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JPH08512129A - Compositions and methods and treatments for anti-addictive anesthetic analgesic activity screening - Google Patents

Compositions and methods and treatments for anti-addictive anesthetic analgesic activity screening

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JPH08512129A
JPH08512129A JP7502986A JP50298694A JPH08512129A JP H08512129 A JPH08512129 A JP H08512129A JP 7502986 A JP7502986 A JP 7502986A JP 50298694 A JP50298694 A JP 50298694A JP H08512129 A JPH08512129 A JP H08512129A
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JP
Japan
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receptor
camp
opioid
agonist
assay
Prior art date
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Application number
JP7502986A
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Japanese (ja)
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サディー、ウォルフガング
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University of California
Original Assignee
University of California
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、麻酔性鎮痛剤中毒状態の調節を測定するアッセーを提供する。本発明の実施によって、活性化オピオイドμレセプター状態に対する被験化合物の作用について、それら被験化合物を分類することが可能となる。オピオイドμレセプター細胞を検査条件下で被験化合物とともに処理するとき、１実施例では、被験化合物の自発的ｃＡＭＰオーバーシュートおよび逆作動薬誘発ｃＡＭＰオーバーシュートを引き出す傾向が決定され、それは常習性傾向の代用測定として役立つ。逆作動薬誘発ｃＡＭＰオーバーシュートは、オピオイドμレセプターのための構造的に活性な状態と呼ばれるものの存在を明示する。これらのアッセーの使用は、オピオイドμレセプターの構造的活性化に対する所望の作用をもつ化合物の同定につながった。これら化合物の治療的有効性は、麻酔性鎮痛剤を常習する患者、または過剰量の麻酔性鎮痛剤を投与された患者、または麻酔性鎮痛剤で疼痛が解除される患者を処置することを含む。   (57) [Summary] The present invention provides an assay for measuring modulation of narcotic analgesic intoxication status. The practice of the present invention allows for the classification of test compounds with respect to their effect on the activated opioid μ receptor status. When treating opioid μ receptor cells with a test compound under test conditions, one example determined the propensity of the test compound to elicit spontaneous and inverse agonist-induced cAMP overshoot, which was a proxy for the addictive tendency. Useful as a measurement. Inverse agonist-induced cAMP overshoot demonstrates the existence of what is termed a constitutively active state for the opioid μ receptor. The use of these assays has led to the identification of compounds with the desired effect on the constitutive activation of opioid μ receptors. Therapeutic efficacy of these compounds includes treating patients who are addicted to narcotic analgesics or who have been given excessive amounts of narcotic analgesics or whose pain has been relieved. .

Description

【発明の詳細な説明】 抗常習性麻酔鎮痛活性スクリーニングのための組成物および方法並びに治療 発明の分野 本発明は、一般に麻酔薬の薬理活性のスクリーニングに関し、より具体的には 、化合物の麻酔活性を分類するために役立つアッセーおよび、そのようなアッセ ーによって確定される抗常習性薬剤を用いる治療に関する。発明の背景 内在性のアヘン製剤レセプターは１９７０年代に発見され、特定の薬剤が常習 性をもたらすメカニズムを明らかにするために熱心に研究が行われてきた。しか しながら、薬剤中毒の分子メカニズムにおけるネスラー(Nestler)の１９９２年 の概論の中で、彼は、そのようなメカニズムは未だ理解されていないと記載して いる(J.Neurosci.，12(7)，2439-2450，1992)。 多数のオピオイドレセプターの種々のタイプが同定されている。とりわけ、既 知のレセプタータイプではオピオイドμレセプターがある。 麻酔性鎮痛剤はオピオイドμレセプターに作用し、痛覚脱失を生じる。しかし ながら、麻酔性鎮痛剤の持続的使用は、典型的には習慣性または中毒をもたらし 、その１つを用いることによって他のものに対する交叉耐性／依存性を生じる。 それらを治療として使用するにもかかわらず、患者はこの麻酔性鎮痛剤に対して 耐性が増していくので、痛みからの解放を達成するためには用量を増加させるこ とが要求される。続いて、望ましくない副作用、例えば肉体的依存性が発生する 傾向がある。 麻酔性鎮痛剤の実例は、例えばアヘンの種々のアルカロイド（例えばモルヒネ ）、モルヒネ塩（例えば臭化水素酸モルヒネ、塩酸モルヒネ、ムチン酸モルヒネ 、オレイン酸モルヒネおよび硫酸モルヒネ）およびモルヒネ類似体（ノルモルヒ ネ、ジアセチルジヒドロモルヒネ、コデインおよびジアセチルモルヒネ（ヘロイ ン））である。他の広く用いられている麻酔性鎮痛剤には、メタドン、メペリジ ン、レボルファノール、プロポキシフェン、フェンタニル、オキシモルホン、ア ニレリジン、メトポンおよびペンタゾシンが含まれる。 医薬の鎮痛特性をヒトで調べる前に、先ず小型のゲッ歯類および／またはサル で実験を行うべきであるということは、現実的および行政的な配慮からしばしば 要請されているので、麻酔性鎮痛剤の作動薬的作用と依存性誘導特性は、ヒトの 他に種々の哺乳類種で研究することが可能であり、現に研究されている。ヒト以 外の哺乳類でモルヒネ様特性を有する薬剤は、ヒトでモルヒネ様であることが分 かった。さらに、ヒトでの作用を予見することができると広く受け入れられてい る動物を用いて、種々の鎮痛アッセーが開発されてきた。長期的に麻酔薬に曝さ れているときの生化学的変化は、標的組織（例えばラットの青斑（ＬＣ）、これ はアヘン製剤依存性の好ましいモデルである）を用いて調べることができる。し たがって、習慣的なアヘン剤処置では、ＬＣニューロンはアヘン剤の急性抑制作 用に対して耐性を生じ、さらに平行して、常習的な処置によって、レセプターと 生理学的反応との間の各主要ステップで、ｃＡＭＰの第二のメッセンジャー系の 劇的なアップレギュレーションが生じ、その結果依存状態をもたらすことが示さ れた（例えばネスラーの２４４０ページを参照のこと）。 今日まで、μオピオイドレセプター系のアッセーでは、麻酔中毒時におけるこ の系の主要変化を全く検出することができなかった。したがって、現在の研究の 多くは、依存状態を説明することを目的として、このレセプターの下流域の事象 （例えば長期的遺伝子調節）に向けられてきた。麻酔薬の依存性傾向は、潜在的 な鎮痛剤としてのその臨床的有用性を極度に制限し、さらに、違法な麻酔薬の使 用によって社会に重い代償を課すが故に、麻酔薬依存状態を予防もしくは回復さ せるか、または薬物の緩慢な使用中止を促進することができる薬剤のスクリーニ ングは、麻酔性鎮痛剤の臨床的有用性を大いに高め、さらに、違法な薬剤使用に 対する戦いにおいて効果的な医薬武器として役立つであろう。発明の要旨 オピオイドμレセプターが作動薬に曝されることによってレセプターが構造的 に活性化されることとなる新規なメカニズムが提唱される。麻酔性鎮痛剤に対す る中毒状態は、このメカニズムを介して調節される。 本発明の１つの目的は、μレセプターの構造的活性化を防止または回復させる 化合物の研究において、中毒状態の調節を検出または測定する手段を提供し、さ らに、μレセプターの構造的に活性な状態に対する被検物の作用に関して、それ ら被検物を分類することである。 本発明の他の目的は、麻酔性鎮痛剤に常習癖を有するか、もしくは過剰量の麻 酔性鎮痛剤を服用した患者、または疼痛が麻酔性鎮痛剤で緩和される患者を治療 する方法である。本発明の治療方法は、通常オピオイドμレセプターの構造的活 性化に所望の作用を有する薬剤の選択を伴う。これら所望の作用は、本発明のア ッセーによって知ることができる。 したがって、本発明の実施によって、麻酔性鎮痛剤の臨床的利用性が大いに高 められ、さらに、違法な薬剤使用に対する戦いにおいて効果的な医薬的武器とし て役立つことが期待される。図面の簡単な説明 図１は、耐性依存状態を理解するために有用な関係を示す模式図である。好ましい実施例の詳細な説明 本発明の１つの目的は、構造的に活性なレセプターに対する被検化合物の作用 を知るために、μレセプター活性について被験化合物をスクリーニング、または 分類することである。本発明を実施するために、ｃＡＭＰに対する作用が、本発 明の１実施例ではマーカーとして使用される。 ｃＡＭＰ値の使用は、オピオイドμレセプター活性を決定する証拠として本発 明の好ましい実施例ではあるが、他の作用およびマーカーもまた有用なものとし て包含される。例えば、本発明のリガンド結合アッセースクリーニング例は、ｃ ＡＭＰアッセースクリーニングよりも速い。なぜならば、リガンド結合スクリー ニングは、構造的に活性化されたμレセプター部位へのそれらの親和性について 多数の化合物を迅速に検査することができるからである。 オピオイドμレセプター活性についての証明としてｃＡＭＰ値を用いる場合、 図１では、構造的に活性なμレセプターは“μ＊”と表されている。すなわち、 μ＊レセプターはμオピオイドレセプターの構造的に活性な状態を示し、一方、 μレセプターは休止状態で、これは、作動薬による刺激に感受性を有する。ｃＡ ＭＰ系は、Ｇ蛋白、アデニリルシクラーゼおよび蛋白キナーゼＡを含む第二のメ ッセンジャーカスケードから成る。活性化μレセプターは、一般にｃＡＭＰ系を 抑制し、矢印の大きさは、この抑制の相対的な強さを示している。未経験状態（ 薬物に未だ曝されたことがない）では、μ＊状態の活性度は最小であり、殆どの レセプターは薬物感受性である。説明のために、モルヒネを模範作動薬として、 さらに古典的な拮抗薬（すなわちそれ自身では活性を持たないが、休止状態のμ レセプターに対する作動薬の作用を阻害する）としてナロキソン（およびＣＴＯ Ｐも（これは下記で考察する））を使用する。 麻酔性作動薬の前処置により生じる依存状態が高まりつつあるとき、ｃＡＭＰ 系の実質的アップレギュレーションが生じ、作動薬の排除に際してｃＡＭＰの定 常状態応答逸脱（オーバーシュート）（以下では“自発的ｃＡＭＰオーバーシュ ート”という）をもたらす。これと並んで、μからμ＊への緩慢な最終的変換が 生じ、それによって作動薬の作用に感受性を有する残りのμレセプターの数が減 少し、耐性を生じる。さらに、豊富なμ＊状態が増すことは、ｃＡＭＰ系のアッ プレギュレーションを代償し、正常なｃＡＭＰレベル近くを維持するために必須 である。それゆえに、耐性−依存状態の特徴は、μ＊活性の増加とｃＡＭＰのア ップレギュレーョンの結合である。ナロキソンは図１に示すように逆の作動薬と して作用する、すなわち、それはμ＊活性を阻害する。それゆえ、薬物を含まな い耐性−依存組織へのナロキソンの添加は、ｃＡＭＰオーバーシュート（本明細 書では“ナロキソンｃＡＭＰオーバーシュート”と呼ぶ）の増加をもたらす。対 照的に、ＣＴＯＰは、活性に影響を与えること無くμ＊に結合することによって 、中性または効果非発現性（ヌル）拮抗物質として活性なμ＊レセプター部位で 作用する。 本発明の実施を説明する際、構造的に活性なμレセプターをモニターする手段 と合わせてオピオイドμレセプター源（例えばｃＡＭＰ系）を、以下ではまとめ て、時に“生物学的系”と呼ぶ。ｃＡＭＰ産生に曝されるか、または組み合わさ れる好ましいオピオイドμレセプター源は、ヒト神経芽腫（ＮＢ）細胞株（ＳＫ −Ｎ−ＳＨ）およびそのサブクローンＳＨ−ＳＹ５Ｙで、両者とも豊富なμオピ オイドレセプター（細胞１個につき約５００００部位）を発現している。完全な 細胞を適切な細胞培養条件下て増殖させるとき、この細胞はｃＡＭＰを産生する であろう。本発明の目的のために有用な生物学的系の別の源は、実験動物（例え ばラットおよびマウスであるが、これらは、ヒトのオピオイドμレセプター活性 の好ましいモデルである）由来のある種の組織（例えば、ラットの青斑またはモ ルモットの回腸）が可能である。 生物学的系として完全細胞が用いられる場合は、アジュバントまたはアデニリ ルシクラーゼの刺激剤（例えばＰＧＥ、ＶＩＰ、またはフォルスコリン）を添加 し、さらに、ホスホジエステラーゼ抑制物質（例えばＩＢＭＸ）を避けることが 好ましい。細胞は、好ましくは先ず、例えば１−１０μＭのレチノイック酸で分 化させ、ｃＡＭＰ系に共役する刺激性または抑制性レセプターを強化させる。そ のような生物学的系の調製物は以下に記載されている：Yuら、J．Neurochem.，5 ，J．Pharmac．Exp．Ther.，245，350-355(1988)。 オピオイドμレセプターに富む細胞を、本発明の検査に基づいて被験組成物で 処理する場合、この被験組成物の自発的で逆作動薬誘発性のｃＡＭＰオーバーシ ュートを誘発する傾向を決定することができ、これは、常習性の代用測定として 用いることができる。逆作動薬誘発性ｃＡＭＰオーバーシュートは、構造的に活 性なレセプターが存在することを示している。 このアッセーの変形例では、細胞を麻酔性鎮痛剤で１２時間またはそれより長 く処理し、依存状態を誘発し、続いて麻酔性作動薬または拮抗剤と疑われる化合 物または化合物の混合物を、逆作動薬誘発ｃＡＭＰオーバーシュートに類似する 能力、または中等度に耐性の細胞における作動薬（例えばモルヒネ）惹起ｃＡＭ Ｐレベルの抑制に類似する能力について検査することができる。コントロール値 は、作動薬誘発オピオイドμレセプター活性の非存在下で、ｃＡＭＰ産生に対す るレセプターの作用を測定することによって決定される。 薬物を含まない作動薬前処置依存細胞におけるｃＡＭＰレベルに対する作用を 単独では持たないように見える被験化合物は、それでも、作動薬または逆作動薬 のいずれかと組み合わせて検査し、ヌル拮抗物質をつきとめるべきである。ヌル 拮抗物質（すなわち単独で投与した場合、モルヒネの作用をブロックするかまた は、モルヒネとナロキソンの両方の作用をブロックする）であることが分かった 化合物は、極端で急激な薬物中断のリスクを避けながら過剰投与量の麻酔性鎮痛 剤を治療する能力を有するか、または、長期作用を最小限にし選択的に薬物の急 性作用をブロックすることによって（例えば逆作動薬による可能な全体的μレセ プターアップレギュレーション）、さらなる薬物の使用を中止させるために役立 つかもしれない。 要約すれば、本発明の特徴の１つは、オピオイドμレセプター活性に対する作 用をスクリーニングするために有用なアッセーである。このアッセーは、ｃＡＭ Ｐ系を含むか、またはｃＡＭＰ系と組み合わせて用いることができるキットを用 いて実施できる。例えば、ＳＫ−Ｎ−ＳＨのような細胞株を用いる場合は、この 細胞株は、増殖条件下でｃＡＭＰを産生することができ、オピオイドμレセプタ ーに富んでいる。初めのｃＡＭＰ値は、作動薬誘発オピオイドμレセプター活性 の非存在下で、これらレセプターの初めの部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測 定することによって決定される。この初めのｃＡＭＰ値はコントロール値として 用いられる。第二および第三のｃＡＭＰ値もまた決定される。第二のｃＡＭＰ値 は、レセプターが構造的に活性状態にあるが、実質的には作動薬分子が存在しな いとき、レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ生産に対する作用を測定することに よって決定される。第三のｃＡＭＰ値は、レセプターが構造的に活性で、実質的 にいずれの作動薬分子も含まず、しかも逆作動薬分子を実質的にすべてのレセプ ターと結合させるために十分な量の逆作動薬が存在するとき、このレセプターの 第二の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することによって決定される。第 三のｃＡＭＰ値を決定する場合、実質的に全てのレセプターに逆作動薬分子を結 合させるために適切な高濃度を用い、最大の作用を得ることが好ましい（例えば 最大のｃＡＭＰオーバーシュート）。 第二のｃＡＭＰ値と第三のｃＡＭＰ値との間の差異は、レセプターの活性を示 す。作動薬が“実質的に存在しない”（第二および第三のｃＡＭＰ値を決定する 場合）ということは、ほぼ最大の作用を与える投与量で前処置した後、全作動薬 の約１％未満が残存し、その結果反応曲線では作用が測定不可能であることを意 味する。排除されたか否かの決定には、ラジオイムノアッセーを用いるか、また は洗浄水で未投薬細胞を曝し、さらに作用が存在するか否かをバイオアッセーに よって決定する方法でこの洗浄水を調べてもよい。作動薬が１μＭのモルヒネの ならば、典型的には細胞を注意深く３回洗浄することによって実質的な除去は達 成される。インビボでこのアッセーを実施する場合は、組織を取り出し、薄く切 り水浴で洗浄する。 種々のアッセーによって、薬理学的な効能に影響を与えること無く、構造的に 活性なμレセプターを防止または減少させる被験組成物の検査が可能になる。そ のような薬剤は、麻酔性作動薬のインキュベーション（保温）中に（構造的に活 性な状態を生成するため）、または麻酔性作動薬の除去後にオピオイドμレセプ ターに添加して、逆作動薬によって誘発されるオーバーシュートがより迅速に逆 転できるか否かを検査することができる。この種類の被験化合物は、構造的に活 性なレセプターの生成を防止または逆転させる能力を有し、したがって、（麻酔 性鎮痛剤とともに治療として用いた場合）麻酔性鎮痛剤の常習性を抑制する能力 をもつか、または単独で麻酔薬中毒の治療薬として有用であるかもしれない。そ のような化合物のいくつか（Ｈ７、Ｈ９およびＨＡ−１００４）をこの提唱スク リーニングによって同定した。さらに、Ｈ７（１−（５−イソキノリンスルフォ ニル）−２−メチルピペラジンジヒドロクロリド）は、モルヒネ注射マウスの耐 性依存状態を本来の状態に逆転させることが示され、この種類の化合物の治療的 有効性が明らかになった。 最近得られた証拠は、構造的に活性なμレセプター状態は、Ｇ蛋白共役レセプ ターキナーゼ（ＧＲＫ）類に属するキナーゼによるμレセプターの燐酸化によっ て形成されることを提唱する。したがって、Ｈ７およびそのような他の化合物は 、おそらく他の可能な治療用途としてＧＲＫ抑制物質として使用できるであろう 。さらにまた、構造的に活性なμレセプター状態の形成を防止し、および／また は逆転させる薬剤のまた別のスクリーニング方法として、ＧＲＫについての標準 的な酵素活性分析、例えばチェンとその共同研究者らによって記載された方法が ある（Chenら、J．Biol．Chem.，268:7825-7831(1993)）。 細胞膜が所望の生物学的系の源である場合は、典型的には上記と同じまたは同 様な前処置を用いることができるが、インビトロで細胞膜を用いてｃＡＭＰアッ セーを実施することになろう。 一般に本発明の実施は、オピオイドμレセプターに対する作用、例えばオピオ イドμレセプター活性を有する被験化合物が、構造的に活性なμレセプターと反 応するか否か、または被験化合物が、構造的に活性なμレセプター状態を防止ま たは逆転させるか否かを決定するために有用である。本発明の実施は、完全な逆 作動薬、部分的な逆作動薬または部分的な作動薬のようにリガンドの分類を可能 にする。さらに、被験化合物がヌル（または中性）拮抗剤であるか否かを決定す ることができる。 “完全な逆作動薬”とは、構造的に活性なμレセプター状態の作用を完全に抑 制する薬剤を意味する。 “部分的な逆作動薬”とは、最大投与量で構造的に活性なμレセプター状態の 作用を部分的に抑制する薬剤を意味する。 “部分的な拮抗剤”とは、最大投与量で休止状態の、薬物感受性μレセプター 状態の部分的な活性化を引き起こす。 “ヌル、または中性拮抗剤”とは、その活性に変化を生じること無くレセプタ ーに単に結合する化合物を意味する。ヌル拮抗物質は、休止状態の、薬物感受性 μレセプター状態、または構造的に活性なμレセプター状態、または両方の状態 に選択的に結合するかもしれない 例えば本発明のアッセーを用いて一旦薬剤を分類すると、薬物中毒を治療する ための最適な特性が、標準的なインビボの動物実験で得られる。 以下でさらに詳しく述べるように、これらの分類は、被験化合物または組成物 のｃＡＭＰ作用を比較する対照点としてある種のｃＡＭＰ値を決定することによ って実施することができる。すなわち、前述の第一、第二および第三のｃＡＭＰ 値が、被験化合物または組成物を分類するために用いられる。 レセプターは作動薬の非存在下で一定の最小基本活性を示し、さらに、作動薬 に曝すことによって通常脱感作が生じ（例えば燐酸化によって）、したがって薬 剤に対する耐性が生じる。しかしながら、本明細書では、神経伝達物質レセプタ ーを作動薬に曝すことによって構造的活性化がもたらされる（これはもはや作動 薬の存在に左右されない）ということが提唱される。麻酔剤の抑制的な影響を代 償するためにｃＡＭＰ系はアップレギュレーションを生じるので、μレセプター の構造的活性化が増加する（すなわちもはや作動薬を必要としない）。したがっ て、μ＊レセプターと強化ｃＡＭＰ系は互いに均衡を保つ。このタイプの活性化 はμオピオイドレセプターとともに生じると仮定すると、多くの耐性および依存 現象の説明がつく。 レセプターが構造的に活性な場合では、残存する不活性なレセプターをさらに 刺激する作動薬と、この活性化レセプターを不活性な基本状態に回復させる“作 動薬とは区別される。１例はベンゾジアゼピンレセプターであるが、この場合、 作動薬は抗不安薬で、一方逆作動薬は不安誘発的である。依存状態で構造的活性 化μレセプターに応用された場合、逆作動薬は、活性なμ＊レセプター状態を基 本状態に逆転させることによって、逆作動薬はｃＡＭＰレベルを高めるであろう と予想される。以下でさらに考察するように、ナロキソンは実際そのような逆作 動薬であり、一方それはまた、休止状態の、薬物感受性μレセプター状態の古典 的拮抗物質である。 したがって、例えば、モルヒネによる刺激に際してＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞のμオ ピオイドレセプターは、徐々に構造的に活性なμ＊形に変換されるが、この形は はもはや作動薬の存在によって影響を受けない。完全な依存状態において最大の 構造的活性化が期待される。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を１μＭのモルヒネで１２−４ ８時間前処置し、続いて薬物を完全に除去した後、ナロキソンはＰＧＥ1刺激ｃ ＡＭＰの蓄積を顕著に高め、一方２０分またはそれ未満の時間しかモルヒネ処理 を施さなかった細胞では増加は認められず、減少すら観察される。したがって、 ナロキソンは、構造的に活性化されたμオピオイドレセプターでは逆作動薬とし て作用する（ＥＣ５０〜３ｎＭ）。これらの結果は、実験動物でモルヒネの依存 が増加するにつれ、禁断症状を誘発するために必要なナロキソンの投与量は、活 性μ＊状態の増加のために極めて減少するという観察と一致する。 ｃＡＭＰ系と構造的に活性なμレセプターのアップレギュレーションにつれて 、活性化されるべき残存するレセプターは少なくなるので、麻酔性作動薬に対す る耐性が予想される。さらに、逆作動薬が作用することができるより多くの活性 化レセプターが存在するので、より少い投与量のナロキソンで急激な薬物の使用 中止が期待できるであろう。つまり、活性化μレセプター状態の衰退は、体内か らの薬物除去速度よりむしろ、禁断症状の時間経過を指令するであろう。禁断症 状のピーク後に残存する構造的レセプター活性によって、長期間に亙る明らかな 禁断症状システムを誘発するナロキソンの持続的な活性を説明できる。 そのような構造的に活性なμオピオイドレセプターメカニズムは、麻酔薬中毒 の現在の仮定の範囲を越え、このメカニズムは、構造的活性化を防止または逆転 させるか、または、ヌル拮抗剤もしくは部分的逆作動薬の適切な特徴を示すこと によって（依存状態を持続させることなく、また過剰な禁断症状を引き起こすこ ともなく継続的に薬物に曝すことを制限して）、薬物使用中止を促進させる薬剤 の発見にそれ自体役立つ。したがって、混合作動薬−拮抗剤または部分的作動薬 麻酔薬として先に分類された化合物は、麻酔薬中毒を治療するために潜在的な有 効性をもつ部分的逆作動作用を示すかもしれない。構造的に活性なレセプター状 態の調節に寄与するメカニズムを知ることは、個々の薬物の依存傾向の診断用検 査に役立つであろう。 麻酔薬の依存状態を確立し持続させる推進力の説明となる強制メカニズムは以 前には提唱されていなかった。このプロセスにおけるμレセプターのための重要 な役割は長い間推測されてはきたが、実験結果は、顕著な変化を示すことはでき なかった。構造的活性化過程はそれ自体、抗常習性薬剤をスクリーニングし、麻 酔薬依存性の分子メカニズムを探索するために役立つので、本発明の実施によっ て、麻酔薬の有用な活性を望ましくない長期的作用から分離するという新規なア プローチの提供が期待される。 先に記載したように、本発明のアッセーを実施するための用いられる生物学的 系は、例えば細胞を１２時間またはそれ以上麻酔性鎮痛剤で処理することによっ て前処置して、依存状態を誘発することができる。選択される特定の細胞保温お よび前処置条件は、表１に要約するようにｃＡＭＰ測定と処置とのいくつかの関 係につれて変動するであろう。 表１に提唱するように、洗浄工程の後およびｃＡＭＰアッセーの前（ＰＧＥ1） に、約２時間以内の回復保温工程（ここでは薬物は存在しない）が用いられ、そ の間に構造的に活性なμレセプター状態の逆転について検査できる。 表１について、“第一のｃＡＭＰ値”、“第二のｃＡＭＰ値”および“第三の ｃＡＭＰ値”の用語は前述のように、“第一のｃＡＭＰ値”は未処置の細胞のコ ントロール値で、“第二のｃＡＭＰ値”は自発的なｃＡＭＰオーバーシュートで 、回復時間が３０分またはそれ以上の場合は急激にコントロール値まで低下し、 “第三のｃＡＭＰ値”は自発的ｃＡＭＰオーバーシュートを越えるナロキソンオ ーバーシュートで、これは構造的に活性なμ＊状態を表す。この“第三のｃＡＭ Ｐ値”は、回復保温が実施される場合は少なくとも２時間上昇したままである。 本発明の実施については、μレセプターの構造的活性化を防止する代表的化合 物の同定を可能にすることによってその有用性は既に証明され、またそれは、ヌ ル拮抗剤の同定にも役立った。 本発明の別の特徴は、過剰量の麻酔性鎮痛剤を服用したと疑われる患者を治療 する方法である。したがって、疑われる麻酔性鎮痛剤に対してヌル拮抗剤である と決定された薬剤が選択される。このヌル拮抗剤は、好ましくは本発明のアッセ ーを用いることによって決定されているであろう。 実施例２に示すように、したがってヌル拮抗剤の決定によって、疑われる麻酔 性鎮痛剤に対して選択されたヌル拮抗剤を医薬的に有効な量で投与することがで きる。これは、好ましくは、投与される用量は、麻酔剤の過剰投与の治療におい てまたは禁断症状の治療開始時に、中毒患者において重篤な禁断症状を誘発する こと無く麻酔性鎮痛剤作用を阻害するために有効であることを示している。この ことは、典型的には過剰量の麻酔性鎮痛剤を投与されていると疑われる患者にナ ロキソンが投与されている場合（患者は即座に重篤な禁断症状を呈する）に、本 発明を実施するについての利点である。 ヌル拮抗剤であると決定された薬剤の医薬的に有効な量は、確立されたいずれ かの臨床的疼痛モデルにおける無痛覚阻害のドースレスポンス曲線と安全な投与 量を確立することによって臨床的に容易に決定できるであろう。ゲッ歯類の動物 モデルにおける無痛覚は、尾部打撃法（D'Amour & Smith，J．Pharmac．Exp．Th er.，72:74-79(1941)；Tulunay & Takemoriによって改変（J．Pharmac．Exp．Th er.，190:395-400(1974)、この文献は両方とも参照により本明細書に含まれる） によって容易に測定できる。ＥＤ50値、その９５％信頼限界および２つのＥＤ50 値間の有効比の有意差は、リッチフィールドとウィルコクソンの方法（Litchfie ld & Wilcoxon J．Pharmac．Exp．Ther.，96:99-113(1949)、この文献は参照に より本明細書に含まれる）によって決定できる。 本発明の別の特徴は、患者の疼痛を処置する治療方法である。本発明のこの特 徴では、オピオイドμレセプターの構造的活性化を防止、および／またはオピオ イドμレセプターの構造的活性化を逆転させる薬剤が決定される。この決定は、 好ましくは、実施例１で記載し例証したように実施される。続いて薬剤を選択し 、治療的に有効な量、例えば疼痛解除量の麻酔性鎮痛剤と組み合わせて投与され る。すなわち、本発明の特徴は、麻酔性鎮痛剤の臨床使用を増やすことである。 なぜならば、選択された薬剤は、急性作用を阻害すること無く麻酔性鎮痛剤の長 期的な麻酔作用を防止することができるからである。 また別に、構造的μ＊レセプター活性化を逆転させることが示された薬剤は、 麻酔剤中毒の患者の治療に用いられる。この薬剤はしたがって、依存状態の推進 力を除去し、それによって麻酔剤中毒を効果的に治療できるであろう。選択を決 定された薬剤の治療的に有効な量は、薬剤による前処置によってその後のナロキ ソン誘発禁断症状が阻害される、麻酔性鎮痛剤のドース−レスポンス曲線から確 認できる。 本発明の特徴は、さらに具体例によってこれから詳述するが、これらは本発明 を例証するもので、限定することを目的とするものではない。 実施例１ レセプター活性は、一般に燐酸化によって調節されているので、構造的に活性 なμレセプター状態の形成を防止し逆転させるいくつかの既知の蛋白キナーゼ抑 制物質の活性について、以下のように本発明にしたがって調べた。 被験化合物（１０−１００μＭ）をまず、１μＭのモルヒネと共にまたは単独 （コントロール）でＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞と１２時間の前処置時間保温し、その後 洗浄し、回復期間を設けず、さらにｃＡＭＰアッセー（表１参照）を実施し３種 のｃＡＭＰ値を確立し、それによって自発的、およびナロキソン誘発ｃＡＭＰオ ーバーシュートを決定する。第二の実験系では、被験化合物（１０−１００μＭ ）を３０分または２時間の回復期間中に培養液に添加した。最初の実験系は、ナ ロキソンｃＡＭＰオーバーシュートを防止する（すなわち、活性μ＊状態の形成 の防止）薬剤を同定するためにデザインされ、一方、第二の実験系は、短時間で 構造的μレセプター活性を逆転させる薬剤を同定するためにデザインされた。 調べた化合物の内で、Ｈ７（１−（５−イソ−キノリンスルフォニル）−２− メチルピペラジンジヒドロクロリド（１０および１００μＭ）は、モルヒネ前処 置とともに１２時間添加され、その後モルヒネとＨ７薬剤の両方を完全に除去し たとき、ナロキソンのｃＡＭＰオーバーシュートを停止させる。対照的に、Ｈ７ による１２時間の前処置は、モルヒネによるｃＡＭＰレベルの急性抑制を防ぐこ とはなかった。これは、Ｈ７は、休止μレセプター状態の作動薬誘発活性化に干 渉しないことを示している。さらに、１２時間のモルヒネ前処置時間後直ちに（ ３０−１２０分の回復期間中に）添加したときは、Ｈ７は完全にナロキソンｃＡ ＭＰオーバーシュートを逆転させた。すなわち、それは、構造的に活性なμ＊状 態を休止μ状態に逆転させた。構造的に活性なμレセプター状態の形成を防止で きる蛋白キナーゼ抑制物質として同定された他の化合物は、Ｈ９（Ｎ−（２−ア ミノエチル）−５−イソキノリンスルフォンアミドジヒドロクロリド）およびＨ Ａ−１００４（Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルフォンア ミドヒドロクロリド）である。この種類の化合物はまたＧＲＫ抑制物質であるこ とが示唆されるので、別のスクリーニング方法は、ＧＲＫについての標準的酵素 活性分析である（Chenら、J．Biol．Chem.，268:7825-7831(1993)）。 Ｈ７は、ＰＫＡおよびＰＫＣを含むいくつかの蛋白キナーゼを抑制することが 知られている。Ｈ７は、構造的に活性なμレセプター状態の形成に寄与しないこ とによって、急性作用を阻害すること無く、長期的な麻酔作用を防止、および逆 転させることができる種類の化合物の代表である。このタイプの化合物は、麻酔 性鎮痛剤の臨床使用を増やし、さらに麻酔剤中毒を治療するために有用である。 実施例２ 本発明のスクリーニングを実施する別の目的は、構造的に活性なμオピオイド レセプター状態を逆転させる能力をもたないオピオイドヌル拮抗剤をつきとめる ことである。ナロキソンはμオピオイド拮抗物質（すなわちμレセプターの活性 化を阻害する）と考えられるが、一方、本明細書で定義され（すなわち、構造的 に活性なレセプターを遮断する）、さらに以前に詳述したようにそれはまた逆作 動薬でもある。したがって、重篤で即座の禁断症状を引き起こす能力は高い。 １μＭのモルヒネで１２時間前処置したＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を用いて、ＣＴＯ Ｐ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈ ｒ−ＮＨ2）（１μＭ）は、μレセプター状態の構造的活性を逆転させない（す なわち、それはナロキソンｃＡＭＰオーバーシュートを引き起こさない）ことが 分かった。一方、それは、モルヒネの急性作用を完全に阻害することが以前に知 られていた。本発明のｃＡＭＰアッセー系では、今やそのような化合物は、休止 μレセプター状態での拮抗剤から予想されたようにモルヒネの急性作用を阻害す ることが分かったが、またナロキソンの逆作動薬作用も阻害するであろう。 本発明のアッセーでＣＴＯＰのこれらの特性についてテストするために、ＳＫ −Ｎ−ＳＨ細胞を１μＭのモルヒネ（またはコントロールとしては薬剤なし）で １２時間前処置し第一および第二のｃＡＭＰ値を確定した（ｃＡＭＰアッセー（ 表１参照）の前の回復時間なし）。続いてナロキソンをＣＴＯＰ（１−１０μＭ ）で置き換え、第三のｃＡＭＰ値を決定した。第二および第三のｃＡＭＰ値は異 ならなかったので、ＣＴＯＰは、ナロキソンのようには逆作動薬として作用しな い。ＣＴＯＰがナロキソンの作用を阻害するか否かをテストするために、ＣＴＯ Ｐ（１−１０μＭ）およびナロキソン（０．１−１μＭ）をまとめてｃＡＭＰア ッセーに添加した。ナロキソンｃＡＭＰオーバーシュートの逆転によって、活性 μ＊状態において中性（ヌル）拮抗剤として作用することが示された。さらに、 ＣＴＯＰ（１−１０μＭ）はまた、モルヒネ（１μＭ）によって引き起こされた ｃＡＭＰレベルの低下を逆転させたが、このことによって、ＣＴＯＰは休止μ状 態で拮抗物質として作用することが確認される。同様な結果はＣＴＯＰ類似体Ｃ ＴＡＰ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ2）およびナロルフィンで得られた。 選択的μ拮抗剤ＣＴＯＰ（ナロキソンとは完全に異なる）は、したがってμレ セプターのヌル拮抗物質の模範例で、構造的に活性なμレセプター状態に対して 作用をもたない。そのようなヌル拮抗物質のあり得べき使用には２つの要素があ る。第一に、それは、麻酔剤の過剰投与と対抗するために臨床的に投与される拮 抗物質として作用することができ、重篤な即時禁断症状が避けられるというナロ キソンを越える利点を持つ（禁断症状は、構造的μレセプター活性の逆転に強く 起因すると仮定して）。第二に、ヌル拮抗物質は、依存状態の悪循環を遮断する ために例えばＨ７のような化合物と組み合わせて、麻酔剤中毒治療または治療の 誘発に有用である。 もう一度図１について言えば、ペプチドμオピオイド拮抗物質ＣＴＯＰは、こ こではヌルまたは中性拮抗剤としてμ＊レセプターで作用することが示されてい る。したがって、ＣＴＯＰは作動薬モルヒネの作用をμ状態で阻害するだけでな く、活性化μ＊状態で逆作動薬ナロキソン作用をも阻害する。中性拮抗物質の治 療的可能性は、モルヒネ依存マウスで引き起こされる禁断症状は極めてわずかで あり、さらにナロキサン誘発禁断症状も減少することを示す実験によって明らか にされる。 本発明のまた別の応用は、自家制限性最大活性をもつ麻酔薬をつきとめること である。幾つかの麻酔剤は、ベル型のドースレスポンス曲線を示す。これらの薬 剤は、中間の投与量レベルで最大の作用を表し、それより高い投与量ではその作 用は逆転する。オピオイド薬剤のこの態様メカニズムは未だ分かっていない。μ レセプターの部分的作動薬はまた、高い投与量では構造的に活性化されたμレセ プターで逆作動薬としても作用し、それによってそれ自身の作用を阻害する。作 動薬の能力と逆作動薬の特性とは、十分な急性作用が得られ、さらに呼吸抑制に 関連する最大の作用が弱くなるようにバランスさせる必要がある。 安全な鎮痛剤としての目的化合物は、十分な能力をもち、さらに最大反応と呼 吸抑制のような副作用を制限する構造的に活性なμレセプターでの有効性をもつ μ（部分的）作動薬である。ブプレノルフィン（臨床的に用いられている鎮痛剤 ）は、そのような化合物の模範例であるが、その自家制限性特性は、呼吸抑制と 中毒傾向を防止するには不十分である。この態様で識別される、構造的に活性な μレセプターで作用するヌル拮抗物質のみが、通常の作動薬と組み合わせてピー ク効果を最小限にし、または作用時間を制限するために役立つ。 先に記載したように、本発明を実施する場合はオピオイドμレセプターでの作 用の単独インジケーターとしてｃＡＭＰ系を用いる必要はない。3Ｈ標識オピオ イドトレーサーを使用し本発明の特徴のリガンド結合アッセーによって、構造的 に活性なμレセプターに結合する能力をもつ薬剤のスクリーニングを迅速に実施 することができる。麻酔性作動薬（例えばモルヒネ、ＤＡＭＧＥ）は、構造的に 活性なμレセプターに極めて低い親和性をもち、さらに不活性なμレセプターを 遮断する分析用手段として役立ち、したがって、μ＊状態が劇的に増加している ことが示されている耐性−依存組織において、例えば3Ｈ−ナロキソンまたは3Ｈ −ＣＴＯＰで構造的に活性なμ部位を選択的に標識することが可能である。した がって、本発明のリガンド結合アッセーは、複数のオピオイドレセプター（その うちの少なくとも幾つか（好ましくは大半）は構造的に活性状態である）を提供 することを含む。不活性ないずれのレセプターも麻酔性作動薬で遮断されている 。このレセプターは、十分な濃度で十分な時間麻酔性鎮痛剤で処置されるときに 、構造的に活性な状態で提供される。不活性なレセプターのいずれも麻酔性拮抗 剤で遮断される。したがって、この構造的に活性なμ部位は、例えば放射性原子 （好ましくはトリチウム標識オピオイドトレーサー）で選択的に標識できる。続 いて、レセプターを被験化合物に曝したとき、この被験化合物が選択的に標識レ セプターに結合するか否かを決定できる。例えば放射性トレーサーによる選択 的標識は、好ましくは約２０℃−３７℃の温度範囲内で保温することによって達 成できる。したがって、被験化合物を加える場合は、通常の競合結合アッセーは 結合親和性を求めるために実施できる。そのようなリガンド結合アッセースクリ ーニングは、多数の被験化合物の構造的に活性なμ部位への親和性をテストする 場合は、ｃＡＭＰアッセースクリーニングよりも迅速である。 実施例３ 麻酔剤耐性および依存性の提唱されているモデルは一般的な現象であり、μオ ピオイドレセプターを含む全ての組織に適用できるはずである。モルモット−ブ タ回腸は、最も広く使用されているインビトロ組織調製物の１つであるが、この 場合、麻酔性作動薬は、機能的終末点として電気的に誘発される痙攣を抑制する 。（モルヒネを完全に除去した後）ナロキソン誘発痙攣を特徴とする依存状態を 発生させるためには、モルヒネに極めて短時間（〜５分）曝せば十分である。こ のナロキソン誘発痙攣反応は、モルヒネ前処置ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるナロ キソンｃＡＭＰオーバーシュート と同等物である。 モルモット−ブタ回腸をキナーゼ抑制物質と中性拮抗物質の作用をテストする ために用いた。μ＊形成の提唱メカニズムから予想されるように、Ｈ７および幾 つかの類似体（Ｈ９、ＨＡ−１００４、Ｈ８）による処置はナロキソン誘発痙攣 を強く抑制したが、これはμ＊形成の防止を示唆している。さらに、提唱された 、中性μレセプター拮抗物質ＣＴＯＰは依存状態のモルモット−ブタ回腸で痙攣 を生じなかったが、ナロキソン誘発痙攣は抑制した。これらの結果は、ＳＨ−Ｓ Ｙ５Ｙ細胞におけるこれらの化合物の反応態様から全て予想されたことであるが 、これは、μレセプターの構造的活性化は依存状態に必須であるという考え方の 強力な証明を提供するものである。さらに、モルモット−ブタ回腸またはマウス 精管のような器官組織はまた、抗常習性薬剤（例えばキナーゼ抑制剤および中性 拮抗物質）をスクリーニングするために適切である。 実施例４ 最近、いくつかの研究室でμレセプター遺伝子がクローニングされた（例えば 、Chenら、Molec．Pharmacolo.，44:8-12(1993)）。我々は、抗常習性薬剤のス クリーニングに使用するためにより簡便で明瞭なμ＊活性検出用に、μ遺伝子を Ｕ ２９３細胞（Ｕ２９３−μ〜１０6部位／細胞）に安定的に核酸感染させた。モ ルヒネ前処置と薬剤の洗浄は、Ｓｈ−ＳＹ５Ｙ細胞について記載したものと同じ であった。この場合のｃＡＭＰ蓄積の刺激は、１０μＭのフォルスコリン１０分 処理で最も良く施された。これらの条件下では、モルヒネ前処置の後、測定可能 な自発的ｃＡＭＰオーバーシュートがあったが、しかしながら、１−１０μＭの ナロキソン添加は、ｃＡＭＰレベルにおける極めて大きな新たな増加をもたらし た（５００−６００％≡ナロキソンｃＡＭＰオーバーシュート）。このことは、 ｃＡＭＰレベルを抑制する実質的なμ＊活性の存在を示唆している。これらの結 果は、麻酔剤耐性−依存状態は、核酸感染非ニューロン性細胞において再生する ことができることを示している。したがって、これは、抗常習性薬剤を同定する有望なスクリーニング方法として役立つであろう。 好ましい実施例とともに上記に本発明を詳述したが、実施例の記述は説明を意 図したものであって本発明の範囲を制限するためではないことは理解されよう。 本発明の範囲は、添付の請求の範囲によって明らかにされる。Detailed Description of the Invention   Compositions and methods and treatments for anti-addictive anesthetic analgesic activity screening Field of the invention   The present invention relates generally to screening for pharmacological activity of anesthetics, and more specifically , An assay useful for classifying the anesthetic activity of compounds, and such an assay. Related to treatment with an anti-addictive drug.Background of the Invention   Endogenous opiate receptor was discovered in the 1970s and certain drugs were addicted Research has been enthusiastically conducted to clarify the mechanism that causes sex. Only While Nestler's 1992 on the molecular mechanism of drug addiction In a general introduction to He said that such a mechanism is not yet understood. (J. Neurosci., 12 (7), 2439-2450, 1992).   A number of different types of opioid receptors have been identified. Above all, The known receptor type is the opioid μ receptor.   Narcotic analgesics act on opioid μ receptors and cause analgesia. However Continued use of narcotic analgesics typically results in addiction or addiction while , Using one of them produces cross-resistance / dependence on the other. Despite their use as a treatment, patients As resistance increases, doses may need to be increased to achieve pain relief. Is required. Subsequent unwanted side effects, such as physical dependence Tend.   Examples of narcotic analgesics are, for example, the various alkaloids of opium (eg morphine). ), Morphine salts (eg, morphine hydrobromide, morphine hydrochloride, morphine mucinate) , Morphine oleate and morphine sulfate) and morphine analogues (normorphine Ne, diacetyldihydromorphine, codeine and diacetylmorphine (heroin )). Other widely used narcotic analgesics include methadone and meperidi , Levorphanol, propoxyphene, fentanyl, oxymorphone, a Includes nirelidine, methopone and pentazocine.   Before investigating the analgesic properties of medicines in humans, first the small rodents and / or monkeys The fact that experiments should be carried out in Since required, the agonistic action and dependence-inducing properties of narcotic analgesics have been Other various mammalian species are possible and are currently being studied. Less than human Drugs with morphine-like properties in mammals outside have been found to be morphine-like in humans. won. Moreover, it is widely accepted that it is possible to foresee its effects in humans. Various analgesic assays have been developed using animals. Long term exposure to anesthetics Biochemical changes that occur when the target tissue (such as rat locus coeruleus (LC), Is a preferred model of opiate formulation dependence). Shi Therefore, in the habitual opiate treatment, LC neurons produce acute opiate inhibition. Tolerant to use, and in parallel, by the habitual treatment, with the receptor At each major step between the physiological response and the second messenger system of cAMP Shown to result in dramatic upregulation, resulting in dependence (See, eg, Nessler page 2440).   To date, mu-opioid receptor-based assays have been used to No major changes in the system could be detected. Therefore, of the current research In many cases, events downstream of this receptor are used to explain dependence. (Eg, long-term gene regulation). Anesthetic dependence tendency is potentially Extremely limits its clinical utility as an effective analgesic, and further, the use of illegal anesthetics Prevent or restore anesthetic dependence due to heavy costs to society due to use. Drug screeni that can let or promote slow discontinuation of the drug Ning greatly enhances the clinical usefulness of narcotic analgesics and further It will serve as an effective medicinal weapon in the fight against.Summary of the invention   Exposure of opioid μ receptors to agonists results in structural structural changes A new mechanism that will be activated by For narcotic analgesics Intoxication status is regulated through this mechanism.   One object of the present invention is to prevent or restore structural activation of μ receptors. In the study of compounds, it provides a means of detecting or measuring the regulation of addiction conditions, Furthermore, regarding the effect of the analyte on the constitutively active state of the μ receptor, It is to classify the test object.   Another object of the present invention is to have addictive or excessive amounts of hemp in narcotic analgesics. Treat patients who are taking sickness painkillers or whose pain is alleviated by narcotic painkillers Is the way to do it. The therapeutic method of the present invention generally involves the structural activity of opioid μ receptors. It involves the selection of agents that have the desired effect on sexualization. These desired effects are You can know by seeing.   Therefore, the practice of the present invention greatly enhances the clinical utility of narcotic analgesics. As a medicinal weapon effective in combating illegal drug use. Expected to be useful.Brief description of the drawings   FIG. 1 is a schematic diagram showing a relationship useful for understanding the tolerance dependent state.Detailed description of the preferred embodiment   One object of the present invention is the action of test compounds on structurally active receptors. The test compound for μ receptor activity, or It is to classify. In order to carry out the present invention, the effect on cAMP is It is used as a marker in one embodiment of Ming.   The use of cAMP levels was used as evidence to determine opioid μ receptor activity. Although it is a preferred embodiment of the present invention, other effects and markers may also be useful. Included. For example, the example of the ligand binding assay screening of the present invention is c Faster than AMP assay screening. Because the ligand binding screen Ning, on their affinity for constitutively activated μ receptor sites. This is because many compounds can be tested rapidly.   When using cAMP levels as proof of opioid μ receptor activity, In FIG. 1, the constitutively active μ receptor is designated as “μ *”. That is, The μ * receptor represents the structurally active state of the μ opioid receptor, while The μ receptor is dormant, which is sensitive to stimulation by agonists. cA The MP system includes a second protein containing G protein, adenylyl cyclase and protein kinase A. It consists of the Messenger Cascade. Activated μ-receptors commonly use the cAMP system. The size of the repressed arrow indicates the relative strength of this repression. Inexperienced state ( (Not exposed to the drug), the activity in the μ * state is minimal and The receptor is drug sensitive. For the sake of explanation, morphine is used as a model agonist, A more classical antagonist (ie, it has no activity on its own, Naloxone (and CTO) that inhibits the action of agonists on receptors Also use P (which is discussed below).   CAMP when the dependence resulting from anesthetic agonist pretreatment is increasing Substantial upregulation of the system occurs, and cAMP determination upon elimination of agonist Normal state response deviation (overshoot) (hereinafter referred to as “spontaneous cAMP oversh ). Alongside this, a slow final conversion from μ to μ * Occurs, thereby reducing the number of remaining μ receptors that are sensitive to the action of the agonist. A little resistant. Furthermore, the increase in abundant μ * states means that the Essential for compensating for regulation and maintaining near normal cAMP levels Is. Therefore, the resistance-dependent characteristics are characterized by increased μ * activity and cAMP amplification. It is a combination of top-leg regulation. Naloxone is the opposite agonist as shown in Figure 1. Act, ie, it inhibits μ * activity. Therefore, do not include drugs Addition of naloxone to resistant-dependent tissues resulted in cAMP overshoot (see the present specification). (Referred to as "naloxone cAMP overshoot" in the text). versus Illustratively, CTOP binds to μ * without affecting its activity. , At the μ * receptor site that is active as a neutral or non-effect-producing (null) antagonist Works.   In describing the practice of this invention, means for monitoring constitutively active μ receptors. A summary of opioid μ receptor sources (eg cAMP systems) is provided below. Sometimes called "biological system". Exposed to or combined with cAMP production A preferred source of opioid μ receptors is the human neuroblastoma (NB) cell line (SK -N-SH) and its subclone SH-SY5Y, both of which are rich in It expresses the Oid receptor (about 50,000 sites per cell). Complete When a cell is grown under appropriate cell culture conditions, this cell produces cAMP Will. Another source of biological systems useful for the purposes of the present invention is laboratory animals (eg, For example, rat and mouse, which have human opioid μ receptor activity. Certain tissues (eg, rat locus coeruleus or moth) Lummot's ileum) is possible.   If whole cells are used as the biological system, an adjuvant or adenylyl Add stimulants of lucylase (eg PGE, VIP, or Forskolin) In addition, avoid phosphodiesterase inhibitors (eg IBMX) preferable. The cells are preferably first separated with, for example, 1-10 μM retinoic acid. And potentiates stimulatory or inhibitory receptors that are coupled to the cAMP system. So Preparations of biological systems such as are described below: Yu et al. Neurochem., 5 , J. Pharmac. Exp. Ther., 245, 350-355 (1988).   Cells rich in opioid μ receptors were tested in a test composition based on the test of the invention. When treated, this test composition was tested for spontaneous, inverse agonist-induced cAMP oversaturation. The propensity to induce mutations can be determined, which is a surrogate measure of addiction. Can be used. Inverse agonist-induced cAMP overshoot is structurally active It is shown that there is a sexual receptor.   In a variation of this assay, cells were treated with narcotic analgesics for 12 hours or longer. Compounds that induce addiction, followed by a combination of suspected narcotic agonists or antagonists. Or mixture of compounds mimics inverse agonist-induced cAMP overshoot Potency or agonist (eg morphine) -induced cAM in moderately resistant cells The ability to mimic P level suppression can be tested. Control value Responds to cAMP production in the absence of agonist-induced opioid μ receptor activity It is determined by measuring the action of the receptor.   Effect on cAMP levels in drug-free agonist pretreatment-dependent cells The test compound that does not appear to have it alone is an agonist or inverse agonist. Should be tested in combination with either of these to identify null antagonists. null Antagonists (ie, block the action of morphine when administered alone or Block the action of both morphine and naloxone) The compound was used in overdose narcotic analgesia while avoiding the risk of extreme and sudden drug interruption. It has the ability to treat the agent, or it selectively urges the drug to minimize long-term effects. By blocking sexual effects (eg possible overall μ-reduction by inverse agonists) Pter up regulation), to help stop further drug use It may be one.   In summary, one of the features of the present invention is that it acts on opioid μ receptor activity. It is a useful assay for screening. This assay is cAM For kits that include the P system or can be used in combination with the cAMP system Can be implemented. For example, when using a cell line such as SK-N-SH, The cell line is capable of producing cAMP under growth conditions, and the opioid μ receptor -Rich. Initial cAMP level is agonist-induced opioid μ receptor activity The effect of the initial portion of these receptors on cAMP production in the absence of It is decided by setting. This initial cAMP value is used as a control value Used. Second and third cAMP values are also determined. Second cAMP value Indicates that the receptor is in a structurally active state but is substantially free of agonist molecules. When measuring the effect of the second part of the receptor on cAMP production. Is determined. The third cAMP level is that the receptor is structurally active and Does not contain any agonist molecules, and the inverse agonist molecules are Of this receptor when sufficient amount of inverse agonist is present to bind It is determined by measuring the effect of the second part on cAMP production. First In determining the three cAMP levels, the inverse agonist molecule is bound to substantially all receptors. It is preferable to use a suitable high concentration to obtain the maximum effect (eg, Maximum cAMP overshoot).   The difference between the second and third cAMP values is indicative of receptor activity. You Agonist is "substantially absent" (determines second and third cAMP levels Case) means that after pretreatment with a dose that gives near-maximal effect, the total agonist Of less than about 1% of the residual amount, which means that the action cannot be measured by the reaction curve. To taste. Use radioimmunoassays to determine if they have been eliminated, Exposes untreated cells with wash water to determine if there is more activity in the bioassay. Therefore, this washing water may be examined by the method of determination. The agonist is 1 μM of morphine If so, then substantial removal is typically achieved by washing the cells carefully three times. Is made. If performing this assay in vivo, remove the tissue and cut into thin slices. Rinse in a water bath.   Structurally, various assays have been performed without affecting the pharmacological efficacy. It allows testing of test compositions that prevent or reduce active μ receptors. So Drugs such as () are (structurally active) during the incubation (incubation) of the narcotic agonist. To produce a sexual condition) or after removal of the narcotic agonist opioid μ receptor To reverse the overshoot induced by inverse agonists more quickly. You can check whether you can roll. This type of test compound is structurally active. Have the ability to prevent or reverse the production of sexual receptors, and thus Ability to suppress addictiveness of narcotic analgesics when used as a treatment with other analgesics Or may be useful alone as a remedy for anesthetic addiction. So Some of the compounds such as (H7, H9 and HA-1004) It was identified by leaning. In addition, H7 (1- (5-isoquinoline sulfo Nil) -2-Methylpiperazine dihydrochloride) is resistant to morphine injection in mice. It has been shown to reverse sex-dependent conditions to their natural state, and the therapeutic potential of this class of compounds The effectiveness has been revealed.   Recent evidence has shown that the constitutively active μ receptor state is associated with G protein-coupled receptors. By phosphorylation of the μ receptor by kinases belonging to the terkinase (GRK) family It is advocated that it is formed by. Therefore, H7 and other such compounds are Could possibly be used as a GRK inhibitor for other possible therapeutic applications . Furthermore, it prevents the formation of a constitutively active μ receptor state, and / or Is a standard for GRK as another screening method for drugs that reverse Enzymatic activity assays, such as the method described by Chen and his co-workers (Chen et al., J. Biol. Chem., 268: 7825-7831 (1993)).   When the cell membrane is the source of the desired biological system, it is typically the same as above or the same. Such pretreatments can be used, but cAMP uptake using cell membranes in vitro. I will carry out a sause.   In general, the practice of the invention is directed to actions on opioid μ receptors, such as opiods. A test compound with id μ-receptor activity did not react with the structurally active μ-receptor. Or not, or the test compound prevents the constitutively active μ receptor state. Or to determine whether or not to reverse. The practice of the invention is a complete reversal. Allows classification of ligands like agonist, partial inverse agonist or partial agonist To In addition, determine whether the test compound is a null (or neutral) antagonist Can be   A “complete inverse agonist” is one that completely suppresses the effects of the constitutively active μ receptor state. Means a controlling drug.   A “partial inverse agonist” is the maximal dose of the constitutively active μ receptor state. It means a drug that partially suppresses the action.   “Partial antagonist” means a drug-sensitive μ receptor that is dormant at maximum dose. Causes partial activation of the condition.   A "null or neutral antagonist" is a receptor that does not change its activity. Means a compound that simply binds to Null antagonists are dormant, drug-sensitive μ receptor state, or structurally active μ receptor state, or both states May selectively bind to   For example, once drugs are classified using the assay of the present invention, drug addiction is treated. The optimal properties for are obtained in standard in vivo animal studies.   As discussed in more detail below, these categories are classified as test compounds or compositions. By determining certain cAMP levels as a control point to compare the cAMP effects of Can be implemented. That is, the aforementioned first, second and third cAMP The value is used to classify the test compound or composition.   The receptor exhibits a certain minimal basal activity in the absence of agonist, and Desensitization usually results from exposure to (eg, by phosphorylation) and therefore drug Resistance to the drug develops. However, as used herein, neurotransmitter receptor Exposure to agonists results in structural activation (which is no longer active) It is advocated that it does not depend on the presence of drugs). The suppressive effects of anesthetics In order to compensate, the cAMP system produces upregulation, so the μ receptor The structural activation of is increased (ie, no longer requires agonist). Accordingly Thus, the μ * receptor and the enhanced cAMP system balance each other. This type of activation Is associated with the mu opioid receptor, many resistances and Explain the phenomenon.   When the receptor is constitutively active, the remaining inactive receptor is A stimulatory agonist and an "activator" that restores this activated receptor to its inactive basic state. Distinguished from kinetics. One example is the benzodiazepine receptor, in which case Agonists are anxiolytics, while inverse agonists are anxiety-inducing. Structural activity in dependence When applied to a modified μ receptor, an inverse agonist is based on the active μ * receptor state. Inverse agonists will increase cAMP levels by reversing to this state It is expected to be. As discussed further below, naloxone is actually such a reverse It is also a kinetic drug, while it is also a quiescent, drug-sensitive μ-receptor classical Is a competitive antagonist.   Therefore, for example, the mu of SK-N-SH cells upon stimulation with morphine The poidoid receptor is gradually converted to the structurally active μ * form, which is Is no longer affected by the presence of agonist. Maximum in full dependency Structural activation is expected. SK-N-SH cells were treated with 1 μM morphine for 12-4 After 8 hours of pretreatment followed by complete drug removal, naloxone was blocked by PGE.1Stimulation c Significantly increased AMP accumulation, while morphine treatment for 20 minutes or less No increase was observed in cells that were not treated, and even a decrease was observed. Therefore, Naloxone is an inverse agonist at the constitutively activated mu opioid receptor. Acts (EC50-3 nM). These results show that morphine dependence in experimental animals As the dose increases, the dose of naloxone required to induce withdrawal symptoms Consistent with the observation that there is a significant decrease due to increasing sex μ * status.   With the up-regulation of the cAMP system and the constitutively active μ receptor , Because there are few remaining receptors to be activated, Resistance is expected. In addition, more activity that inverse agonists can act on The use of smaller doses of naloxone for acute drug use due to the presence of derivatized receptors It can be expected to stop. In other words, is the decline of the activated μ receptor state caused by the body? They will dictate the time course of withdrawal rather than their drug removal rate. Withdrawal The structural receptor activity that remains after the eccentric peak reveals an apparent long-term Explain the persistent activity of naloxone that induces the withdrawal system.   Such a constitutively active mu opioid receptor mechanism has been linked to anesthetic poisoning. Beyond the current assumptions of, this mechanism prevents or reverses structural activation Or exhibiting the appropriate characteristics of a null antagonist or partial inverse agonist (Causes excessive withdrawal without causing addiction Drugs that facilitate withdrawal of drug use (with limited and continuous exposure to the drug) Useful for discovering itself. Thus, mixed agonist-antagonist or partial agonist Compounds previously classified as anesthetics have potential potential for treating anesthetic addiction. It may exhibit a partial inverse agonistic effect. Structurally active receptor Understanding the mechanisms that contribute to the regulation of pathology is a diagnostic test of individual drug dependence. It will be useful for inspection.   The force mechanism that accounts for the driving force that establishes and sustains the anesthetic dependence is It had not been advocated before. Important for the μ receptor in this process Although long-standing roles have been speculated for a long time, experimental results have not shown significant changes. There wasn't. The structural activation process itself screens for antiaddiction drugs and By practicing the present invention, it is useful for exploring molecular mechanisms of sickness dependence. To separate the useful activity of anesthetics from unwanted long-term effects. Proc is expected to be provided.   As described above, the biological used to carry out the assay of the present invention. The system can be used, for example, by treating cells with an anesthetic analgesic for 12 hours or more. Can be pretreated to induce dependence. The specific cell insulation to be selected And pretreatment conditions are some of the relationships between cAMP measurement and treatment as summarized in Table 1. It will fluctuate depending on the situation. As suggested in Table 1, after the washing step and before the cAMP assay (PGE1) For this, a recovery heat-retaining step (no drug is present here) within about 2 hours is used. During reversal of the constitutively active μ receptor state.   For Table 1, "first cAMP value", "second cAMP value" and "third cAMP value" As described above, the term "cAMP level" means that the "primary cAMP level" is the value of untreated cells. The control value, and the "second cAMP value" is the spontaneous cAMP overshoot. , If the recovery time is 30 minutes or more, it will rapidly drop to the control value, “Third cAMP level” is naloxone that exceeds spontaneous cAMP overshoot. Overshoot, which represents a constitutively active μ * state. This “third cAM The "P-value" remains elevated for at least 2 hours when recovery heat retention is implemented.   For the practice of the present invention, representative compounds that prevent constitutive activation of the μ receptor are It has already proved its usefulness by allowing the identification of an object, and it It also helped identify le antagonists.   Another aspect of the invention is to treat patients suspected of taking excessive amounts of narcotic analgesics. Is the way to do it. Therefore, it is a null antagonist for suspected narcotic analgesics The drug determined to be selected is selected. This null antagonist is preferably the assay of the invention. Would have been determined by using   As shown in Example 2, and thus by determination of null antagonists, suspected anesthesia It is possible to administer selected null antagonists for sexual analgesics in pharmaceutically effective amounts. Wear. This is preferably because the dose administered is in the treatment of overdose of anesthetic. Or severe withdrawal symptoms in addicted patients at the beginning of treatment of withdrawal symptoms However, it has been shown to be effective for inhibiting the action of anesthetic analgesics. this This is typical for patients suspected of receiving an overdose of narcotic analgesics. If loxone is being administered (patients immediately develop severe withdrawal symptoms) Advantages for practicing the invention.   A pharmaceutically effective amount of a drug determined to be a null antagonist may be any of the established Dose response curve and safe dosing of analgesia in some clinical pain models It could be easily determined clinically by establishing the amount. Rodent animals Analgesia in the model was measured by the tail strike method (D'Amour & Smith, J. Pharmac. Exp. Th. er., 72: 74-79 (1941); modified by Tulunay & Takemori (J. Pharmac. Exp. Th. er., 190: 395-400 (1974), both of which are incorporated herein by reference). Can be easily measured by. ED50Value, its 95% confidence limit and two EDs50 The significant difference in the effective ratio between the values can be found by the method of Litchfield and Wilcoxon (Litchfie ld & Wilcoxon J. Pharmac. Exp. Ther., 96: 99-113 (1949), this reference is for reference. More included herein).   Another feature of the invention is a therapeutic method for treating pain in a patient. This feature of the invention Indications prevent structural activation of opioid μ receptors and / or opioid Agents that reverse the structural activation of the id-mu receptor are determined. This decision It is preferably carried out as described and exemplified in Example 1. Then select the drug Administered in combination with a therapeutically effective amount, such as a pain-relieving amount of an anesthetic analgesic It Thus, a feature of the invention is to increase the clinical use of narcotic analgesics. Because the drug of choice is a long-acting analgesic drug without inhibiting its acute effects. This is because it is possible to prevent a temporary anesthetic action.   Alternatively, agents shown to reverse structural μ * receptor activation are: Used to treat patients with anesthetic poisoning. This drug therefore promotes dependence The force could be removed, thereby effectively treating anesthetic addiction. Make a choice The therapeutically effective amount of a given drug is determined by pretreatment with the drug, Dose-response curves of narcotic analgesics that inhibit Sonson-induced withdrawal symptoms I can accept it.   The features of the present invention will be described in more detail below with reference to specific examples. Are not intended to be limiting.                                   Example 1   Receptor activity is structurally active because it is generally regulated by phosphorylation Inhibition of several known protein kinases that prevent and reverse the formation of various mu receptor states The activity of the inhibitors was investigated according to the invention as follows.   The test compound (10-100 μM) was first administered with or without 1 μM morphine. (Control) incubated with SK-N-SH cells for 12 hours pretreatment time, then Washed, without recovery period, and further cAMP assay (see Table 1) 3 types Of cAMP levels of naloxone and naloxone Determine the overshoot. In the second experimental system, the test compound (10-100 μM ) Was added to the culture during the 30 minute or 2 hour recovery period. The first experimental system is Prevents roxone cAMP overshoot (ie formation of an active μ * state Prevention), while the second experimental system was designed to Designed to identify agents that reverse structural μ receptor activity.   Among the compounds investigated, H7 (1- (5-iso-quinolinesulfonyl) -2- Methylpiperazine dihydrochloride (10 and 100 μM) was added to morphine For 12 hours with complete removal of both morphine and H7 drug Stop the naloxone cAMP overshoot. In contrast, H7 Pretreatment with morphine for 12 hours prevents acute inhibition of cAMP levels by morphine. Was not. This indicates that H7 has a negative effect on agonist-induced activation of the resting μ receptor state. It shows that it does not cross. In addition, immediately after the morphine pretreatment time of 12 hours ( H7 is completely naloxone cA when added (during a recovery period of 30-120 minutes). The MP overshoot was reversed. Ie, it is a structurally active μ * -like The state was reversed to the rest μ state. Prevents the formation of structurally active μ receptor states Another compound identified as a potent protein kinase inhibitor is H9 (N- (2- Minoethyl) -5-isoquinoline sulfonamide dihydrochloride) and H A-1004 (N- (2-guanidinoethyl) -5-isoquinoline sulfone Midhydrochloride). This class of compounds should also be GRK inhibitors Another screening method is the standard enzyme for GRK. Activity assay (Chen et al., J. Biol. Chem., 268: 7825-7831 (1993)).   H7 can inhibit several protein kinases including PKA and PKC Are known. H7 does not contribute to the formation of the constitutively active μ receptor state. Prevent long-term anesthesia without adversely affecting acute effects, and reverse It is representative of the class of compounds that can be converted. This type of compound is anesthesia It is useful for increasing clinical use of sex analgesics and for treating anesthetic poisoning.                                   Example 2   Another object of practicing the screening of the present invention is the structurally active mu opioid. Identifying opioid null antagonists that do not have the ability to reverse receptor status That is. Naloxone is a mu opioid antagonist (ie, mu receptor activity). Is defined as (i.e., structural) Block the active receptors to), and it also reverses, as detailed further above. It is also a drug. Therefore, the ability to cause severe and immediate withdrawal symptoms is high.   CTO using SK-N-SH cells pretreated with 1 μM morphine for 12 hours. P (D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Th r-NH2) (1 μM) does not reverse the structural activity of the μ receptor state. That is, it does not cause naloxone cAMP overshoot) Do you get it. On the other hand, it was previously known to completely block the acute effects of morphine. It was being done. In the cAMP assay system of the present invention, such compounds are now inactive. Inhibits the acute effects of morphine as expected from antagonists in the mu receptor state However, it may also inhibit the inverse agonist action of naloxone.   To test these properties of CTOP in the assay of the present invention, SK -N-SH cells with 1 μM morphine (or no drug as control) Pretreatment for 12 hours was performed to determine the first and second cAMP levels (cAMP assay ( No recovery time before Table 1)). Subsequently, naloxone was added to CTOP (1-10 μM ) And the third cAMP value was determined. The second and third cAMP values are different CTOP does not act as an inverse agonist like naloxone. Yes. To test whether CTOP inhibits the action of naloxone, CTO P (1-10 μM) and naloxone (0.1-1 μM) were combined into cAMP amp. Added to the seed. Activated by reversing naloxone cAMP overshoot It was shown to act as a neutral (null) antagonist in the μ * state. further, CTOP (1-10 μM) was also caused by morphine (1 μM) It reversed the decrease in cAMP levels, which caused CTOP to rest in a mu-like state. In this state, it is confirmed that it acts as an antagonist. Similar results show CTOP analog C TAP (D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH 2) and obtained by nalorphine.   The selective μ antagonist CTOP (which is completely different from naloxone) therefore An example of a scepter null antagonist for the constitutively active μ receptor state It has no effect. There are two factors to the possible use of such null antagonists. It First, it is administered clinically to counter an overdose of anesthetics. Nalo, which can act as an anti-substance, avoiding severe immediate withdrawal symptoms Has an advantage over xons (withdrawal is strongly associated with reversal of structural μ receptor activity) (Assumed to be due). Second, null antagonists block the vicious cycle of dependence In combination with compounds such as H7 for the treatment of anesthetic addiction or treatment Useful for triggering.   Again referring to FIG. 1, the peptide μ opioid antagonist CTOP is It has been shown here to act at the μ * receptor as a null or neutral antagonist It Therefore, CTOP not only inhibits the action of the agonist morphine in the μ state. In addition, it also inhibits the inverse agonist naloxone action in the activated μ * state. Neutral antagonist cure The therapeutic potential is that withdrawal symptoms caused by morphine-dependent mice are extremely small. Yes, and further revealed by experiments showing reduced naloxane-induced withdrawal symptoms To be   Another application of the invention is to locate anesthetics with maximal self-limiting activity. Is. Some anesthetics exhibit a bell-shaped dose response curve. These drugs The agent exhibits maximal effects at intermediate dose levels, and at higher doses it produces its effect. Use reverses. The mechanism of this mode of opioid drug remains unknown. μ Partial agonists of the receptor also show that at higher doses, the μ-receptor that is constitutively activated. It also acts as an inverse agonist in putters, thereby inhibiting its own action. Product The ability of the kinetic drug and the characteristics of the inverse agonist provide a sufficient acute effect and further suppress respiratory function. It must be balanced so that the maximum action involved is weakened.   The target compound as a safe analgesic has sufficient capacity and is called maximal response. Has efficacy at the constitutively active μ receptor that limits side effects such as anti-resorptive It is a μ (partial) agonist. Buprenorphine (a clinically used analgesic ) Is an example of such a compound, whose self-restricting properties are Insufficient to prevent addiction tendency. Structurally active, identified in this manner Only null antagonists that act at the μ-receptor, in combination with normal agonists, Helps to minimize the effect or limit the duration of action.   As described above, when practicing the present invention, opioid μ receptor activation is used. It is not necessary to use the cAMP system as the sole indicator for.3H labeled opio By using the ligand binding assay of the present invention using an id tracer, the structural Rapid screening of drugs that have the ability to bind to active mu receptor can do. Narcotic agonists (eg morphine, DAMGE) are structurally It has an extremely low affinity for the active μ receptor, and the inactive μ receptor Serves as an analytical tool to shut off, thus dramatically increasing the μ * state In resistance-dependent tissues that have been shown to3H-naloxone or3H It is possible to selectively label the constitutively active μ-site with -CTOP. did Therefore, the ligand-binding assay of the present invention is a combination of multiple opioid receptors (the Provide at least some (preferably most) of them are structurally active Including doing. All inactive receptors are blocked by narcotic agonists . This receptor, when treated with anesthetic analgesics at sufficient concentration for sufficient time , Provided in a structurally active state. Anesthesia antagonism for all inactive receptors Blocked by the agent. Thus, this structurally active μ site is, for example, a radioactive atom. (Preferably tritium-labeled opioid tracer) can be used for selective labeling. Continued And the receptor is exposed to a test compound, the test compound selectively Whether to bind to the scepter can be determined. Selection by eg radioactive tracer Labeling is achieved by incubation, preferably within a temperature range of about 20 ° C-37 ° C. Can be achieved. Therefore, when adding test compounds, the usual competitive binding assay This can be done to determine the binding affinity. Such a ligand binding assay Training tests the affinity of many test compounds for constitutively active μ sites. The case is faster than cAMP assay screening.                                   Example 3   The proposed model of anesthetic resistance and dependence is a common phenomenon and It should be applicable to all tissues containing pioid receptors. Guinea pig The ileum, one of the most widely used in vitro tissue preparations, In some cases, narcotic agonists suppress electrical-induced seizures as a functional endpoint . Dependent conditions characterized by naloxone-induced seizures (after complete removal of morphine) Exposure to morphine for a very short time (~ 5 minutes) is sufficient to generate it. This Naloxone-induced seizure response in morphine-pretreated SH-SY5Y cellsNARO Kison cAMP overshoot Is equivalent to.   Testing the effects of kinase inhibitors and neutral antagonists on the guinea pig-pig ileum. Used for. As expected from the proposed mechanism of μ * formation, H7 and Treatment with some analogs (H9, HA-1004, H8) resulted in naloxone-induced convulsions Were strongly suppressed, suggesting prevention of μ * formation. In addition, was proposed , A Neutral μ-Receptor Antagonist, CTOP, Has Convulsions in the Dependent Guinea Pig-Pig Ileum However, naloxone-induced convulsions were suppressed. These results are SH-S As expected from the reaction pattern of these compounds in Y5Y cells, , Which is the idea that structural activation of μ receptors is essential for dependence It provides a strong proof. In addition, guinea pig-pig ileum or mouse Organ tissues, such as the vas deferens, are also associated with anti-addictive agents (eg, kinase inhibitors and neutrals). Suitable for screening antagonists).                                   Example 4   Recently, the mu receptor gene has been cloned in several laboratories (eg Chen et al., Molec. Pharmacolo., 44: 8-12 (1993)). We are an anti-addictive drug Use the μ gene for more convenient and clear detection of μ * activity for use in cleaning. U 293 cells (U293-μ-106(Site / cell) was stably infected with nucleic acid. Mo Luhine pretreatment and drug washes are the same as described for Sh-SY5Y cells. Met. The stimulation of cAMP accumulation in this case was 10 μM forskolin for 10 min. Best applied in processing. Measurable after morphine pretreatment under these conditions WhatSpontaneous cAMP overshootThere was, however, 1-10 μM Naloxone addition results in a very large new increase in cAMP levels (500-600% ≡Naloxone cAMP overshoot). This is It suggests the existence of substantial μ * activity that suppresses cAMP levels. These conclusions Fruits, anesthetic resistance-dependent states regenerate in nucleic acid-infected non-neuronal cells It shows that you can. Therefore, this identifies an anti-addictive drugIt will serve as a promising screening method.   While the invention has been described in detail above with preferred embodiments, the description of the embodiments is intended to be illustrative. It will be understood that it is illustrative and not intended to limit the scope of the invention. The scope of the invention is defined by the appended claims.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page    (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG , CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AT, AU, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, ES, FI, G B, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, LU, LV , MG, MN, MW, NL, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SK, UA, UZ, VN

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． 多数のオピオイドμレセプター； 作動薬誘発オピオイドμレセプター活性の非存在下で、該レセプ ターの最初の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することによって決定でき る第一のｃＡＭＰ値； 構造的に活性な状態に有るが、作動薬分子を実質的に含まないと きに、該レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することに よって決定できる第二のｃＡＭＰ値； （ａ）構造的に活性な状態にあり、（ｂ）いずれの作動薬分子も 実質的に含まず、さらに（ｃ）実質的に全てのレセプターに逆作動薬分子を結合 させるに十分な量の逆作動薬の存在下で、該レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ 産生に対する作用を測定することによって決定できる第三のｃＡＭＰ値； という上記の項目を含むｃＡＭＰ系と組み合わせたとき、オピオ イドμレセプター活性に対する作用をスクリーニングするために有用なキット。 ２． 細胞増殖条件下でｃＡＭＰを産生することができ、さらにオピオ イドμレセプターを有する細胞株； 作動薬誘発オピオイドμレセプター活性の非存在下で、該レセプ ターの最初の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することによって決定でき る第一のｃＡＭＰ値； 構造的に活性な状態に有るが、作動薬分子を実質的に含まないと きに、該レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することに よって決定できる第二のｃＡＭＰ値； （ａ）構造的に活性な状態にあり、（ｂ）いずれの作動薬分子も 実質的に含まず、さらに（ｃ）実質的に全てのレセプターに逆作動薬分子を結合 させるに十分な量の逆作動薬の存在下て、該レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ 産生に対する作用を測定することによって決定できる第三のｃＡＭＰ値； という上記の項目を含むオピオイドμレセプター活性に対する作 用のスクリーニングに有用な細胞株キット。 ３． 該細胞株がＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞またはＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞である 、請求の範囲第２項のキット。 ４． 該細胞株が、μ遺伝子を安定的に核酸感染させたＵ２９３細胞で ある、請求の範囲第２項のキット。 ５． ｃＡＭＰ産生系に曝された多数のオピオイドμレセプターを提供 し； 作動薬誘発オピオイドμレセプター活性の非存在下で、該レセプ ターの最初の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することによって第一のｃ ＡＭＰ値を決定し； 構造的に活性な状態に有るが、作動薬分子を実質的に含まないと きに、該レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することに よって第二のｃＡＭＰ値を決定し； （ａ）構造的に活性な状態にあり、（ｂ）いずれの作動薬分子も 実質的に含まず、さらに（ｃ）実質的に全てのレセプターに逆作動薬分子または 被験化合物分子を結合させるに十分な量の逆作動薬または被験化合物の存在下で 、該レセプターの第二の部分のｃＡＭＰ産生に対する作用を測定することによっ て第三のｃＡＭＰ値を決定し；さらに、 該レセプターの検査部分と被験組成物とを合わせ、検査ｃＡＭＰ 値としてｃＡＭＰ産生に対するその作用を測定する； という上記の項目を含むオピオイドμレセプター活性に対する作 用をスクリーニングするために有用なアッセー。 ６． ｃＡＭＰ産生系に曝される多数のオピオイドμレセプターが、生 細胞として提供され、さらにアデニリルシクラーゼ刺激剤を含む、請求の範囲第 ５項のアッセー。 ７． 該細胞がＳＫ−Ｎ−ＳＨまたはＳＨ−ＳＹ５Ｙである、請求の範 囲第６項のアッセー。 ８． 該細胞が、μ遺伝子を安定的に核酸感染させたＵ２９３である、 請求の範囲第６項のアッセー。 ９． 該細胞が、μ遺伝子を安定的に核酸感染させたＵ２９３であり、 該アデニリルシクラーゼ刺激剤がフォルスコリンである、請求の範囲第６項のア ッセー。 １０． さらに、第一のｃＡＭＰ値、第二のｃＡＭＰ値および第三のｃ ＡＭＰ値のうち１つまたは２つ以上に対して検査ｃＡＭＰ値を比較することを含 む、請求の範囲第５項のアッセー。 １１． さらに、第一のｃＡＭＰ値、第二のｃＡＭＰ値および第三のｃ ＡＭＰ値のうち１つまたは２つ以上に対して検査ｃＡＭＰ値を比較することによ って、被験組成物を部分的作動薬、ヌル作動薬、部分的逆作動薬または完全逆作 動薬として分類することを含む、請求の範囲第５項のアッセー。 １２． 第二のｃＡＭＰ値と第三のｃＡＭＰ値との間の違いは、構造的 に活性な状態にある該レセプターの活性化を表すものである、請求の範囲第５項 のアッセー。 １３． 少なくともその幾分かは構造的に活性な状態にある多数のオピ オイドμレセプターを、麻酔性作動薬で遮断したいずれかの不活性なレセプター とともに提供し；さらに、 該構造的に活性なレセプターを選択的に標識することを含む、 オピオイドμレセプターに対する作用を決定するために有用なリガンド結合アッ セー。 １４． 該標識が放射性原子を用いて実施される、請求の範囲第１３項 のアッセー。 １５． さらに、該レセプターを被験組成物に曝すことを含む、請求の 範囲第１３項のアッセー。 １６． さらに、該被験組成物が選択的に標識されたレセプターに結合 するか否かを決定することを含む、請求の範囲第１５項のアッセー。 １７． 該遮断麻酔性作動薬がモルヒネまたはＤＡＭＧＥである、請求 の範囲第１３項のアッセー。 １８． 該オピオイドμレセプターが、麻酔性鎮痛剤とともに保温する ことによって構造的に活性化される、請求の範囲第１３項のアッセー。 １９． 該標識がトリチウムを含む化合物を用いて実施される、請求の 範囲第１４項のアッセー。 ２０． 該標識が3Ｈ−ナロキソンまたは3Ｈ−ＣＴＯＰを用いる、請求 の範囲第１９項のアッセー。 ２１． 該標識が3Ｈ−ＣＴＡＰまたは3Ｈ−Ｄ−Ｔｉｃ−ＣＴＡＰまた は3Ｈ−ナロルフィンを用いる、請求の範囲第１９項のアッセー。 ２２． 問題の麻酔性鎮痛剤に対してヌル拮抗物質であることが分かっ た薬剤を選択し；さらに 該問題の麻酔性鎮痛剤に対して選択されたヌル拮抗物質を医薬 的に有効な量で投与することを含む、過剰量の麻酔性鎮痛剤を摂取したと思われ る患者の治療方法。 ２３． 該投与量が、麻酔剤過剰投与を治療する際に重篤な禁断症状を 誘発すること無く中毒患者において麻酔性作動薬作用を遮断するために有効であ るか、または薬剤使用中止の処置を開始するために有効である、請求の範囲第２ ２項の方法。 ２４． 投与される該ヌル拮抗物質がＤ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ −Ｔｒｐ−Ｏｒｎ−Ｔｙｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ2を含む、請求の範囲第２２ 項の方法。 ２５． 該投与されるヌル拮抗物質がナロルフィンである、請求の範囲 第２２項の方法。 ２６． 該投与されるヌル拮抗物質がＣＴＡＰ（Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ− Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ2）である、請求 の範囲第２２項の方法。 ２７． 該投与されるヌル拮抗物質がＤ−Ｔｉｃ−ＣＴＡＰ（Ｄ−Ｔｉ ｃ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｐｅｎ−Ｔｈｒ−ＮＨ2） である、請求の範囲第２２項の方法。 ２８． オピオイドμレセプターの構造的活性化を防止することが分か った薬剤を選択し；さらに 疼痛解除量の麻酔性鎮痛剤と合わせて治療的に有効量の該選択 薬剤を投与することを含む、患者の疼痛を治療する方法。 ２９． 該選択薬剤が１−（５−イソキノリン−スルフォニル）−２− メチルピペラジンジヒドロクロリドであり、該麻酔性鎮痛剤がモルヒネである、 請求の範囲第２８項の治療方法。 ３０． 該選択薬剤がＨ９（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノ リンスルフォンアミドジヒドロクロリド）である、請求の範囲第２６項の治療方 法。 ３１． 該選択薬剤がＨＡ−１００４（Ｎ−（２−グアニジノエチル） −５−イソキノリンスルフォンアミドヒドロクロリド）である、請求の範囲第２ ６項の治療方法。 ３２． オピオイドμレセプターの構造的活性化を防止するか、および ／または逆転させることが分かった薬剤を選択し；さらに 該中毒患者に治療的に有効な量の該選択薬剤を投与することを 含む、麻酔剤中毒患者の治療方法。 ３３． 該選択薬剤が１−（５−イソキノリン−スルフォニル）−２− メチルピペラジンジヒドロクロリドである、請求の範囲第３２項の治療方法。 ３４． 該選択薬剤がＨ９（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノ リンスルフォンアミドジヒドロクロリド）である、請求の範囲第３２項の治療方 法。 ３５． 該選択薬剤がＨＡ−１００４（Ｎ−（２−グアニジノエチル） −５−イソキノリンスルフォンアミドヒドロクロリド）である、請求の範囲第３ ２項の治療方法。[Claims] 1. Multiple opioid μ receptors; a first cAMP value that can be determined by measuring the effect of the first portion of the receptor on cAMP production in the absence of agonist-induced opioid μ receptor activity; A second cAMP value that is present but which is substantially free of agonist molecule and can be determined by measuring the effect of the second portion of the receptor on cAMP production; (a) in a structurally active state And (b) is substantially free of any agonist molecule, and (c) is in the presence of an inverse agonist in an amount sufficient to bind the inverse agonist molecule to substantially all receptors. A third cAMP value that can be determined by measuring the effect of the second part of cAMP on the production of cAMP; Kits useful for screening action on opioid μ receptor activity. 2. A cell line capable of producing cAMP under cell growth conditions and further having an opioid μ receptor; measuring the effect of the first part of the receptor on cAMP production in the absence of agonist-induced opioid μ receptor activity. CAMP value that can be determined by; by determining the effect of a second portion of the receptor on cAMP production when in a structurally active state but substantially free of agonist molecule A second cAMP value; (a) in a structurally active state, (b) substantially free of any agonist molecule, and (c) bound an inverse agonist molecule to substantially all receptors. A third cA that can be determined by measuring the effect of the second portion of the receptor on cAMP production in the presence of an inverse agonist sufficient to cause Useful cell lines kit for screening effect that for opioid μ receptor activity, including the above-mentioned items; P value. 3. The kit according to claim 2, wherein the cell line is SK-N-SH cell or SH-SY5Y cell. 4. The kit according to claim 2, wherein the cell line is U293 cells in which the μ gene is stably nucleic acid-infected. 5. Providing a large number of opioid μ receptors exposed to the cAMP production system; a first c AMP by measuring the effect on cAMP production of the first portion of the receptor in the absence of agonist-induced opioid μ receptor activity. The second cAMP value is determined by measuring the effect of the second portion of the receptor on cAMP production when in a structurally active state but substantially free of agonist molecule. (A) in a structurally active state, (b) substantially free of any agonist molecule, and (c) substantially all receptors containing an inverse agonist molecule or test compound molecule. A third cAMP value by measuring the effect of the second portion of the receptor on cAMP production in the presence of an inverse agonist or test compound in an amount sufficient to bind. Further, it is useful for screening an effect on opioid μ receptor activity including the above-mentioned item, which comprises: determining a test part of the receptor and a test composition, and measuring its effect on cAMP production as a test cAMP value. Assay. 6. The assay of claim 5 wherein a number of opioid μ receptors exposed to the cAMP production system are provided as living cells and further comprise an adenylyl cyclase stimulator. 7. 7. The assay according to claim 6, wherein the cells are SK-N-SH or SH-SY5Y. 8. 7. The assay according to claim 6, wherein the cell is U293 which is stably nucleic acid-infected with the μ gene. 9. 7. The assay according to claim 6, wherein the cell is U293 which is stably nucleic acid-infected with the μ gene, and the adenylyl cyclase stimulant is forskolin. 10. 6. The assay of claim 5 further comprising comparing the test cAMP value to one or more of the first cAMP value, the second cAMP value and the third cAMP value. 11. Further, comparing the test cAMP value to one or more of the first cAMP value, the second cAMP value and the third cAMP value, the test composition is treated with a partial agonist, null The assay of claim 5 including classifying as an agonist, a partial inverse agonist or a full inverse agonist. 12. An assay according to claim 5 wherein the difference between the second and third cAMP values is indicative of activation of the receptor in its constitutively active state. 13. Providing multiple opioid μ receptors, at least some of which are in a constitutively active state, with any inactive receptor blocked by a narcotic agonist; and further selecting the constitutively active receptor Ligand binding assay useful for determining effects on opioid μ receptors, including selective labeling. 14. 14. The assay according to claim 13, wherein the labeling is carried out with radioactive atoms. 15. 14. The assay of claim 13 further comprising exposing the receptor to a test composition. 16. 16. The assay of claim 15, further comprising determining whether the test composition binds to the selectively labeled receptor. 17． 14. The assay according to claim 13, wherein the blocking anesthetic agonist is morphine or DAMGE. 18. 14. The assay of claim 13, wherein the opioid μ receptor is constitutively activated by incubation with an anesthetic analgesic. 19. 15. The assay according to claim 14, wherein said labeling is carried out with a compound containing tritium. 20. The label is used 3 H- naloxone or 3 H-CTOP, assay range of the 19 preceding claims. 21. The label is used 3 H-CTAP or 3 H-D-Tic-CTAP or 3 H- nalorphine, assay range of the 19 preceding claims. 22. Selecting a drug known to be a null antagonist for the anesthetic analgesic in question; further administering a null antagonist selected for the anesthetic analgesic in question in a pharmaceutically effective amount And a method of treating a patient suspected to have taken an excessive amount of narcotic analgesic. 23. The dose is effective to block anesthetic agonist action in addicted patients without inducing severe withdrawal symptoms in treating anesthetic overdose or initiate discontinuation treatment 22. The method of claim 22 which is effective for 24. The null antagonist to be administered comprises a D-Phe-Cys-Tyr- D -Trp-Orn-Tyr-Pen-Thr-NH 2, the method of paragraph 22 claims. 25. 23. The method of claim 22, wherein the null antagonist administered is nalorphine. 26. Null antagonist to be the administration is CTAP (D-Phe-Cys- Tyr -D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH 2), The method of claims 22 wherein. 27. Null antagonist to be the administration is D-Tic-CTAP (D- Ti c-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH 2), The method of claims 22 wherein. 28. Selecting a drug found to prevent structural activation of the opioid μ receptor; and further administering a therapeutically effective amount of the selected drug in combination with a pain-relieving amount of a narcotic analgesic. How to treat pain. 29. 29. The method of treatment according to claim 28, wherein the selected drug is 1- (5-isoquinoline-sulfonyl) -2-methylpiperazine dihydrochloride and the narcotic analgesic is morphine. 30. 27. The method of treatment according to claim 26, wherein the selected drug is H9 (N- (2-aminoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride). 31. 27. The method of treatment according to claim 26, wherein the selected drug is HA-1004 (N- (2-guanidinoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide hydrochloride). 32. Anesthesia comprising selecting an agent found to prevent and / or reverse the constitutive activation of opioid μ receptors; further comprising administering to said addicted patient a therapeutically effective amount of said selected agent. How to treat drug addicts. 33. 33. The method of treatment of claim 32, wherein the selected agent is 1- (5-isoquinoline-sulfonyl) -2-methylpiperazine dihydrochloride. 34. 33. The method of treatment according to claim 32, wherein the selected agent is H9 (N- (2-aminoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide dihydrochloride). 35. 33. The method of treatment of Claim 32, wherein the selected agent is HA-1004 (N- (2-guanidinoethyl) -5-isoquinolinesulfonamide hydrochloride).
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CA2164966A1 (en) 1995-01-05

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