JPH08508568A

JPH08508568A - Concentration determination by affinity titration and competitive displacement in drug delivery

Info

Publication number: JPH08508568A
Application number: JP6522341A
Authority: JP
Inventors: エム．カウヴァー、ローレンス
Original assignee: テラピンテクノロジーズ，インク．
Priority date: 1993-03-30
Filing date: 1994-03-30
Publication date: 1996-09-10
Also published as: WO1994023298A1; EP0692096A1; AU6622994A; CA2157929A1; AU693442B2

Abstract

(57)【要約】試料中の被検体の量を決定する方法は、系統的に変化する被検体に対する特異的な結合パートナーに関する親和性又は被検体自身に対する親和性をもった一連のテスト領域を利用する。試料中の被検体と競合して特異的な結台パートナーと結台することができ、又は被検体と結合する、テスト領域の部分を決定することによって、被検体の量を測定し得る。連続希釈工程なしにアッセイを実施できるので、親和性滴定は濃度滴定に取って代わる。あるいは、複合体からの所望成分のレリースを制御するために複合体成分に対する様々なリガンドの競合を利用する。一例として、小さいモイエティのクリアランスを、レリース剤をきっかけとしてレリースまたは解離可能なサイズエンハンシング試薬とそれらを組み合わせることによって遅らせることができる。他の例では、標的自身が複合体からのモイエティの活性形をレリースする競合者である。 (57) [Summary] The method of determining the amount of analyte in a sample utilizes a series of test regions with an affinity for a specific binding partner for the analyte that varies systematically or for the analyte itself. The amount of analyte can be measured by determining the portion of the test area that can compete with the analyte for binding to a specific anchoring partner in the sample, or that binds the analyte. Affinity titration replaces concentration titration because the assay can be performed without serial dilution steps. Alternatively, one utilizes the competition of various ligands for complex components to control the release of the desired component from the complex. As an example, the clearance of small moieties can be delayed by triggering a release agent and combining them with a release or dissociable size enhancing reagent. In another example, the target itself is a competitor that releases the active form of the moiety from the complex.

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称親和性滴定による濃度の決定とドラッグデリバリーにおける競合的置換技術分野本発明の第一の視点は小容量での使用に適する単純化され、その分野での使用に適する被検体（analyte）の濃度の決定に関する。そのような決定に包含される原理についての他の適用は複合体（complex）の一部とレリース剤（releasing agent）との競合が目的とする物質を含有する複合体の命運を決定するデリバリーシステムに関する。本発明のアッセイは、被検体の濃度を典型的なイムノアッセイについての範囲である１．５対数単位までの範囲にするか、または動的範囲において多数の測定値をうるかのいずれかのため、連続希釈を必要とせずに濃度を決定するための系統的に変化する競合イムノアッセイを含む。本発明のドラッグデリバリーに関する視点はインビポまたはインビトロ環境下でのある結合モイエティ（moieties,対を構成する要素）部分の有用性及び／または活性を調整するための親和性競合の使用に関する。発明の背景アッセイ臨床的、環境的、または他の分野（settings）での被検体の濃度決定のためのアッセイは一般に連続希釈の使用を含む。そのような希釈の目的は２つある：第一にそのアッセイの範囲内にその試料の濃度を調整する必要があることである；もしその試料が高濃度である場合には意味のある測定ができない。さらに連続希釈は一連の濃度にわたってさまざまな測定値が得られる動的範囲に適合しかつカバー（span）し、そしてその結果の正確さを高めることができる。他の場合には、希釈のレベルそれ自体が濃度の評価として使用し得る。この場合、イムノアッセイまたは他の特別な結合アッセイは試料の連続希釈と組み合わせて多数のテスト領域または部分を使用することにより１試料における１被検体の量を測定するために使用し得る。さまざまな種類のテスト仕様が使用される、そこでは同じテスト仕様がこれらの多数のテスト領域で使用される、しかし被検体を含むその試料は識別応答が消滅するまで順次より低い濃度で使用される。応答がもはや確認できない希釈のレベルを考慮し、かつその結果を標準について得られた結果と比較することにより、原試料の被検体の濃度が逆算できる。連続希釈を使用する諸方法は有用であるが、極めて労力または機械力を要する、また実験室環境の外での被検体に関するテストに必要とされるような半定量的分析には適さない。例えば、フィールドテスト（field testing）が適当である場所での土壌中の汚染菌のレベルの確認はより複雑で誤りがちな多数の希釈を行う方法よりも、単一の試料容量のみを必要とする方法によりなされるべきである。同様に、臨床の分野では、測定のための連続希釈を手で行なう、訓練され信頼されている人員の欠如は、ヘルスケアの提供においては認識されている問題である；そのような希釈を機械的に行う装置は高価で信頼性が制限されている。さらに試料採取の侵害的（invasive）性質を最小限に止めるために極端に少量の試料で臨床的アッセイを行なうことが望ましい。例えばマイクロタイターの範囲での試料の連続希釈は本来不正確である。この問題に対するひとつのアプローチはリー（Ｌｙ）に対する米国特許４，６５４，３１０及び４，９２３，８００で述べられている。記載されたその方法においては、多数のテスト部分における系統的に量が変化するテスト試薬が、試料の連続希釈を必要とせずに同じ被検体の溶液についての半定量的な結果を得るために使用されている。ひとつの簡単に理解される開示されたアプローチは、相対的に変化する量の２つの触媒を使用する、２つの競合する触媒的に制御された反応を利用するものである。その最も単純な形式においては、その被検体を基質として利用する２つの酵素が生成物へのその基質の変換のために競合する。その生成物の１つは全か無か（all-or-n one）の検出できる結果を示す；他方は検出できる応答を示さない。もし被検体が高濃度であるならば、検出できる生成物への変換から取去る大量の競合的酵素すら問題ではない；しかしながら被検体が低濃度の場合は、結果を見るには十分な量が残っていないだろう。したがって高濃度の被検体は競合する高濃度の酵素が存在する場合でさえ検出できる結果を示すことができるであろう。ホーホシュトラッサー（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ）に対する米国特許４，０４２，３２９に記載されたやや異なるしかし関連のあるアプローチにおいては、変動しうる化学量論的試薬濃度は一連のテスト領域で半定量的な結果を達成するのに使用される。本発明のアッセイについての視点は連続希釈の必要なしに一連のテスト領域を使用する定量的な被検体濃度を決定する方法を同様に提供する。上記に言及した技術と対比して本発明の方法はその被検体自身かまたはその被検体の特別な結合パートナーと多数のリガンドとの変動しうる結合親和性を利用する。いずれの場合においても、本発明は単一の物質に対して有効性の程度を変動させながら反応する多数のリガンドを利用する。ドラッグデリバリー（ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ）生物学的に活性な化合物または診断のために組織を標識することができる化合物の発見はこれらの物質をその望ましい最終目的のために使用することについての複雑な問題のごく一部にすぎない。例えば薬品が効果的であるためには、薬品はその効果を発揮するに十分な時間目的とされた標的の環境下に存在しなければならない。薬品はまた多くの場合これらの標的への選択的輸送によって効果を発揮する。同じことが特定の組織を局在化するための標識体の使用にもあてはまる。そのような局在化を起こさせるメカニズムそしてその局在化された標識体が検出できるようなシステムから残りのバックグラウンドの標識体を明確にするためのメカニズムを見いださなければならない。これらの効果を奏するいくつかのアプローチが知られている。破壊することを目的とする毒素、例えば腫瘍細胞はその腫瘍と結合することができる免疫グロブリンのような特異的な親和性のある試薬と複合体となることが示唆されている。おそらく腫瘍の表面に特別な結合試薬と毒素との組み合わせを集合させることによって、その腫瘍はその特異的な親和性試薬が引きつけられない組織を犠牲にして破壊される。同様にシンチグラフィーの標識体を例えば試薬の標的に対して特異的な親和性をもつその試薬と組み合わせることにより、特別な組織の特異的なイメージを利用する技術がある。さらに一般的に、いくつかの試薬はポリエチレングリコールのように重合してポリマーとすることによりその半減期にわたって効果を高めるよう修飾されている。しかしながら輸送される生物学的に活性な物質が排他的にその望ましい標的に運ばれ、目標に到達したときには残りの組織からは一掃されるような薬動力学を注意深く検定することは可能でなかった。多くの場合には望ましい場所に十分な薬品を蓄積することさえ可能でなかった。本発明のドラッグデリバリーの視点はこれらの一般的なアプローチがその効果を達成する正確さを改善する方法を提供することであり、そしてインビボ、インビトロいずれの環境下においても標的に対して目的物質を輸送することに適用し得る。発明の開示第一に本発明はフィールド（field）または臨床的条件下で目的とする被検体の濃度の簡単な決定に関する直接的（straight forward）で定量的な方法を提供するものであり、被検体または特異的な結合モイエティがその被検体と反応するその特異的な結合モイエティのいずれかに関する変化するリガンドの親和性を利用する。好ましい競合の態様においては、その試薬はその特異的な結合パートナーに関する競合の程度を変化させるので、競合物の規則正しいアレイに関するそのテスト試料の競合的な成功を、既知の被検体の濃度についての検量線にしたがいその量の指標として使用できる。このように、１つの好ましい視点において、本発明はその試料中の被検体の量を決定する方法に直結するものであり、その方法は多数のテスト領域にその試料を適用することを含む。そのテスト領域はその望ましい被検体と結合することができる特異的な結合パートナーに関して親和性が変化するリガンドを含む。そのテスト領域は連続的に、すなわち識別できるその特異的な結合パートナーに関する含有されたリガンドの親和性が単調に増大するような様式で配置される。もちろんこれは最も単純な可能な方法、例えば親和性が増加するリガンドが例えば左から右へ配置される直線的配置でなされる。試料が多数のテスト領域と接触するその時に、一定量の特異的な結合パートナーがそれぞれに提供され、そしてもちろん当初からそれぞれのテスト領域に含まれ得る。特異的な結合パートナーの存在下でその試料とそのテスト領域との接触後、必要な場合には、そのテスト領域に結合しているリガンドに結合していないその特異的な結合パートナーは洗い流される。当業者に知られているようにいくつかの検出方法にとって、洗浄は必須ではない。残りの結合した特異的な結合パートナーは次いで検出される。次いで、結合した特異的な結合パートナーを含むテスト領域のその部分はその被検体の尺度（measure）として使用される。それぞれのゾーンにおける全か無かの間における中間の値はさらに正確な値を与える。上述したリー及びホーホシュトラッサーの方法から利用できる半定量的なデータとは異なり、本発明の方法を用いて得られる結果は、もし必要ならばあるいはより定性的に解釈され得るならば十分に定量的な解析ができる。得られる答の正確さはテスト部分に関する試薬の数と試薬の適当な選択を検討することにより増大する。別法として、その多数のテスト部分は直接的で非競合的な仕様（format）で使用され、そこでは一連の特異的な結合リガンドは被検体それ自体に対して変化する親和性を有する。被検体が低濃度の場合には、その被検体について高い親和性をもつリガンドを含むそれらのテスト部分のみが検出されるに十分な量の被検体を結合するであろう。本発明のこの方法（実施形態）は力学的に（kinetically ）コントロールされるか平衡的にコントロールされるかのいずれかの仕様により行い得る。定量的な結果を与えるに必要な結合親和性の最適な範囲は競合的な仕様のそれとは異なるであろうし、また通常の実験を用いて行ないうる。他の視点においては、本発明は本発明の方法に使用するテスト装置に関するものである。これらのテスト装置はその特異的な結合パートナーのための親和性が変化するリガンドを含む多数のテスト領域を含む（あるいは第二の仕様に関して、その被検体のための）；そのテスト領域は特異的な結合パートナー（または被検体）に関する親和性が増大するリガンドを含む領域が容易に識別され得るような方法で配置される。本発明のドラッグデリバリーについての視点は、目的物質との複合体となって含まれるレリース剤（即ち解放発現剤、releasing agent）とモジュレイティング物質（modulating material）との間の競合を効果的にすることにより、望む場所で絶対的かつ相対的な量の目的物質を制御する手段を提供する。そのレリース剤は適当な時に供給されてもよく、またその標的とする場所に内在していてもよい。複合体はそのレリース剤が供給されまたは衝突されるまで完全に維持される；その重要な成分はその時その効果を発揮することができる。このように本発明はある環境下である標的に関して望む物質の活性をモジュレイト（変調）させる方法に関し、そしてその方法は前記望む物質をコントロール試薬を含む複合体として提供すること、及びレリース剤と複合体との相互作用により複合体からの望む物質のレリース（解放）を効果的にすることを含む。このレリース剤は望む物質のコントロール試薬若しくはコントロール試薬の望む物質と競合するか、又はコントロール試薬によってもたらされた凝集体を分離する。１つの実施態様において、複合体はそのコントロール試薬としてインビボ系で低クリアランス率を有する複合体を提供するサイズエンハンシング（size-enhan cing）剤を含む。そのため目的成分は高い凝集体重量の複合体としてその被験体（subject）中に維持される。クリアランスはその複合体を破壊しその望む成分を解放するレリース剤を提供することによりもたらされ得る。この方法は望む成分が標的に選択的に結合する特異的な親和性の成分を含むようにすることができる。サイズエンハンシング剤は十分な望む成分が標的に蓄積されるまで解放されまたは解離されない。他の実施態様においては、活性化成分はそれが複合体のなかに残っている間それを不活性化するパートナーと複合化される。もしこの不活性化物質が、生物学的に活性な物質が目的とする標的に対して特異的な結合能をも有するならば、そして標的に対する結合が複合体を破壊するならば、その活性化物質は該標的の存在下においてのみ活性となるであろう。近接する位置にある標的または物質はこれによってレリース剤として機能する。或いは、外部的レリース剤も利用できる。第三の例示的な実施態様においては、活性物質はその目的とする基質または偽基質（pseudosubstrate）に関する競合物（competitor）に対して複合化されて投与される。高濃度の目的とする基質または偽基質は次いで活性物質を解放（レリース）する。図面の簡単な説明図１ａ〜１ｃは活性成分（ＡＣ）とコントロール試薬（ＣＡ）との間の複合体におけるレリース剤（ＲＡ）の濃度を増加させた場合の効果を概略的に示したものである。図２ａ〜２ｂは自己凝集サイズエンハンシング剤（ＳＥＡ）をコントロール剤として含む、凝集複合体におけるレリース剤の濃度を増加させた場合の効果を概略的に示したものである。図３ａ〜３ｂはサイズエンハンシング剤と免疫接合体を含む凝集複合体におけるレリース剤の濃度を増加させた場合の効果を概略的に示したものである。図４ａと４ｂは図３ａ〜３ｂのその複合体のさらに詳細を示す。図５ａと５ｂはエピトープの類似物を含むポリマーに対する免疫接合体の結合における高濃度でのエピトープ標的についての競合の効果を示している。図６は１つの被検体と反応する様々な試薬に対する例示的な親和性滴定曲線を示している。発明の実施の形態本発明の方法において、親和性の滴定は、判読可能な信号を発生するための濃度の滴定に置替わる。一般的な原理は以下のように記載され得る：図６は異なる用量（doses）の被検体（analyte）に対する応答が、その被検体または競合種に関するその結合試薬の特異的な親和性により互いにずれている（offset）、３つの特異的な結合試薬またはリガンド（Ａ、Ｂ及びＣ）を図解的に示している。図示したように、シフトされた用量−応答曲線は異なる濃度帯（番号づけされた１〜５）の被検体に対して区別できる応答パターンを示す。かくて、ある未知の標本の濃度帯は、その応答パターンをこれら３つのリガンドに関し比較すること、及びその応答を標準品のそれと比較することにより決定され得る。１つの帯内の定量は標準的な方法によりなされ得る、またはもし望むならば、この範囲内の異なる結合試薬の数を増加させることによりなされ得る。参照のためここに参照をもって繰込まれる米国特許５，１１３，８６６は最大限に特性の変化するリガンドの様々なパネルの生成を記載している。これらのパネルは、被検体またはその被検体自身に関する特異的な結合パートナーを含む単一のモイエティに対する親和性が様々に変化する複数のリガンドを提供するのに特に有用である。最大限の多様性は本発明で使用されるリガンドについては必要とされないが、このような多様性は、被検体または特異的な結合パートナーに関するリガンドの結合を系統的にコントロールするので、有利である。上記参照した特許において記載されたリガンドのその様々なパネルは単調に変化する結合能力をもったリガンドの起源として好適であるが、そのようなリガンドの他の起源も同様に使用できる。特異的な結合パートナーに対する親和性が変化する一連のモノクローナル抗体が例えば使用できる。同様にランダムなまたは系統的に変化する配列をもつペプチドは現在その分野で周知の技術を用いることにより生じさせることができる。比較的不便ではあるが、リガンドが結合されるべき標的の性質に基づいて適当な候補の間で本質上試行錯誤することにより、親和性が変化するある範囲のリガンドを得ることは不可能ではない。例えば、被検体または被検体に関するその特異的な結合パートナーが酵素である場合、該酵素に関する基質分子または阻害分子の変動を利用できよう。もし被検体または被検体のための特異的な結合パートナーがレセプターであるならば、そのレセプターに結合することが知られているリガンドの変動を利用し得るのではないか；逆に標的化合物がレセプターに結合することが知られているモイエティである場合、該レセプター蛋白質の結合部位の変動を利用することができる。このように、被検体または被検体に対する特異的な結合パートナーに対する系統的に変化する親和性をもったリガンドの望む集合を得るための多くのアプローチが当該技術分野で利用できる。その方法の好ましい競合形態は被検体に対する”特異的な結合パートナー”を使用する。ここで使用されるように、”特異的な結合パートナー”はその望む被検体に対して相当の親和性をもって結合することが知られている物質に関する；典型的なそのような特異的な結合パートナーは、抗体もしくはＦａｂ、Ｆａｂ’ 、Ｆａｂ’₂のような免疫学的に反応するその断片、または例えば、その被検体がレセプターに合致するリガンドである場合の該リガンドに対する該レセプター等であろう。さらにもちろん、もしその被検体が抗体自身である場合にはその特異的な結合パートナーは該抗体が応答する抗原であることができる。本発明のアッセイはその特異的な結合パートナーまたは被検体に対する親和性が変化するリガンドが結合する固体支持体マトリクス上でなされることが好ましい。しかしながらある均質溶液相である検出方法が利用できるので、均質溶液に関するアッセイ例えば蛍光性のエネルギー移動に関するそのアッセイを構成することは可能である；固体支持体の洗浄や付着（attach ment）は必要とされない。固体マトリクスは、別々のテスト領域がその表面で境界を区画され得る限り、任意のデザインであり得る。例えばマイクロタイタープレートのようなこの種の従来の基質は便利に利用できる。それに代り、疎水性境界の適用により複数のテスト領域に分割されている平面的な親水性表面を使用できる。例えば直線的に配置された多数の長方形または正方形を区画するためにワックスのクロスハッチング（cross-hatchings）で下地形成（backing）しているセルロースを使用できよう。テスト領域アレイのデザイン（形状）はその結果を解釈する利便性及び単純性の問題である。好ましくはこれらの領域は、その特異的な結合パートナーまたは被検体に対する親和性が増加する、直線的に整列（アレイ）したリガンドがその下地（backing）に結合することができるような様式で配置される。これに代り、リガンドは円もしくは螺旋形またはその他の便利な規則正しく意図されたパターンとして配置され得る。同一または異なる被検体の特異的な結合パートナーに対する親和性が単調に増加するそのような多数の一連のリガンドは同じ基質または固体支持体の表面に配置され得る。各テスト領域に対する個々のリガンドの結合の性質は、もしそのような結合が望まれるならば、固体基質の性質と使用されるリガンドの性質に依存してまた広く変化する。その結合は共有結合かまたは吸着によるものであってもよい。もしペプチドが複数の親和性を有するリガンドの起源として使用されるならば、エステル、アミドまたはＳ−Ｓ（disulfide）結合を形成することができるか、基質と適当な共有結合を形成することができる結合モイエティ（linker moieties）を使用し得る。しかしながら、核酸、炭水化物、及び他のポリマーを含むさらなるリガンドのタイプを同様に使用し得よう。これらのいくつかは上記の参照特許に記載されている。結合は従来の方法による；例えば、セルロース基質に対する結合は、シアノーゲンブロマイド、アルキル塩化ギ酸（alkyl chloroformates）、又はカルボニルジイミダゾールによって行うことができ、環状炭酸塩または炭酸塩活性エステルを形成する。そのテスト装置の立上げにおいて、それぞれのテスト領域は分離して、既知のパターンで特異的な親和性をもつそのリガンドに結合している。その結合はこのようにその特異的な結合パートナーまたは被検体に関する親和性が変化する一連のテスト領域となる。競合する仕様における実施に関して、テスト領域を含むその支持体には、そのテスト自体に先立ってそれぞれのテスト領域に含まれるが結合はしていない既知量の（好ましくは一定量の）特異的な結合パートナーが選択的に提供されてもよい。あるいは、その特異的な結合パートナーは試料が提供されるその時に分離溶液として提供されてもよい。そのテストの実施においては、試料は一定量の特異的な結合パートナーとともに全体の一連のテスト領域に適用される。試料と特異的な結合パートナーは試料中に含まれるリガンドと被検体との間の特異的な結合パートナーに関して競合が起こるための十分な時間、一連のテスト領域と接触する状態になっている。リガンドに対する特異的な結合パートナーの結合の検出方法に依存して、培養期間後に、テスト領域でリガンドに結合した特異的な結合パートナーのみが残留するようそのテスト部分を洗浄することが必要か望ましいかもしれないしそうでないかもしれない。いずれにしても、ある特異的なテスト領域においてリガンドに結合している特異的な結合パートナーの存在または非存在は、培養後に被検体を含む試料との競合において検出される。この検出は様々な方法でなされ得る。いくつかの方法では結合していない特異的な結合パートナーを含む溶液を洗浄することは必要ではない。例えばリガンドの固体支持体に対する結合を含む仕様において、固体支持体には蛍光がその特異的な結合パートナーに付着した部分によって消され得る、蛍光放射化合物を備え得る。結合した特異的な結合パートナーのみが蛍光を消すことができるのであり、溶液中の結合していないパートナーの存在は測定を妨害しない。この方法は、リガンドがテスト領域において溶液中に存在する均質な媒体中においても同様に使用することができる。あるいは、他の場所ではなく表面においてのみ、蛍光信号のような信号の存在または非存在を検出する光学装置をまた使用することができる。例えばその特異的な結合パートナーが結合酵素の検出のために酵素に結合するその一連のテスト領域に基質溶液を添加するような、さらに伝統的な方法は、そのテスト領域の予備洗浄を必要としうる。もしテスト領域が本当に洗浄されて結合していない特異的な結合パートナーがないならば、その特異的な結合パートナーの存在または非存在はそのような従来の方法を用いることによりそれぞれのテスト領域で検出される。例えばもしその特異的な結合パートナーが抗体であるならば、この抗体はそれ自体ある標識体を含むことができ、それと特に免疫学的に反応する二次抗体を用いて標識されることもできる。様々な従来の標識方法が、放射性標識、酵素的標識、蛍光標識、及びこれらの組み合わせを含んで、その分野で周知である。検出が効果的になされると、結合のパターンが次いで観察される。単一の一連のテスト領域においては、被検体が高濃度の試料は、多くのテスト領域において特異的な結合パートナーと結合することができないであろう。結合リガンドとわずかに競合することができる少量の被検体のみを含む試料は、多くのテスト領域が標識体の存在を示すその一連のテスト領域になるであろう。このように、結合を示すテスト領域の比率はその試料の被検体のレベルに大まかに反比例する。そのテストは既知の量の被検体と適当な標準によって半（semi）定量的になされる。正確さのレベルは、その特異的な結合パートナーに対するそのテスト部分の相対的な親和性を調整することにより、望むレベルの必要性にしたがい変化し得る。親和性の適度な増加を伴うリガンドをもつ大量のそのようなテスト部分はそのアッセイの正確さを高めるため使用できる。あるいは、直接的な仕様において、多くのテスト部分を推測上被検体を含むその試料と接触させる。特別なテスト部分においてリガンドに結合する被検体の能力は、その被検体自身に関するそのテスト部分に存するリガンドの親和性に依存する。結合は力学的または平衡的ベースに立って判断され得る；もし力学的ベースに立って判断されるなら、平衡状態に達する前に終了する短期間の培養が使用される。この仕様では、被検体は好ましく最も高い親和性を有するリガンドを含むテスト部分においてリガンドと結合するであろう；低濃度ではその被検体に対してたいへん高い親和性をもつテスト部分のみが、検出可能量の被検体との結合に成功するであろう。より高濃度の被検体では比較的低い親和性をもつリガンドをもったテスト部分でさえ被検体と結合することができるであろう。この仕様におけるリガンド結合被検体の検出は結合による固体支持体の表面の性質の変化を測定することによっても行ない得る。しかしながら結合していない被検体を含む試料を除去することを含み、そして標識体を含む二次結合試薬を用いることを含む、より従来のアプローチが好ましい。しかしながら洗浄はその試料のその結合の性質を変化させるかもしれないので一般には指示されない。このアプローチの１つの例は例えば被検体を特に結合することができる抗体またはその断片を使用することであり、その抗体またはその断片自体は放射性活性、蛍光、酵素、または他の標識体を含む。次いで、結果はテストされるべきその試料中の被検体と結合する領域の数を、標準濃度の対照（control）中の被検体と結合するテスト領域の数と比較することにより測定される。この仕様では、より高濃度の被検体はより多数のテスト領域において検出可能な結合を示すであろう。直接的な仕様か競合的な仕様で行われるかに拘らず、そのアッセイは多くのテスト領域を用いて行なわれる。好ましくは、そのテスト領域はそれぞれのその結果が測定されまた特別なリガンドと関連され得るような方法で配置される。直接的な測定装置については、被検体に対して親和性が増加するかまたはその特別な結合試薬に関して親和性が増加する、直線的なリガンドの配置のような、ある規則正しい配置が必要となるであろう。あるいは、螺旋状または二次元の整列のような他の規則正しい配列（アレイ）も、その結果が理解できる限り使用され得る。もしそのテスト領域が単にマイクロタイタープレートのウエルであるかまたはラックのテストチューブであるならば、その配列は融通がきき、実施者の選択に委ねられる。無作為な物理的配置も、様々な親和性をもつリガンドのその位置を選り分けるためにコンピューターを用いることによって、また使用できる。しかしながら原理的には、単一仕様のテストでは、単に積極的な結果を与えるテスト部分の数が決定的になるであろう。必要な数のテスト領域をもった装置を作成するのに特に便利な１つの方法は、マトリクス領域が疎水性バリヤーによって互いに分離されている基質（basic）の親水性マトリクスを含むものである。このように１つのセルロースマットはワックスの線または他の疎水性のバリヤーによって正方形または他の適当な形の領域に細分され得る。本発明はまた”親和性競合”の過程を通して目的物質の他の物質との相互作用をコントロールすることにより、代謝系のような特別な環境下での物質の挙動をコントロールするための方法を提供する。目的物質または材料は”コントロール ”試薬との複合体として含まれ、この複合体は目的物質の挙動を、その物質を不活性化し、その大きさを変化させることにより、または他の方法によりその特性を変化させて、コントロールする。その複合体は、コントロール試薬に対する目的物質と、もしくは目的物質に対するコントロール試薬とのいずれかと競合するか、またはコントロール試薬によって形成された自己凝集の解離を引き起こす” レリース剤”によって解離される。その”コントロール試薬”と目的物質との間の複合体の近傍におけるレリース剤の存在は、適当な環境へとそのレリース剤を投与することか、または標的位置に高濃度のレリース剤を局在化させることにより任意に達成される。複合体からの望む物質のレリースは、そのレリース剤の濃度に関する親和性滴定の必然的な結果である。レリース剤の濃度が高くなればなるほど、望む物質のレリース能力は実質的により大きくなる。望む物質に対するコントロール試薬の親和性、または目的物質もしくはコントロール試薬に対するレリース剤の親和性に関する凝集性の強さを調整することにより、レリース剤の適当な濃度が決定され得る。もしレリース剤が内因性（endogenous）であるならば、その系の成分の親和性はその環境下で見いだされるレリース剤の濃度に適合するように調整されねばならない。本発明の方法の適用が成功するかどうかは、複合体の一成分に関するレリース剤の親和性の正しい選択及びその複合体の残りの成分に対する前記一成分の親和性の正しい選択に依存する。例えば、もしそのレリース剤がコントロール試薬に結合する活性成分を排除（outcompete）することによって複合体を解離することを意図しているならば、そのコントロール試薬に対するその活性成分の親和性と比較してそのコントロール試薬に対するそのレリース剤の親和性は、該レリース剤の達成できる濃度が該レリース剤とコントロール試薬との相互作用のために親和性のバランスを傾ける（tip）に十分であるようでなければならない。適当な親和性のレリース剤を提供するために、系統的に変化する特性をもつ物質のパネルに頼ることができる。これはレリース剤の適当な選択がなされるようコントロール試薬に対する親和性の範囲を与えるであろう。逆にそのようなパネルは予備決定されたレリース剤の濃度に応答する適当なコントロール試薬に関する候補を与えることができる。系統的に変化する特性をもったそのようなパネルは例えば上に示したように米国特許５，１３３，８６６に記載されている。この特許は望む親和性の範囲をカバーするよう要求されるパネル中の候補の数を最小限とするために最大限に変化する特性をもったリガンドのパネルを記載している。レリース剤のみならず複合体の形成のための材料の起源としてのそのようなパネルの使用は望ましいがしかし要求はされない。その複合体成分（またはそのレリース剤）に対して必要とされる親和性を有する物質を使用できるよう親和性の範囲を得るための任意の方法を使用することができる。その一般的な原理は図１ａ〜１ｃに概略的に示されている。その最も単純な形式においては、その活性成分（図のＡＣ）はコントロール試薬（ＣＡ）との複合体の形で、図１ａに示すように一般的に低濃度のレリース剤を有する環境に投与される。これらの濃度レベルではその複合体はそのまま残る。しかしながらそのレリース剤濃度が増加すると、その複合体は図１ｂに示すようにＣＡに対するかまたは図１ｃに示すようにその活性成分に対する、レリース剤（ＲＡ）の親和性により解離する。もしレリース剤が活性成分の標的であるかまたはある方法でそれと結合するならば、その有効濃度は標的部で最高となるであろう。この概念の他の可能な形は図２ａと２ｂに概略的に示してある。図２ａにおいて、高い凝集量（ａｇｇｒｅｇａｔｅｗｅｉｇｈｔ）の複合体が、コントロール試薬、この場合サイズエンハンシング試薬（ＳＥＡ）の自己集合によって形成される。ＳＥＡは目的物質、活性成分（ＡＣ）に共有結合的に結合できる。レリース剤がないかまたは低濃度の場合には、図２ａに示すように、ＳＥＡは複合体を形成するように凝集する。しかしながらレリース剤が適当な濃度で存在する場合には、図２ｂに示すように、サイズエンハンシング試薬は活性成分が有効に低い凝集量部分として存在するように解離する。以下に実施例を示すが、これらは本発明を何等制限するものではない。実施例１アッセイアッセイはスコット，ジェイ．ケイ．（Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．）ら（Proc Nat l Acad Sci USA （1992）89:5398-5402）により記載された物質を用いて示すことができる。要するにレクチンコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）は特異的に糖メチル−アルファ−マンノース（ＭｅＭａｎ）に結合する。多価のＣｏｎＡは菌株Ｂ−１３５５−５からのもののような様々な細菌由来のデキストランと結合して不溶性複合体を形成する。ＣｏｎＡデキストランの沈降はＭｅＭａｎによる用量依存（ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）の仕方で阻害することができる。ファージのエピトープディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより、ＣｏｎＡデキストランの沈降をも阻害するいくつかのペプチド（例えばＭＹＷＹＰＹとＶＧＲＡＦＳ）が顕著な５０％の阻害値をもって同定された。被検体としてのＭｅＭａｎの測定は、このように原理的には競合するリガンドとしてまたはＣｏｎＡデキストランの沈降を阻むためにペプチドを利用し、測定できるＭｅＭａｎの濃度範囲を効果的に拡張することにより、行うことができる。デキストランとペプチドは原理的には固定化することができ、ＭｅＭａｎでＣｏｎＡを競合的にトラップするのに使用し得る。逆に、ＭｅＭａｎとペプチドをＣｏｎＡ濃度の範囲を決定する競合試薬として、ＣｏｎＡは被検体と、デキストランＢ−１３５５−５は特異的な結合試薬と、夫々見なされ得る。本発明のドラッグデリバリーについての視点は以下の実施例において例示されている。これらの実施例がレリース剤の存在下で分解されるコントロールモイエティと目的物質との間の複合体を提供する一般的な特性を共有することは、これらの実施例を見れば明らかとなるであろう。実施例２処置または診断における使用のためのトキシンまたは放射性金属と結合したモノクローナル抗体の輸送モノクローナル抗体を悪性腫瘍細胞を標的とするための特異的な親和性試薬として及び検出または破壊のためにそれらの細胞をマークするための特異的な親和性試薬として利用する多くの試みがなされてきた。このように、標識体、トキシン、もしくは他の薬品、または腫瘍標的に対する他の目的物質の輸送（delivery ）のための免疫接合体を記述した膨大な量の文献を今利用できる。本発明のこの実施例においては、免疫接合体がしたがって目的物質（substance of interest ）である。その腫瘍細胞はその標的を構成する。免疫接合体の輸送について懸案となってきた１つの問題は低分子量、好ましくは７０キロダルトン（ｋｄ）以下、さらに好ましくは２０キロダルトン以下であることが腫瘍の塊への侵入には望ましいが、そのような低分子量の免疫接合体は腎臓によって速やかにクリアー（clear through）してしまうことである。その腫瘍に対する局在化は２４〜３６時間が必要であると推定されている；この時間までにはこのような低分子量の物質はほとんどクリアーしてしまう。他方適当量の物質が、結合するモノクローナル抗体の能力によりその腫瘍に蓄積しているならば、急速なクリアランスは望ましいものとなる。もしその免疫接合体の目的が標識であるならば、そのようなクリアランスはそのバックグラウンドを縮小させ、検出の正確さを高める。もしその免疫接合体が治療を目的としているならば、そのようなタリアランスは健康な組織に対する反対の影響を阻止する。しかしながら７０キロダルトン超の複合体は急速にはタリアーされない。もしその免疫接合体がその腫瘍組織に十分な時間存在する（homing）この分子量を越える複合体の一部にでき、また侵入及びクリアランスのためにレリースされ得るならば、理想的な薬力学的状況が達成されるだろう。この理想的な状況は、レリース剤が供給されるまで、その免疫接合体との複合体中で維持され得る適当なサイズエンハンシング試薬を供給することにより達成され得る。様々な目的のそのサイズエンハンシング試薬とその複合体が想像され得る。例えば、モノクローナル抗体または好ましくは免疫活性部位−−すなわちＦ_v 領域−−はラジオアイソトープ標識のためのキレート部位と図３に示すようにサイズエンハンシング試薬として働く伸張部位とを含むよう修飾され得るペプチドをもった融合（fusion）蛋白質として作られ得る。Ｆ_v領域の融合蛋白質が例示されているが、そのコントロール試薬（この場合そのペプチドの伸長によって表されたサイズエンハンシンク試薬）は、それに代り、ペプチドを含むがオリゴヌクレオチドのような他の適当な化学物質をも含む、共有結合的に結合したモイエティであり得る。図３ａに示したように、図中アステリスクとして示した放射性標識体または薬品と結合したＦ_v領域の抗体はサイズエンハンシング試薬（ＳＥＡ）により伸張される。その標識体はＳＥＡ上またはＦ_v上に置くことができ、また結合前または後に添加することができる。ＳＥＡの目的は二量体または多量体の構成を促進することである。これは反対に帯電しており２つの相互に引きつけあう伸張、ＳＥＡ、ＳＥＡ’を用いることにより効果的となり得る；あるいは、疎水的伸張のように自然な親和性をもつ伸張を使用することができる。一般的には、わずか１セットの試薬を用意すればよいので、簡単に自己凝集するサイズエンハンシング試薬が好まれる。その伸張の互いの親和性は、上に記載したように最大限に多様な（diversity）候補のパネルを用いるエピトープ／パラトープ対のデザインによるか、または参照により本書に組込まれる米国特許５，２１７，８６９に記載されたスクリーニング技術を用いることにより、変化（modify）し得る。レリース剤ＲＡは、適当な濃度でＳＥＡの二量体が図３ｂに示されるように解離するように、その少なくとも１つのＳＥＡの伸長に対して十分な親和性を持っている。このデザインのいくぶんより洗練されたものは図４に示されている。この例示においては、サイズエンハンシング試薬の伸張はその融合したペプチドの分岐によって形成された少なくとも２つの結合する腕（binding arm）を持っている。その結合する腕は、複合体を互いに維持するため正及び負の腕の間の静電気的引力を用いて凝集させる形状とすることができるポリリシン（ｐｏｌｙ⁺）又はポリグルタミン酸もしくはポリアスパラギン酸（ｐｏｌｙ^-）のようなポリイオン性領域からなっていてもよい。あるいは、結合する腕は結合を行うエピトープ／パラトープ対からなるものであってもよい。Ｆ_vまたはＭａｂに融合した分岐した腕をもつペプチドはこのように個々の融合ペプチドを凝集させることができるサイズエンハンシング試薬である。その凝集体はその被験体である動物の体に投与され、複合体は標的となる細胞または組織において蓄積される。その蓄積が起こるに十分な時間が経過したとき、レリース剤が添加される。もしその結合する腕がポリイオン性であるならば、そのレリース剤は例えば正または負に帯電したペプチド（ポリリシン、又はポリグルタミン酸もしくはポリアスパラギン酸）の形で存在する。もしその結合する腕がエピトープ／パラトープ対であるならば、そのレリース剤はパラトープもしくはエピトープまたはそれに類するもの（mimi c）である。そのレリース剤と凝集した複合体との相互作用はそれらを解離し、その溶融蛋白質についてのクリアランスと貫通が現実化するようにその凝集体重量を縮小する。前述の実施例は図４において概略的に図示されている。図４ａは分岐した伸張についての反対に帯電したポリイオン性の腕により集合した完全な凝集体を示している。正電荷をもつレリース剤を高濃度とした場合は、例えば図４ｂに示すように、その複合体は解離する。活性モイエティも、活性成分のコントロール領域と相互作用するモイエティを担持する隙間（interstices）を有するポリマー状のビーズのように、コントロールされたレリース剤に含まれることができる。活性成分はそのコントロール領域にそって、拡散によってその隙間から解放（release）される。解放速度は活性成分の一部とポリマー中に含まれる”コントロール試薬”との間の特別な親和性によってコントロールされ、そこではそのポリマー含有モイエティの効果的な局所濃度がその適当な拡散速度をもたらすよう調整され得る。この場合そのレリース剤は拡散をコントロールする周りの環境を含む。適当なポリマーはポリアクリルアミド、コラーゲン、その他のような穴のあるポリマーを含む。あるいは、ラジオアイソトープ標識体もしくはトキシンまたは薬品は、薬品またはトキシンの場合のように共有結合的にかまたはラジオアイソトープの場合のようにキレートによってＦ_vユニットと結合してもよい、そして結果する免疫接合体はポリマーに結合した少なくとも１つの親和性リガンド（適切な抗原またはエピトープのような）を持つポリマーに吸着される。適当なポリマーは例えばポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸、その他のような不活性な生物学的に両立する（biocompatible）物質を含む。次いで親和性ポリマーサイズエンハンシング試薬は十分な免疫接合体がその標的に蓄積するまでその標的が含まれる環境下に該免疫接合体を維持する。その親和性ポリマーサイズエンハンシング試薬のいくつかは、複合体が標的に到達するときに、内因性抗原（レリース剤として）からの免疫接合体に対する競合によってレリースされてもよい；しかしながら循環複合体に関しては、これはたとえば標的エピトープを表すペプチドの投与によって適当な時間にレリースされ得る。より小さなエピトープは次いで親和性ポリマーを置替し、効果的にクリアー（clear）されるよう置換複合体の凝集体重量を効果的に低下させるであろう。これは図５に図示されている。図５はポリマーに含まれるエピトープに対するまたはエピトープ類似の領域に対する親和性によって複合化された免疫接合体を示している。図５ａに示すようにエピトープが低濃度のとき、複合体は完全な状態に留る。エピトープの局所の濃度が増加すると、図５ｂに示すように、複合体は解離する。他の方法（strategy）は、免疫接合体において、サイズエンハンシング試薬に対する分離した親和性領域を与える。この方法においては、そのレリース剤は標的によっては供給されない。サイズエンハンシング試薬はまた多価であってもよい。例えば望む抗体の免疫反応的領域は標的に向けられた免疫反応的領域に関係のない第二の免疫反応的領域に共有結合的に結合してもよい；該免疫接合体はトキシン、薬品、またはラジオアイソトープのような望むモイエティを含むであろう。この免疫接合体はしたがって、１）特異的に標的と結合するようにされた免疫特異的な領域；２）そのサイズエンハンシング試薬と結合するようにされた免疫特異的領域；３）標識または薬品、を含む。サイズエンハンシング試薬は、その特異的な結合パートナーがポリマーに共有結合的に結合するよう意図されている該免疫接合体の領域と特異的に免疫反応する１またはそれ以上のリガンドを含んでいてもよい。複合体はそのときこの第二の免疫反応領域によって免疫接合体と複合化したサイズエンハンシング試薬（誘導ポリマーのような）を含む。この場合標的において複合体が蓄積しても該複合体の感知ができるほどのいかなる解離も起こらない。これはレリース剤として、サイズエンハンシング試薬またはこれに類するものに対して複合体を結合するのに用いられた、親和性リガンドを投与することによってもたらされる。実施例３活性部位のマスキング及び暴露本発明の方法は作用部位において生物学的に活性な分子のその活性部位を暴露するのに用いてもよい。この実施例は生物学的活性を生じさせるべき部位において特異的に存在するレリース剤に対するマスキング試薬の特異的親和性の差（di fferential attinity）か、またはマスキング（コントロール）試薬と比較したその標的に対する生物学的に活性な試薬の特異的親和性の差のいずれかに依存する。この実施例の適用はインシュリンの投与に関する。インシュリンは現在注射により投与されている、しかしながら通常の肝インシュリンレベル（hepatic insulin levels）は血液レベルの１０〜５０倍である。望ましい肝インシュリンレベルを得るためには、注射により投与されるインシュリン用量の劇的な増加が必要である。これは１つのプロトコルにおいて、通常レベルの２５倍のインシュリンをこれらの高インシュリンレベルについての低血糖効果を補う（offset）に十分なグルコースとともに投与することによってなされる。このアプローチはその点で厄介で満足できないものである。本発明の方法においては、インシュリンの活性部位はインシュリンに対するよりも肝特異的細胞表面抗原に対してより高い親和性をもつリガンドによってマスクされている。他の選択においては、インシュリンは肝細胞抗原に対する特異的な免疫接合体として供給され、そして上記実施例１で記載した方法によりマスキング試薬含有複合体からレリースされる。このように、そのインシュリンは、肝部位に到達するまで、血液中において活性からマスク（保護）され、該肝部位において肝部位の細胞表面抗原が該マスキング試薬を置換し活性インシュリンになる。実施例４基質親和性または擬基質親和性競合第三の実施例においては、直接的または間接的に内因性基質に作用する生物学的に活性なモイエティは、生物学的に活性な物質が結合するがしかし基質または擬基質として認識するものではない代替基質と結合するモイエティを提供することにより、該基質の濃度に依存して滴定することがてきる。例えばインシュリンはデキストランに結合する抗体またはレクチンとの複合体として提供することができる；次いでそのデキストランは高内因性グルコースレベルにより置換される。この例示においては、インシュリンはグルコースとは直接的には相互作用しないがその物質代謝に寄与するので、グルコースはインシュリンの擬基質と考えられ得る。もちろん高濃度のグルコースが存在するときには利用できるインシュリンレベルを高めることが望ましい。そのインシュリンをデキストランに対する親和性を有する抗体またはレクチンに結合することにより、グルコース代謝をもたらすインシュリンの能力に逆に影響を与える複合体を形成することができる。高濃度のグルコースは抗体結合インシュリンまたはレクチン結合インシュリンを固定化デキストランからレリースし、そしてレクチンまたは抗体になお結合していてもインシュリンがその代謝機能を発揮するようにするであろう。この例示においては、そのデキストランはコントロール試薬としての役割を果たし、グルコースはレリース剤であり、目的物質はインシュリンである；複合体の活性成分はレクチン−インシュリン複合体または抗体−インシュリン複合体である。実施例５２価のミモトープの使用さらに他の実施例においては、２価のミモトープ（mimotope）の組み合わせを利用する、即ち、その価数は適当な親和性定数を持ち２価の抗体または免疫反応部の価数と相補的であるもの、を利用する。少なくとも２価のミモトープの価数の１つは、標的抗原−−例えば腫瘍抗原と比較してその抗体の対応領域に対してコントロールされた親和性を持つ。ある意味でこの価はその腫瘍抗原を模する。抗原−マスク（shedding）から血液に生じるような低濃度の腫瘍抗原においては、２価のミモトープはその相補的な２価の抗体に対する両方の価を介して複合化し、この複合体は効果的に不活性である。しかしながらその腫瘍部位で見いだされるような高濃度の腫瘍抗原においては、少なくともその腫瘍抗原を模する２価のミモトープの部分は、該２価の抗体上でその結合部位から効果的に置換され、その腫瘍に対して該２価の抗体が結合する。その抗体の価数の１つのみがミモトープの価数の１つと相互作用する、抗体に対するミモトープの親和性が減少するため、その２価のミモトープは結果的にマスクされ（shed）る。このように投与された複合体はその複合体の完全性が腫瘍抗原−−すなわちレリース剤の内因性濃度の相違により定量的に影響されるよう設計されている。さらに他の方法としては、抗体に対する伸張がエピトープ類似物を含む伸張を含む、キメラ蛋白質を利用する。エピトープ類似物は該キメラの他の分子の免疫反応部と結合し、２量体を形成する。この２量体はそのエピトープがそのレリース剤、例えば腫瘍抗原によって置換されると、解離する。実施例２〜５の要約実施例２〜５において、例えば治療または診断のための目的物質及び複合体に望ましい特性−−例えばその目的物質の大きさ、不活性等を与えるコントロール試薬を含む複合体が形成される。その複合体は、レリース剤が適当なときに適当な濃度で内因的に提供されるかまたは別個に投与されて、解離するまで完全な状態に留る。Detailed Description of the Invention Title of invention For concentration determination and drug delivery by affinity titration Competitive replacement inTechnical field A first aspect of the present invention is a simplified, suitable for use in small volumes, use in the field For the determination of analyte concentrations suitable for. Included in such a decision Other applications of the principle are: part of complex and releasing agent. delivery that determines the fate of the complex containing the substance of interest in competition with -Regarding the system. The assay of the present invention is used to measure analyte concentration in a typical immunoassay. Range up to 1.5 log units, which is the range for sei, or dynamic range Concentrations without the need for serial dilutions, either because you will get multiple measurements at Systematically varying competitive immunoassays to determine The drag of the present invention The point of view of delivery is that some binding moie in in vitro or in vitro environment. Regulates the usefulness and / or activity of the moieties part For the use of affinity competition forBackground of the Invention Assay For concentration determination of analytes in clinical, environmental, or other settings The assay generally involves the use of serial dilutions. The purpose of such dilution is twofold: First, the concentration of the sample needs to be adjusted within the assay; If the sample is highly concentrated, meaningful measurements are not possible. Further continuous rare The solution conforms to the dynamic range over which various measurements are taken and the scale You can span and improve the accuracy of the results. In other cases , The level of dilution itself can be used as an estimate of concentration. In this case, Say or other special binding assays can be used in combination with serial dilutions of the sample for multiple test runs. The amount of one analyte in one sample by using Can be used for Different types of test specifications are used, where the same test Strike specifications are used in these numerous test areas, but The agents are used in progressively lower concentrations until the identification response disappears. The response is no longer confirmed Consider the level of dilution that is not possible and compare the result to the result obtained for the standard. By comparing, the concentration of the analyte in the original sample can be calculated backward. Methods that use serial dilution are useful, but extremely labor or mechanical , And semi-quantitative as required for testing analytes outside the laboratory environment Not suitable for analysis. For example, field testing is appropriate Confirming the level of contaminants in soil at the site involves multiple dilutions that are more complex and error-prone. Should be done by a method that requires only a single sample volume, rather than . Similarly, in the clinical field, trained and trusted to manually make serial dilutions for measurements. Lack of personnel is a recognized problem in the provision of health care. Devices that perform such dilution mechanically are expensive and of limited reliability. Furthermore Extremely small samples to minimize the invasive nature of sampling It is desirable to carry out clinical assays in. For example in the microtiter range Serial dilution of the sample is inherently incorrect. One approach to this problem is US Pat. No. 4,6 to Ly. 54,310 and 4,923,800. To the method described In the case of a test reagent, the amount of test reagent that varies systematically in many test parts Obtained semi-quantitative results for solutions of the same analyte without the need for serial dilutions of It is used for One easily understood disclosed approach is Two competing catalytically controlled reactions using dynamically varying amounts of two catalysts It uses the response. In its simplest form, the analyte is the substrate Two enzymes used as products are products Compete for the conversion of that substrate to. One of the products is all-or-none (all-or-n one) shows a detectable result; the other shows no detectable response. If the subject High concentrations of abundant competitive enzymes that remove it from conversion to a detectable product Not even a problem; however, low analyte concentrations are sufficient to see results There will not be enough. Therefore, a high concentration of analyte will compete with a high concentration of enzyme Would be able to show detectable results even in the presence of. Hohosh US Patent 4,042,329 to Hochstrasser In the slightly different but relevant approach described in Stoichiometric reagent concentrations are used to achieve semi-quantitative results in a range of test areas. It The perspective for the assay of the present invention is to set up a series of test areas without the need for serial dilution. Also provided is a method for determining the quantitative analyte concentration used. Mentioned above In contrast to the technique, the method of the present invention can either be the analyte itself or a special binding of the analyte. Take advantage of the variable binding affinities of partners and multiple ligands. Any place Even in the case of the present invention, the present invention reacts to a single substance with varying degrees of effectiveness. It utilizes a large number of ligands. Drug delivery(Drug Delivery) Biologically active compounds or compounds capable of labeling tissues for diagnosis The discovery of things is about using these substances for their desired end purpose Are just a few of the complex issues of. For example, in order for a drug to be effective, Must exist in the environment of the intended target for sufficient time to exert their effect. I won't. Drugs often also exert their effects by selective transport to these targets. Volatile. The same applies to the use of labels to localize specific tissues . The mechanism that causes such localization and the localized labeling In order to clarify the remaining background markers from the system We have to find the mechanism of. There are several effects that can produce these effects. Proc is known. Toxins that are intended to be destroyed, such as tumor cells, With a specific affinity test, such as an immunoglobulin that can bind to other tumors It has been suggested to complex with the drug. Possibly a special binding reagent on the surface of the tumor By assembling a combination of a toxin and a toxin, the tumor has its specific affinity. The sexual reagent is destroyed at the expense of tissues that are not attracted. Similarly scintigraphy A label with a reagent that has a specific affinity for the target of the reagent, for example. There is a technique that utilizes a specific image of a special tissue by making it possible. Furthermore To In general, some reagents polymerize like polyethylene glycol Is modified to enhance the effect over its half-life. Only While the biologically active substance being transported is exclusively transported to its desired target Be careful with the pharmacokinetics so that when the goal is reached, the rest of the tissue will be wiped out It was not possible to test it. In many cases, enough chemicals in the desired location It wasn't even possible to accumulate. From the viewpoint of drug delivery of the present invention, these general approaches are effective. To provide a method of improving the accuracy of achieving It is applicable to transporting a target substance to a target in any environment in vitro. obtain. Disclosure of the invention First, the present invention is directed to target analytes under field or clinical conditions. Provides a straight forward, quantitative method for simple determination of the concentration of And the analyte or specific binding moiety reacts with that analyte. It takes advantage of varying ligand affinities for any of its specific binding moieties. To use. In a preferred competitive embodiment, the reagent is the specific binding partner. It will change the degree of competition for The test sample's competitive success was made into a calibration curve for known analyte concentrations. It can be used as an index of quantity. Thus, in one preferred aspect, the invention provides for the amount of analyte in the sample. Directly to the method of determining the Including applying. The test area can bind to the desired analyte Includes ligands with varying affinities for possible specific binding partners. That The test region is related to its specific binding partner in a continuous, i.e. distinguishable manner Are arranged in such a manner that the affinity of the contained ligands increases monotonically. Rice cake Of course, this is the simplest possible method, eg ligands with increased affinity are left It is made in a linear arrangement that is placed from to right. When the sample comes into contact with multiple test areas, a certain amount of specific binding partners Provided for each, and of course included in each test area from the beginning Can be Contact of the sample with its test area in the presence of a specific binding partner Later, if necessary, not bound to a ligand that is bound to that test region Its specific binding partner is washed away. Go as known to those skilled in the art Washing is not essential for some detection methods. The remaining bound specific binding patterns The toner is then detected. Then contains the bound specific binding partner That portion of the test area is used as a measure of the subject. That Intermediate values between all or nothing in each zone give more accurate values . Semi-quantitative data available from the methods of Lee and Hochstrasser mentioned above. The results obtained using the method of the present invention, unlike A fully quantitative analysis is possible if it can be interpreted more qualitatively. Positive answer obtained Accuracy is increased by considering the number of reagents for the test part and the appropriate choice of reagents. Big Alternatively, many of its test parts can be used in a direct, non-competitive format. Used, where a series of specific binding ligands are altered relative to the analyte itself Have an affinity. High affinity for analytes at low analyte concentrations Of analyte sufficient to detect only those test moieties containing ligands with Would combine. This method (embodiment) of the present invention is kinetically ) Depending on whether it is controlled or balanced You can do it. The optimal range of binding affinities needed to give a quantitative result is a competitive specification. Like that, and can be done using routine experimentation. In another aspect, the invention also relates to a test device for use in the method of the invention. Of. These test devices have an affinity for their specific binding partner. Includes multiple test regions with varying ligands (or with respect to the second specification , For that analyte); that test area is a specific binding partner (or analyte) So that regions containing ligands with increased affinity for (analyte) can be easily identified Arranged in any way. The viewpoint of the drug delivery of the present invention is to form a complex with a target substance. Included release agents (ie releasing agents) and modu- latins Desired by effectively competing with the modulating material It provides a means to control the absolute and relative amounts of the target substance at the location. That Lerry The drug may be delivered at the appropriate time, or it may be internal to its target location. Good. The complex is maintained completely until its release agent is supplied or collided. Its important ingredients can then exert their effect. Thus, the present invention modulates the activity of a desired substance with respect to a target under certain circumstances. A method for modulating (modulating), which method controls the desired substance. To provide a complex containing a reagent and to interact the release agent with the complex. More desired substance from complex Including effective release of This release agent is It competes with the desired substance of the control reagent or control reagent, or Separate the aggregates brought about by the roll reagents. In one embodiment, the complex is used in vivo as its control reagent. Size-enhancing (size-enhan that provides complexes with low clearance rates) cing) agent. Therefore, the target component is a complex of high aggregate weight, Maintained during (subject). Clearance destroys the complex and its desired component Can be provided by providing a release agent that releases the This method is desired Can contain components of specific affinity that selectively bind to the target It The size-enhancing agent is released until enough desired ingredient has accumulated in the target Or not dissociated. In other embodiments, the activating component is activated while it remains in the complex. It is complexed with a partner that inactivates it. If this inactivating substance is biological If the chemically active substance also has the ability to specifically bind to the target of interest, then If the binding to the target then destroys the complex, the activator is present in the target. It will only be active in its immediate presence. Targets or substances that are in close proximity It functions as a release agent. Alternatively, an external release agent can be used It In a third exemplary embodiment, the active substance is the substrate or pseudo-target of interest. Complexed to a competitor for a pseudosubstrate Is administered. A high concentration of the target or pseudo-substrate then releases the active substance. Lease). Brief description of the drawings 1a-1c show the complex between the active ingredient (AC) and the control reagent (CA). The effect of increasing the concentration of the release agent (RA) in Of. 2a-2b show self-aggregation size enhancing agent (SEA) as control agent. , The effect of increasing the concentration of the release agent in the aggregated complex is summarized. It is shown schematically. Figures 3a-3b show an aggregation complex containing a size enhancing agent and an immunoconjugate. 2 schematically shows the effect when the concentration of the release agent is increased. Figures 4a and 4b show further details of the complex of Figures 3a-3b. Figures 5a and 5b show binding of immunoconjugates to polymers containing epitope analogs. 3 shows the effect of competition for epitope targets at high concentrations in. FIG. 6 shows various reagents that react with one analyte. 3 shows an exemplary affinity titration curve. Embodiment of the invention In the method of the present invention, affinity titration is performed to generate a readable signal. Replace with titration. The general principle can be described as follows: FIG. 6 is different The response of a dose to an analyte depends on the analyte or competing species. 3 offset by one another due to the specific affinity of their binding reagents with respect to Figure 2 schematically illustrates the specific binding reagents or ligands (A, B and C) of. Figure As shown, the shifted dose-response curves show different concentration bands (numbered 1 5 to 5) show response patterns that can be distinguished for the subject. Thus, an unknown mark The concentration band in the book compares its response pattern for these three ligands, And by comparing its response with that of a standard. Within one obi Quantitation can be done by standard methods or, if desired, within this range. Can be done by increasing the number of binding reagents. US Pat. No. 5,113,866, which is hereby incorporated by reference herein for reference It describes the generation of various panels of ligands of varying properties. These pas A channel is a unit that contains a specific binding partner for the analyte or the analyte itself. Parents to Moi No Ichi It is particularly useful for providing multiple ligands of varying compatibility. Maximum Diversity is not required for the ligands used in the present invention, but such Diversity organizes the binding of ligands with respect to the analyte or specific binding partner. It is advantageous because it is controlled dynamically. The various panels of ligands described in the above referenced patents are monotonically variable. Suitable as a source of a ligand with the ability to bind Other sources of do may be used as well. Altered affinity for specific binding partner A series of monoclonal antibodies can be used, for example. As well as random or Peptides with systematically varying sequences should use techniques currently well known in the art. Can be caused by. Relatively inconvenient, but suitable based on the nature of the target to which the ligand is to be bound A range of rigors whose affinity changes due to essentially trial-and-error among different candidates. It is not impossible to get a handicap. For example, the subject or its characteristics relating to the subject. If the heterologous binding partner is an enzyme, a substrate molecule or inhibitor for that enzyme You can use the fluctuations of the child. If analyte or specific binding part for analyte If the ner is a receptor, it is known to bind to that receptor Is it possible to utilize the fluctuation of the ligand; conversely, the target compound binds to the receptor Is a known moiety that binds to the receptor protein Fluctuations can be used. Thus, systems for analytes or specific binding partners for analytes Many approaches to obtain the desired set of ligands with systematically changing affinities Are available in the art. The preferred competitive form of the method is a "specific binding partner" for the analyte. use. As used herein, a “specific binding partner” is the desired target. Substances known to bind to a sample with a considerable affinity; Typical such specific binding partners are antibodies or Fab, Fab '. Fab '₂Immunologically reactive fragments thereof, or, for example, its analytes The receptor for the ligand when is a ligand matching the receptor And so on. And, of course, if the analyte is the antibody itself, The heterologous binding partner can be the antigen to which the antibody responds. The assay of the present invention has an affinity for its specific binding partner or analyte. Preferably on a solid support matrix to which the variable ligand is attached. Yes. However, some detection methods that have a homogeneous solution phase are advantageous. Can be used for assays involving homogeneous solutions such as fluorescent energy transfer. It is possible to configure such assays; washing and attaching solid supports. ment) is not required. A solid matrix has separate test areas bounded by its surface. It can be of any design as long as it can be compartmentalized. For example, microtiter Conventional substrates of this kind, such as rate, are conveniently available. Instead, the hydrophobic border Uses a planar hydrophilic surface that is divided into multiple test areas by application of a field Wear. For example, to divide a large number of rectangles or squares arranged in a straight line, Backing with cross-hatchings Cellulose could be used. The test area array design (shape) It is a matter of convenience and simplicity of interpretation. Preferably these regions are Linear alignment (array with increased affinity for specific binding partners or analytes) The manner in which the laid ligand can bind to its backing. Will be placed in. Alternatively, the ligand can be circular or spiral or any other convenient It can be arranged in a regular and intended pattern. Of the same or different subjects Such a large series of monotonically increasing affinities for specific binding partners Ligands can be placed on the same substrate or surface of a solid support. The nature of the binding of the individual ligands to each test area depends on the nature of such binding. If desired, depending on the nature of the solid substrate and the nature of the ligand used, it can also be broadened. Changes. The binding may be covalent or by adsorption. if If the peptide is used as the source of multiple affinity ligands, A substrate capable of forming a ter, amide or S—S (disulfide) bond, or a substrate A linking moiety capable of forming an appropriate covalent bond with Can be used. However, it may also contain nucleic acids, carbohydrates, and other polymers. Different types of ligands could be used as well. Some of these are referenced patents above It is described in. Binding is by conventional methods; eg to cellulosic substrates The bond is cyanogen bromide, alkyl chloroformates , Or carbonyldiimidazole, cyclic carbonate or charcoal The acid salt active ester is formed. When the test equipment was started up, each test area was separated and It binds to its ligand with a specific affinity in the pattern. The bond is this A series of varying affinity for its specific binding partner or analyte It becomes the test area of. Test areas for implementation in competing specifications Including that support included in each test area prior to the test itself Known amount (preferably a fixed amount) of a specific binding partner that is bound but not bound May be selectively provided. Alternatively, the specific binding partner is It may be provided as a separate solution at that time. The smell of the test For example, the sample may be used with a fixed amount of specific binding partner to test the entire test area. Applied to. The binding partner that is specific to the sample and the ligand contained in the sample Sufficient time for competition to occur with the analyte for a specific binding partner, It is in contact with a series of test areas. Specific binding to ligand Depending on the method of detection of the binding of the partner, the ligand is tested in the test area after the incubation period. The test portion is washed so that only the specific binding partner bound to May or may not be necessary or desirable. In any case, the characteristics of binding to the ligand in a specific test area The presence or absence of a heterologous binding partner can interfere with the sample containing the analyte after culturing. Will be detected when This detection can be done in various ways. In several ways It is not necessary to wash the solution containing unbound specific binding partner Absent. For example, including binding of the ligand to the solid support. Fluorescence is attached to its specific binding partner on the solid support A fluorescent emitting compound can be provided that can be quenched by the moiety. Bound specific binding pattern -Only the toner can quench the fluorescence, so the unbound particles in the solution The presence of toner does not interfere with the measurement. In this method, the ligand is It can likewise be used in the homogeneous medium present in the solution. There Is the presence or absence of a signal such as a fluorescence signal only at the surface, not elsewhere. Optical devices to detect the presence can also be used. For example its specific binding partner binds to the enzyme for detection of bound enzyme A more traditional method, such as adding substrate solution to the series of test areas, is to May require precleaning of the test area. If the test area is really cleaned If there is no specific binding partner that does not match, the specific binding partner The presence or absence of a user can be determined by using such conventional methods. Detected in the strike area. For example, if its specific binding partner is an antibody In fact, the antibody may contain some label itself, and especially immunologically It can also be labeled with a reactive secondary antibody. Various conventional labeling methods Radiolabels, enzymatic labels, fluorescent labels, and combinations thereof It is well known in the art, including matching. When the detection is effectively done, the pattern of binding is then observed. Single series In the test area of It will not be able to bind to a specific binding partner. Bound ligand Samples containing only small amounts of analyte, which can compete with each other, are often used in many test areas. Will be the series of test areas showing the presence of the label. Join like this The proportion of the test area showing is roughly inversely proportional to the analyte level of the sample. So Testing is done semi-quantitatively with known amounts of analyte and appropriate standards . The level of accuracy depends on the phase of the test moiety with respect to its specific binding partner. By tailoring pairwise affinities, one can change according to the desired level of need . Large numbers of such test moieties with ligands with a modest increase in affinity It can be used to increase the accuracy of the assay. Alternatively, in a direct specification, many test parts may be assumed to contain Contact with the sample. The ability of the analyte to bind the ligand in a particular test moiety Force depends on the affinity of the ligand present in the test part for the analyte itself To do. Binding can be judged on a mechanical or equilibrium basis; Use short-term cultures that end before reaching equilibrium if judged by standing To be done. In this specification, the analyte is preferably a test sample containing the ligand with the highest affinity. Will bind to the ligand at the Only test moieties with very high affinity successfully bind detectable amounts of analyte Will do. Higher concentrations of analyte will have ligands with relatively low affinity. Even test moieties that could be bound could bind to the analyte. The detection of the ligand-bound analyte in this specification is based on the binding of the solid support surface. It can also be done by measuring changes in properties. However not bound Removing the sample containing the analyte and using a secondary binding reagent containing the label. More conventional approaches, including the inclusion of However, cleaning is a trial It is generally not indicated as it may change the nature of its combination of charges. this One example of an approach is, for example, an antibody or its ability to specifically bind an analyte. The antibody or its fragment itself is radioactive, fluorescent. , Enzymes, or other labels. The result then determines the number of areas in the sample to be tested that bind to the analyte, Standard concentration control It is measured by comparison with the number of test areas that bind the analyte therein. This finish , Higher concentrations of analyte yielded detectable binding in a larger number of test areas. Will show. Whether run in direct or competitive format, the assay has many The strike area is used. Preferably, the test area is The fruits are arranged in such a way that they can be measured and associated with a particular ligand. Directly Conventional measuring devices have an increased affinity for the analyte or its special Certain criteria, such as linear ligand placement, that increase the affinity for the binding reagent. Regular placement will be required. Alternatively, a spiral or two-dimensional alignment Other regular arrays such as this could also be used as long as the results are understandable . If the test area is simply a well of a microtiter plate or If it's a rack test tube, its arrangement is flexible and practitioner's choice. Entrusted. Random physical placement also determines the location of ligands with different affinities. It can also be used by using a computer to sort. Only In principle, a single-spec test is simply a test that gives positive results The number of parts will be decisive. To create a device with the required number of test areas One particularly convenient method is that the matrix regions are separated from each other by a hydrophobic barrier. It includes a hydrophilic matrix of a basic substance. 1 like this Two cellulose mats are square with wax lines or other hydrophobic barriers It can be subdivided into shapes or other suitable shaped regions. The present invention also relates to the interaction of the target substance with other substances through the process of "affinity competition". By controlling the behavior of a substance in a special environment such as a metabolic system. Provides a way to control. Target substance or material is "control" Included as a complex with the reagent, this complex will Its properties by activating and changing its size or by other methods Change and control. The complex is an eye for the control reagent. Competitive with either the target substance or the control reagent for the target substance Or causes dissociation of self-aggregates formed by control reagents " Dissociated by the release agent. Between the "control reagent" and the target substance The presence of the release agent in the vicinity of the complex of By administration or by localizing high concentrations of the release agent at the target location. It is achieved arbitrarily. The release of the desired substance from the complex is It is an inevitable result of affinity titration with respect to agent concentration. High release agent concentration The more the release capacity of the desired substance is substantially greater. To the desired substance Affinity of the control reagent for the target substance or control reagent By adjusting the strength of cohesiveness with respect to the affinity of the release agent for release The appropriate concentration of the drug can be determined. If the release agent is endogenous , The affinity of the components of the system depends on the concentration of the release agent found in the environment. Must be adjusted to suit. The successful application of the method of the invention depends on the release of one component of the complex. Correct selection of the affinity of the agent and the affinity of said one component for the rest of the complex Depends on the right choice of sex. For example, if the release agent Dissociating the complex by outcompeteing the active ingredient to which it binds , The affinity of the active ingredient for the control reagent and The affinity of the release agent for the control reagent in comparison is The achievable concentration of the agent is dependent on the interaction between the release agent and the control reagent. It should appear to be sufficient to tip the balance of harmony. Appropriate Panels of materials with systematically varying properties to provide an affinity release agent You can rely on Le. This This is because of the affinity of the control reagent for proper selection of the release agent. Will give a range. Conversely, such a panel would contain a predetermined concentration of release agent. Can be provided for a suitable control reagent that responds to the frequency. Such a panel with systematically changing characteristics is eg rice as shown above. It is described in Japanese Patent No. 5,133,866. This patent covers the range of desired affinity. Maximum change to minimize the number of candidates in the panel required to bar A panel of ligands with the properties to Not only release agent but also compound The use of such panels as a source of material for the formation of the body is desirable However, it is not requested. Needed for its complex component (or its release agent) Any method for obtaining a range of affinity so that a substance having an affinity to be used can be used Can be used. The general principle is shown schematically in Figures 1a-1c. Its simplest form In the formula, the active ingredient (AC in the figure) is complexed with the control reagent (CA). In body form, typically administered to an environment with low concentrations of release agent, as shown in Figure 1a To be done. The complex remains intact at these concentration levels. However that When the release agent concentration increased, did the complex react with CA as shown in Figure 1b? Or as shown in Figure 1c It dissociates due to the affinity of the release agent (RA) for its active ingredient. If Reli If the source agent is the target of the active ingredient or binds to it in some way, then The effective concentration will be highest at the target site. Another possible form of this concept is shown schematically in Figures 2a and 2b. 2a smell Therefore, the complex having a high aggregate weight (aggregate weight) Formed by the self-assembly of a reagent, in this case the size-enhancing reagent (SEA) To be done. SEA can be covalently bound to a target substance, an active ingredient (AC). Leri In the absence or low concentration of sorbent, SEA is complexed as shown in Figure 2a. Agglomerates to form. However, if the release agent is present in a suitable concentration, In this case, the size-enhancing reagent effectively lowers the active ingredient, as shown in Figure 2b. It dissociates so that it exists as a large amount of aggregation. Examples will be shown below, but these do not limit the present invention in any way. Example 1 Assay The assay is Scott, Jay. Kei. (Scott, JK) et al.Proc Nat l Acad Sci USA (1992)89: 5398-5402) Can be. In short, lectin concanavalin A (Co nA) specifically binds to sugar methyl-alpha-mannose (MeMan). Multivalent ConA is derived from various bacteria, such as from strain B-1355-5. Binds with dextran to form an insoluble complex. ConA Dextran sedimentation Inhibits in a dose-dependent manner by MeMan Can be To screen a phage epitope display library Thus, some peptides (eg, M) that also inhibit the precipitation of ConA dextran YWYPY and VGRAFS) were identified with a marked inhibition value of 50%. In principle, the measurement of MeMan as an analyte is such a competitive ligand. As a peptide or to prevent the precipitation of ConA dextran This can be done by effectively expanding the range of possible MeMan concentrations. . Dextran and peptides can in principle be immobilized and It can be used to competitively trap onA. Conversely, MeMan and peptide As a competitive reagent that determines the ConA concentration range, ConA Run B-1355-5 can be considered as a specific binding reagent, respectively. The viewpoint of the drug delivery of the present invention is as follows. Of the examples. These examples decomposed in the presence of the release agent. General features that provide a complex between the control moiety and the target substance The sharing of sex will be apparent upon looking at these examples. Example 2 Toxins or radiometal-conjugated models for use in treatment or diagnosis. Transport of noclonal antibodies Monoclonal antibody as a specific affinity reagent for targeting malignant tumor cells And specific affinity for marking those cells for detection or destruction Many attempts have been made to utilize it as a sex reagent. Thus, labeled, Or other drug, or other target substance delivery to the tumor target (delivery An extensive body of literature describing immunoconjugates for) is now available. This of this invention In the examples, the immunoconjugate is therefore a substance of interest. ). The tumor cell constitutes the target. One issue that has been a concern for the transport of immunoconjugates is low molecular weight, preferably Is 70 kilodaltons (kd) or less, more preferably 20 kilodaltons or less. Is desirable for tumor mass invasion, but such low molecular weight immunoconjugates It is to be cleared quickly by the kidneys. That Tumor Localization to the ulcer is estimated to require 24-36 hours; up to this time Almost all such low molecular weight substances are cleared by. On the other hand, an appropriate amount If the substance is accumulating in the tumor due to the ability of the monoclonal antibody to bind If so, rapid clearance is desirable. If the purpose of the immunoconjugate is If it's wisdom, such clearance reduces that background, Increase detection accuracy. If the immunoconjugate is intended for treatment, then Talarence such as prevents the adverse effects on healthy tissue. However, complexes greater than 70 kilodaltons are not rapidly tallyed. if The immunoconjugate is present in the tumor tissue for a sufficient period of time to exceed this molecular weight. Can be part of a complex that can be released and released for entry and clearance. Then the ideal pharmacodynamic situation will be achieved. This ideal situation is that the release agent is complexed with its immunoconjugate until it is delivered. Achieved by supplying appropriate size enhancing reagents that can be maintained in the body Can be done. Its size-enhancing reagents and their complexes for various purposes are envisioned obtain. For example, a monoclonal antibody or preferably an immunoactive site--ie F_v Area --- is the radioisotope As a chelating site for labeling and a size-enhancing reagent as shown in FIG. Fusion protein with a peptide that can be modified to include an extension site Can be made as quality. F_vThe fusion protein of the region is exemplified, but Reagent (in this case the size enhancer represented by the extension of the peptide Reagents) instead include peptides but other suitable such as oligonucleotides. Can be covalently bound moieties that also include various chemicals. As shown in FIG. 3a, a radiolabel or drug shown as an asterisk in the figure F combined with goods_vRegion antibody is extended by size-enhancing reagent (SEA) To be done. The label is on SEA or F_vCan be placed on top of Can be added later. The purpose of SEA is to promote the formation of dimers or multimers It is to be. This is an extension that is oppositely charged and attracts each other, S It may be effective by using EA, SEA '; As such, stretches with natural affinities can be used. Generally only 1 Size enhancement that easily self-aggregates by preparing a set of reagents Reagents are preferred. The mutual affinity of the stretches is maximally diverse, as described above. For designing epitope / paratope pairs using a panel of diversity candidates Described in US Pat. No. 5,217,869, herein incorporated by reference. It can be modified by using the screening technique described above. Lerry The agent RA will dissociate the dimer of SEA at the appropriate concentration as shown in Figure 3b. As such, it has a sufficient affinity for the extension of at least one SEA. The somewhat more sophisticated version of this design is shown in FIG. This example In, the extension of the size-enhancing reagent leads to branching of the fused peptide. It thus has at least two binding arms formed. The joining arms are electrostatically attracted between the positive and negative arms to keep the complex together. Polylysine (polylysine), which can be shaped to aggregate using force⁺) Or po Liglutamic acid or polyaspartic acid (poly^-) Like polyion It may consist of a sex area. Alternatively, the binding arm is the epitope that binds / It may consist of a pair of paratopes. F_vOr branching fused to Mab Peptides with open arms can thus aggregate individual fusion peptides It is a size enhancing reagent. The aggregate is thrown onto the body of the subject animal. Upon application, the complex accumulates in the targeted cells or tissues. That accumulation occurs The release agent is added when sufficient time has passed to scrape. If that joins If the arm is polyionic, the release agent may be positively or negatively charged, for example. Of peptides (polylysine, or polyglutamic acid or polyaspartic acid) Exists in shape. If the binding arm is an epitope / paratope pair, The release agent is a paratope or epitope or the like (mimi c). The interaction of the release agent with the aggregated complex dissociates them, Its aggregated weight so that clearance and penetration for the molten protein is realized Reduce the amount. The embodiment described above is schematically illustrated in FIG. Figure 4a shows a bifurcated extension Shows perfect aggregates assembled by oppositely charged polyionic arms of ing. When a high concentration of a release agent having a positive charge is used, for example, as shown in FIG. As such, the complex dissociates. The active moiety also has a moiety that interacts with the control region of the active ingredient. Like polymeric beads with interstices to support, control Can be included in the released release agent. The active ingredient is its control area Along the area, it is released from the gap by diffusion. Release speed is active A special affinity between some of the active ingredients and the "control reagents" contained in the polymer Controlled by sex Where the effective local concentration of the polymer-containing moiety is its proper diffusion. It can be adjusted to provide speed. In this case, the release agent controls diffusion. Including the surrounding environment. Suitable polymers are polyacrylamide, collagen, Others include perforated polymers. Alternatively, the radioisotope label or toxin or drug is Or covalently, as in the case of toxins, or in the case of radioisotopes As by chelating F_vImmune contacts that may bind to and result in units The combination comprises at least one affinity ligand (an appropriate antigen or Adsorbed to a polymer having an epitope (like). Suitable polymers are, for example, Like polyethylene glycol, polyacrylamide, polymethacrylic acid, etc. Inert, biocompatible material. Then affinity The limmer size enhancing reagent is sufficient to accumulate sufficient immunoconjugate at its target Maintaining the immunoconjugate in an environment that contains its target. Its affinity polymer size Some of the enhancing agents are used by the endogenous anti-antibody when the complex reaches its target. Released by competition for immunoconjugate from raw (as release agent) However, in the case of the circulating complex, this may for example be the target epitope. table It can be released at a suitable time by administration of the peptide. Smaller epitome Then replaces the affinity polymer so that it is effectively cleared. It will effectively reduce the aggregate weight of the recombinant complex. This is illustrated in FIG. FIG. 5 shows the epitope contained in the polymer. Or immunoconjugates complexed by affinity for epitope-like regions Shows. At low concentrations of the epitope, the complex was intact as shown in Figure 5a. Stay in a state. Increasing the local concentration of the epitope, as shown in FIG. Dissociates. Another strategy is to use size-enhancing reagents in immunoconjugates. It provides a separate affinity region for. In this method, the release agent is Not supplied depending on the target. Size-enhancing reagents can also be multivalent Yes. For example, the immunoreactive region of the desired antibody is related to the targeted immunoreactive region May be covalently bound to a second immunoreactive region that lacks the immunoconjugate; Contains desired moieties such as xin, drug, or radioisotope U This immunoconjugate is therefore 1) free from the specific binding to the target. Epidemiologically specific region; 2) immune to its size-enhancing reagent Epidemiologically specific area; 3) Includes markers or drugs. Size-enhancing reagents The specific binding partners of Containing one or more ligands that specifically immunoreact with a region of the immunoconjugate. You can leave it. The complex is then immunoconjugated by this second immune response region. A size-enhancing reagent (such as a derivatized polymer) complexed with this In some cases, any solution that allows the complex to sense even if it accumulates at the target No separation occurs. This is a release agent that can be used as a size-enhancing reagent or The affinity ligand used to bind the complex to the like is used. It is brought about by giving. Example 3 Active site masking and exposure The method of the present invention exposes the active site of a biologically active molecule at the site of action. You may use it to do. This example shows the location of the site where the biological activity should occur. Difference in the specific affinity of the masking reagent for the release agent (di fferential attinity) or compared to masking (control) reagents Depends on any of the differences in specific affinity of the biologically active reagent for its target It The application of this example relates to the administration of insulin. Insulin is currently given by injection, however, normal liver insulin Hepatic insulin levels are 10 to 50 times blood levels. Hope Insulin administered by injection to obtain better liver insulin levels There is a need for a dramatic increase in drug dose. This is a normal level in one protocol. 25 times more insulin than hypoleptic effect on these high insulin levels Made by administration with enough glucose to offset the fruit . This approach is cumbersome and unsatisfactory in that respect. In the method of the present invention, the active site of insulin is relative to insulin. Ligands with a higher affinity for liver-specific cell surface antigens Have been In other selections, insulin is specific for hepatocyte antigens. As an immunoconjugate and by the method described in Example 1 above. Released from the complex containing the Eng's reagent. Thus, that insulin is Until it reaches the site, it is masked (protected) from activity in the blood and The cell surface antigen at the liver site replaces the masking reagent and becomes active insulin. It Example 4 Substrate affinity or pseudo substrate affinity competition In a third embodiment, biology acting directly or indirectly on endogenous substrates Biologically active moieties are bound by biologically active substances but Providing a moiety that binds to an alternative substrate that is not recognized as a pseudo substrate Can titrate depending on the concentration of the substrate. For example insulin Can be provided as a complex with an antibody or lectin that binds to dextran Yes; then the dextran is replaced by high endogenous glucose levels . In this example, insulin does not interact directly with glucose. However, glucose is considered to be a pseudo-substrate for insulin because it contributes to its metabolism. Can be Of course, insulin levels available when high concentrations of glucose are present It is desirable to increase The insulin has an affinity for dextran By binding to the antibody or lectin that it has, it causes glucose metabolism. Complexes can be formed that adversely affect insulin capacity. High concentration Glucose immobilizes antibody-bound insulin or lectin-bound insulin. If you release from kisstran and still bind to the lectin or antibody, It will allow insulin to exert its metabolic function. In this example , That dextran is It plays a role as a roll reagent, glucose is a release agent, and the target substance is Is insulin; the active ingredient of the complex is the lectin-insulin complex or Antibody-insulin complex. Example 5 Use of bivalent mimotopes In yet another embodiment, a bivalent mimotope combination is used. Use, that is, its valence has an appropriate affinity constant and is a divalent antibody or immune reaction The one that is complementary to the valence of a part is used. Valency of a mimotope that is at least divalent One of the target antigens--for example against the corresponding region of the antibody compared to the tumor antigen Has a controlled affinity. In a sense, this value mimics that tumor antigen. At low concentrations of tumor antigen, such as those that arise in the blood from the antigen-shedding The bivalent mimotope is complexed through both valencies to its complementary bivalent antibody. However, this complex is effectively inactive. However, it was found at the tumor site At such a high concentration of tumor antigen, at least divalent imitating that tumor antigen Part of the mimotope of is effectively displaced from its binding site on the divalent antibody, The bivalent antibody binds to the tumor. Only one of the valences of the antibody is Mimoto The affinity of the mimotope for the antibody to interact with one of the valences of the group Was Therefore, the bivalent mimotope is eventually masked. Administered this way The integrity of the complex is dependent on the tumor antigen--that is, the endogenous concentration of the release agent. It is designed to be quantitatively affected by differences in degree. Yet another alternative is for the extension to the antibody to include an epitope analog. , Including chimeric proteins. Epitope analogs immunize other molecules of the chimera Combines with the reaction site to form a dimer. This dimer has its epitope It dissociates when replaced by a drug, such as a tumor antigen. Summary of Examples 2-5 In Examples 2 to 5, for example, target substances and complexes for treatment or diagnosis Desirable properties--controls that give, for example, the size and inertness of the target substance A complex containing the reagent is formed. The complex is suitable when the release agent is suitable Provided endogenously at different concentrations or administered separately, until complete dissociation Stay in a state.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, M C, NL, PT, SE), AU, CA, JP

Claims

[Claims] 1. (A) The sample is applied to a number of test areas, each test area being It is arranged to allow regular search of results in Parents to the body or specific binding partners capable of binding to said analyte Including a series of ligands whose compatibility changes systematically, The specific binding that allows the systematically varying affinity to bind to the analyte. When applied to a mating partner, the application is a fixed amount of the specific binding. In the presence of a partner, the ligand and the analyte bind to the specific binding partner. Under competing conditions, (B) the analyte or specific that binds to the ligand in each test region Various binding partners, and (C) Evaluate the portion of the test region to which the analyte or specific binding partner binds Characterized in that the concentration of the analyte is determined by A method of determining the concentration of the analyte in the sample. 2. The method of claim 1, wherein the ligand is bound to a solid support. Law. 3. After the step (a), it is further bound with the ligand contained in each test region. Incompatible subject or specific 3. The method according to claim 1, further comprising the step of removing a specific binding partner. How to list. 4. Whether the ligand is hydrophobic, charge distribution, and corrugation factor Maximally different in at least two parameters selected from the group consisting of The polymer according to any one of claims 1 to 3, which is a polymer having characteristics. Law. 5. The binding analyte or the specific binding partner is an enzyme or a radiolabel Detected by, or said bound analyte or specific binding partner is Contracts characterized by being detected by assessing differences in the characteristics of the test area. The method according to any one of claims 1 to 4. 6. The systematically varying affinity is for the analyte, and the test A region further comprises said specific binding partner. The method according to claim 1. 7. A series of hydrophilic matrices with the test area separated by a hydrophobic barrier 3. A method according to claim 2, characterized in that it is arranged linearly on the surface of a plane. . 8. The test region has an affinity for the analyte or specific binding partner Are sequentially arranged with monotonically increasing ligands. 7. The method according to any one of 7 above. 9. Suitable for carrying out the method according to any of claims 1-8. A set of test areas. 10. One arranged to allow for a regular search of results in each test area. A series of test areas, the test areas being capable of binding an analyte or a desired analyte. Contains a series of ligands with systematic changes in affinity for heterologous binding partners Test equipment. 11. The series of test areas are sequentially arranged for the monotonically increasing affinity. And / or said ligand is bound to a solid support The device according to claim 10. 12. From the hydrophilic matrix where the test area is separated by a hydrophobic barrier The device of claim 11, wherein: 13. The systematically varying affinity is for the analyte, and the test 11. The domain further comprises the specific binding partner. An apparatus according to any one of 1 to 12. 14. Providing the target substance contained in the complex containing the control reagent for a certain environment Offering, Releasing the target substance from the complex by providing a sufficient concentration of the release agent. And the release agent is used as a control reagent for the target substance, or It competes with the target substance for the control reagent, or the release agent does not Characterized in that it comprises disaggregating the Troll reagent, A method for changing the activity of a target substance on a target in the environment. 15. The release agent is endogenous to the environment, or the release agent Bind to the target, or the release agent releases the environment when the release is to take place. 15. The method of claim 14, wherein the method is administered to the. 16. When the control reagent is in the complex, the biological Inactivates the activity profile or allows the control reagent to size enhance The method according to claim 14 or 15, which is a reagent. 17． The size-enhancing reagent has the ability to aggregate and has a dual function. Or the size-enhancing reagent is And a polymer bound to at least one affinity ligand directed to the ligand reagent. 17. The method of claim 16, wherein the method comprises: 18. The specific affinity for the target localized in the animal subject to the target A method of transporting a moiety having a cohesive weight of less than 70 kilodaltons , For the subject, including the moiety and at least one size A complex containing an enhancing reagent and having an aggregate weight of more than 70 kilodaltons Including administering the body, Allowing the complex to be present in the target and binding at least some of the moieties to the target Sir, Sacrificing the moiety in an amount effective to displace it from the complex (At the expense of) Whether it selectively binds to size-enhancing reagents , Or dissociate the bulking agent (backing agent). Administering a sucrose agent to the subject, And clear any moieties that do not bind to the target from the environment , A method of transporting a moiety, which is characterized by: 19. Inevitably less than 70 kilodalton immunoconjugates and at least one self-aggregate Aggregating weight characterized by consisting essentially of a functional size-enhancing reagent A complex larger than 70 kilodaltons. 20. A complex essentially consisting of an active substance and a control reagent in an environment containing the target And the control reagent is in a complex with the active substance And the control reagent interacts with the release agent to render the complex Removed from The release agent may be provided to dissociate the complex. A method for delivering a biologically active substance to a target characterized by: 21. The release agent is endogenous to the target and the release agent is Target the complex to remove control reagents and activate actives 21. The method of claim 20 including homed. 22. The release agent is glucose and the substance comprises insulin, 22. The method according to claim 21, wherein the control reagent is dextran. Law. 23. The subject contains a biologically active substance and a size enhancing reagent, Administration of a complex having a gross weight of more than 70 kilodaltons, Allowing the complex to remain in the subject for a desired time, Administering a release agent that dissociates the complex into components less than 70 kilodaltons, Characterized in that the component is removed from the subject, A method of adjusting the half-life of a biologically active substance in a subject.