviting. Similarly, HGBV-B is the only representative of its own viral lineage. Things. The relative turning distances between the viral sequences analyzed are shown in Figures 45 and 46. It is easily revealed by examining the rootless phylogenetic diagram shown in. In the system diagram The length of the branch is proportional to the evolutionary distance. Evolutionary function that HCV virus is close to It is clear that it is involved and that the encoded genomic sequence will be used to perform the analysis. Is consistent with choosing to use a portion of the genome or the entire genome (Figure 44). HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C and Flavi The high degree of divergence with other members of viridae , The most closely related GB hepatitis virus is HCV It cannot be considered a genotype and is actually a new group within the Flaviviridae family. It is supposed to be representative of the group. The present invention relates to HGBV-A, HGBV-B, And reagents and methods for determining the presence of HGBV-C. Specific for HGBV-A, HGBV-B, and HGBV-C described herein Polynucleotide or polypeptide (or fragment thereof), or Antibodies produced from polypeptides and polynucleotides are commonly used Antibodies against the above viruses, which can be combined with other assay reagents. Can be incorporated into this assay procedure for the detection of Is considered. Alternatively, HGBV-A, HGB described herein V-B and HGBV-C specific polynucleotides or polypeptides ( Or fragments thereof), or these polypeptides and polynucleotides (also Antibody produced from HGBV-A, HGBV-B, and HG Each can be used separately to detect the BV-C virus. Other uses or variations of the present invention will occur to those of ordinary skill in the art in view of the disclosure herein. Obvious. Accordingly, the invention is limited only by the appended claims. Is intended to be done.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０７Ｋ 14/08 9356−4ＨＣ０７Ｋ 14/08 16/10 9356−4Ｈ 16/10 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4ＢＣ１２Ｎ 7/00 7/00 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 7823−4ＢＣ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 7823−4Ｂ 1/70 1/70 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 Ｄ // Ａ６１Ｋ 38/00 9284−4ＣＳ 39/395 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 0276−2ＪＧ０１Ｎ 33/576 ＺＣ１２Ｐ 21/08 0276−2Ｊ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/576 9282−4ＢＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号０８／２８３，３１４ (32)優先日 1994年７月29日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者パイロツト−マテイアス，タミ・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、グリーン・オークス、クランブルツク・ロード・2100 (72)発明者ドーソン，ジヨージ・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、サウス・ダイモンド・ロード・ 914 (72)発明者シユラウダー，ジヨージ・ジーアメリカ合衆国、イリノイ・60076、スコキー、カーラブ・7640 (72)発明者デサイ，サーレツシユ・エムアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、アミー・レーン・1408 (72)発明者リアリー，トマス・ピーアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、ケノーシヤ、ワンハンドレツドセブンス・アベニユー・6820 (72)発明者ミユーホフ，アンソニー・スコツトアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53143、ケノーシヤ、シツクステイエイス・プレイス・611 (72)発明者エルカー，ジエイムス・カールアメリカ合衆国、イリノイ・60030、ハイネスビル、ノース・ホワイト・テイル・ドライブ359 (72)発明者ビユイジク，シエリ・エルアメリカ合衆国、イリノイ・60073、ラウンド・レイク、イースト・プリンストン・コート・660 (72)発明者マツシユアワー，イサ・ケイアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイスレイク、アーバー・ブルバード・ 18790─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C07K 14/08 9356-4H C07K 14/08 16/10 9356-4H 16/10 C12N 5/10 9282-4B C12N 7/00 7/00 9637-4B C12P 21/02 C C12P 21/02 7823-4B C12Q 1/68 A C12Q 1/68 7823-4B 1/70 1/70 9284-4C A61K 39/395 D // A61K 38/00 9284-4C S 39/395 9637-4B C12P 21/08 0276-2J G01N 33/576 Z C12P 21/08 0276-2J 33/577 B G01N 33/576 9282-4B C12N 5/00 B 33 / 577 9051-4C A61K 37/02 (C12P 21/02 C12R 1:19) (31) Priority claim number 08 / 283,314 (32) Priority date July 29, 1994 (33) Priority claim country United States ( US) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), CA, JP, US (72) Inventor Pilotto-Mateias, Tami Jei USA, Illinois 60048 , Green Oaks, Kramblutsk Rhode 2100 (72) Inventor Dawson, The George Yoei United States, Illinois 60048, Libertyville, South Dimond Road 914 (72) Inventor Shylauder, George Yogy United States, Illinois 60076, Skokee, Carlab 7640 (72) Inventor Desai, Saray Tsushiyu Em United States, Illinois 60048, Libertyville, Amy Lane 1408 (72) Inventor Liary, Thomas Peas United States, Wisconsin 53143, Kenosya, One-Handed Seventh Avenue 6820 (72) Inventor Mi -Hof, Anthony Scott United States, Wisconsin 53143, Kenosya, Sixstay Aces Place 611 (72) Inventor Elker, James Ames Carl United States, Illinois 60030, Highnessville, North White Tale Drive 359 ( 72) Inventor Biuzijk, Sieri El United States, Illinois 60073, Round Lake, East Princeton Court 660 (72) Inventor Matsushiyu Hour, Isa Kay United States, Illinois 60030, Grace Lake, Arbor Boulevard 18790

Claims

[Claims] 1. Selective hive in the genome of hepatitis GB virus (HGBV) or its complement Purified polynucleotide derived from HGBV or its fragment capable of lysing Gment. 2. Whether the polynucleotide is HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C An amino acid sequence having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive-chain RN containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing a no acid sequence The purified polynucleotide or the flag thereof according to claim 1, which has an A genome. Ment. 3. Whether the polynucleotide is HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C An amino acid sequence having at least 40% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive-chain RN containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing a no acid sequence The purified polynucleotide or the fragment thereof according to claim 1, characterized by an A genome. Gment. 4. Whether the polynucleotide is HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C An amino acid sequence having at least 60% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Includes an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing a no acid sequence The purified polynucleotide or its derivative according to claim 1, characterized by a positive-strand RNA genome. Fragment of. 5. Selective hive in the genome of hepatitis GB virus (HGBV) or its complement Recombinant HGBV-derived recombinant polynucleotide or its subunit capable of lysing Ragment. 6. The nucleotide encodes at least one epitope of HGBV The recombinant polynucleotide according to claim 5, which comprises a sequence. 7. The recombinant nucleotides are HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. An amino acid sequence having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive chain R containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing a mino acid sequence Recombinant polynucleotide according to claim 6, characterized by an NA genome. 8. The recombinant polynucleotide according to claim 5, which is contained in a recombinant vector. . 9. 9. The method according to claim 8, further comprising a host cell transformed with the vector. The described polynucleotide. 10. A nucleotide sequence derived from the hepatitis GB virus (HGBV) genome HGBV recombinant polynucleoti containing Code or a fragment thereof. 11. 11. The HGBV recombinant poly according to claim 10 contained in a recombinant vector. nucleotide. 12. Further comprising a host cell transformed with said vector. HGBV recombinant polynucleotide according to 0. 13. 11. The HGB of claim 10, wherein the sequence encodes an epitope of HGBV. V recombinant polynucleotide. 14． Whether the sequence is a group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C An amino acid sequence having at least 35% identity with the amino acid sequence selected from A positive strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing The HGBV recombinant polynucleotide according to claim 13, characterized. 15. The HGBV recombinant poly according to claim 13, which is contained in a recombinant vector. nucleotide. 16. Further comprising a host cell transformed with said vector. 5. The HGBV recombinant polynucleotide according to item 5. 17． DN derived from hepatitis GB virus (HGBV) A recombinant expression system comprising an A or RNA open reading frame, wherein the open reading frame is HG Contains BV genomic or cDNA sequences and is compatible with the desired host A recombinant expression system operably linked to control sequences. 18. Further comprising cells transformed with said recombinant expression system. The expression system according to 7. 19. Furthermore, the length of at least about 8 amino acids produced by said cell. 19. The expression system of claim 18, which comprises the polypeptide of claim. 20. Purified hepatitis GB virus (HGBV). 21. Further included are preparations of HGBV polypeptides or fragments thereof. The purified virus according to claim 20. 22. Selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C Polypro containing an amino acid sequence having at least 35% identity with the amino acid sequence An array characterized by a positive-strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding thein From hepatitis GB virus (HGBV) containing a mino acid sequence or a fragment thereof Purified polypeptide derived. 23. From HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C An amino acid having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive-stranded RNA containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing an acid sequence Recombinant polypep comprising an amino acid sequence characterized by the genome or fragments thereof Chid. 24. Selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C Polypro containing an amino acid sequence having at least 35% identity with the amino acid sequence An array characterized by a positive-strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding thein A recombinant polypeptide comprising a mino acid sequence or a fragment thereof. 25. Antibodies to at least one hepatitis GB virus (HGBV) epitope . 26. 26. The antibody of claim 25, wherein the antibody is polyclonal. 27. 26. The antibody of claim 25, wherein the antibody is monoclonal. 28. At least one hepatitis GB virus (HGBV) polypeptide or a polypeptide thereof A fusion polypeptide that includes a fragment. 29. Particles that are immunogenic to hepatitis GB virus (HGBV) infection Amino acids capable of forming particles when produced in a eukaryotic or prokaryotic host A non-HGBV polypeptide having a sequence and at least one HGBV epitope Particles containing and. 30. It is a polynucleotide probe for hepatitis GB virus (HGBV). Selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. Polyprotease containing an amino acid sequence having at least 35% identity with a mino acid sequence A polyn characterized by a positive-strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding the in Nucleotide probe. 31. Determine presence of hepatitis GB virus (HGBV) antigen or antibody in test sample An assay kit for performing at least one present in HGBV antigen Assay kit comprising a container containing a polypeptide having an HGBV epitope of G. 32. The polypeptide is from HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. An amino acid having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing an acid sequence 32. The assay kit according to claim 31, characterized by a strand RNA genome. 33. 33. The assay kit of claim 32, wherein the polypeptide is attached to a solid phase. And 34. Determine presence of hepatitis GB virus (HGBV) antigen or antibody in test sample And a sequence similarity of at least 60% with the sequence of HGBV. Specific for an HGBV antigen containing an HGBV epitope encoded by a sequence having A kit that includes a container containing an antibody that binds chemically. 35. 35. The kit of claim 34, wherein the antibody is attached to a solid phase. 36. Testing tests suspected of containing hepatitis GB virus (HGBV) polynucleotides A kit for determining the presence of said polynucleotide in a sample, comprising: An amino acid sequence selected from the group consisting of -A, HGBV-B and HGBV-C; Encodes a polyprotein containing an amino acid sequence having at least 35% identity Sequence characterized by a positive-strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) A kit comprising a container containing a polynucleotide probe containing 37. Polype containing at least one hepatitis GB virus (HGBV) epitope A method for producing a peptide, comprising: HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. An amino acid sequence having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Positive chain R containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing a mino acid sequence Use of an expression vector containing a sequence encoding a polypeptide featuring the NA genome And incubating the transformed host cells. 38. Of HGBV in test samples suspected of containing hepatitis GB virus (HGBV) A method of detecting nucleic acid, comprising: a. The inspection sample is composed of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. Amino acid sequences having at least 35% identity with the amino acid sequences selected from the group Positive strand RNA geno containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing sequences H encoded by a sequence of HGBV or a fragment thereof Probe for GBV polynucleotide, and HGB in the probe and test sample Reacting for a time and under conditions capable of forming a complex with V nucleic acid; b. Detect a complex containing the probe A method consisting of: 39. Further, the probe of the step (a) is used for polymerase chain reaction (PCR). 39. The method of claim 38, including the step of amplifying by the method). 40. Furthermore, the probe of step (a) is used for ligase chain reaction (LCR) method. 39. The method of claim 38 including the step of amplifying by. 41. HGBV in test samples suspected of containing hepatitis GB virus (HGBV) A method of detecting an antigen, the method comprising: a. An antibody that specifically binds at least one HGBV antigen to the test sample Or sufficient time and conditions to form an antibody / antigen complex with the fragment. Contact under conditions; b. Detect a complex containing the antibody A method consisting of: 42. 42. The method of claim 41, wherein the antibody is attached to a solid phase. 43. The antibody is a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. 2. The method according to 1. 44. Suspected of containing hepatitis GB virus (HGBV) antibody A method for detecting HGBV antibody in a test sample comprising: a. The inspection sample is composed of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. Amino acid sequences having at least 35% identity with the amino acid sequences selected from the group Positive strand RNA geno containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing sequences At least one H containing an amino acid sequence characterized by Form an antibody / antigen complex with a probe polypeptide containing a GBV epitope For a time and under conditions sufficient for b. A method comprising detecting a complex comprising said probe polypeptide. 45. 43. The method of claim 42, wherein the probe polypeptide is attached to a solid phase. Law. 46. The solid phase is beads, microtiter wells, test tube walls, nitro cells A contract selected from the group consisting of loin strips, magnetic beads, and non-magnetic beads. The method according to claim 42. 47. The polypeptide is from HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. An amino acid having at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of Contains acid sequence Features a positive-strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein Recombinant protein encoding at least one HGBV epitope 45. The method according to claim 44, which is a synthetic peptide or a synthetic peptide. 48. Whether the sequence is a group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C An amino acid sequence having at least 35% identity with the amino acid sequence selected from A positive strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing The method of claim 44, wherein the method is characterized. 49. A vaccine for the treatment of hepatitis GB virus (HGBV) infection, which is medicinal A pharmacologically effective amount of HGBV-A, HGBV-B and HGB in an acceptable vehicle. Has at least 35% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of V-C. Containing an open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing the amino acid sequence Immunogenic HGBV polypeptide characterized by positive-strand RNA genome or flag thereof Vaccine containing menthol. 50. A vaccine for the treatment of hepatitis GB virus (HGBV) infection, which is medicinal Vaccinia containing a pharmacologically effective amount of inactivated or attenuated HGBV in an acceptable vehicle N. 51. Tissue culture proliferating cells infected with hepatitis GB virus (HGBV). 52. 52. The method of claim 51, wherein the HGBV is transfected into a cell. Tissue culture proliferating cells. 53. 6. The HGBV comprises a subgenomic fragment of the HGBV gene. The tissue culture expanded cell according to 1. 54. A method for producing an antibody against hepatitis GB virus (HGBV), comprising: At least one HGBV epitope in the body sufficient to elicit an immune response Comprising administering an isolated immunogenic polypeptide or fragment thereof comprising Way. 55. A synthetic peptide encoding an epitope of hepatitis GB virus (HGBV) And is selected from the group consisting of HGBV-A, HGBV-B and HGBV-C. Containing an amino acid sequence having at least 35% identity with the amino acid sequence Featuring a positive-strand RNA genome containing an open reading frame (ORF) encoding rotein A synthetic peptide comprising the sequence of HGBV or a fragment thereof. 56. 56. The synthetic polypeptide of claim 55 attached to a solid phase. 57. Diagnostic comprising a polynucleotide derived from hepatitis GB virus (HGBV) The polynucleotide or fragment thereof is a HGBV It encodes at least one epitope and includes HGBV-A, HGBV-B and And an amino acid sequence selected from the group consisting of HGBV-C and at least 35% An open reading frame (ORF) encoding a polyprotein containing an amino acid sequence having a lethality. ) A diagnostic reagent characterized by a positive-stranded RNA genome comprising: 58. A polypeptide derived from hepatitis GB virus (HGBV) or its polypeptide A diagnostic reagent comprising a fragment, said polypeptide or fragment thereof Encodes at least one epitope of HGBV, HGBV-A, A few amino acid sequences selected from the group consisting of HGBV-B and HGBV-C With a read encoding a polyprotein containing an amino acid sequence with 35% concordance. A diagnostic reagent characterized by a positive-strand RNA genome containing a framework (ORF).