JPH09509844A

JPH09509844A - Ａｒａｌｉａ及びＩｍｐａｔｉｅｎｓからの抗菌性タンパク質

Info

Publication number: JPH09509844A
Application number: JP52331395A
Authority: JP
Inventors: アッテンバラ，シェイラ; ヴレーケルト，ヴィレム・フラン; オズボーン，ルパート・ウィリアム; レイ，ジョン・アンソニー; リーズ，サラ・ブロンウェン; テイラー，ラヴィンドラ・ハリブハイ
Original assignee: ゼネカ・リミテッド
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1995-03-09
Publication date: 1997-10-07
Also published as: CN1313387A; CA2180353A1; ES2168358T3; US6150588A; EP0749485A1; DE69525529T2; PT749485E; DK0749485T3; ATE213506T1; CN1143978A; US5861480A; AU1856295A; EP0749485B1; GB9404807D0; WO1995024486A1; BR9507034A; AU685920B2; DE69525529D1

Abstract

(57)【要約】Ａｒａｌｉａ又はＩｍｐａｔｉｅｎｓの種子から単離することができる抗菌性タンパク質は、広範囲な抗真菌活性とある程度の抗菌活性とを示す。このタンパク質をコードするＤＮＡを単離して、ベクターに組込むことができる。このＤＮＡによって形質転換された植物を生成することができる。このタンパク質は抗真菌剤又は抗菌剤として商業的用途を見いだしており；形質転換植物は増強された病気抵抗性を示すと考えられる。本発明はさらに、Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ抗菌性タンパク質をコードする遺伝子の構造に基づいて、ＤＮＡ構築体を用いて、トランスジェニック植物にポリプロテインを発現させる方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】Ａｒａｌｉａ及びＩｍｐａｔｉｅｎｓからの抗菌性タンパク質本発明は抗菌性タンパク質と、それらの製造方法と、使用方法と、それらをコードするＤＮＡ配列とに関する。特に、本発明はＡｒａｌｉａ又はＩｍｐａｔｉｅｎｓの種子から単離することができる抗菌性タンパク質に関する。これに関連して、抗菌性（antimicrobial）タンパク質は下記活性：抗真菌（a ntifungal）活性（抗酵母活性を含みうる）；抗菌（antibacterial）活性の少なくとも１種を有するタンパク質又はペプチドとして定義される。活性は例えば部分的阻害又は死のような、ある範囲のアンタゴニスト効果を含む。抗菌性タンパク質はオリゴマーであることも、単一ペプチド単位であることも考えられる。Ａｒａｌｉａ属は、その最もよく知られた要素がキヅタ属(ivy)とヤクヨウニンジン(ginseng)である中型植物科である、ウコギ科(Araliaceae)の一部である。例えばＡｒａｌｉａｃｏｒｄａｔａのような、幾つかのＡｒａｌｉａ種から薬効のある抽出物が得られている。Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ属はツリフネソウ(Balsaminaceae)植物科の一部である。５００〜６００のＩｍｐａｔｉｅｎｓ種が存在し、これらの多くは温室植物又はポット植物として商業的に栽培されている。植物は広範囲な系列の抗真菌性化合物を産生して、可能な侵入者を撲滅しており、最近１０年間にわたって、抗真菌活性を有するタンパク質がこれらの防衛の重要な部分を形成することが解明されている。チオニン、β−１，３−グルカナーゼ、リボソーム不活化タンパク質、ゼアマチン(zeamatins)、キチン結合レクチン及びキチナーゼを含めた、数種類のこのようなタンパク質が開示されている。これらのタンパク質はバイオコントロール剤(biocontrol agent)として用いることができる可能性があるので、かなりの注目を集めている。植物病原性真菌類(pathogenic fungi)に対して活性を有する抗菌性タンパク質がある一定の植物種から単離されている。我々は今までに数種類の、このようなタンパク質の構造的及び抗真菌性の特性を下記タンパク質を含めて述べている：Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｉａｌａｐａ種子からのＭｊ−ＡＭＰ１とＭｊ−ＡＭＰ２［Cammue BPA等，１９９２，J.Biol.Chem.２６７：２２２８〜２２３３；国際出願公開第ＷＯ９２／１５６９１号］；Ａｍａｒａｎｔｈｕｓｃａｕｄａｔｕｓ種子からのＡｃ−ＡＭＰ１およびＡｃ−ＡＭＰ２［Broekaert WF等、１９９２，Biochemistry，３７：４３０８−４３１４；国際出願公開第ＷＯ９２／２１６９９号］；ＣａｐｓｉｃｕｍａｎｎｕｕｍからのＣａ−ＡＭＰ１、ＢｒｉｚａｍａｘｉｍａからのＢｍ−ＡＭＰ１、ＤｅｌｐｈｉｎｉｕｍからのＤａ−ＡＦＰ、ＣａｔａｐｏｄｉｕｍからのＣｒ−ＡＦＰ、ＢａｐｔｉｓｉａからのＢａ−ＡＦＰ及びＭｉｃｒｏｓｅｎｓｉｓからのＭ１−ＡＦＰ［国際特許出願公開第ＷＯ９４／１１５１１号］；Ｒａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓ種子からのＲｓ−ＡＦＰ１とＲｓ−ＡＦＰ２［ＴｅｒｒａｓＦＲＧ等，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５３０１〜１３３０９］；及び例えばＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓからのＢｎ −ＡＦＰ１とＢｎ−ＡＦＰ２、ＢｒａｓｓｉｃａｒａｐａからのＢｒ−ＡＦＰ１とＢｒ−ＡＦＰ２、ＳｉｎａｐｉｓａｌｂａからのＳａ−ＡＦＰ１とＳａ− ＡＦＰ２、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａからのＡｔ−ＡＦＰ１、ＤａｈｌｉａｍｅｒｃｋｉｉからのＤｍ−ＡＭＰ１とＤｍ−ＡＭＰ２、ＣｎｉｃｕｓｂｅｎｅｄｉｃｔｕｓからのＣｂ−ＡＭＰ１とＣｂ−ＡＭＰ２、ＬａｔｈｙｒｕｓｃｉｃｅｒａからのＬｃ−ＡＭＰ、ＣｌｉｔｏｒｉａｔｅｒｎａｔｅａからのＣｔ−ＡＭＰ１とＣｔ−ＡＭＰ２、ＲａｐｈａｎｕｓｓａｔｉｖｕｓからのＲｓ−ｎｓＬＴＰのような関連タンパク質［国際特許出願公開第ＷＯ９３／０５１５３号］。上記その他の植物由来抗菌性タンパク質は、特に農業用途の殺真菌剤(fungici de)又は抗生物質として有用である。タンパク質は植物に又は植物の周囲に施用することも、植物内に発現させることもできる。我々は今回、新規な強力な抗菌性タンパク質を精製した。本発明によると、Ａｒａｌｉａ又はＩｍｐａｔｉｅｎｓの種子から単離することができる、約３ｋＤａの抗菌性タンパク質を提供する。我々はＡｒａｌｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓの種子から、以下でＡｒｃ−ＡＭＰ１（Ａｒａｌｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ−抗菌性タンパク質１）と、Ａｒｃ−ＡＭＰ２（Ａｒａｌｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ−抗菌性タンパク質２）と称する、２種類の新規な抗菌性タンパク質を精製した。我々はまた、Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａの種子から、以下でＩｂ−ＡＭＰ１（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ−抗菌性タンパク質１）と、Ｉｂ−ＡＭＰ２（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ−抗菌性タンパク質２）と、Ｉｂ−ＡＭＰ３（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ−抗菌性タンパク質３）と、Ｉｂ−ＡＭＰ４（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ −抗菌性タンパク質４）と称する、４種類の新規な抗菌性タンパク質を精製した。本発明による抗菌性タンパク質はＡｒａｌｉａ又はＩｍｐａｔｉｅｎｓの種子から単離することができ、関連種と非関連種の両方の種子からも単離することができ、又は任意の適当な方法によって製造若しくは合成することができる。本発明によると、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から成る群から選択される配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質がさらに提供される。配列が配列番号１０〜１３のいずれかと少なくとも６０％の配列同一性(sequence identity)を有するならば、この配列は “実質的に相同”であり、抗菌活性を有するタンパク質をコードする。本抗菌活性タンパク質は植物材料から抽出して、精製することも、その既知のアミノ酸配列から標準ペプチド合成器を用いる化学合成によって製造することも、組換えＤＮＡの発現によって適当な生物体（例えば、微生物又は植物）内で産生させることもできる。本抗菌性タンパク質は殺真菌剤又は抗生物質として有用であり、農業用途又は製薬用途に用いることができる。Ｉｂ−ＡＭＰのアミノ酸配列決定は実施例７と８において説明する。Ｉｂ−ＡＭＰ１のアミノ酸配列は配列番号１０として示し；Ｉｂ−ＡＭＰ２のアミノ酸配列は配列番号１１として示し；Ｉｂ−ＡＭＰ３のアミノ酸配列は配列番号１２として示し；Ｉｂ−ＡＭＰ４のアミノ酸配列は配列番号１３として示す。これらの４種類のＩｂ−ＡＭＰは相互の非常に密接な相同体であるが、既知タンパク質の配列に対しては有意な相同性を有さない。その一次構造を知ることは、標準ペプチド合成器を用いる化学合成によって、本抗菌性タンパク質又はその部分を製造することを可能にする。一次構造を知ることは、本抗菌性タンパク質をコードするＤＮＡ構築体の製造も可能にする。本発明はさらに、本発明による抗菌性タンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。このＤＮＡ配列はｃＤＮＡ配列でもゲノム配列でもよく、ｃＤＮＡクローン又はゲノムＤＮＡクローン又は標準核酸合成器を用いて製造されたＤＮＡから誘導することができる。ＤＮＡ配列は既知アミノ酸配列から予測することができ、タンパク質をコードするＤＮＡを標準核酸合成器を用いて製造することができる。或いは、植物由来ＤＮＡライブラリーからＤＮＡ配列を単離することができる。適当なオリゴヌクレオチドプローブを既知アミノ酸配列から得て、タンパク質の一部又は全てをコードするｃＤＮＡクローンのためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。Ｉｂ−ＡＭＰｃＤＮＡのクローニングは実施例８で説明する。オリゴヌクレオチドプローブ又はｃＤＮＡクローンを用いて、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって実際の抗菌性タンパク質遺伝子（単数または複数）を単離することができる。このようなゲノムクローンは植物ゲノム中で機能するコントロール配列(control sequence)を含むことができる。したがって、抗菌性（又は他の）タンパク質を発現させるために用いることができるプロモーター配列を単離することもできる。これらのプロモーターは環境条件（例えば、真菌病原体の存在）に特に敏感であり、任意の標的遺伝子を発現させるために用いることができる。抗菌性タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適当な調節配列(regulatory se quence)（プロモーター、ターミネーター等）と共に、ＤＮＡ構築体又はベクター中に組込むことができる。ＤＮＡ配列を構成プロモーター又は誘導プロモーター（例えば、環境条件、病原体の存在、化学物質(chemical)の存在によって刺激されたもの）の制御下に置くことができる。このようなＤＮＡ構築体を、コードされたタンパク質の発現又はタンパク質の活性部分の発現を可能にする生物学的系にクローン化又は形質転換することができる。適当な生物学的系は微生物（例えば、大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス属(Pseudomonas)のような細菌、例えばＣｌａｖｉｂａｃｔｅｒｘｙｌｉ亜種、ｃｙｎｏｄｏｎｔｉｓ（Ｃｘｃ）のような内生植物(endophyte)；酵母；ウイルス；バクテリオファージ等）、培養細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）及び植物を含む。場合によっては、発現されたタンパク質をその後に抽出し、単離して用いることができる。本発明による抗菌性タンパク質は殺真菌剤又は抗生物質として有用である。本発明はさらに、真菌類又は細菌を本発明による抗菌性タンパク質に暴露させることによって、それらを撲滅する方法を提供する。製薬用途のためには、抗菌性タンパク質を殺真菌剤又は抗菌剤として用いて、哺乳動物の感染症を治療する（例えば、カンディダ属(Candida)のような酵母を撲滅する）ことができる。本発明による抗菌性タンパク質は防腐剤として（例えば、食品添加剤として）用いることもできる。農業用途のためには、本抗菌性タンパク質を用いて、植物の生存中の作物の病気−抵抗性若しくは病気−耐性を改良したり又は収穫後の作物の保護をすることができる。これらのタンパク質に暴露された病原体は阻害される。抗菌性タンパク質は植物に既に定着した病原体を根絶することも、今後の病原体作用から植物を保護することもできる。このタンパク質の根絶剤効果(eradicant effect)は特に有利である。抗菌性タンパク質への植物病原体の暴露は、例えば、下記のような種々な方法で達成することができる：（ａ）標準の農業技術（例えば、噴霧(spraying)）を用いて、単離タンパク質を含む組成物を植物部分又は周囲土壌に施用することができる；タンパク質は植物組織から抽出したものでも、化学的に合成したものでも、このタンパク質を発現するように遺伝的に修飾された微生物から抽出されたものでもよい；（ｂ）抗菌性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された微生物を含む組成物を植物に又は植物が成長する土壌に施用することができる；（ｃ）抗菌性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された内生植物を植物組織に組込むことができる（例えば、種子処理プロセスを介して）；［内生植物は植物宿主と非病原性の内共生的関係に入る能力を有する微生物と定義される。植物の内生植物強化(endophyte-enhanced)保護の方法はＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる一連の特許出願（例えば、国際出願公開第ＷＯ９０／１３２２４号、ヨーロッパ特許公開第ＥＰ−１２５４６８−Ｂ１号、国際出願公開第ＷＯ９１／１０３６３号、国際出願公開第ＷＯ８７／０３３０３号）に開示されている。内生植物を遺伝的に修飾して、農業用化学物質を産生させることができる。国際特許出願公開第ＷＯ９４／１６０７６号（ＺＥＮＥＣＡＬｉｍｉｔｅｄ）は植物由来抗菌性タンパク質を発現するように遺伝的に修飾された内生植物の使用を開示する］。（ｄ）抗菌性タンパク質をコードするＤＮＡを植物ゲノムに組入れて、このタンパク質が植物体内で発現されるようにする（このＤＮＡはｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡ、又は標準核酸合成器を用いて製造されたＤＮＡでもよい）。種々な既知方法［ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＴｉプラスミド、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクティルガン(mic roprojectile gun)等］に従って、組換えＤＮＡ構築体によって、植物細胞を形質転換することができる。次に、この形質転換細胞を、適当な場合には、新しい核物質がゲノムに安定に組込まれた完全植物(whole plant)に再生することができる。この方法で、形質転換された単子葉植物と双子葉植物の両方が得られるが、後者の方が通常は再生しやすい。これらの一次形質転換体(primary transform ant)の子孫の一部は、抗菌性タンパク質（単数または複数）をコードする組換えＤＮＡを遺伝によって受け継ぐことになる。本発明はさらに、真菌病原体又は細菌病原体に対して改良された抵抗性を有し、本発明による抗菌性タンパク質を発現する組換えＤＮＡを含む植物を提供する。このような植物は標準の植物繁殖交配に親として用いて、改良された真菌抵抗性又は細菌抵抗性を有するハイブリッド及びラインを開発することができる。組換えＤＮＡは、形質転換によって植物又はその祖先(ancestor)に組込まれた異種(heterologous)ＤＮＡである。組換えＤＮＡは病原体攻撃部位（例えば、葉）に供給するために発現される抗菌性タンパク質をコードする。このＤＮＡは抗菌性タンパク質の活性サブユニットをコードすることができる。病原体は植物上、植物内又は植物近くで成長する、あらゆる真菌又は細菌でありうる。これに関連して、改良された抵抗性とは、野生型植物に比べて、真菌病原体又は細菌病原体に対する強化された耐性として定義される。抵抗性は病原体の作用に対する耐性の軽度の増強（この場合には、病原体が部分的に阻害される）から、植物が病原体の存在によって影響されないほど、完全な抵抗性（この場合には、病原体が重度に阻害されるか又は殺滅される）まで変化しうる。特定の病原体に対する抵抗性又は病原体の広範囲スペクトルに対する抵抗性のレベル上昇は両方とも抵抗性の改良をなす。改良された抵抗性を示すトランスジェニック植物（又はそれから誘導された植物）は植物の形質転換後又はその後の交配後に選択される。抗菌性タンパク質がトランスジェニック植物又はその子孫内に発現される場合には、真菌又は細菌は植物の病原体攻撃部位においてタンパク質に暴露される。特に、適当な遺伝子調節配列の使用によって、タンパク質をｉｎｖｉｖｏにおいて最も効果的なときにかつ最も効果的な箇所で産生させることができる。例えば、タンパク質が通常は多量には発現されないが、病気抵抗性が重要である植物の部分内で（例えば、葉において）、このタンパク質を産生させることができる。生産することができる遺伝的に修飾された植物の例には、作物、穀物、果実及び野菜、例えば、カノーラ(canola)、ヒマワリ、タバコ、砂糖大根、綿、大豆、トウモロコシ、小麦、大麦、米、サトウモロコシ、トマト、マンゴ、桃、林檎、ペア、苺、バナナ、メロン、馬鈴薯、人参、レタス、キャベツ、玉葱がある。本発明の抗菌性タンパク質は主要なトウモロコシ病原体の一部に対して非常に有効であるので、前記タンパク質をコードする構築体によってトウモロコシ植物を形質転換することが特に有利である。或いは、他の適当な方法によって、トウモロコシ植物に該タンパク質を供給することができる。本発明の他の態様は一般に、トランスジェニック植物における“ポリプロテイン類(polyproteins)”の発現に関する。“ポリプロテイン”は、単一翻訳生成物を形成するように一緒に結合した２個以上のペプチドと定義される。発現されたポリプロテインを翻訳後に処理して成分分子にするような、切断部位によって成分ペプチドは分離される。このような切断はプロテアーゼの作用によって又はポリプロテインのセルフ−プロセシング(self-processing)によって達成される。トランスジェニック植物における幾つかの組込み遺伝子(introduced gene)の相対的発現レベルは、ゲノム中への導入遺伝子組込み(transgene integration) の特定部位によって決定される“位置効果”によって周知のように影響される。収斂(convergent)プロモーター又は拡散(divergent)プロモーターのいずれかによって誘導された、同じＴ−ＤＮＡに組込み遺伝子が結合する場合にも、これらの遺伝子は通常、同じレベルでは協調的に(co-ordinately)発現されない。このことは、幾つかの導入活性の高レベルの発現が必要である場合には、例えば、植物における新規な生化学経路を発現させようと試みる場合には、特別な問題を提出する。２種類のタンパク質の組織特異的な協調発現を達成しようと試みて、研究者は、同じＴ−ＤＮＡ上に同時トランスフェレンス(co-transference)によって遺伝子を結合させるが、発現レベルは独立的に変化することが判明している。他の手段(strategy)は隣接プロモーター及び拡散プロモーターを介して遺伝子を結合させることであるが、一貫した協調発現(consistently co-ordinated expre ssion)は得られなかった。ポリプロテインの形態のタンパク質を結合することは、多くのウイルスの複製に採用されている手段である。翻訳時に、ウイルスによってコードされるプロテイナーゼがポリプロテインの非常に迅速な分子内（シス）切断を仲介して、個別のタンパク質生成物が生ずる。国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２７６５号（１９９４年１２月１９日出願）は、トランスジェニック植物に多重タンパク質を発現させる方法であって、構造遺伝子の転写をその制御下で開始することができるプロモーターを含む５’−領域と、１個より多いタンパク質をコードするタンパク質コーディング配列(protein encoding sequence)と、ポリアデニル化シグナルを含む３’−ターミネーター領域とを含む遺伝子構築体を植物のゲノム中に挿入することを含み、前記タンパク質コーディング配列の各々が隣接タンパク質コーディング配列から、翻訳時に切断部位を生じるＤＮＡ配列によって分離され、それによって発現ポリプロテインが翻訳後に成分タンパク質分子になるように処理される前記方法を開示する。翻訳後切断部位をコードするＤＮＡ配列をウイルスから、特に、例えば口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease）（ＦＭＤ）ウイルスのようなピコルナウイルスから得ることが好ましい。このようにして、多重遺伝子が、セルフ−プロセシングポリプロテインの形態で、単一プロモーターの制御下で植物ゲノム中に挿入される。植物形質転換構築体へのプロテイナーゼ又は切断配列の包含は、植物細胞及び植物中への、最初はポリプロテインとして結合した、多重導入タンパク質の単一プロモーターからの発現を可能にする。本発明を導いた研究では、４種のＩｂ−ＡＭＰタンパク質が単一遺伝子（配列番号８、実施例８）によってコードされることを、我々は実証した。Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子配列は、単離されたＩｂ−ＡＭＰの４種類の全てをコードする６個の相同反復配列(homologous repeat)を含む、３３３アミノ酸（ポリプロテイン）のオープンリーディングフレームを有する。この遺伝子は前駆体タンパク質のプロセシング中に除去される７個のプロペプチドドメインをも含み；これらのドメイン中の５個（配列番号１４〜配列番号１８）はＡＭＰコーディング領域間に存在するスペーサーであり；これらのドメインの１個（配列番号２０）はタンパク質のＣ末端に存在し；これらのドメインの１個（配列番号１９）はタンパク質のＮ末端に存在し、約２５アミノ酸のシグナル配列（配列番号２１）に結合する。Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子の構造は図１０に示し、実施例８において説明する。植物では、ほぼ同じ複数部分に切断されるマルチドメイン前駆体については２例のみ、すなわち、ポリユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１８：６７５〜６８９）及びＮｉｃｏｔｉａｎａａｌａｔａからのプロテイナーゼ阻害因子（Ａｔｋｉｎｓｏｎ等，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，５：２０３〜２１３）が知られているに過ぎない。本発明の他の態様によると、トランスジェニック植物に多重タンパク質を発現させる方法であって、構造遺伝子の転写をその制御下で開始することができるプロモーターを含む５’−領域と、少なくとも２個のタンパク質コーディング配列と、ポリアデニル化シグナルを含む３’−ターミネーター領域とを含む遺伝子構築体を植物のゲノム中に挿入することを含み、前記タンパク質コーディング配列の各々が隣接タンパク質コーディング配列から、翻訳時に切断部位を生じるＤＮＡ配列によって分離され、それによって、発現ポリプロテインが翻訳後に成分タンパク質分子になるように処理され、切断部位を提供するＤＮＡ配列の少なくとも１個が配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードしている前記方法を提供する。アミノ酸配列において機能に大きく影響しないような変化がなされうることは周知であり、前記配列のこのような変異形(variant)と、それをコードするヌクレオチドとは本発明の範囲内であることが意図される。切断部位を提供するＤＮＡ配列は配列番号８から得ることができる。タンパク質コーディング配列を結合させるための５個のＩｂ−ＡＭＰスペーサープロペプチドドメイン（配列番号１４〜１８）のいずれか１個の挿入は、植物発現ベクターのエンジニアリング(engineering)を可能にし、この場合に、多重の完全タンパク質又はタンパク質ドメインをポリプロテインとして発現させて、同時翻訳によって(co-translationally)高い効率で切り離すことができる。植物由来スペーサー配列の使用は、トランスジェニック植物組織内のポリプロテインのプロセシングを容易にする。Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子からの、他のプロペプチドドメイン（配列番号１９、配列番号２０）とシグナルペプチド（配列番号２１）をも植物発現ベクターに組込むことができる。したがって、保存スペーサープロペプチドドメインを用いて、所定のタンパク質のマルチマー(multimer)をコードする人工遺伝子を構築することによって、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子配列(gene arrangement)を他のペプチド又はタンパク質（他の抗菌ペプチドを含む）の発現に用いることができる。ポリプロテインのタンパク質成分は同じであることができ、したがって、１種の“遺伝子量(gene dosage) ”効果によって前記タンパク質の発現を高めることができる。或いは、２種類以上の異なるタンパク質成分を１つのポリプロテインに結合させて、異なるタンパク質を協調発現させることができる。例えば、これによって、植物中へ全酵素カスケード(entire enzyme cascade)を迅速に組込むことができる。次に、図面を参照しながら、本発明を実施例のみによって説明する：図面において、図１は、Ｉｂ−ＡＭＰの精製に関するカチオン交換クロマトグラムを示す。図２は、精製したＩｂ−ＡＭＰ１の逆相クロマトグラムを示す。図３は、精製したＩｂ−ＡＭＰ２の逆相クロマトグラムを示す。図４は、精製したＩｂ−ＡＭＰ３の逆相クロマトグラムを示す。図５は、精製したＩｂ−ＡＭＰ４の逆相クロマトグラムを示す。図６は、Ａｒｃ−ＡＭＰの精製に関するカチオン交換クロマトグラムを示す。図７は、精製したＡｒｃ−ＡＭＰ１の逆相クロマトグラムを示す。図８は、精製したＡｒｃ−ＡＭＰ２の逆相クロマトグラムを示す。図９は、Ｉｂ−ＡＭＰのペプチドフラグメントのアミノ酸配列を示す。図１０は、Ｉｂ−ＡＭＰｃＤＮＡとコードされたタンパク質との配列を示す。図１１は、ベクターｐＩＢ６の構造を示す線図を示す。図１２は、ベクターｐＢｉｎＩＢ６の構造を示す線図を示す。本発明を配列表に関しても説明する：配列番号１は、図９に示すＩｂ−ＡＭＰ１の部分アミノ酸配列である；配列番号２は、図９に示すＩｂ−ＡＭＰ２の部分アミノ酸配列である；配列番号３は、図９に示すＩｂ−ＡＭＰ３の部分アミノ酸配列である；配列番号４は、図９に示すＩｂ−ＡＭＰ４の部分アミノ酸配列である；配列番号５は、Ｉｂ−ＡＭＰ配列の１領域のアミノ酸配列である；配列番号６は、オリゴヌクレオチドＩｂＡＭＰ１−Ｃのヌクレオチド配列である；配列番号７は、オリゴヌクレオチドＩｂＡＭＰ１−Ｂのヌクレオチド配列である；配列番号８は、図１０に示す、Ｉｂ−ＡＭＰｃＤＮＡのヌクレオチド配列である；配列番号９は、図１０に示す、Ｉｂ−ＡＭＰｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列である；配列番号１０は、Ｉｂ−ＡＭＰ１の完全アミノ酸配列である；配列番号１１は、Ｉｂ−ＡＭＰ２の完全アミノ酸配列である；配列番号１２は、Ｉｂ−ＡＭＰ３の完全アミノ酸配列である；配列番号１３は、Ｉｂ−ＡＭＰ４の完全アミノ酸配列である；配列番号１４は、Ｉｂ−ＡＭＰプロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号１５は、Ｉｂ−ＡＭＰプロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号１６は、Ｉｂ−ＡＭＰプロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号１７は、Ｉｂ−ＡＭＰプロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号１８は、Ｉｂ−ＡＭＰプロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号１９は、Ｉｂ−ＡＭＰＮ末端プロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号２０は、Ｉｂ−ＡＭＰＣ末端プロペプチドスペーサードメインのアミノ酸配列である；配列番号２１は、Ｉｂ−ＡＭＰシグナルペプチドのアミノ酸配列である。実施例１抗真菌活性及び抗菌活性のアッセイ既述されたように（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ等，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５〜６０）、抗真菌活性を顕微分光測光法によって測定した。試験は（フィルター滅菌）試験溶液（２０μｌ）と、培地Ａ［１／２濃度馬鈴薯デキストロースブロス(half strength potato dextrose broth)若しくは１／２ＰＤＢ］又は培地Ｂ［１ｍＭのＣａＣｌ₂と５０ｍＭのＫＣｌとを補充した１／２ＰＤＢ］中の真菌胞子懸濁液（２ｘ１０⁴胞子／ｍｌ）（８０μ ｌ）とによってルーチンに実施した。対照のミクロ培養物は無菌蒸留水（２０μ ｌ）と真菌胞子懸濁液（８０μｌ）とを含有した。他に述べないかぎり、試験生物体(test organism)はＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍ（菌株，ＩＭＩ１８０４２０）であり、インキュベーションは２５℃において４８時間実施した。成長阻害率(percent growth inhibition)は、［（対照ミクロ培養物の修正吸光度−試験ミクロ培養物の修正吸光度）／対照ミクロ培養物の５９５ｎｍにおける修正吸光度］ｘ１００として定義される。修正吸光度値は（４８時間後に測定した培養物の５９５ｎｍにおける吸光度）マイナス（３０分間後に測定した５９５ｎｍにおける吸光度）に等しい。抗菌活性は顕微分光測光法によって次のように測定した。軟栄養アガロース(s oft nutrient agarose)（トリプトン，１０ｇ／１；Ｓｅａｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ），５ｇ／ｌ）に接種することによって、細菌懸濁液を調製した。細菌懸濁液（１０⁵コロニー形成単位／ｍｌ）のアリコート（８０μｌ）を平底９６孔マイクロプレート中のフィルター滅菌サンプル（２０μｌ）に加えた。２８℃における３０分間インキュベーション後と２４時間インキュベーション後とに、培養物の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレート読み取り機(reader) によって測定した。抗真菌活性アッセイに関して上述したように、成長阻害率を算出した。実施例２Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ種子からの抗菌性タンパク質の精製Ｉ．ｂａｌｓａｍｉｎａ種子［ＣｈｉｌｔｅｒｎＳｅｅｄｓ（英国，カンブリア）から購入］（５００ｇ）をコーヒーミルで粉砕し、得られたミールを１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄と、１５ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄と、１００ｍＭのＫＣｌと、２ｍＭのＥＤＴＡと、１ｍＭのベンズアミジンとを含む氷冷抽出バッファー（２リットル）によって、４℃において２時間、抽出した。得られたホモジネートをチーズクロス(cheese cloth)に通して絞り、遠心分離法（７，０００ｘｇにおいて３０分間）によって清澄化した。固体の硫酸アンモニウムを上清に加えて、７５％の相対飽和度(relative saturation)を得て、４℃において一晩放置することによって沈殿を形成させた。７，０００ｘｇにおける３０分間の遠心分離後に、沈殿を最少量の蒸留水に再溶解して、ベンゾイル化セルロース管（Ｓｉｇｍａ，ミズーリ州，セントルイス）を用いて蒸留水に対して広範に透析した。透析後に、１０倍に濃縮したバッファーの添加によって、溶液を５０ｍＭの（ＮＨ₄）Ａｃ（ｐＨ９）に調節して、その後に、５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ９）で平衡化したＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン、ウプサラ）カラム（１２ｘ５ｃｍ）上に通した。カラムを貫流した塩基性タンパク質画分を酢酸によってｐＨ６に調節して、以下で説明するように、カチオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。塩基性タンパク質画分（約５００ｍｌ）を５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃバッファー（ｐＨ６．０）で予め平衡化させたＳ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（１０ｘ１．６ｃｍ）に供給した。このカラムを３２５分間にわたって線状勾配の５０〜７５０ｍＭのＮＨ₄Ａｃ（ｐＨ６）によって３ｍｌ／分で溶出した。溶出液を２８０ｎｍにおける吸光度のオンライン測定によってタンパク質に関してモニターして、１０ｍｌ画分で回収した。各画分からのサンプルを実施例１に述べたように抗真菌活性に関して分析した。結果は、活性ピークに黒く陰を付けて、図１に示す。クロマトグラフィー後に、抽出物は４００ｍＭ〜７００ｍＭのＮＨ₄Ａｃにおいて溶出する４個の活性ピークを生じた。抗真菌活性を示す各ピークからの画分をプールし、逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。各ピークの約３ｍｇ量を、０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したＰｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂ ／Ｃ₁₈，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（２５ｘ０．９３ｃｍ）に負荷させた。このカラムを０．１％ＴＦＡ〜１００％アセトニトリル／０．１％ＴＦＡの線状勾配によって６５分間にわたって１ｍｌ／分で展開させた。溶出液を２１０ｎｍにおける吸光度のオンライン測定によってタンパク質に関してモニターした。ピーク１、２、３及び４に関する結果を、それぞれ、図２、３、４及び５に示す。１ｍｌ画分を回収し、真空乾燥させ、最後に蒸留水（０．５ｍｌ）中に溶解した。各画分からの１０μｌを抗真菌活性に関して分析した。ピーク１、２及び３は約２０％アセトニトリルで溶出した、単一ピークの抗真菌活性（黒く陰を付けた部分）を生じた。ピーク１、２及び３中の活性画分をそれぞれＩｂ−ＡＭＰ１、Ｉｂ−ＡＭＰ２及びＩｂ−ＡＭＰ３と名付ける。ピーク４は抗真菌活性の２ピークを生じ、大きい方の第２ピークをＩｂ−ＡＭＰ４（図５における黒く陰を付けた部分）と名付ける。第１ピークはピーク３からＦＰＬＣへの若干の持ち越し(carry over)を表すと思われる。実施例３Ａｒａｌｉａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ種子からの抗菌性タンパク質の精製Ａ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ種子［ＳａｎｄｅｍａｎＳｅｅｄｓ（英国，サセックス州，Ｐｕｌｂｏｒｏｕｇｈ）から購入］から実施例２に述べた方法を用いて塩基性タンパク質画分を抽出した。このタンパク質画分を次に実施例２に述べた方法を用いてさらに精製した。Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅカラム上でのクロマトグラフィー後に、Ａｒａｌｉａ抽出物は約４００ｍＭ（ピーク１）と５００ｍＭ（ピーク２）ＮＨ₄Ａｃにおいて溶出する抗真菌活性の２ピークを生じた。結果は、黒で陰を付けた２個の活性ピークと共に、図６に示す。各ピークの活性画分をプールし、実施例２に述べたように、逆相ＨＰＬＣ上でさらに精製した。ピーク１の結果を図７に示す：これは約２０％アセトニトリルで溶出する、Ａｒｃ−ＡＭＰ１と名付ける、活性因子を生じた。同様に、ピーク２は溶出して、Ａｒｃ−ＡＭＰ２と名付ける、単一活性ピークを生じた（結果は図８に示す）。実施例４精製した抗菌性タンパク質の分子構造精製した抗菌性タンパク質の分子構造をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって、さらに分析した。ＳＤＳ− ＰＡＧＥはＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）電気泳動装置を用いて、商業的なプレキャスト(precast)ゲル（ＰｈａｒｍａｃｉａからのＰｈａｓｔＧｅｌＨｉｇｈＤｅｎｓｉｔｙ）上で実施した。サンプルバッファーは２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）と、１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳと、１ｍＭのＥＤＴＡと、０．００５％のブロモフェノールブルーと、他に述べないかぎり、１％（ｗ／ｖ）のジチオエリトリトール（ＤＴＥ）とを含有した。タンパク質をニトロセルロースへの拡散ブロッティングと、その後の銀染色法とによって、可視化した。分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と精製済みＭｊ−ＡＭＰ２（Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ種子からの４ｋＤａタンパク質）とを比較のために泳動した。Ｉｂ−ＡＭＰ１とＡｒｃ−ＡＭＰ１とをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。両方のタンパク質は還元されて(reduced)泳動する場合も、還元されないで(non- reduced)泳動する場合も、約３ｋＤａのバンド（bands）として泳動した。結果はペプチドが一本鎖ポリペプチドであることを実証する。実施例５抗菌性タンパク質の抗真菌効力実施例１に述べたアッセイを用いて、精製済みタンパク質の抗真菌効力を種々な植物病原真菌に関して評価した。真菌類の成長、真菌胞子の回収及び採取は既述されたように実施した［Broekaert等，１９９０，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ，６９：５５〜６０］。次の真菌の菌株を用いた：ＡｌｔｅｒｎａｒｉａｌｏｎｇｉｐｅｓＣＢＳ６２０８３、ＢｉｐｏｌａｒｉｓｍａｙｄｉｓＨＭ−１０、ＢｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａＭＵＣＬ３０１５８、Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｂｅｔｉｃｏｌａ菌株Ｋ８９７、ＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａＣＧ−１７、ＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｓｐｈａｅｒｏｓｐｅｒｍｕｍＫＯ７９１、ＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏｒｕｍＩＭＩ１８０４２０、ＦｕｓａｒｉｕｍｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍＦＲ−１２、ＦｕｓａｒｉｕｍｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅＦＭ−９、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｄｉｇｉｔａｔｕｍ（ＫＯ８７９）、ＳｐｈａｃｅｌｏｔｈｅｃａｒｅｉｌｉａｎａＨＳ、Ｓｅｐｔｏｒｉａｔｒｉｔｉｃｉ（Ｋ１０９７Ｄ）、Ｓｔｅｎｏｃａｒｐｅｌｌａｍａｙｄｉｓ、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｉｄｅＫ１１２７、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍＫＯ９３７、ＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅＭＵＣＬ１９２１０。成長培地Ａ（１／２濃度馬鈴薯デキストロースブロス、１／２ＰＤＢ）又は培地Ｂ（１ｍＭのＣａＣｌ₂と５０ｍＭのＫＣｌとを補充した培地Ａ）のいずれかを用いて、抗真菌性タンパク質の連続希釈物を真菌類に供給した。成長阻害率を顕微分光測光法によって測定した。４８時間のインキュベーション後の５０％成長阻害率のために必要な濃度（ＩＣ₅₀値）を用量−反応曲線から算出した。Ｉｂ−ＡＭＰ１、Ｉｂ−ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ３及びＩｂ−ＡＭＰ４に関する結果を表１に要約する。Ａｒｃ−ＡＭＰ１とＡｒｃ−ＡＭＰ２に関する結果は表２に要約する。６種類のペプチドの全ては、試験した病原体に対して広範囲スペクトルの活性を示した。低イオン強度培地（培地Ａ）では、ＩＣ₅₀値は一般に１０μｇ／ｍｌ未満である。ペプチドの活性はアッセイに用いるイオン状態に敏感であり、高塩培地(high salt medium)（培地Ｂ）中では、それらの活性は低下する。しかし、培地Ｂ中でも、Ｉｂ−ＡＭＰペプチドの中で最大塩基性のもの（Ｉｂ−ＡＭＰ４）は試験した真菌類の一部に対してまだかなり強い活性を示す。実施例６Ｉｂ−ＡＭＰ１とＡｒｃ−ＡＭＰ１との抗菌及び抗酵母活性精製済みタンパク質を下記細菌の成長に対するそれらの効果に関して評価した：ＢａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＡＴＣＣ１３６３２及び大腸菌(E scherichia coli)の菌株ＨＢ１０１。これらのタンパク質をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＪＲＹ１８８とＣａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓＫＡ−１との成長に関しても評価した。実施例１に述べたように、バイオアッセイを実施した。結果は表３に要約する。両タンパク質はＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとの成長を強度に阻害したが、大腸菌の成長には殆ど又は全く影響を及ぼさなかった。Ｉｂ−ＡＭＰ１はＣ．ａｌｂｉｃａｎｓの成長をも強度に阻害した。実施例７Ｉｂ−ＡＭＰのアミノ酸配列決定Ｆｕｌｌｍｅｒの方法（１９８４，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ，１４２，３３６〜３４１）を用いて、Ｓ−ピリジルエチル化によって、システイン残基を修飾した。Ｐｅｐ−Ｓ（多孔質シリカＣ₂／Ｃ₁₈）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（２５ｘ０．４ｃｍ）上でのＨＰＬＣによって、試薬を除去した。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリルまでの線状勾配によってカラムを溶離することによって、Ｓ−ピリジルエチル化タンパク質を回収した。得られたタンパク質画分に対して、４７７ＡＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）におけるアミノ酸配列分析を実施し、１２０ＡＡｎａｌｙｓｅｒ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてフェニルチオヒダントインアミノ酸誘導体をオンライン検出した。Ｉｂ−ＡＭＰを配列決定する最初の試みは、４種のペプチドの全てがＮ−末端ブロックされることを実証した。これらの配列を得るために、各ペプチドをトリプシン又はキモトリプシンのいずれかによって消化させた。生じたペプチドフラグメントをＲＰ−ＨＰＬＣによって精製して、配列決定した。各場合に、１個のペプチドフラグメント（タンパク質のＮ末端）がブロックされて、Ｉｂ−ＡＭＰタンパク質の完全な配列決定を妨害することが判明した。トリプシンによるＩｂ−ＡＭＰ１の消化は４フラグメントを生じ、それらからＩｂ−ＡＭＰ１（配列番号１）の部分配列が得られた。フラグメントＩｂ１Ｔ１は１６アミノ酸長さであり、（図９に示すように）Ｉｂ−ＡＭＰ１の大部分を含有した。他の３ペプチドフラグメントはペプチドＩｂ１Ｔ１がさらに切断されることを示す。さらに、キモトリプシンによるＩｂ−ＡＭＰ１の消化によって得られたペプチド（Ｉｂ１Ｃ１）の配列決定は、さらに２アミノ酸をＮ−末端に割り当てることを可能にした。キモトリプシン消化によって得られたペプチドフラグメントの配列から同様な方法で、Ｉｂ−ＡＭＰ２（配列番号２）、Ｉｂ−ＡＭＰ３（配列番号３）及びＩｂ−ＡＭＰ４（配列番号４）の部分配列を組み立てた（図９）。Ｉｂ−ＡＭＰ３からの２フラグメントのみが配列決定されたので、図９に示す配列（配列番号３）はこのペプチドのＣ末端からの１１アミノ酸のみを示す。Ｉｂ−ＡＭＰの全長を予測するために、Ｉｂ−ＡＭＰ１の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって測定して、２４６６Ｄａであると判明した。アミノ酸配列決定によって割り当てた１８アミノ酸の分子量は２１７２Ｄａであり、このことは全長ペプチドの方が２又は３アミノ酸だけ長いことを示唆する。これらの４種類のＩｂ−ＡＭＰペプチドの全ては相互の非常に密接な相同体であり、それらの間では若干のアミノ酸置換のみが存在する。タンパク質データベースの探索はＩｂ−ＡＭＰ配列に対して有意な相同性を有する他のタンパク質を見いだすことができなかった。しかし、Ｉｂ−ＡＭＰ配列の小部分、ＧＰＧＲＲＹ領域（配列番号５）は幾つかのタンパク質（ウイルスコートタンパク質を含む）中で発見され、β−ターンの形成に関与することが判明している。実施例８ＩｍｐａｔｉｅｎｓｃＤＮＡの分子クローニング乾燥Ｉｍｐａｔｉｅｎｓｂａｌｓａｍｉｎａ種子から、Ｊｅｐｓｏｎ等の方法（１９９１，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌＲｅｐｏｒｔｅｒ，９（２））を用いて、全ＲＮＡを抽出した。種子（３０ｇ）から全ＲＮＡ（５．９ｍｇ）が回収された。全ＲＮＡ（約３ｍｇ）を用いて、ＰｏｌｙＡｔｒａｃｋキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によってＰｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを精製した。これは約３０μｇのｍＲＮＡを生成し、この半分を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のラムダＺＡＰＩＩファージベクターキットによって、製造者の使用説明書に従って、ｃＤＮＡ合成に用いた。合成したｃＤＮＡを３画分：６ｋｂまで、４ｋｂまで及び２ｋｂまでにサイズ分画した。鋳型としての合成ｃＤＮＡ画分と、Ｉｂ−ＡＭＰ１のために利用可能なペプチド配列に基づく２種の縮重オリゴ(degenerate oligo)とを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ライブラリーをスクリーニングするためのＤＮＡプローブを作成した。ＰＣＲプライマーの配列は次の通りであった：５０ｂｐのＰＣＲ生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、ランダム標識して、ライブラリーを検査するために用いた。約１６０，０００プラークを検査して、この第１ラウンドのスクリーニングから１５個の陽性プラークを得た。これらの１５個のプラークを、同じＤＮＡプローブを用いて、さらに２回のラウンドのスクリーニングによって精製した。これらの精製済みプラークからインサートをｉｎｖｉｖｏで、ヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミド中へと切断した。Ｘｈｏ１及びＥｃｏＲ１による消化によってインサートを取り出し、それらのサイズをアガロースゲル上で比較した。インサートのサイズは約６００ｂｐ〜１３００ｂｐの範囲であった。１４クローンに対してヌクレオチド配列決定を実施した。クローンＩｂ２２を完全に配列決定して、これが、単離されたＩｂ−ＡＭＰの４種の全てをコードする６個の相同繰り返しを包含する３３３アミノ酸のオープンリーディングフレームを有する、完全な遺伝子配列を含むことが判明した。他のクローンはクローンＩｂ２２又は全長遺伝子の切頭形(truncated version)のいずれかに同じであることが発見された。図１０はＩｂ−ＡＭＰｃＤＮＡ（クローンＩｂ２２）のヌクレオチド配列（配列番号８）と、反復配列（図１０の下線を施した部分）を含むコードされたタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号９）とを示す。この推定配列を、直接ペプチド配列決定によって得られたＩｂ−ＡＭＰ配列と比較することによって、完全なＩｂ−ＡＭＰ配列が同定された。第１の繰り返しがＩｂ−ＡＭＰ３（配列番号１２）をコードし；第２、第３及び第４の繰り返しがそれぞれＩｂ−ＡＭＰ１（配列番号１０）をコードし；第５の繰り返しがＩｂ−ＡＭＰ２（配列番号１１）をコードし；第６の繰り返しがＩｂ−ＡＭＰ４（配列番号１３）をコードすることが判明した。したがって、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子はＩｂ−ＡＭＰ１の３個の繰り返しと、Ｉｂ −ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ３及びＩｂ−ＡＭＰ４の各１個とを含む。この遺伝子はまた、約２５アミノ酸の推定シグナル配列と、前駆体タンパク質のプロセシング中に除去される７個のプロペプチドドメインとを含む。したがって、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子（図１０）によってコードされるポリプロテインの構造は次のようになる：プロペプチドドメインの中の５個（配列番号１４〜配列番号１８）は２個のＩｂ −ＡＭＰコーディング領域を分離する“スペーサー”である。これらのスペーサーはポリプロテインの翻訳後プロセシング中に両端で切断される。Ｎ−末端プロペプチドドメイン（配列番号１９）は一端においてシグナルペプチド（配列番号２１）から切断され、他方の末端においてＩｂ−ＡＭＰ３コーディング領域から切断される。Ｃ−末端プロペプチド領域（配列番号２０）は一端においてＩｂ− ＡＭＰ４コーディング領域から切断される。実施例９Ｉｂ−ＡＭＰｃＤＮＡを含む植物発現ベクターｐＩＢ６の構築強化(enhanced)３５Ｓプロモーターと、ＴＭＶリーダー配列と、Ｎｏｓターミネーターとを有するｐＵＣに基づいたベクターｐＭＪＢ１を用いて、植物発現ベクターｐＩＢ６を構築した。ＮｃｏＩ部位をＰＣＲによってＩｂ−ＡＭＰｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの始点に導入し、その後に、Ｉｂ−ＡＭＰｃＤＮＡをＮｃｏＩ部位とＳｍａＩ部位とにおいてｐＭＪＢ１中にクローン化して、ｐＩＢ６を作成した（図１１）。実施例１０植物形質転換ベクターｐＢｉｎＩＢ６の構築発現ベクターｐＩＢ６をＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲ１とによって消化させて、Ｉｂ−ＡＭＰ発現カセットを含むフラグメントをｐＢｉｎ１９Ｒｉにサブクローン化した。ｐＢｉｎ１９Ｒｉは植物形質転換ベクターｐＢｉｎ１９の修飾形であり（Ｂｅｖａｎ，１９８４，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２，８７１１〜８７２１）、特有のＥｃｏＲ１とＨｉｎｄＩＩＩ部位とが交換され(switched)、不完全なｎｐｔＩＩ発現カセット（Ｙｅｎｏｆｓｋｙ等，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，３４３５〜３４３９）が導入されている。この新しい植物形質転換ベクターはｐＢｉｎＩＢ６と名付ける（図１２）。実施例１１植物形質転換無力化(disarmed)Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＡＬ４４０４）（Ｈｏｅｋｅｍａ等，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０３，１７９〜１８０）を、ｄｅＦｒａｍｏｎｄ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１，２６２〜２６９）を用いて、ベクターｐＢｉｎＩＢ６によって形質転換した。ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＳａｍｓｕｎのリーフディスク(leaf disc)を用いて、ｐＢｉｎＩＢ６を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に同時培養して、タバコの形質転換を実施した。同時培養中に１００μｇ／ｍｌのカナマイシンの選択圧が存在した。ｐＢｉｎＩＢ６によって形質転換されたトランスジェニック植物を１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む培地で再生した。トランスジェニック植物を、標準ウェスタンブロット法によって、導入遺伝子の発現に関して分析し、構成性発現(constitutive expression)可能な植物を選択し、自家受粉させて、種子を得る。トランスジェニック植物のＦ１実生(seedl ing)をさらに分析し、発達させて、Ｉｂ−ＡＭＰ遺伝子に関してホモ接合体である植物を選択する。実施例１２ポリプロテインをコードするＤＮＡ構築体の作成抗菌性タンパク質Ｒｓ−ＡＦＰ２をコードするＤＮＡ配列を用いて、人工遺伝子を構築する（国際特許出願公開第ＷＯ／０５１５３号）。この人工遺伝子は２個のスペーサー領域によって連結されたＲｓ−ＡＦＰ２コーディング配列の３個のコピーを含み、各スペーサー領域は配列番号１４〜配列番号１８のいずれか１つの配列を有するプロペプチドリンカーをコードする。成熟タンパク質配列の３’末端に適当な制限酵素部位を導入し、これにリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、５１アミノ酸Ｒｓ−ＡＦＰ２ペプチド配列をコードするＤＮＡのさらに幾つかのコピーとを導入することによって、Ｒｓ−ＡＦＰ２配列から人工遺伝子を構築する。Ｒｓ−ＡＦＰ２ペプチド配列の各後続コピーは先行コピーに、リンカーペプチド配列を用いて連結される。Ｒｓ−ＡＦＰ２コーディング配列の最終コピーの後には、停止コドンが続く。Ｒｓ−ＡＦＰ２コーディング配列の第１コピーには、シグナル配列が先行する。次に、この人工遺伝子を用いて、植物の形質転換に適した植物発現構築体を構築する。ポリプロテインが産生され、その後に処理されて、Ｒｓ−ＡＦＰ２タンパク質の３コピーを放出するように、植物作用性(plant-operative)プロモーターが人工遺伝子を発現させる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年３月１５日【補正内容】請求の範囲１．配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から成る群から選択される配列に少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する抗菌性タンパク質。２．Ｉｂ−ＡＭＰ１、Ｉｂ−ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ３及びＩｂ−ＡＭＰ４から成る群から選択される、請求項１記載の抗菌性タンパク質。３．請求項１または請求項２のいずれかに記載の抗菌性タンパク質をコードする組換えＤＮＡ。４．配列番号８の塩基１８１から２４０、配列番号８の塩基３２５から３８４、配列番号８の塩基４６３から５２２、配列番号８の塩基６０７から６６６、配列番号８の塩基７１５から７７４、及び配列番号８の塩基８５３から９１２から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３に記載の組換えＤＮＡ。５．請求項３に記載のＤＮＡを含む生物学的系。６．微生物である、請求項５記載の生物学的系。７．植物である、請求項５記載の生物学的系。８．真菌病原体又は細菌病原体に対して改良された抵抗性を有し、請求項１に記載の抗菌性タンパク質を発現する組換えＤＮＡを含む植物。９．請求項１記載の抗菌性タンパク質に真菌又は細菌を暴露させることを含む、真菌又は細菌の撲滅方法。１０．構造遺伝子の転写をその制御下で開始させることができるプロモーターを含む５’−領域と、少なくとも２個のタンパク質コーディング配列と、ポリアデニル化シグナルを有する３’−ターミネーター領域とを含み、前記タンパク質コーディング配列の各々が隣接タンパク質コーディング配列から、翻訳時に切断部位を与えるＤＮＡ配列によって分離され、それによって発現ポリプロテインが翻訳後に処理されて成分タンパク質分子になる遺伝子構築体を植物ゲノムに挿入することを含む、トランスジェニック植物に多重タンパク質を発現させる方法であって、切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードする前記方法。１１．切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが、配列番号８の塩基２４１から３２４、配列番号８の塩基３８５から４６２、配列番号８の塩基５２３から６０６、配列番号８の塩基６６７から７１４、及び配列番号８の塩基７７５から８５２から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の方法。１２．植物細胞において活性な遺伝子プロモーターと、複数個のタンパク質コーディング領域と、ポリアデニル化シグナルを有する３’−非翻訳領域とを連続的に含む、植物の遺伝的修飾に用いるための遺伝子構築体であって、複数個のタンパク質コーディング領域の各々が、翻訳時に切断部位を与えるＤＮＡ配列によって分離され、それによって発現ポリプロテインが翻訳後に処理されて成分タンパク質分子になり、切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードする前記遺伝子構築体。１３．切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが、配列番号８の塩基２４１から３２４、配列番号８の塩基３８５から４６２、配列番号８の塩基５２３から６０６、配列番号８の塩基６６７から７１４、及び配列番号８の塩基７７５から８５２から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２記載の遺伝子構築体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 9637−4ＢＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＺ 8615−4ＣＣ０７Ｈ 21/04 ＢＣ０７Ｈ 21/04 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/02 ＡＤＺ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者オズボーン，ルパート・ウィリアムイギリス国ミドルセックスティーダブリュー２６エスダブリュー，トウィッケンハム，ウォーリック・ロード 36 (72)発明者レイ，ジョン・アンソニーイギリス国バークシャーアールジー12 ４エックスエックス，ブラックネル，ウッデン・ヒル，シルヴァナス 30 (72)発明者リーズ，サラ・ブロンウェンイギリス国バークシャーアールジー12 ３エックスエックス，ブラックネル，フォレスト・パーク，マイケルデヴァー・ウェイ 32 (72)発明者テイラー，ラヴィンドラ・ハリブハイイギリス国バークシャーアールジー12 ３ユーキュー，ブラックネル，ネットルクーム 50

Claims

【特許請求の範囲】１．Ａｒａｌｉａ又はＩｍｐａｔｉｅｎｓの種子から単離することができる、約３ｋＤａの抗菌性タンパク質。２．Ａｒｃ−ＡＭＰ１及びＡｒｃ−ＡＭＰ２から成る群から選択される、請求項１記載の抗菌性タンパク質。３．Ｉｂ−ＡＭＰＩ、Ｉｂ−ＡＭＰ２、Ｉｂ−ＡＭＰ３及びＩｂ−ＡＭＰ４から成る群から選択される、請求項１記載の抗菌性タンパク質。４．配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２及び配列番号１３から成る群から選択される配列に実質的に相同であるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の抗菌性タンパク質。５．請求項１〜４のいずれかに記載の抗菌性タンパク質をコードする組換えＤＮＡ。６．配列番号８に含まれる一連の塩基に相同であるヌクレオチド配列を有する、請求項５記載の組換えＤＮＡ。７．請求項５に記載のＤＮＡを含む生物学的系。８．微生物である、請求項７記載の生物学的系。９．植物である、請求項７記載の生物学的系。１０．真菌病原体又は細菌病原体に対して改良された抵抗性を有し、請求項１に記載の抗菌性タンパク質を発現する組換えＤＮＡを含む植物。１１．請求項１記載の抗菌性タンパク質に真菌又は細菌を暴露させることを含む、真菌又は細菌の撲滅方法。１２．構造遺伝子の転写をその制御下で開始させることができるプロモーターを含む５’−領域と、少なくとも２個のタンパク質コーディング配列と、ポリアデニル化シグナルを有する３’−ターミネーター領域とを含み、前記タンパク質コーディング配列の各々が隣接タンパク質コーディング配列から、翻訳時に切断部位を与えるＤＮＡ配列によって分離され、それによって発現ポリプロテインが翻訳後に処理されて成分タンパク質分子になる遺伝子構築体を植物ゲノムに挿入することを含む、トランスジェニック植物に多重タンパク質を発現させる方法であって、切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードする前記方法。１３．切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが配列番号８から得られる、請求項１２記載の方法。１４．植物細胞において活性な遺伝子プロモーターと、複数個のタンパク質コーディング領域と、ポリアデニル化シグナルを有する３’−非翻訳領域とを連続的に含む、植物の遺伝的修飾に用いるための遺伝子構築体であって、複数個のタンパク質コーディング領域の各々が、翻訳時に切断部位を与えるＤＮＡ配列によって分離され、それによって発現ポリプロテインが翻訳後に処理されて成分タンパク質分子になり、切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７及び配列番号１８から成る群から選択されるアミノ酸配列をコードする前記遺伝子構築体。１５．切断部位を与えるＤＮＡ配列の少なくとも１つが配列番号８から得られる、請求項１４記載の遺伝子構築体。