JPH0881380A - 高分子量ポリフェノールを有効成分として含有する抗歯周病剤並びに抗歯周病性食品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 樹木、発酵茶またはバラ科ピラカンタ属植物
等に由来する、重量平均分子量が８００〜１０,００
０、重合度が３〜３０であるポリフェノールを有効成分
とする抗歯周病剤。 【効果】 本発明の抗歯周病剤の有効成分である高分子
量ポリフェノールは、歯周病の原因菌であるＰ.ジンジ
バリスの歯周組織への付着を阻害することにより、歯周
病の発生、進行を防止するものであり、しかもそれ自身
には特異な味、におい等がない。 従って、この高分子
量ポリフェノールを有効成分として含有する抗歯周病剤
は、口腔衛生剤や食品添加用剤として、歯周病予防のた
め広く利用することができるものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、歯周病原因菌の付着阻
害作用を有するポリフェノールを有効成分とする抗歯周
病剤に関し、更に詳細には、樹木の心材や樹皮、発酵茶
葉あるいはバラ科ピラカンタ属植物等の植物体に由来
し、歯周病原因菌の付着阻害作用を有するポリフェノー
ルを有効成分とする抗歯周病剤及び該ポリフェノールを
含有する抗歯周病性食品並びに該ポリフェノールの製造
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】歯周病は、一般に歯槽膿漏とも呼ばれて
いるものであり、う蝕（虫歯）と並ぶ代表的な歯科疾患
である。 この疾患は、歯を支えている組織に起こる慢
性炎症で、歯周組織破壊を伴う口腔疾患であり、その病
像は、一般的に、歯肉に炎症が起こり（歯肉炎）、続い
て歯根膜、歯槽骨等歯周組織にまで炎症が波及し、やが
て、歯牙の脱落をきたすという経過をたどる。

【０００３】歯周病の罹患率は２０代後半から増加する
傾向にあり、中高年にいたっては約８０％が歯周病患者
であると言われている。それゆえ歯周病予防は現代人に
とって非常に重要な課題である。

【０００４】この歯周病の病因と病態の成立並びに進展
機構を説明しうる明確な知見は長い間得られなかった
が、徐々に嫌気性グラム陰性菌との因果関係が提示され
てきた。 その中でも、ポルフィロモナス・ジンジバリ
ス（Porphyromonas gingivalis、以下、「Ｐ.ジンジバ
リス」と略す。旧名バクテロイデス・ジンジバリス）が
歯周病の原因菌であることが現在多くの研究から支持さ
れている。このＰ.ジンジバリスは、歯周炎患者の病巣
部から高頻度に検出される微生物で、組織破壊性のプロ
テアーゼを産生し、内毒素を有し、補体の活性化や白血
球の遊走を促進する微生物である。

【０００５】ところで歯周病の治療剤としては、すで
に、アデノシントリフォスファターゼインヒビター、シ
ステインプロティナーゼインヒビター、セリンプロティ
ナーゼインヒビター及びプロテインキナーゼＣインヒビ
ターから選ばれる１種以上を含む歯周病治療剤が報告さ
れている（特開平５−９７７０８号公報）。

【０００６】しかし、上記報告は、マウス頭蓋骨の骨吸
収阻害を指標に活性を評価していることもあり、十分な
抗歯周病効果が確認されているとは言えないものであ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、歯周病
予防は現代人にとって非常に重要な課題であるが、未だ
満足すべき効果を有する歯周病の予防法が見いだされて
いない現状で、十分強力な効果を有し、かつ人体に対し
て安全性等の面でなんら問題を起こすことのない抗歯周
病剤の開発が課題とされていた。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、有効な抗
歯周病剤を得べく、まず、歯周病発生のメカニズムを検
討した。その結果、Ｐ.ジンジバリスが歯肉上皮細胞、
特に細胞外マトリックス（ＥＣＭ、例えばラミニン、コ
ラーゲン、フィブロネクチンなど）をターゲットとして
付着し（Infection）、その後、組織破壊性酵素（プロ
テアーゼ、コラゲナーゼ）、細菌由来の内毒素、ペプチ
ドグリカン、テイコ酸等のメディエイター（ビルレンス
因子）によってライソゾーム由来の自己溶解酵素の放出
やマクロファージの動員を伴う免疫応答反応が発現する
ことにより、歯肉組織の破壊および炎症が引き起こさ
れ、歯周病発病にいたるというメカニズムが明らかにな
った。

【０００９】上記メカニズムにおいて、ビルレンス因子
としてはＰ.ジンジバリスが産生するトリプシン様プロ
テアーゼが重要視されており、これが感染局部周辺の組
織崩壊、細菌の組織進入の容易化、起炎効果などに関与
していると推定され、Ｐ.ジンジバリスが歯肉上皮細胞
に付着する時の本体はフィンブリエ（fimbriae）と呼ば
れる線毛構成蛋白質であり、フィンブリエの付着増加は
該プロテアーゼに依存した現象であることも解明され
た。

【００１０】更に上記トリプシン様プロテアーゼがラミ
ニン、コラーゲン、フィブロネクチン等の細胞外マトリ
ックスを分解することにより、フィンブリエの歯肉上皮
細胞への付着ひいてはＰ.ジンジバリスの歯周組織への
定着が誘導されると推定された。

【００１１】そこで、本発明者らは、歯周病に関する上
記メカニズムに基づき、歯周病発病の第１ステップと考
えられるＰ.ジンジバリスの歯周組織への付着（Infecti
on）を歯周病予防の重要なターゲットと判断し、Ｐ.ジ
ンジバリスの付着を効果的に抑制し、かつ、人体に対し
て有害な作用を有しない物質を見いだすべく鋭意研究を
行った。

【００１２】そしてこの結果、アカシア樹皮由来のポリ
フェノール、ワットルタンニン、ケブラコタンニン、あ
るいは発酵茶葉やバラ科ピラカンタ属植物由来のポリフ
ェノール等の一群の植物由来の高分子量のポリフェノー
ルが当該要求を満足させることを見いだし、本発明を完
成させるに至った。

【００１３】すなわち、本発明の目的は、重量平均分子
量が８００〜１０,０００、重合度が３〜３０であるポ
リフェノールを有効成分とする抗歯周病剤を提供するこ
とである。また、本発明の別の目的は、上記ポリフェノ
ールを含有する抗歯周病性食品を提供することである。
更に、本発明の他の別の目的は、樹木の心材または樹皮
あるいは発酵茶葉あるいはバラ科ピラカンタ属植物等の
植物体を溶媒抽出後、該抽出物を吸着カラムクロマトグ
ラフィーに付すことを特徴とする、歯周病原因菌の付着
阻害作用を有する抗歯周病性物質の製造方法を提供する
ことである。

【００１４】本発明の抗歯周病剤の有効成分である、重
量平均分子量が８００〜１０,０００、重合度が３〜３
０であるポリフェノール（以下、「高分子量ポリフェノ
ール」ということがある）は、樹木、発酵茶葉、ピラカ
ンタ属に属する植物をはじめとする植物体を抽出するこ
とにより、これらに由来するポリフェノールとして得る
ことのできるものである。

【００１５】樹木に由来する高分子量ポリフェノールと
しては、樹木の心材または樹皮の抽出物そのものを用い
てもよいし、抽出物から精製したものを用いてもよい。
また、樹木由来のポリフェノールとして市販されてい
るケブラコタンニンやワットルタンニンそのものを用い
てもよい。 ここで、ケブラコタンニンとは、ウルシ科
植物 Schinopsis lorentzii Engl. や Schinopsis bala
nse Engl. などの心材のタンニンであり、ワットルタン
ニンとは、マメ科 Acacia molissima の樹皮のタンニン
である。

【００１６】樹木由来の高分子量ポリフェノールを得る
場合の、抽出原料の樹木としては、特に限定するもので
はないが、好ましいのはウルシ科（Anacardacea）)、マ
ツ科（Pinaceae）、マメ科（Leguminosae）の樹木の心
材または樹皮であり、より好適なものはアカシヤ樹皮、
カラマツ樹皮等である。 また、桂皮類、樟樹皮、楊梅
皮、キナ皮、シャリンバイ樹皮、メヒルギ樹皮等を抽出
原料としても良い。

【００１７】一方、発酵茶葉に由来する高分子量ポリフ
ェノールを得る場合の抽出原料としては、ウーロン茶、
紅茶、プアール茶等の発酵茶のいずれをも利用すること
ができる。 また、ピラカンタ属に属する植物に由来す
る高分子量ポリフェノールを得るために用いる植物とし
ては、中国名「火棘」（Pyracantha fortuneana）およ
びタチバナモドキ（Pyracantha angustifolia）が好ま
しく、特にそれらの果実が抽出原料として好適である。
更に、ピラカンタ属以外の植物の植物体、例えばブド
ウ、リンゴ、コケモモ、大黄、何首鳥、麻黄、梹椰子、
営実、阿仙薬、ハス果托などを抽出原料としても良い。

【００１８】上記各原料から高分子量ポリフェノールを
抽出するための溶媒は、特に限定するものではないが、
メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、水、
熱水、あるいはこれらの混合溶媒系を用いることが出来
る。 抽出時の溶媒の温度も特に限定するものではない
が、５℃〜溶媒の沸点以下、特に１５〜３５℃が好まし
い。 また抽出時間も、特に限定するものではないが、
２時間〜２週間の範囲内、特に２日以内とすることが好
ましい。 なお、抽出は遮光下で行うことがより好適で
ある。

【００１９】得られた上記の各抽出物や市販のケブラコ
タンニン、ワットルタンニン等は、そのままで本発明の
抗歯周病剤の有効成分として利用することもできるが、
更に精製して用いることが好ましい。

【００２０】高分子量ポリフェノールの精製手段として
は、合成吸着剤等を用いる吸着剤処理方法や、逆浸透
膜、限外濾過膜を用いる膜分離方法が挙げられるが、こ
のうちより好適な例としては、セファデックス ＬＨ−
２０（米国、ファルマシア社製）、ダイヤイオン ＨＰ
−２０（三菱化成工業製）、セパビーズＨＰ１ＭＧ（三
菱化成工業製）、トヨパールＨＷ４０Ｆ（東洋曹達工業
製）等の合成吸着剤カラムなどを用いるカラムクロマト
グラフィーが挙げられる。

【００２１】具体的にカラムクロマトグラフィーを用い
て精製するには、各種高分子量ポリフェノール抽出物や
市販のケブラコタンニン、ワットルタンニン等を少量の
水、メタノール、エタノール等の溶媒あるいはこれらの
混合溶媒に溶かし、上記合成吸着剤カラムに吸着させた
後、水で充分に洗浄し、エタノール、メタノール、アセ
トン等の親水性有機溶媒あるいはこれらの混合溶媒で溶
出させれば良い。

【００２２】本発明で用いる高分子量ポリフェノール
は、その精製工程により得られる溶出画分ごとに平均分
子量［重量平均分子量（Ｍｗ）］及び重合度を算出する
ことが出来る。具体的には、高分子量ポリフェノール画
分をテトラヒドロフラン等の溶媒に溶解した後、ショー
デックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＦ−８０２及び８０４（昭
和電工）等のカラムに吸着させ、次いで同溶媒で溶出
し、２８０ｎｍで測定する。 この測定値を、ポリスチ
レン標準品を用いて作成した検量線と比較することによ
り、高分子量ポリフェノールの分子量分布を求め、これ
から重量平均分子量が算出される。 また重合度は、高
分子量ポリフェノール画分の最大含有分子種の分子量を
算出後、１ユニットの分子量を２９０として算出され
る。

【００２３】本発明の抗歯周病剤の有効成分である高分
子量ポリフェノールは、前記のように重量平均分子量が
８００〜１０,０００で、重合度が３〜３０のものであ
るが、より好適なものは、重量平均分子量が１,５００
〜６,０００で重合度が５〜２０のものである。

【００２４】本発明の高分子量ポリフェノールは、抽出
物あるいはその精製物の何れを用いるにせよ、そのまま
のもの、濃縮したもの、溶媒を除去した乾燥物などいか
なる状態のものでも使用することが出来るが、保存性、
有機溶媒の安全性の点で乾燥物の状態にするのが好まし
い。

【００２５】本発明の抗歯周病剤は、上記のようにして
得られた高分子量ポリフェノールを有効成分とし、これ
を公知の薬学的に許容される担体と組み合わせることに
より製造される。

【００２６】本発明における抗歯周病剤は、主に口腔衛
生剤として用いられ、その具体的な剤形の例としては、
歯磨、洗口液、トローチ等が挙げられる。

【００２７】この口腔衛生剤の製造に当っては、その剤
形に応じた通常使用される適宜な成分を使用することが
でき、例えば、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウ
ム、無水ケイ酸、炭酸マグネシウム、グリセリン、ソル
ビトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコ
ール、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロー
ス、アルギン酸ソーダ、カラギーナン、カルボキシビニ
ルポリマー、ジオクチルスルホコハク酸ソーダ、ラウリ
ル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリ
ウム、パラオキシ安息香酸ブチル、ヒノキチオール、ア
ラントイン、グリチルリチン、アルコール、アラビアゴ
ム、デンプン、コーンスターチ、サッカリンナトリウ
ム、ステビオサイド、ブドウ糖、乳糖、ステアリン酸マ
グネシウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、メ
ントール、ユーカリ油、ペッパーミント、スペアミン
ト、色素等の他、フッ化ナトリウム、モノフルオロリン
酸ナトリウム等のフッ化物、塩化リゾチーム、アズレン
等の抗炎症剤、塩化ナトリウム等の通常使用される成分
を適宣配合することができる。

【００２８】また、本発明の抗歯周病剤は、抗歯周病を
目的として各種食品中に添加する剤形のものとすること
ができる。 抗歯周病剤を添加できる食品の例として
は、茶飲料、果汁飲料、コーヒー飲料、炭酸飲料、乳酸
菌飲料、チューイングガム、キャンディー、キャラメ
ル、チョコレート、アイスクリーム等が挙げられる。

【００２９】上記食品の製造においては、その種類に応
じて通常使用される適宜な成分を使用することができ、
使用される成分の例としては、ブドウ糖、果糖、ショ
糖、マルトース、ソルビトール、ステビオサイド、コー
ンシロップ、乳糖、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、コハ
ク酸、乳酸、Ｌ−アスコルビン酸、ｄｌ−α−トコフェ
ロール、エリソルビン酸ナトリウム、グリセリン、プロ
ピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグ
リセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ソル
ビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エ
ステル、アラビアガム、カラギーナン、カゼイン、ゼラ
チン、ペクチン、寒天、ビタミンＢ類、ニコチン酸アミ
ド、パントテン酸カルシウム、アミノ酸類、カルシウム
塩類、色素、香料、保存剤等、通常の食品原料として使
用されているものを挙げることができる。

【００３０】本発明の高分子量ポリフェノールは、樹木
や発酵茶等に由来する天然物であるので、安全性の点で
は問題ないが、本発明のポリフェノールを口腔用剤など
に配合するに際しては、味、色、香りなどの点で、０.
０００１〜０.５％の濃度範囲が好ましい。

【００３１】

【作用】本発明の高分子量ポリフェノールは、歯周病の
原因菌であるＰ.ジンジバリスの産生するプロテアーゼ
を強力に阻害することにより同菌の歯周組織への付着を
極めて強力に抑制し、歯周病の予防等に十分な効果を発
揮するものである。そして、高分子量ポリフェノールの
Ｐ.ジンジバリスの付着阻害活性は分子量に大きく依存
し、例えば重量平均分子量が８００未満のポリフェノー
ルでは、付着阻害活性が弱いために、抗歯周病剤として
の実用性は認め難い。

【００３２】

【実施例】次に本発明の高分子量ポリフェノールの製造
法、高活性物質の精製法、分子量測定法、Ｐ.ジンジバ
リスの歯周組織への付着阻害活性等の検定試験に関する
実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明
はこれら実施例に何等制約されるものではない。

【００３３】実 施 例 １ 樹木由来高分子量ポリフェノールの製造例：原料として
アカシア樹皮（Ａ）、カラマツ樹皮（Ｋ）それぞれ１ｋ
ｇの粉砕物をアセトン−水（７：３ｖ／ｖ）１０Ｌで抽
出した。 抽出は２５℃、２日間行い、これをグラスフ
ィルターで濾過した。 濾液を減圧下濃縮し、粉末残査
をそれぞれ１０７ｇ,２１０ｇを得た。

【００３４】このようにして得られたアカシア樹皮およ
びカラマツ樹皮からの抽出物、市販のワットルタンニン
およびケブラコタンニンを、次のようにして精製した。
すなわち、各抽出物またはタンニンの５ｇを水−エタノ
ール（１：１ｖ／ｖ）１０ｍｌに溶解し、セファデック
スＬＨ−２０（米国、ファルマシア社製）のカラム（φ
３ｃｍ×１００ｃｍ）に吸着させた。 ２リットルの水
で洗浄後、順にエタノール、メタノール、アセトンそれ
ぞれ２リットルずつで溶出し、得られた画分を減圧下濃
縮し、それぞれエタノール溶出画分（ＥＥ）、メタノー
ル溶出画分（ＭＥ）、アセトン溶出画分（ＡＥ）とし
た。

【００３５】その結果、アカシア樹皮抽出物のＥＥ画分
（Ａ−ＥＥ）０.７５ｇ、同ＭＥ画分（Ａ−ＭＥ）３.２
５ｇ、同ＡＥ画分（Ａ−ＡＥ）０.７０ｇが、カラマツ
樹皮抽出物のＥＥ画分（Ｋ−ＥＥ）０.９ｇ、同ＭＥ画
分（Ｋ−ＭＥ）１.５０ｇ、同ＡＥ画分（Ｋ−ＡＥ）２.
２５ｇがそれぞれ得られた。

【００３６】また、ワットルタンニンのＥＥ画分（Ｗ−
ＥＥ）０.２５ｇ、同ＭＥ画分（Ｗ−ＭＥ）２.９０ｇ、
同ＡＥ画分（Ｗ−ＡＥ）０.５０ｇが、ケブラコタンニ
ンのＥＥ画分（Ｑ−ＥＥ）０.６０ｇ、同ＭＥ画分（Ｑ
−ＭＥ）１.７５ｇ、同ＡＥ画分（Ｑ−ＡＥ）０.９０ｇ
がそれぞれ得られた。

【００３７】実 施 例 ２ 発酵茶由来高分子量ポリフェノールの製造例：ウーロン
茶１００ｇを２リットル容の三角フラスコに入れ、５０
容量％エタノール１リットルを加え、室温下で、１時間
ごとに軽く撹拌して３時間抽出を行った。これをセライ
ト濾過し、得た濾液を減圧下濃縮してエタノールを除去
後、水を加えて凍結乾燥し、抽出物２９.２ｇを得た。
紅茶、プアール茶についても上記と同様にして、それぞ
れ３０.４ｇ、３１.３ｇの抽出物を得た。

【００３８】ウーロン茶抽出物５ｇについて実施例１と
同様にして、セファデックスＬＨ−２０カラムクロマト
グラフィーを行い、エタノール溶出画分（ＯＴＥ−Ｅ
Ｅ）.２.２０ｇ、メタノール溶出画分（ＯＴＥ−ＭＥ）
０.９０ｇ、アセトン溶出画分（ＯＴＥ−ＡＥ）０.５０
ｇをそれぞれ得た。

【００３９】実 施 例 ３ 火棘由来高分子量ポリフェノールの製造例：火棘の乾燥
果実５０ｇを９０℃の熱水５００ｍｌに浸漬し、３時間
煮沸の後に濾過し、得られた抽出液を減圧濃縮後、凍結
乾燥して抽出物１３.３ｇを得た。この抽出物５ｇにつ
いて実施例１と同様にして、セファデックスＬＨ−２０
カラムクロマトグラフィーを行い、エタノール溶出画分
（火棘−ＥＥ）１.７０ｇ、メタノール溶出画分（火棘
−ＭＥ）１.２５ｇ、アセトン溶出画分（火棘−ＡＥ）
０.５５ｇをそれぞれ得た。

【００４０】実 施 例 ４ 各高分子量ポリフェノール画分の平均分子量測定：下記
方法により実施例１〜３で得られた各高分子量ポリフェ
ノール画分の重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。 カ
ラムはショーデックス（Ｓｈｏｄｅｘ）ＫＦ−８０２及
び８０４（昭和電工）を用いた。 試料は各サンプル２
ｍｇをテトラヒドロフラン１０ｍｌに溶解して調製し
た。 これを上記のカラムに吸着させた後、テトラヒド
ロフランで溶出し、２８０ｎｍで検出した。 検量線は
ポリスチレン標準品を用いて作成した。

【００４１】各サンプルを溶出し、常法により、各画分
の重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。 各画分の重合
度（ＤＰ）は最大ピークを示す最大含有分子種について
算出した。 すなわち、検量線からその分子量を算出
後、１ユニット２９０と考えて重合度（ＤＰ）を算出し
た。 この結果を表１にまとめた。

【００４２】

【００４３】実 施 例 ５ 各ポリフェノール画分のプロテアーゼ阻害活性および付
着阻害活性の検定： Ａ. Ｐ.ジンジバリス産生プロテアーゼに対する阻害活
性； （１）プロテアーゼの調製 Ｐ.ジンジバリス３８１株を日水製薬社製ＧＡＭブイヨ
ン培地１２Ｌで３７℃、６５時間嫌気培養した。 これ
を１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離し、集めた菌体
を１ｍＭのＣａＣｌ₂と０.２％トリトンＸ−１００を含
むｐＨ７.４のリン酸緩衝液に懸濁させ、超音波破砕し
た。 再度８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得ら
れた上清を１ｍＭのＣａＣｌ₂を含むｐＨ７.４のリン酸
緩衝液に対して透析した。次いで、この透析液を、Ａｒ
ｇセファロース、ＤＥＡＥセファロース、ヒドロキシア
パタイトの各カラムクロマトグラフィーに順次付し、部
分精製したプロテアーゼを得た。 このプロテアーゼを
以下の試験に供した。

【００４４】（２）プロテアーゼ阻害活性の測定 合成基質ベンゾイル−アルギニン−パラニトロアニリド
（Ｌ−ＢＡＰＡ、米国シグマ社製）を、０.３０ｍＭの
ＣａＣｌ₂と０.８８ｍＭのシステインを含むｐＨ７.５
の８８ｍＭリン酸緩衝液中にとり、当該合成基質に対す
る前記プロテアーゼの分解活性を、３７℃で２０分反応
させた後、４０５ｎｍにおける吸光度により測定するこ
とにより求めた。 各ポリフェノール画分のプロテアー
ゼ阻害活性は、その適当量を合成基質と同時に反応液中
に加えることにより、また、そのＩＣ₅₀は常法により求
めた。

【００４５】Ｂ. Ｐ.ジンジバリス由来フィンブリエの
細胞外マトリックスへの付着に対する阻害活性； （１）フィンブリエの調製 Ｐ.ジンジバリス３８１株をＧＡＭブイヨン培地１２Ｌ
で３７℃、６５時間嫌気培養した。 培養後、２５℃、
で１０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離し、菌体を集め
た。 この菌体を０.１５ＭのＮａＣｌと１０ｍＭのＭｇ
Ｃｌ₂を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）に
懸濁させ、室温下でスターラーで撹拌しながらピペッテ
ィングにより機械的にフィンブリエ（線毛構成蛋白質）
を菌体から剥離させた。 この懸濁液を２５℃で１５分
間、８０００ｒｐｍで遠心分離して上清を得た。 この
上清を硫安で４０％飽和させて沈殿物を得た。

【００４６】この４０％硫安沈殿を２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８.０）に溶かし、同緩衝液に対して透析
した。 透析後、同じ緩衝液で平衡化させたＤＥＡＥセ
ファロースカラムクロマトグラフィーに付し、０から
０.５ＭのＮａＣｌ濃度勾配によりグラディエント溶出
させてフィンブリエ画分を得た。 このフィンブリエ画
分を硫安で５０％飽和させて沈殿物を得、これを１０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）に懸濁後、同緩衝液
に対して透析し、精製フィンブリエ５０ｍｇを得た。

【００４７】（２）フィンブリエの細胞外マトリックス
への付着に対する阻害活性の検定 前項で調製した精製フィンブリエを常法によりビオチン
化した。 まず、９６穴マルチプレートの各ウェルを細
胞外マトリックス蛋白質の１つであるコラーゲンでコー
ティングした。 すなわち、ヒト肺由来のコラーゲン
（エラスチン・プロダクツ社製）を１０ｍＭ酢酸に２０
μｇ／ｍｌとなるように溶かし、この溶液を各ウェルに
１００μｌずつ加えて室温下２時間半放置した。

【００４８】次いで、非特異的吸着を抑えるために、牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）のリン酸緩衝生理食塩液（Ｐ
ＢＳ）溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）２００μｌを各ウェルに
加えて室温下３０分間放置することにより各ウェルをブ
ロッキングした。 更に、ヒト血漿由来のフィブロネク
チン（ケミコン・インターナショナル社製）のＰＢＳ溶
液（１０μｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに加えて室
温下１時間放置することにより、各ウェルにコーティン
グされているコラーゲンにフィブロネクチンを結合さ
せ、細胞外マトリックスのモデルとした。

【００４９】次に、付着促進因子であるＰ.ジンジバリ
ス由来の前記部分精製プロテアーゼのＰＢＳ溶液（３.
７μｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに加えて、３７℃
で３０分間反応させた後に、ビオチン化フィンブリエの
ＰＢＳ溶液（１０μｇ／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに
加えて室温下３０分間放置することにより付着反応を行
わせた。

【００５０】フィンブリエ付着量は、各ウェルをＰＢＳ
で十分に洗浄後、ビオチンをストレプトアビジン結合ア
ルカリホスファターゼで検出し、４０５ｎｍの吸光度を
測定することにより定量した。 すなわち、ベクター・
ラボラトリー社キット中のストレプトアビジン結合アル
カリホスファターゼ溶液をＰＢＳで１０００倍希釈した
もの１００μｌを各ウェルに加えて室温下３０分間放置
後、アルカリホスファターゼ基質溶液１００μｌを各ウ
ェルに加えて室温下３０分間反応後、４０５ｎｍの吸光
度を測定した。 各ポリフェノール画分はＰ.ジンジバリ
ス由来のプロテアーゼ添加時に適当量加え（対照はＰＢ
Ｓ）、ＩＣ₅₀の算出は常法によった。

【００５１】Ｃ. Ｐ.ジンジバリス由来フィンブリエの
線維芽細胞への付着に対する阻害活性；正常ヒト皮膚線
維芽細胞（ＮＨＤＦ、倉敷紡績社製）を、Ｆ−ＧＭ培地
（倉敷紡績社製）を用いて、９６穴マルチプレートで培
養した（３×１０⁵cells／９６穴）。 ＰＢＳで培養細
胞を洗浄後、前項と同様にＢＳＡで各ウェルをブロッキ
ングした後、前項と同様にＰ.ジンジバリス由来のプロ
テアーゼ添加以降の操作を行い、フィンブリエ付着量を
定量することにより、各ポリフェノール画分のＩＣ₅₀を
算出した。

【００５２】上記Ａ〜Ｃで測定した、各ポリフェノール
画分のＰ.ジンジバリス産生プロテアーゼに対する阻害
活性並びに同菌由来フィンブリエ（線毛構成蛋白質）の
細胞外マトリックス（ラミニン、コラーゲン、フィブロ
ネクチン等）及び線維芽細胞への付着に対する阻害活性
を表２に示す。

【００５３】

【表２】

【００５４】実 施 例 ６ 歯 磨 き 剤：下記組成により、常法に従って歯磨き
剤を調製した。 （ 組 成 ） 重 量 部 第２リン酸カルシウム ４２ グリセリン １８ カラギーナン ０.９ ラウリル硫酸ナトリウム １.２ サッカリンナトリウム ０.０９ パラオキシ安息香酸ブチル ０.００５ 香 料 １ 高分子量ポリフェノール^* ０.０５ 水 残 量 全 量 １００ * 実施例１で得たＡ−ＡＥ（アカシア樹皮抽出物のアセ
トン溶出画分）

【００５５】実 施 例 ７ 洗 口 液：下記組成により、常法に従って洗口液を調
製した。 （ 組 成 ） 重 量 部 ラウリル硫酸ナトリウム ０.８ グリセリン ７ ソルビトール ５ エチルアルコール １５ 高分子量ポリフェノール^** ０.０５ Ｌ−メントール ０.０５ 香 料 ０.０４ サッカリンナトリウム ０.１ 水 残 量 全 量 １００ **実施例１で得たＷ−ＡＥ（ワットルタンニンのアセト
ン溶出画分）

【００５６】実 施 例 ８ チューイングガム：下記組成により、常法に従ってチュ
ーイングガムを調製した。 （ 組 成 ） 重 量 部 ガムベース ２０ 炭酸カルシウム ２ ステビオサイド ０.１ 高分子量ポリフェノール^*** ０.０１ 乳 糖 ７６.８９ 香 料 １ 全 量 １００ *** 実施例１で得たＯＴＥ−ＡＥ（ウーロン茶抽出物の
アセトン溶出画分）

【００５７】実 施 例 ９ キャンデー：下記組成により、常法に従ってキャンデー
を調製した。 （ 組 成 ） 重 量 部 グラニュー糖 ５５ 水 飴 ４３.５ クエン酸 １.０ 香 料 ０.２ 色 素 ０.２ 高分子量ポリフェノール⁺ ０.１ 全 量 １００ + 実施例１で得たＡ−ＭＥ（アカシア樹皮抽出物のメタ
ノール溶出画分）

【００５８】実 施 例 １０ 果汁飲料：下記組成により、常法に従って果汁飲料（ジ
ュース）を調製した。 （ 組 成 ） 重 量 部 冷凍濃縮温州みかん果汁 ５ 果糖ブドウ糖液糖 １１ クエン酸 ０.２ Ｌ−アスコルビン酸 ０.０２ 香 料 ０.２ 色 素 ０.１ 高分子量ポリフェノール⁺⁺ ０.２ 水 残 量 全 量 １００ ++ 実施例１で得たＯＴＥ−ＭＥ(ウーロン茶抽出物のメ
タノール溶出画分)

【００５９】

【発明の効果】本発明の抗歯周病剤の有効成分である高
分子量ポリフェノールは、歯周病の原因菌であるＰ.ジ
ンジバリスの歯周組織への付着を阻害することにより、
歯周病の発生、進行を防止するものであり、しかもそれ
自身には特異な味、におい等がない。従って、この高分
子量ポリフェノールを有効成分として含有する抗歯周病
剤は、口腔衛生剤や食品添加用剤として、歯周病予防の
ため広く利用することができるものである。 以 上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 隆治 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社生物医学研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 重量平均分子量が８００〜１０,００
   ０、重合度が３〜３０であるポリフェノールを有効成分
   とする抗歯周病剤。
2. 【請求項２】 ポリフェノールが樹木の心材または樹皮
   に由来するポリフェノールである請求項第１項記載の抗
   歯周病剤。
3. 【請求項３】 ポリフェノールがマメ科(Leguminosae)
   の樹木に由来するポリフェノールである請求項第１項ま
   たは第２項記載の抗歯周病剤。
4. 【請求項４】 ポリフェノールが発酵茶葉に由来するポ
   リフェノールである請求項第１項記載の抗歯周病剤。
5. 【請求項５】 ポリフェノールがバラ科ピラカンタ属
   （Rosaceae Pyracantha）植物に由来するポリフェノー
   ルである請求項第１項記載の抗歯周病剤。
6. 【請求項６】 口腔衛生剤である請求項第１項記載の抗
   歯周病剤。
7. 【請求項７】 食品添加用剤である請求項第１項記載の
   抗歯周病剤。
8. 【請求項８】 重量平均分子量が８００〜１０,００
   ０、重合度が３〜３０であるポリフェノールを含有する
   抗歯周病性食品。
9. 【請求項９】 樹木の心材若しくは樹皮、発酵茶葉また
   はバラ科ピラカンタ属植物を溶媒抽出後、該抽出物を吸
   着カラクロマトグラフィーに付すことを特徴とする、抗
   歯周病性物質の製造方法。
10. 【請求項１０】 重量平均分子量が８００〜１０,００
    ０、重合度が３〜３０のポリフェノールである請求項第
    ９項記載の抗歯周病性物質の製造方法。