JPH0880191A - 木本性植物からの核酸抽出方法 - Google Patents
木本性植物からの核酸抽出方法Info
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- JPH0880191A JPH0880191A JP21918794A JP21918794A JPH0880191A JP H0880191 A JPH0880191 A JP H0880191A JP 21918794 A JP21918794 A JP 21918794A JP 21918794 A JP21918794 A JP 21918794A JP H0880191 A JPH0880191 A JP H0880191A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 木本性植物からの品質、収率ともに優れた核
酸抽出方法を提供する。 【構成】 木本性植物組織をバナジルリボヌクレオシド
化合物および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
を含有する緩衝液中で処理することを特徴とする木本性
植物からの核酸抽出方法
酸抽出方法を提供する。 【構成】 木本性植物組織をバナジルリボヌクレオシド
化合物および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
を含有する緩衝液中で処理することを特徴とする木本性
植物からの核酸抽出方法
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、木本性植物から核酸を
抽出する方法に関し、更に詳しくは木本性植物からの効
果的な核酸抽出方法に関するものである。近年、遺伝子
工学の進展に伴い、これを応用した形質転換植物の作出
が盛んに行われている。遺伝子操作を行うためには、目
的とする植物種からの核酸抽出が不可欠である。従っ
て、本発明による核酸抽出方法は、遺伝子工学的技術を
広く木本性植物種全般に応用するために極めて有用であ
る。
抽出する方法に関し、更に詳しくは木本性植物からの効
果的な核酸抽出方法に関するものである。近年、遺伝子
工学の進展に伴い、これを応用した形質転換植物の作出
が盛んに行われている。遺伝子操作を行うためには、目
的とする植物種からの核酸抽出が不可欠である。従っ
て、本発明による核酸抽出方法は、遺伝子工学的技術を
広く木本性植物種全般に応用するために極めて有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】核酸の抽出方法は生物全般に多くの方法
が提唱されている。これらの方法に共通しておる特徴
は、i)タンパク質変性剤を含む緩衝溶液を用いて核酸分
解酵素を抑制しつつ除タンパク操作を行う、 ii)試料の
酸化を抑さえるために還元剤存在下で抽出操作を行う、
の２点である。代表的核酸抽出法としては、ドデシル硫
酸ナトリウム (以下ＳＤＳと略すことがある) を含む抽
出バッファーを用い、フェノール抽出操作により除タン
パク質を行うフェノール・ＳＤＳ法（Kirbyら、Biochem
J.： ６６、１９５７）、臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウム（以下ＣＴＡＢと略すことがある）を含む
抽出バッファーを用い、糖質、タンパク質画分をクロロ
ホルム抽出することによって除くＣＴＡＢ法（Murray
ら、Nucl. Acids Res.：８、１９８０）、グアニジウム
チオシアネート（ＧＩＴ）を含む抽出バッファーを用い
て試料を破砕した後、塩化セシウムを用いる超遠心分離
によりＲＮＡを沈殿させる方法（Glisinら、Biochemist
ry：１３、１９７４）が挙げられる。
が提唱されている。これらの方法に共通しておる特徴
は、i)タンパク質変性剤を含む緩衝溶液を用いて核酸分
解酵素を抑制しつつ除タンパク操作を行う、 ii)試料の
酸化を抑さえるために還元剤存在下で抽出操作を行う、
の２点である。代表的核酸抽出法としては、ドデシル硫
酸ナトリウム (以下ＳＤＳと略すことがある) を含む抽
出バッファーを用い、フェノール抽出操作により除タン
パク質を行うフェノール・ＳＤＳ法（Kirbyら、Biochem
J.： ６６、１９５７）、臭化ヘキサデシルトリメチル
アンモニウム（以下ＣＴＡＢと略すことがある）を含む
抽出バッファーを用い、糖質、タンパク質画分をクロロ
ホルム抽出することによって除くＣＴＡＢ法（Murray
ら、Nucl. Acids Res.：８、１９８０）、グアニジウム
チオシアネート（ＧＩＴ）を含む抽出バッファーを用い
て試料を破砕した後、塩化セシウムを用いる超遠心分離
によりＲＮＡを沈殿させる方法（Glisinら、Biochemist
ry：１３、１９７４）が挙げられる。
【０００３】これらの方法は各々に改良がなされて現在
に至っている。当初は核酸分解酵素の作用を抑制する目
的で、特別な核酸分解酵素阻害剤や核酸分解酵素を消化
するためのタンパク質分解酵素を添加する方法が示され
ていた。その例としてＲＮＡ分解酵素拮抗阻害剤である
バナジルリボヌクレオシド化合物（Bergerら、Biochemi
stry：１８、１９７９）、核酸分解酵素を消化するため
のタンパク質分解酵素（プロテナーゼＫ）が挙げられ
る。しかしながら最近の抽出方法においては、タンパク
質変性剤を含む緩衝液の効果により核酸分解酵素を抑制
できることから、これらの化合物については無添加とし
ていることが多い。
に至っている。当初は核酸分解酵素の作用を抑制する目
的で、特別な核酸分解酵素阻害剤や核酸分解酵素を消化
するためのタンパク質分解酵素を添加する方法が示され
ていた。その例としてＲＮＡ分解酵素拮抗阻害剤である
バナジルリボヌクレオシド化合物（Bergerら、Biochemi
stry：１８、１９７９）、核酸分解酵素を消化するため
のタンパク質分解酵素（プロテナーゼＫ）が挙げられ
る。しかしながら最近の抽出方法においては、タンパク
質変性剤を含む緩衝液の効果により核酸分解酵素を抑制
できることから、これらの化合物については無添加とし
ていることが多い。
【０００４】一方、抽出時において試料中の成分が酸化
されることによって現われる褐変反応は、最終的に核酸
の呈色（黒褐色）にまで及び、その後の酵素反応を著し
く阻害するとともに、核酸画分の収量低下の主要因とな
っている。酵素反応は、得られた核酸から特定の遺伝子
を選抜するために必要なライブラリーの作製等や、制限
酵素断片長に由来する多型（ＲＦＬＰと呼ばれる）の検
出等に用いられる必須の反応である。
されることによって現われる褐変反応は、最終的に核酸
の呈色（黒褐色）にまで及び、その後の酵素反応を著し
く阻害するとともに、核酸画分の収量低下の主要因とな
っている。酵素反応は、得られた核酸から特定の遺伝子
を選抜するために必要なライブラリーの作製等や、制限
酵素断片長に由来する多型（ＲＦＬＰと呼ばれる）の検
出等に用いられる必須の反応である。
【０００５】従来法において試料成分の褐変防止に用い
る代表的還元剤としては、ジチオスレイトール（C4H10O
2S2、分子量１５４.２４、ｐＨ７で−０．３３Ｖの酸化
還元電位を示す）、２ーメルカプトエタノール（CH2(S
H)CH2OH、分子量７８．１３）等が広く用いられてい
る。動物試料や細菌試料の場合は比較的少量の還元剤を
添加することにより、褐変を防ぐことが可能であるが、
植物の場合、特に木本性植物では多量に存在する２次代
謝産物のために、還元剤の効果が得られないことが少な
くない。
る代表的還元剤としては、ジチオスレイトール（C4H10O
2S2、分子量１５４.２４、ｐＨ７で−０．３３Ｖの酸化
還元電位を示す）、２ーメルカプトエタノール（CH2(S
H)CH2OH、分子量７８．１３）等が広く用いられてい
る。動物試料や細菌試料の場合は比較的少量の還元剤を
添加することにより、褐変を防ぐことが可能であるが、
植物の場合、特に木本性植物では多量に存在する２次代
謝産物のために、還元剤の効果が得られないことが少な
くない。
【０００６】このような状況において、木本性植物に対
して、褐変を認めない核酸画分を抽出する方法の開発が
望まれていた。さらに、林木に対する育種は地球環境を
保全する立場から鑑みた場合においても今後益々重要に
なると考えられ、そのためには従来の交雑育種に加え、
遺伝子工学的手法を用いる育種法の応用が不可欠である
ことは言うまでもない。
して、褐変を認めない核酸画分を抽出する方法の開発が
望まれていた。さらに、林木に対する育種は地球環境を
保全する立場から鑑みた場合においても今後益々重要に
なると考えられ、そのためには従来の交雑育種に加え、
遺伝子工学的手法を用いる育種法の応用が不可欠である
ことは言うまでもない。
【０００７】本発明者らは、特に林木の場合において従
来法により抽出された核酸が褐色に着色することに着目
した。これは、フェノール系化合物（タンニン等と推定
される(Tesniereら、Plant Mol. Biol. Rep.：９、１９
９１））由来の褐色物質が核酸と結合するために生じる
と考えられた。このような着色した核酸試料はその後の
酵素反応に用いた場合、反応が阻害されることが知られ
ている。
来法により抽出された核酸が褐色に着色することに着目
した。これは、フェノール系化合物（タンニン等と推定
される(Tesniereら、Plant Mol. Biol. Rep.：９、１９
９１））由来の褐色物質が核酸と結合するために生じる
と考えられた。このような着色した核酸試料はその後の
酵素反応に用いた場合、反応が阻害されることが知られ
ている。
【０００８】従来法によりタンパク質および多糖類の除
去は完成されていることから、最終的には褐色物質と核
酸の結合さえ妨げることができれば、純度の高い核酸画
分の回収が可能になると考えた。本発明者らは各方面か
ら鋭意研究し、このような褐色物質と核酸の結合を防ぐ
添加物の探求を重ねた結果、従来からＲＮＡ分解酵素の
拮抗阻害剤として知られていたバナジルリボヌクレオシ
ド化合物が、核酸と褐色物質の結合を阻害する新規の効
果を有することを見い出し本発明を完成した。
去は完成されていることから、最終的には褐色物質と核
酸の結合さえ妨げることができれば、純度の高い核酸画
分の回収が可能になると考えた。本発明者らは各方面か
ら鋭意研究し、このような褐色物質と核酸の結合を防ぐ
添加物の探求を重ねた結果、従来からＲＮＡ分解酵素の
拮抗阻害剤として知られていたバナジルリボヌクレオシ
ド化合物が、核酸と褐色物質の結合を阻害する新規の効
果を有することを見い出し本発明を完成した。
【０００９】
【本発明が解決しようとする課題】本発明は上記に示し
た現状に鑑み、木本性植物から高品位の核酸を得るため
の抽出方法の提供を目的としてなされたものである。さ
らに、本発明は木本性植物に対して褐変を生じない核酸
画分を抽出する方法の提供を目的としてなされたもので
ある。
た現状に鑑み、木本性植物から高品位の核酸を得るため
の抽出方法の提供を目的としてなされたものである。さ
らに、本発明は木本性植物に対して褐変を生じない核酸
画分を抽出する方法の提供を目的としてなされたもので
ある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明は，木本性植物組
織をバナジルリボヌクレオシド化合物および臭化ヘキサ
デシルトリメチルアンモニウムを含む緩衝液中で処理す
ることを特徴とする木本性植物からの核酸抽出方法に存
する。本発明において使用するバナジルリボヌクレオシ
ド化合物の濃度は１ｍＭ以上１００ｍＭの範囲、臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムについては１％（ｗ
／ｖ）でその効果を得ることができるが、さらに好まし
くは１０ｍＭのバナジルリボヌクレオシド化合物および
１％（ｗ／ｖ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ムを含む緩衝液中で処理する場合に最大の効果が得るこ
とができる。
織をバナジルリボヌクレオシド化合物および臭化ヘキサ
デシルトリメチルアンモニウムを含む緩衝液中で処理す
ることを特徴とする木本性植物からの核酸抽出方法に存
する。本発明において使用するバナジルリボヌクレオシ
ド化合物の濃度は１ｍＭ以上１００ｍＭの範囲、臭化ヘ
キサデシルトリメチルアンモニウムについては１％（ｗ
／ｖ）でその効果を得ることができるが、さらに好まし
くは１０ｍＭのバナジルリボヌクレオシド化合物および
１％（ｗ／ｖ）臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウ
ムを含む緩衝液中で処理する場合に最大の効果が得るこ
とができる。
【００１１】本発明の対象である木本性植物としては，
特に限定されるものではないが例えばユーカリ、アカシ
ア、パラゴムノキ、コーヒー等の常緑広葉樹、ポプラ、
コナラ、クヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹、ミカン、レモ
ン、サクラ、モモ、リンゴ、ナシ、アボガト、キウイフ
ルーツ、カキ、クルミ、ブドウ、イチヂク、アーモン
ド、マンゴウ等の果樹類，さらにバラ、ツバキ、ウメ等
の花木類等、マツ類、スギ類、ヒノキ類等の針葉樹など
をあげることができる。さらに，実際に用いるこれら木
本性植物の組織としては，主幹部（木部組織，髄組織
等）、茎頂部、あるいは胚軸、葉、根、実（胚，子葉
等）等が挙げられる。
特に限定されるものではないが例えばユーカリ、アカシ
ア、パラゴムノキ、コーヒー等の常緑広葉樹、ポプラ、
コナラ、クヌギ、ウルシ等の落葉広葉樹、ミカン、レモ
ン、サクラ、モモ、リンゴ、ナシ、アボガト、キウイフ
ルーツ、カキ、クルミ、ブドウ、イチヂク、アーモン
ド、マンゴウ等の果樹類，さらにバラ、ツバキ、ウメ等
の花木類等、マツ類、スギ類、ヒノキ類等の針葉樹など
をあげることができる。さらに，実際に用いるこれら木
本性植物の組織としては，主幹部（木部組織，髄組織
等）、茎頂部、あるいは胚軸、葉、根、実（胚，子葉
等）等が挙げられる。
【００１２】次に本発明の核酸抽出法に用いた供試試料
および抽出試薬について説明する。 供試試料 Eucalyptus camaldulensis（３年生）の地表部から主幹
胸高位（約１２０センチ）に相当する木部組織の一部で
ある２次壁肥厚部位を採取し、抽出操作直前まで超低温
冷凍庫−８０℃）において保存した。
および抽出試薬について説明する。 供試試料 Eucalyptus camaldulensis（３年生）の地表部から主幹
胸高位（約１２０センチ）に相当する木部組織の一部で
ある２次壁肥厚部位を採取し、抽出操作直前まで超低温
冷凍庫−８０℃）において保存した。
【００１３】抽出試薬 以下に示した試薬を作製した。 ・メタノール／ジチオスレイトール溶液・・ジチオスレ
イトール（１ｍｇ／ｍｌ）を含むメタノール ・ＲＮＡ抽出溶液・・１００ｍＭ (ｐＨ９)、 ２％(ｗ
／ｖ） ＳＤＳ ・２００ｍＭ バナジルリボヌクレオシド化合物溶液
（GibcoBRL社製） ・１０％（ｗ／ｖ） ＣＴＡＢ溶液 ・クロロホルム：イソアミルアルコール（＝２４：１）
溶液 ・５Ｍ 塩化ナトリウム溶液 ・イソプロパノール ・フェノール・クロロホルム（＝１：１）溶液（フェノ
ールは０．１Ｍ トリスバッファー（ｐＨ８）で飽和さ
せておく） ・エタノール ・７０％（ｖ／ｖ） エタノール溶液 ・３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液 ・１２Ｍ 塩化リチウム溶液
イトール（１ｍｇ／ｍｌ）を含むメタノール ・ＲＮＡ抽出溶液・・１００ｍＭ (ｐＨ９)、 ２％(ｗ
／ｖ） ＳＤＳ ・２００ｍＭ バナジルリボヌクレオシド化合物溶液
（GibcoBRL社製） ・１０％（ｗ／ｖ） ＣＴＡＢ溶液 ・クロロホルム：イソアミルアルコール（＝２４：１）
溶液 ・５Ｍ 塩化ナトリウム溶液 ・イソプロパノール ・フェノール・クロロホルム（＝１：１）溶液（フェノ
ールは０．１Ｍ トリスバッファー（ｐＨ８）で飽和さ
せておく） ・エタノール ・７０％（ｖ／ｖ） エタノール溶液 ・３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液 ・１２Ｍ 塩化リチウム溶液
【００１４】以下，本発明を実施例によって具体的に説
明する。
明する。
【実施例１】 ＲＮＡ抽出方法 抽出方法については，特に詳しく説明しない箇所はMani
atisらのMolecular Cloning （１９９１）に記載されて
いる方法に従った。 (1)５グラムの凍結試料を液体窒素下で破砕した後、５
０ｍｌ遠心チューブ（NUNC社製）に移し、ガラスビーズ
を１０グラム加えた後、ホモジナイザーで５分間摩砕し
た。 (2)メタノール／ジチオスレイトール溶液を用いて摩砕
試料の溶媒抽出を行った。上清に着色が認められなくな
るまで（３回程度）繰り返した。抽出終了後、試料を凍
結乾燥させた。 (3)凍結乾燥試料を２５ｍＬのＲＮＡ抽出溶液（使用直
前に２０ミリグラムのジチオスレイトール、バナジルリ
ボヌクレオシド化合物溶液を添加）と混合し６５℃で３
０分間保温した。この際に、表１に示したRNA抽出溶液
中のバナジルリボヌクレオシド化合物溶液を添加する割
合を変えた５つの実験区を設定した。
atisらのMolecular Cloning （１９９１）に記載されて
いる方法に従った。 (1)５グラムの凍結試料を液体窒素下で破砕した後、５
０ｍｌ遠心チューブ（NUNC社製）に移し、ガラスビーズ
を１０グラム加えた後、ホモジナイザーで５分間摩砕し
た。 (2)メタノール／ジチオスレイトール溶液を用いて摩砕
試料の溶媒抽出を行った。上清に着色が認められなくな
るまで（３回程度）繰り返した。抽出終了後、試料を凍
結乾燥させた。 (3)凍結乾燥試料を２５ｍＬのＲＮＡ抽出溶液（使用直
前に２０ミリグラムのジチオスレイトール、バナジルリ
ボヌクレオシド化合物溶液を添加）と混合し６５℃で３
０分間保温した。この際に、表１に示したRNA抽出溶液
中のバナジルリボヌクレオシド化合物溶液を添加する割
合を変えた５つの実験区を設定した。
【００１５】
【表１】
【００１６】(4)保温終了後の試料溶液中に、５Ｍ塩化
ナトリウム溶液及び１０％ＣＴＡＢ溶液を添加した。こ
の際、添加後の試料溶液中における塩化ナトリウム濃度
は１．４Ｍ、ＣＴＡＢ濃度は１％（ｗ／ｖ）となるよう
にした。試料溶液をよく混合した後６５℃で１０分間保
温した。 (5)等量のクロロホルム：イソアミルアルコール溶液を
添加し、緩やかに、かつ充分に混合した。混合後、遠心
操作により上清を回収した。 (6)上清に対し、５５％容のイソプロパノールを添加
し、１時間氷冷した。 (7)遠心操作により沈殿を得、これを水に溶解させた
後、フェノール抽出を行った。 (8)フェノール抽出後の上清に１０％容の３Ｍ酢酸ナト
リウム溶液および６０％容のイソプロパノールを添加
し、よく混合した後、遠心操作により沈殿を回収した。 (9)沈殿を滅菌水を用いて溶解した後、終濃度3Mとなる
ように１２Ｍ 塩化リチウム溶液を添加し、よく混合し
た後、１時間氷冷した。 (10)遠心操作によりRNA沈殿を回収し、洗浄、乾燥を経
て、最終的に水４００μLに溶解させ、全ＲＮＡ画分と
した。結果を表２に示した。
ナトリウム溶液及び１０％ＣＴＡＢ溶液を添加した。こ
の際、添加後の試料溶液中における塩化ナトリウム濃度
は１．４Ｍ、ＣＴＡＢ濃度は１％（ｗ／ｖ）となるよう
にした。試料溶液をよく混合した後６５℃で１０分間保
温した。 (5)等量のクロロホルム：イソアミルアルコール溶液を
添加し、緩やかに、かつ充分に混合した。混合後、遠心
操作により上清を回収した。 (6)上清に対し、５５％容のイソプロパノールを添加
し、１時間氷冷した。 (7)遠心操作により沈殿を得、これを水に溶解させた
後、フェノール抽出を行った。 (8)フェノール抽出後の上清に１０％容の３Ｍ酢酸ナト
リウム溶液および６０％容のイソプロパノールを添加
し、よく混合した後、遠心操作により沈殿を回収した。 (9)沈殿を滅菌水を用いて溶解した後、終濃度3Mとなる
ように１２Ｍ 塩化リチウム溶液を添加し、よく混合し
た後、１時間氷冷した。 (10)遠心操作によりRNA沈殿を回収し、洗浄、乾燥を経
て、最終的に水４００μLに溶解させ、全ＲＮＡ画分と
した。結果を表２に示した。
【００１７】
【表２】
【００１８】バナジルリボヌクレオシド化合物を全く添
加していない系においては、遠心操作によって得られる
全核酸沈殿が黒褐色になることが認められた（実験番
号：Ｒ１）。１ｍＭ以上の添加によりＲＮＡ画分の褐変
を低減する効果があることが示された（実験番号：Ｒ
３、Ｒ４、Ｒ５）。さらに，１０mM以上の添加により完
全なＲＮＡ画分の回収が可能となる（実験番号：Ｒ４、
Ｒ５）。褐色物質が除去されたことの付帯効果として、
バナジルリボヌクレオシド化合物無添加の系に比べて、
４倍量のＲＮＡが得られ、収率向上効果があることが確
認された。尚、１００ｍＭの添加では，試料の褐変、収
量ともに１０ｍＭ添加時と差異が認められないことか
ら，好ましくは１０ｍＭの添加量が最も有効であると言
える。
加していない系においては、遠心操作によって得られる
全核酸沈殿が黒褐色になることが認められた（実験番
号：Ｒ１）。１ｍＭ以上の添加によりＲＮＡ画分の褐変
を低減する効果があることが示された（実験番号：Ｒ
３、Ｒ４、Ｒ５）。さらに，１０mM以上の添加により完
全なＲＮＡ画分の回収が可能となる（実験番号：Ｒ４、
Ｒ５）。褐色物質が除去されたことの付帯効果として、
バナジルリボヌクレオシド化合物無添加の系に比べて、
４倍量のＲＮＡが得られ、収率向上効果があることが確
認された。尚、１００ｍＭの添加では，試料の褐変、収
量ともに１０ｍＭ添加時と差異が認められないことか
ら，好ましくは１０ｍＭの添加量が最も有効であると言
える。
【００１９】同一の試料を用いて、バナジルリボヌクレ
オシド化合物をフェノール・ＳＤＳ抽出法に添加した場
合の抽出方法を行った結果、濃度に関わらず核酸は黒褐
色となった。この原因はバナジルリボヌクレオシド化合
物がフェノール抽出時にタンパク質と共に除かれたこと
による。今回、ＣＴＡＢ緩衝液を用いたことによりバナ
ジルリボヌクレオシド化合物の効果が抽出操作の終盤ま
で及んだ結果、初めて核酸の呈色を完全に防ぐことが可
能となった。
オシド化合物をフェノール・ＳＤＳ抽出法に添加した場
合の抽出方法を行った結果、濃度に関わらず核酸は黒褐
色となった。この原因はバナジルリボヌクレオシド化合
物がフェノール抽出時にタンパク質と共に除かれたこと
による。今回、ＣＴＡＢ緩衝液を用いたことによりバナ
ジルリボヌクレオシド化合物の効果が抽出操作の終盤ま
で及んだ結果、初めて核酸の呈色を完全に防ぐことが可
能となった。
【００２０】
【実施例２】 ＤＮＡ抽出方法 下記内容において特に詳しく説明しない箇所は、Maniat
isらのMolecular Cloning （１９９１）に記載されてい
る方法に従った。 (1)から(7)までの操作はＲＮＡ抽出の場合と同様であ
る。 (8)沈殿を４００μｌの滅菌水に溶解し、セファクリル
Ｓ−１００（ファルマシア社製）を用いるゲルろ過を２
回行った。 (9)エタノール沈殿により再度精製し、洗浄、乾燥を経
て、最終的に水２００μｌに溶解させ、全ＤＮＡ画分と
した。結果を表３に示す。
isらのMolecular Cloning （１９９１）に記載されてい
る方法に従った。 (1)から(7)までの操作はＲＮＡ抽出の場合と同様であ
る。 (8)沈殿を４００μｌの滅菌水に溶解し、セファクリル
Ｓ−１００（ファルマシア社製）を用いるゲルろ過を２
回行った。 (9)エタノール沈殿により再度精製し、洗浄、乾燥を経
て、最終的に水２００μｌに溶解させ、全ＤＮＡ画分と
した。結果を表３に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】バナジルリボヌクレオシド化合物を全く添
加していない系においては、遠心操作によって得られる
全核酸沈殿が褐色になることが明かとなった（実験番
号：Ｄ１）。１ｍＭ以上の添加によりＤＮＡ画分の褐変
を低減する効果があることが示された（実験番号：Ｄ
３、Ｄ４、Ｄ５）。さらに，１０ｍＭ以上の添加により
完全なDNA画分の回収が可能となる（実験番号：Ｄ４、
Ｄ５）。収量についてもバナジルリボヌクレオシド化合
物無添加の系に比べて、２倍のＤＮＡ画分が得られた。
尚、１００ｍＭの添加では，試料の褐変、収量ともに１
０ｍＭ添加時と差異が認められないことから，好ましく
は１０ｍＭの添加量が最も有効であると言える。
加していない系においては、遠心操作によって得られる
全核酸沈殿が褐色になることが明かとなった（実験番
号：Ｄ１）。１ｍＭ以上の添加によりＤＮＡ画分の褐変
を低減する効果があることが示された（実験番号：Ｄ
３、Ｄ４、Ｄ５）。さらに，１０ｍＭ以上の添加により
完全なDNA画分の回収が可能となる（実験番号：Ｄ４、
Ｄ５）。収量についてもバナジルリボヌクレオシド化合
物無添加の系に比べて、２倍のＤＮＡ画分が得られた。
尚、１００ｍＭの添加では，試料の褐変、収量ともに１
０ｍＭ添加時と差異が認められないことから，好ましく
は１０ｍＭの添加量が最も有効であると言える。
【００２３】ユーカリは，主要なパルプ原木として世界
的規模で植林されており，遺伝子工学的手法を用いた育
種が期待されている。しかしながら，ユーカリは林木の
中でも比較的多量の２次代謝産物を含み、これらは組織
の破壊と共に褐変し、核酸画分の着色が著しく、従来の
抽出方法では品質および収量ともに低い核酸画分しか得
ることができなかった。実施例１および２に示した様
に，本発明によりユーカリからの核酸抽出が確立された
ことでユーカリの遺伝子工学的育種、さらには紙パルプ
産業の原料供給に利益をもたらすと考えられる。また、
ユーカリ以外の木本性植物についても本発明が応用可能
であることは言うまでもない。
的規模で植林されており，遺伝子工学的手法を用いた育
種が期待されている。しかしながら，ユーカリは林木の
中でも比較的多量の２次代謝産物を含み、これらは組織
の破壊と共に褐変し、核酸画分の着色が著しく、従来の
抽出方法では品質および収量ともに低い核酸画分しか得
ることができなかった。実施例１および２に示した様
に，本発明によりユーカリからの核酸抽出が確立された
ことでユーカリの遺伝子工学的育種、さらには紙パルプ
産業の原料供給に利益をもたらすと考えられる。また、
ユーカリ以外の木本性植物についても本発明が応用可能
であることは言うまでもない。
【００２４】
【発明の効果】本発明により、バナジルリボヌクレオシ
ド化合物の新規の効果として、着色の要因となる物質の
核酸への結合を阻害し、その結果効率良く核酸を回収で
きることが明かとなった。今回、ＣＴＡＢを含む緩衝液
を用いたことによりバナジルリボヌクレオシド化合物の
効果が抽出操作の終盤まで及んだ結果、初めて核酸抽出
処理における核酸の呈色を完全に防ぐことが可能となっ
た。本発明により木本性植物試料においても動物、細菌
の場合と同様に高効率な核酸抽出が可能となった。
ド化合物の新規の効果として、着色の要因となる物質の
核酸への結合を阻害し、その結果効率良く核酸を回収で
きることが明かとなった。今回、ＣＴＡＢを含む緩衝液
を用いたことによりバナジルリボヌクレオシド化合物の
効果が抽出操作の終盤まで及んだ結果、初めて核酸抽出
処理における核酸の呈色を完全に防ぐことが可能となっ
た。本発明により木本性植物試料においても動物、細菌
の場合と同様に高効率な核酸抽出が可能となった。
Claims (1)
- 【請求項１】 木本性植物組織をバナジルリボヌクレオ
シド化合物および臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニ
ウムを含有する緩衝液中で処理することを特徴とする木
本性植物からの核酸抽出方法
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21918794A JPH0880191A (ja) | 1994-09-13 | 1994-09-13 | 木本性植物からの核酸抽出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21918794A JPH0880191A (ja) | 1994-09-13 | 1994-09-13 | 木本性植物からの核酸抽出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0880191A true JPH0880191A (ja) | 1996-03-26 |
Family
ID=16731574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21918794A Pending JPH0880191A (ja) | 1994-09-13 | 1994-09-13 | 木本性植物からの核酸抽出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0880191A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004081209A1 (ja) * | 2003-02-24 | 2004-09-23 | Oji Paper Co., Ltd. | 植物細胞壁形成を制御する遺伝子群 |
| KR100456284B1 (ko) * | 2002-07-09 | 2004-11-09 | 학교법인 인하학원 | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 |
-
1994
- 1994-09-13 JP JP21918794A patent/JPH0880191A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100456284B1 (ko) * | 2002-07-09 | 2004-11-09 | 학교법인 인하학원 | 미생물로부터의 신속한 핵산의 분리방법 |
| WO2004081209A1 (ja) * | 2003-02-24 | 2004-09-23 | Oji Paper Co., Ltd. | 植物細胞壁形成を制御する遺伝子群 |
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