JPH08336386A - フルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新たな臨床分析および食品分析法を開発す
る。 【解決手段】 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生
能を有するペニシリウム属（Penicillium）の菌をフル
クトシルリジン及び／又はフルクトシルＮ^α−Ｚ−リジ
ン含有培地で培養することにより産生されるフルクトシ
ルアミノ酸オキシダーゼ、ペニシリウム属の菌を培養
し、培養物から酵素を分離することからなる該酵素の製
造方法、該ＦＡＯＤを用いるアマドリ化合物の分析法、
該分析法のための試薬およびキット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なフルクトシルア
ミノ酸オキシダーゼに関し、さらに詳しくはペニシリウ
ム属(Penicillium)の菌由来のフルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼ、該酵素の製造方法、該酵素を用いたアマド
リ化合物の分析法、および該酵素を含有する試薬及びキ
ットに関する。

【０００２】

【従来技術】アマドリ化合物は、タンパク質、ペプチド
およびアミノ酸のようなアミノ基を有する物質と、アル
ドースのような還元性の糖が共存する場合、アミノ基と
アルデヒド基が非酵素的かつ非可逆的に結合し、アマド
リ転移することにより生成される。アマドリ化合物の生
成速度は、反応性物質の濃度、接触時間、温度などの関
数で表される。従って、その生成量から、それら反応性
物質を含有する物質に関する様々な情報を得ることがで
きると考えられている。アマドリ化合物を含有する物質
としては、醤油等の食品、および血液等の体液がある。
例えば、生体では、グルコースとアミノ酸が結合したア
マドリ化合物であるフルクトシルアミン誘導体が生成し
ている。例えば、血液中のヘモグロビンが糖化されたフ
ルクトシルアミン誘導体はグリコヘモグロビン、アルブ
ミンが糖化された誘導体はグリコアルブミン、フルクト
シルアミン誘導体のアルカリ溶液中における還元能はフ
ルクトサミンと呼ばれる。これらの血中濃度は、過去の
一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は、
糖尿病の病状の診断及び症状の管理の重要な指標となり
得るために、測定手段の確立は臨床上、極めて有用であ
る。また、食品中のアマドリ化合物を定量することによ
り、その食品の製造後の保存状況や期間を知ることがで
き、品質管理に役立つと考えられる。このように、アマ
ドリ化合物の定量分析は医学および食品を含む広範な分
野で有用である。

【０００３】従来、アマドリ化合物の定量法としては、
高速液体クロマトグラフィーを利用する方法［Chromato
gr.Sci.10:659(1979)］、ホウ酸を結合させた固体をつ
めたカラムを用いる方法［Clin.Chem.28:2088-2094(198
2)］、電気泳動［Clin.Chem.26:1598-1602(1980)]、抗
原−抗体反応を利用する方法［ＪＪＣＬＡ 18: 620(199
3),機器・試薬 16: 33-37(1993)], フルクトサミンの測
定法 [Clin.Chim.Acta 127: 87-95 (1982)], チオバル
ビツール酸を用いて酸化後比色定量する方法[Clin.Chi
m.Acta 112: 197-204 (1981)]などが知られているが、
高価な機器が必要であったり、必ずしも正確で迅速な方
法ではなかった。

【０００４】近年、酵素の有する特性（基質、反応、構
造、位置などの特異性）に起因して、選択的に目的物質
を迅速かつ正確に分析することができることから、酵素
反応を利用する方法が臨床分析や食品分析の分野で普及
してきた。既に、アマドリ化合物に酸化還元酵素を作用
させ、その反応における酸素の消費量又は過酸化水素の
発生量を測定することにより、アマドリ化合物を定量す
る分析法が提案されている（例えば、特公平５−３３９
９７号公報、特公平６−６５３００号公報、特開平２−
１９５９００号公報、特開平３−１５５７８０号公報、
特開平４−４８７４号公報、特開平５−１９２１９３号
公報、特開平６−４６８４６号公報、特開平７−２８９
２５３号公報）。さらに、糖尿病の診断のための糖化タ
ンパクの定量法も開示されている（特開平２−１９５８
９９号公報、特開平２−１９５９００号公報、特開平５
−１９２１９３号公報、特開平６−４６８４６号公報、
特開平７−２８９２５３号公報）。

【０００５】アマドリ化合物の酸化還元酵素による分解
反応は下記の一般式で表すことができる。 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ→ Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ²−ＮＨ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質またはペプチド残基を表す） 上記の反応を触媒する酵素として以下のものが知られて
いる。 １.フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ：コリネバクテ
リウム（Corynebacterium）属（特公平５−３３９９７
号公報、特公平６−６５３００号公報)、アスペルギル
ス属（Aspergillus）（特開平３−１５５７８０号公報) ２．フルクトシルアミンデグリカーゼ：カンジダ属（Ca
ndida)（特開平６−４６８４６号公報） ３．フルクトシルアミノ酸分解酵素：ペニシリウム属
（Penicillium）（特開平４−４８７４号公報)。 ４.ケトアミンオキシダーゼ：コリネバクテリウム属、
フサリウム属、アクレモニウム属またはデブリオマイセ
ス属（特開平５−１９２１９３号公報） ５．アルキルリジナーゼ：Ｊ.Biol.Chem.239巻、第 379
0ー3796頁 (1964年）記載の方法で調製。

【０００６】

【発明が解決すべき課題】しかしながら、これらの酵素
による方法には、下記の問題点があった。即ち、糖尿病
の診断における指標は、糖化アルブミン、糖化ヘモグロ
ビンおよびフルクトサミンである。糖化アルブミンは、
タンパク分子中のリジン残基のε位にグルコースが結合
して生成される[J.Biol.Chem.261:13542-13545(198
6)]。糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンβ鎖のＮ末端
バリンにもグルコースが結合している[J.Biol.Chem.25
4:3892-3898(1979)]。従って、糖尿病の指標となる糖化
タンパクの測定には、フルクトシルリジンおよびフルク
トシルバリンに対する特異性の高い酵素を用いる必要が
あった。しかし、既存のコリネバクテリウム属由来の酵
素はフルクトシルリジンには作用せず、アスペルギルス
属由来の酵素は、糖化タンパク又はその加水分解物に対
する作用については明らかにされていない。他方、特開
平５−１９２１９３号公報記載のケトアミンオキシダー
ゼはフルクトシルバリンを分解し得る酵素であり、リジ
ン残基に糖が結合している糖化タンパクを正確に測定す
ることができない。フルクトシルアミンデグリガーゼ
は、ジフルクトシルリジンに高い活性があるので、リジ
ン残基のε位の糖化物を特異的に測定することができ
ず、また、バリン残基の糖化物を特異的に測定すること
もできない。さらに、アルキルリジナーゼを用いる方法
は糖類以外がリジンに結合した物質に対しても作用し、
糖化物に対する特異性が低いという問題があり、正確な
測定が期待できなかった。特開平４−４８７４号記載の
ペニシリウム属由来の酵素はフルクトシルリジンとフル
クトシルアラニンに作用する酵素である。このように、
従来の酵素は糖化タンパクの正確な定量には適さず、フ
ルクトシルリジン及びフルクトシルバリンに対する特異
性が高い酵素の開発が待たれていた。

【０００７】一般的に、酵素を用いる分析法が正確かつ
有用となるためには、分析の目的に最適な酵素を選択す
る必要がある。即ち、酵素の基質である被検物質の種
類、測定試料の状態、測定条件など、種々の条件を考慮
して適切な酵素を用いなければ、再現性のある正確な分
析を行う事ができない恐れがある。そのような酵素を選
択するためには、予め様々な酵素について、活性、基質
特異性、温度安定性、ｐＨ安定性などが特定されていな
ければならない。従って、より多くのフルクトシルアミ
ノ酸オキシダーゼを製造し、それらの特性を明らかにし
ておくことが望ましい。

【０００８】

【課題を解決する手段】本発明者らは、アマドリ化合
物、特に糖化タンパクに特異的に作用する新規なフルク
トシルアミノ酸オキシダーゼを提供することを目的とし
て鋭意研究を重ねた結果、ペニシリウム属（Penicilliu
m）の菌をフルクトシルリジン及び／又はフルクトシル
Ｎ^α−Ｚ−リジンの存在下で培養すると、目的の活性を
有する酵素が誘導されることを見いだし、本発明を完成
するに至った。即ち、本発明は、ペニシリウム属（Peni
cillium）の菌を、フルクトシルリジン及び／又はフル
クトシル Ｎ^α−Ｚ−リジン含有培地で培養することに
より産生されるフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを提
供するものである。

【０００９】本発明のフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼ産生菌の培養に用いるフルクトシルリジン及び／又は
フルクトシル Ｎ^α−Ｚ−リジン含有培地は、グルコー
スと、リジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジンを温度１００
〜１５０℃において３〜６０分間、オートクレーブ処理
することにより得られるフルクトシルリジン及び／又は
フルクトシル Ｎ^α−Ｚ−リジン（以下、ＦＺＬと略称
することもある）を含有する。後述するように、本発明
のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼはフルクトシルバ
リンおよびフルクトシルリジンの両者に活性があるが、
その活性は、前者に対する活性が後者に対するものより
も高いという特徴を有する。本明細書中では、本発明の
フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをＦＡＯＤと称する
こともある。

【００１０】本発明の酵素は、フルクトシルアミノ酸オ
キシダーゼ産生能を有するペニシリウム属の菌をフルク
トシルリジン及び／又はフルクトシルＮ^α−Ｚ−リジン
含有培地で培養することにより製造することができる。
そのような菌として、ペニシリウムヤンシネルムS-3413
(Penicillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)、
ペニシリウム・ヤンシネルム(IFO NO.4651,6581,7905)
(Penicillium janthinellum)、ペニシリウム・オキサリ
クム(IFO NO.5748)(Penicillium oxalicum)、ペニシリ
ウム・ヤバニクム(IFO NO.7994)(Penicillium javanicu
m)、ペニシリウム・クリソゲヌム(IFO NO.4897)(Penici
llium chrysogenum)、ペニシリウム・シアネウム(IFO N
O.5337)(Penicillium cyaneum)などの種を挙げることが
できる。

【００１１】本発明のＦＡＯＤ類は、一般に、下記の理
化学的特性を有する。 １）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケト
アルデヒド、アミン誘導体および過酸化水素を生成する
反応を触媒し； ２）安定ｐＨは４.０〜１１.０、至適ｐＨは７.５であ
り； ３）安定温度は１５〜５０℃、至適温度は２５℃であ
り； ４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で
測定した場合、分子量は約３８,７００（３８.７ｋＤ
ａ）である。

【００１２】本発明のＦＡＯＤの製造に用いるフルクト
シルリジン及び／又はＦＺＬは、グルコース０.０１〜
５０重量％とリジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジン０.０
１〜２０重量％とを溶液中で、１００〜１５０℃におい
て３〜６０分間オートクレーブ処理する方法で製造され
る。具体的には、全量１０００ｍｌの溶液中にグルコー
ス２００ｇ、Ｎ^α−Ｚ−リジン１０ｇを溶解させ、通常
１２０℃、２０分間オートクレーブ処理することによっ
て製造することができる。また、本発明のＦＡＯＤの製
造に用いるフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ含有培
地（以下、ＦＺＬ培地と称する）は、上記の方法で得ら
れたフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬを通常の培地
に添加するか、例えば、グルコース０.０１〜５０重量
％、リジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジン０.０１〜２０
重量％、Ｋ₂HPO₄ ０.１重量％、ＮａＨ₂ＰＯ₄ ０.１重
量％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ ０.０５重量％、ＣａＣｌ₂
・２Ｈ₂Ｏ ０.０１重量％および酵母エキス０.２重量％
を含有する混合物（好ましくはｐＨ５.６−６.０）を１
００〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処
理することによって得ることができる。

【００１３】本発明のＦＡＯＤの製造に用いる培地は、
炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養源を含有する通
常の合成あるいは天然の培地であってよく、炭素源とし
ては、例えば、グルコース、キシロース、グリセリン
等、窒素源としては、ペプトン、カゼイン消化物、酵母
エキス、等を用いることができる。さらに無機物として
はナトリウム、カリウム、カルシウム、マンガン、マグ
ネシウム、コバルト等、通常の培地に含有されるものを
用いることができる。本発明のＦＡＯＤは、フルクトシ
ルリジン及び／又はＦＺＬを含有する培地で培養したと
き、最もよく誘導される。好ましい培地の例として、上
記の方法で得られるＦＺＬを単一の窒素源とし、炭素源
としてグルコースを用いるＦＺＬ培地（１.０％グルコ
ース、０.５％ＦＺＬ、１.０％Ｋ₂ＨＰＯ₄、０.１％Ｎ
ａＨ₂ＰＯ₄、０.０５％ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、０.０１％
ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏおよび０.０１％ビタミン混合物）
を挙げることができる。特に好ましい培地は、全量１，
０００ml中にグルコース２０ｇ（２％）、ＦＺＬ １０
ｇ（１％）、Ｋ₂ＨＰＯ₄ １.０ｇ（０.１％）、ＮａＨ₂
ＰＯ₄１.０ｇ（０.１％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂０ ０.５
ｇ（０.０５％）、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ ０.１ｇ（０.０
１％）および酵母エキス２.０ｇ（０.２％）を含有する
培地（ｐＨ５.６−６.０）である。ＦＺＬ培地は、通常
の培地にＦＺＬを添加するか、グルコースとＮ^α−Ｚ−
リジンとを含有する培地をオートクレーブ処理すること
によって調製することができる。いずれの方法によって
も得られる培地はフルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ
の存在によって褐色を呈しており、ＦＺＬ褐変化培地又
はＧＬ（グリケーテッドリジン及び／又はグリケーテッ
ドＮ^α−Ｚ−リジン）褐変化培地と呼称される。

【００１４】培養は、通常、２５〜３７℃、好ましくは
２８℃で行われる。培地のｐＨは４.０〜８.０の範囲で
あり、好ましくは５.５〜６.０である。しかしながら、
これらの条件はそれぞれの菌の状態に応じて適宜調整さ
れるものであり、上記に限定されない。例えば、ペニシ
リウム・ヤンシネルムＳ−３４１３株をこの条件下、２
０〜４８時間、好ましくは３６時間培養すると、ＦＡＯ
Ｄが培養培地に蓄積される（図１）。このようにして得
られた培養物は、常法に従い、核酸、細胞壁断片等を除
去し、酵素標品を得ることができる。本発明のＦＡＯＤ
の酵素活性は菌体中に蓄積されるので、培養物中の菌を
破砕し、酵素を抽出する。細胞の破砕は、機械的手段ま
たは溶媒を利用した自己消化、凍結、超音波処理、加圧
などのいずれでもよい。酵素の分離精製方法も既知であ
り、硫安などを用いる塩析、エタノール等の有機溶媒に
よる沈殿、イオン交換クロマトグラフィーや疎水クロマ
トグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラ
フィーなどを組み合わせて精製する。例えば、培養物
を、遠心または吸引ろ過して菌糸体を集め、洗浄後、５
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）に懸濁し、
ダイノミルによって菌糸体を破砕する。次いで、遠心分
離した上清を無細胞抽出液として、硫安分画、ＤＥＡＥ
−セファセルイオン交換クロマトグラフィーで処理する
ことにより精製する。

【００１５】しかしながら、本発明の目的から、ＦＡＯ
Ｄは、その精製度にかかわらず、アマドリ化合物の酸化
反応を触媒することができる限り、培養液をはじめとす
る、あらゆる精製段階の酵素含有物及び溶液を包含す
る。また、酵素分子の内、触媒活性に関与する部位のみ
でも、本発明目的を達成することができることから、任
意の、アマドリ化合物酸化活性を有するフラグメントを
も包含するものとする。このようにして得られたＦＡＯ
Ｄは、アマドリ化合物の定量、特に糖尿病の診断のため
の糖化タンパクの定量に有用である。従って、本発明
は、ペニシリウム属に属し、フルクトシルアミノ酸オキ
シダーゼを産生することができる菌株をフルクトシルリ
ジン及び／又はフルクトシルＮ^α−Ｚ−リジン含有培地
に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸オキシダー
ゼを回収することを特徴とする、フルクトシルアミノ酸
オキシダーゼの製造方法を提供するものである。

【００１６】本発明のＦＡＯＤを産生する菌の内、ペニ
シリウム・ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinel
lum S-3413)（以下、Ｓ−３４１３株と称する）は本発
明者らが土壌中より新規に単離した菌株である。本菌株
について、宇田川俊一ら著の「菌類図鑑」（講談社サイ
エンティフィク 1993）を参考とし、その菌学的特性を
検討した結果、以下の根拠よりペニシリウム・ヤンシネ
ルム(Penicillium janthinellum)と同定した。なお、本
菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に、受託番
号FERM BP-5475の下で寄託されている。 （１）子のう世代を形成しない。 （２）ペニシリ(penicillus)形成が認められた。 （３）フィアライド(phialide)はとっくり型で、急に細
まり長い先端となる。 （４）ペニシリは不規則に分枝し、散開型である。 （５）菌核を形成しない。 （６）分生子連鎖が著しく散開である。 さらに、 （７）培地における生育状況 Czapek寒天培地上で速やかに生育する。２５℃の恒温器
で１０日間培養すると、羊毛状に広がり、淡黄色または
灰緑色を呈する。また、放射状に深いしわを形成する。

【００１７】以下に本発明のＦＡＯＤの特性を詳細に説
明する。 １．一般的な誘導特性 本発明のＦＡＯＤはフルクトシルリジン及び／又はフル
クトシルＮ^α−Ｚ−リジン(ＦＺＬ)によって誘導される
誘導酵素であり、フルクトシルリジン及び／又はＦＺＬ
を窒素源とし、グルコースを炭素源とするフルクトシル
リジン及び／又はＦＺＬ培地で、ペニシリウム属のフル
クトシルアミノ酸オキシダーゼ産生菌株を培養すること
により産生される。ＦＡＯＤは、グルコースとリジン及
び／又はＮ^α−Ｚ−リジンを共にオートクレーブして得
られるＧＬ褐変化培地で誘導されるが、グルコースとリ
ジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジンを別々にオートクレー
ブ処理して調製した培地では誘導されないことから、該
酵素はアマドリ化合物に特異的に作用するものである。

【００１８】２．反応特異性および基質特異性 本発明のＦＡＯＤは、式： Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ → Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ²−ＮＨ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ₂ （式中、Ｒ¹はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タンパ
ク質又はペプチド残基を表す）で示される反応における
触媒活性を有する。上記の反応式において、Ｒ¹が−Ｏ
Ｈ、−（ＣＨ₂）_n−、または−［ＣＨ（ＯＨ）］_n−Ｃ
Ｈ₂ＯＨ（式中、ｎは０−６の整数）であり、Ｒ²が−Ｃ
ＨＲ³−［ＣＯＮＨＲ³］_mＣＯＯＨ（式中、Ｒ³はα−ア
ミノ酸側鎖残基、ｍは１−４８０の整数を表す）で示さ
れるアマドリ化合物が基質として好ましい。中でも、Ｒ
³がリジン、ポリリジン、バリン、アスパラギンなどか
ら選択されるアミノ酸の側鎖残基であり、またｎが５〜
６、ｍが５５以下である化合物が好ましい。

【００１９】本発明のＦＡＯＤの各基質に対する活性
を、以下の表１に示す。表１ 精製されたペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４
１３由来のＦＡＯＤの基質特異性

【表１】 ＊１：検出されず ＊２：フルクトシルヒト血清アルブミン 表１から、本発明のＦＡＯＤはフルクトシルＮ^α−Ｚ−
リジン及びフルクトシルバリンに対して高い特異性を有
する。ペニシリウム属のＦＡＯＤ産生能力を有する菌株
を下記表２に例示する。表２ ＦＺＬ褐変化培地で培養したペニシリウム属の菌
から抽出したＦＡＯＤの基質特異性

【表２】 １）：検出されず

【００２０】表２に示されているように、本発明のＦＡ
ＯＤは、フルクトシルリジンと比較してフルクトシルバ
リンに対して高い活性を有しており、このことは該ＦＡ
ＯＤが糖化ヘモグロビンの測定に有用であることを示唆
するものである。

【００２１】３．ｐＨおよび温度の条件ｐＨ条件の測定 ０.１Ｍ酢酸（Ａｃ）、リン酸カリウム（Ｋ−Ｐ）緩衝
液、トリス-塩酸緩衝液およびグリシン（Ｇｌｙ）−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ４.０〜１１.０）にＦＡＯＤを加
え、２５℃、１０分間インキュベートした後、 通常の
条件（２５℃、ｐＨ８.０）で活性を測定した。上記方
法で測定したとき、本発明のＦＡＯＤの安定なｐＨ域
は、約ｐＨ４.０〜１１.０、好ましくはｐＨ６.０〜９.
０であり、至適ｐＨは約７.５であった（図２参照）。温度条件の測定 ５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）中で１５
〜６０℃の温度条件にＦＡＯＤを加え、１０分インキュ
ベートした後、通常の条件で活性を測定した。安定な温
度領域は１５〜５０℃、好ましくは１５〜４５℃、より
好ましくは１５℃であり、酵素反応は、１５〜４５℃、
好ましくは１５〜４０℃、より好ましくは２５℃で効率
良く進行する。（図３参照）

【００２２】４．力価の測定 酵素の力価測定は下記の方法で行った。 （１）生成する過酸化水素を比色法により測定する方
法。 Ａ.速度法 １００ｍＭ フルクトシルバリン（ＦＶ）溶液はあらか
じめ得られたＦＶを蒸留水で溶解することによって調製
した。４５mＭ ４−アミノアンチピリン、６０ユニット
／ｍｌパーオキシダーゼ溶液、及び６０ｍＭ フェノー
ル溶液それぞれ１００μｌと、０.１Ｍ トリス-塩酸緩
衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌ、および酵素溶液５０μｌを
混合し、全量を蒸留水で２.９５ｍｌとする。２５℃で
平衡化した後、１００ｍＭ ＦＶ溶液５０μｌを添加
し、５０５ｎｍにおける吸光度を経時的に測定した。生
成するキノン色素の分子吸光係数（５.１６×１０³Ｍ^-1
cm^-1）から、１分間に生成する過酸化水素のマイクロモ
ルを算出し、この数字を酵素活性単位（ユニット：Ｕ）
とする。

【００２３】Ｂ.終末法 上記Ａ法と同様に処理し、基質添加後、３０分間２５℃
でインキュベートした後の５０５ｎｍにおける吸光度を
測定し、別にあらかじめ標準過酸化水素溶液を用いて作
成した検量線から生成した過酸化水素量を算出すること
により、酵素活性を測定する。 （２）酵素反応による酸素吸収を測定する方法 ０.１Ｍ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）１ｍｌと酵素
溶液５０μｌを混合し、蒸留水で全量を３.０ｍｌと
し、ランク ブラザーズ社の酸素電極のセルに入れる。
２５℃で攪拌し、溶存酸素と温度を平衡化した後、５０
ｍＭ ＦＶ １００μｌを添加し、酸素吸収を記録計で連
続的に計測し、初速度を得る。標準曲線から１分間に吸
収された酸素量を求め、これを酵素単位とする。

【００２４】５．酵素の阻害、活性化および安定化 （１）金属の影響 ０.１Ｍ トリス-塩酸緩衝液（ｐＨ８.０）の条件で、終
濃度１ｍＭの各種金属イオンを添加し、５分間３０℃で
インキュベートした後、活性を測定した。結果を下記の
表３に示す。表３ 金属イオンのペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３
４１３由来ＦＡＯＤ活性への影響

【表３】 表３から明らかに、本発明のＦＡＯＤの活性に対し、銅
イオン、バリウムイオンが阻害的であり、コバルトイオ
ン、亜鉛イオン、銀イオンおよび水銀イオンは強く阻害
する。

【００２５】（２）各種阻害物質の影響 上記（１）の金属イオンの影響に関する試験と同様の方
法で試験した。ただし、パラクロロ安息香酸第二水銀
（ＰＣＭＢ）は終濃度０.１ｍＭ、それ以外は１ｍＭと
した。結果を表４に示す。安定化の検討は、５０mＭリ
ン酸カリウム緩衝液(ｐＨ７.５)に０.１ｍＭのジチオス
イトール（ＤＴＴ）を添加したものに対して一晩透析を
行った後、活性を測定することにより行った。表４ 各種物質のＦＡＯＤ活性への影響

【表４】 ＊１：ＰＣＭＢ，パラクロロ安息香酸第二水銀 ＊２：ＤＮＴＢ，５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安
息香酸） ＊３：ＥＤＴＡ，エチレンジアミン四酢酸 表４から明らかに、ＦＡＯＤ活性はＰＣＭＢ、ＤＮＴ
Ｂ、ヒドラジン、フェニルヒドラジン、ヒドロキシルア
ミンにより、強く阻害され、酵素反応にはＳＨ基および
カルボニル基が重要な働きをしていることが予想され
る。他方、ジチオスレイトールによって安定化され、保
存に適した溶媒はジチオスレイトール０.１ｍＭを添加
した５０mＭ リン酸カリウム緩衝液（pＨ７.５）であ
る。

【００２６】６．分子量 スーパーデックス２００ｐｇによるゲルろ過法で求めた
結果、分子量は約３８,７００（３８.７ｋＤａ）であっ
た（図４)。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）はデービスの方
法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで、３時間泳
動し、タンパク染色は、クマシーブリリアントブルーＧ
−２５０で行った。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、
標準タンパクとしてホスホリラーゼＢ、牛血清アルブミ
ン、オボアルブミン、カルボニックアンヒドラーゼ、大
豆トリプシンインヒビターを同様に泳動し、検量線を用
いて分子量測定を行った結果、サブユニットの分子量は
約４８,７００（４８.７ｋＤａ）であることが示された
（図５）。従って、本発明のＦＡＯＤは単量体であるこ
とが明らかである。

【００２７】７．既知の酵素との比較 既存の菌由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼと、本
発明のＦＡＯＤとを比較した。表５ 種々の微生物由来のフルクトシルアミノ酸オキシ
ダーゼの比較

【表５】 １）：ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric.Biol.Ch
em., 53(1), 103-110(1989) ２）：ホリウチら（T.Horiuchi et al.) Agric.Biol.Ch
em., 55(2), 333-338(1991) ３）：フルクトシルＮ^α−Ｚ−リジンに対する比活性 ４）：Ｎ^ε−Ｄ−フルクトシルＮ^α−ホルミルリジンに
対する比活性 表５から、本発明のＦＡＯＤと他の２種の菌株由来のフ
ルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの間に、下記の相違
点が認められる。 （１）分子量の相違：本発明のＦＡＯＤは単量体である
のに対し、他の２種の酵素は２量体であり、明らかに異
なる。 （２）補酵素：ＦＡＯＤは補酵素として共有結合的に結
合したＦＡＤを有するのに対し、他の酵素はいずれも非
共有結合的に結合したＦＡＤを有する。 （３）至適ｐＨ、至適温度、およびＳＨ試薬による阻害
等の差異はＦＡＯＤと他の２酵素との相違を示してい
る。

【００２８】さらに、特開平４−４８７４号公報記載の
ペニシリウム属由来フルクトシルアミノ酸分解酵素と、
本発明のＦＡＯＤとを比較すると、下記の相違点が認め
られる。 （１）基質特異性：特開平４−４８７４号公報記載のフ
ルクトシルアミノ酸分解酵素はフルクトシルリジンとフ
ルクトシルアラニンに活性を有するのに対し、本発明の
ＦＡＯＤはフルクトシルリジンとフルクトシルバリンに
活性を有し、活性はフルクトシルバリンに対する方が強
い。 （２）誘導条件：特開平４−４８７４号公報記載のフル
クトシルアミノ酸分解酵素はフルクトシルアミノ酸を含
まない培地でも産生されるが、本発明のＦＡＯＤはフル
クトシルリジンを含有する培地で培養することによって
誘導される。 （３）製造方法：本発明のＦＡＯＤは褐変化培地を用い
て培養し、製造する。

【００２９】既述のごとく、本発明の酵素ＦＡＯＤは、
アマドリ化合物の定量に有用である。従って、本発明は
また、アマドリ化合物を含有する試料と、本発明のＦＡ
ＯＤとを接触させ、酸素の消費量または過酸化水素の発
生量を測定することを特徴とする、試料中のアマドリ化
合物の分析法を提供するものである。本発明の分析法
は、生体成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の
測定、あるいはフルクトシルアミンの定量に基づいて行
われる。ＦＡＯＤの酵素活性は下記の反応に基づいて測
定される。 Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｒ² ＋ Ｏ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ
→Ｒ¹−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ Ｒ²−ＮＨ₂ ＋ Ｈ₂Ｏ_２ （式中、Ｒ^１はアルドース残基、Ｒ²はアミノ酸、タン
パク質またはペプチド残基を表す） 被検液としては、アマドリ化合物を含有する任意の試料
溶液を用いることができ、例えば、血液（全血、血漿ま
たは血清）、尿等の生体由来の試料の外、醤油等の食品
が挙げられる。

【００３０】本発明のＦＡＯＤをアマドリ化合物含有溶
液に、適当な緩衝液中で作用させる。反応溶液のｐＨ、
温度は、上記の条件を満たす範囲、即ち、ｐＨ６.０〜
９.０、好ましくは７.５、温度は１５〜４５℃、好まし
くは１５〜４０℃である。緩衝液としてはリン酸カリウ
ム等を用いる。ＦＡＯＤの使用量は、終点分析法におい
ては通常、０.１ユニット／ml以上、好ましくは１〜１
００ユニット／mlである。

【００３１】本発明の分析法では、下記のいずれかのア
マドリ化合物の定量法を用いる。 （１）過酸化水素発生量に基づく方法 当該技術分野で既知の過酸化水素の定量法、例えば、発
色法、過酸化水素電極を用いる方法等で測定し、過酸化
水素およびアマドリ化合物の量に関して作成した標準曲
線と比較することにより、試料中のアマドリ化合物を定
量する。具体的には、上記４の力価の測定に準じる。た
だし、ＦＡＯＤ量は１ユニット／ｍｌとし適当に希釈し
た試料を添加し、生成する過酸化水素量を測定する。過
酸化水素発色系としては、パーオキシダーゼの存在下で
４−アミノアンチピリン、３−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン等のカップラーとフェノール等の色
原体との酸化縮合により発色する系を用いることができ
る。色原体として、フェノール誘導体、アニリン誘導
体、トルイジン誘導体等があり、例えば、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−ト
ルイジン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ,Ｎ−ジエチル
アニリン、２,４−ジクロロフェノール、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホ
プロピル）−３,５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３,５
−ジメチルアニリン等が挙げられる。又パーオキシダー
ゼの存在下で酸化発色を示すロイコ型発色試薬も用いる
ことができ、そのようなロイコ型発色試薬は、当業者に
既知であり、ｏ−ジアニシジン、ｏ−トリジン、３,３
−ジアミノベンジジン、３,３,５,５−テトラメチルベ
ンジジン、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）
−４,４−ビス（ジメチルアミノ）ビフェニルアミン、
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３,７
−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられ
る。 （２）酸素の消費量に基づく方法 反応開始時の酸素量から反応終了時の酸素量を差し引い
た値（酸素消費量）を測定し、酸素消費量とアマドリ化
合物の量に関して作成した標準曲線と比較することによ
り、試料中のアマドリ化合物を定量する。具体的には、
上記４の力価の測定に準じて行う。但し用いるＦＡＯＤ
量は１ユニット／mlとし、適当に希釈した試料を添加し
吸収される酸素量を求める。

【００３２】本発明方法は試料溶液をそのまま用いて行
うこともできるが、対象となる糖化タンパクによって
は、あらかじめ糖が結合したバリン及び／又はリジン残
基を遊離させてから行うことが好ましい。そのような目
的には、タンパク質分解酵素を用いる場合（酵素法）
と、塩酸等の化学物質を用いる場合（化学法）がある
が、前者が好ましい。その場合、本発明方法には当業者
に既知である、エンド型及びエキソ型のタンパク質分解
酵素（プロテアーゼ）を用いることができる。エンド型
のプロテアーゼには、例えばトリプシン、α−キモトリ
プシン、スブチリシン、プロティナーゼＫ、パパイン、
カテプシンＢ、ペプシン、サーモリシン、プロテアーゼ
ＸＩＶ、リジルエンドペプチダーゼ、プロレザー、ブロ
メラインＦ等がある。一方、エキソ型のプロテアーゼに
はアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙
げられる。酵素処理の方法も既知であり、例えば下記実
施例に記載の方法で行うことができる。

【００３３】上記のごとく、本発明のＦＡＯＤは、フル
クトシルバリンに高い特異性を有することから、糖化ヘ
モグロビンの測定に有用である。また、糖化タンパクに
含まれるフルクトシルリジンにも高い基質特異性を有す
るものであることから、血液試料中の糖化タンパクを測
定することを含む、糖尿病の診断などに有用である。な
お、検体として血液試料（全血、血漿または血清）を用
いる場合、採血した試料をそのまま、あるいは透折等の
処理をした後用いる。さらに、本発明方法に用いるＦＡ
ＯＤ、パーオキシダーゼ等の酵素は、溶液状態で用いて
もよいが、適当な固体支持体に固定化してもよい。例え
ば、ビーズに固定化した酵素をカラムに充填し、自動化
装置に組み込むことにより、臨床検査など、多数の検体
の日常的な分析を効率的に行うことができる。しかも、
固定化酵素は再使用が可能であることから、経済効率の
点でも好ましい。さらには、酵素と発色色素とを適宜組
み合わせ、臨床分析のみならず、食品分析にも有用なア
マドリ化合物の分析のためのキットを得ることができ
る。

【００３４】酵素の固定化は当該技術分野で既知の方法
により行うことができる。例えば、担体結合法、架橋化
法、包括法、複合法等によって行う。担体としては、高
分子ゲル、マイクロカプセル、アガロース、アルギン
酸、カラギーナン、などがある。結合は共有結合、イオ
ン結合、物理吸着法、生化学的親和力を利用し、当業者
既知の方法で行う。固定化酵素を用いる場合、分析はフ
ロー又はバッチ方式のいずれでもよい。上記のごとく、
固定化酵素は、血液試料中の糖化タンパクの日常的な分
析（臨床検査）に特に有用である。臨床検査が糖尿病診
断を目的とする場合、診断の基準としては、結果を糖化
タンパク濃度として表すか、試料中の全タンパク質濃度
に対する糖化タンパク質の濃度の比率（糖化率）又はフ
ルクトシルアミン量で表される。全タンパク質濃度は、
通常の方法（２８０ｎｍの吸光度、ブラッドフォード
法、ビュレット法、Ｌowry法あるいは、アルブミンの自
然蛍光、ヘモグロビンの吸光度など)で測定することが
できる。

【００３５】本発明はまた、本発明のＦＡＯＤを含有す
るアマドリ化合物の分析試薬又はキットを提供するもの
である。本発明のアマドリ化合物の定量のための試薬
は、本発明のＦＡＯＤ、好ましくはｐＨ６.０〜９.０、
より好ましくはｐＨ７.５の緩衝液からなる。該ＦＡＯ
Ｄが固定化されている場合、固体支持体は高分子ゲルな
どから選択され、好ましくはアルギン酸である。試薬中
のＦＡＯＤの量は、終点分析を行う場合、試料あたり、
通常１〜１００ユニット／ml、緩衝液はリン酸カリウム
（ｐＨ７.５）が好ましい。過酸化水素の生成量に基づ
いてアマドリ化合物を定量する場合、発色系としては、
先述の「（１）過酸化水素発生量に基づく方法」に記載
の酸化縮合により発色する系、並びにロイコ型発色試薬
等を用いることができる。本発明のアマドリ化合物の分
析試薬と、適当な発色剤ならびに比較のための色基準あ
るいは標準物質を組み合わせてキットとすることもでき
る。そのようなキットは、予備的な診断、検査に有用で
あると考えられる。上記の分析試薬及びキットは、生体
成分中の糖化タンパクの量及び／又は糖化率の測定、あ
るいはフルクトシルアミンを定量するために用いられる
ものである。以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。

【００３６】

【実施例】実施例１ ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３由
来のＦＡＯＤの製造および精製 ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３（FERM BP-54
75；Penicillium janthinellum S-3413）をＦＺＬ ０.
５％、グルコース １.０％、リン酸二カリウム０.１
％、リン酸一ナトリウム ０.１％、硫酸マグネシウム
０.０５％、塩化カルシウム ０.０１％, イーストエキ
ス ０.２％を含有した培地（ｐＨ６.０)１０Ｌに植菌
し、ジャーファーメンターを用いて通気量２Ｌ／分、攪
拌速度５００ｒｐｍの条件で２８℃、３６時間攪拌培養
した。培養物は瀘過して集めた。菌糸体４１０ｇ（湿重
量）を、０.１ｍＭのＤＴＴを含む、０.１Ｍリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７.５)８００mlに懸濁し、ダイノ・ミ
ルにより菌糸体を破砕した。破砕液を９,５００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離し、得られた液を粗酵素液（無細胞
抽出液）とし、以下の方法で精製した。粗酵素液に４０
％飽和になるように硫酸アンモニウム（以下、硫安と略
す）を加え、攪拌し、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠
心分離した。得られた上清に７５％飽和になるように硫
安を加え、撹拌し、１２,０００ｒｐｍで１０分間遠心
分離した。沈殿を０.１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍ
Ｍ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５)(以下、緩衝液Ａ
と略す）に溶解した。得られた酵素溶液を緩衝液Ａに対
し一晩透析した。外液の交換は２回行った。透析後の酵
素溶液は緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファセルカ
ラム（４.２×２６ｃｍ）にアプライした。活性画分は
同緩衝液による洗浄画分に認められたので、これを集
め、０−５５％飽和の硫安分画に供した。次に２５％飽
和硫安を含む緩衝液Ａで平衡化したフェニル−セファロ
ース６ＦＦ（Low Substitute）カラム（ＨＲ１０／１
０）に吸着した。同緩衝液にて洗浄した後、硫安濃度２
５−０％飽和の直線勾配で溶出した。活性画分を集め、
硫安濃縮後、得られた酵素溶液を０.１mＭ ＤＴＴを含
む０.２Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.５）にて平衡
化したスーパーデックス２００ｐｇカラムによりゲル瀘
過を行い、７０〜１００ユニットの精製酵素を得た。

【００３７】精製酵素のＵＶ吸収スペクトルを図６に示
す。図６は、本酵素がフラビン酵素であることを示して
いる。得られた精製酵素標品はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデ
シル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳
動）により分子量を決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、デ
ービスの方法に従い、１０％ゲルを用いて、４０ｍＡで
３時間泳動し、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０
でタンパク染色を行った。標準タンパクとしてホスホリ
ラーゼＢ、牛血清アルブミン、オボアルブミン、カルボ
ニックアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビターを
同様に泳動し、検量線から分子量を求めた結果、サブユ
ニットの分子量は約４８,７００（４８.７ｋＤａ）であ
ることが示された（図５）。また、スーパーデックス２
００ｐｇによるゲルろ過による分子量測定では、図４の
検量線図から明らかなように、約３８,７００（３８.７
ｋＤａ）であった。本実施例で調製したＦＡＯＤの酵素
活性、ｐＨおよび温度安定性、金属および阻害物質によ
る影響などに関しては、前記の値または性質を示した。

【００３８】実施例２ 糖化ヘモグロビン量の測定 １) 試料の処理 ０〜１５mgのグリコヘモグロビンコントロールＥ(シグ
マ社)を１００μlの蒸留水で溶解した。これらの試料に
塩酸アセトン(１Ｎ塩酸／アセトン:１／１００)１mlを
加え、１２０００回転で１０分間遠心分離した。沈澱物
をジエチルエーテル５００μlで洗浄し、減圧乾固し
た。さらに８Ｍ尿素１００μlを加え、２０分間沸騰水
中で加熱後冷却し、５．４ユニット／ml トリプシン３
００μlと混合、３７℃で３時間インキュベートした。
その後、沸騰水中で５分間加熱し、試料を調製した。 ２) 活性測定 ＦＡＯＤ反応液は以下のようして調製した。 ３mＭ Ｎ−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−４,４ −ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン溶液 ３０μl ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μl ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０) ３００μl ２５ユニット／ml ＦＡＯＤ溶液 ５μl 蒸留水で全量を１mlとした。２５ユニット／ml ＦＡＯ
Ｄ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤを２５ユニッ
ト／mlになるよう、０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝液(p
Ｈ７．５)で希釈して調製した。このＦＡＯＤ反応液に
上記の各処理基質を１５０μl加え、３０℃でインキュ
ベートし、３０分後の７２７nmにおける吸光度を測定し
た。この方法で得られる糖化ヘモグロビンの量と吸光度
との関係を図７に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度
(過酸化水素の量に対応)、横軸は糖化ヘモグロビンの量
を表す。図は、糖化ヘモグロビンの量と過酸化水素発生
量が相関関係にあることを示している。

【００３９】実施例３ 糖化ヘモグロビン量の測定 １) 試料の処理 ３０mgのグリコヘモグロビンコントロールＥ(シグマ社)
を蒸留水２００μlで溶解し、８Ｍ尿素、０．２％ＥＤ
ＴＡ・２ナトリウムを含む５７０mＭトリス−塩酸緩衝
液(pＨ８．８)１mlと、２−メルカプトエタノール４０
μlを添加し、窒素封入下で２時間静置した。その後、
１Ｍのヨード酢酸ナトリウム４００μlを添加し、３０
分間静置後、２−メルカプトエタノール４０μlを添加
した。０．１Ｍ重炭酸アンモニウムに対して透析した
後、１０mg／ml ＴＰＣＫ−トリプシン１０μlと混合
し、３７℃で３時間インキュベートした。その後、沸騰
水中で５分間加熱し試料を調製した。 ２) 活性測定 ＦＡＯＤ反応液は以下のようにして調製した。 ３mＭ Ｎ−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−４,４− ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン溶液 ３０μl ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 ３０μl ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０) ３００μl ２５ユニット／ml ＦＡＯＤ溶液 １０μl 処理試料 ０〜１３．２mg 蒸留水で全量を９００μlとした。２５ユニット／ml
ＦＡＯＤ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤを２５
ユニット／mlになるよう、０．１Ｍ リン酸カリウム緩
衝液(pＨ７．５)で希釈して調製した。このＦＡＯＤ反
応液を３０℃でインキュベートし、３０分後の７２７nm
における吸光度を測定した。この方法で得られる糖化ヘ
モグロビンの量と吸光度との関係を図８に示す。図中の
縦軸は７２７nmの吸光度(過酸化水素の量に対応)、横軸
は糖化ヘモグロビンの量を表す。図は、糖化ヘモグロビ
ンの量と過酸化水素発生量が相関関係にあることを示し
ている。

【００４０】実施例４ ヘモグロビンＡ１c値の測定 ヘモグロビンＡ０試薬(シグマ社)を蒸留水で２．３mＭ
になるように溶解した。この溶液を自動グリコヘモグロ
ビン測定装置(京都第一科学)を用いて分画し、ヘモグロ
ビンＡ１c画分とヘモグロビンＡ０画分を分取、精製し
た。両画分を比率混合することにより、ヘモグロビンＡ
１c値０％〜５２．０％の基質試料を得た。１) 試料の
処理 基質試料 ２５０μg ５００ユニット／ml アミノペプチダーゼ溶液 ５μl １．０Ｍ トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０) １５μl これらを混合し、蒸留水で全量を２００μlとした。こ
の混合液を３０℃で３０分間インキュベートした。その
後、１０％トリクロロ酢酸を２００μl加えて撹拌し、
０℃で２０分間静置した後１２０００回転で１０分間遠
心分離を行った。得られた上清に５Ｎ ＮaＯＨを約４
０μl加え、中性溶液にした。２) 活性測定ＦＡＯＤ反
応液は以下のようして調製した。 ３mＭ Ｎ−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−４,４− ビス(ジメチルアミノ)ビフェニルアミン溶液 １００μl ６０ユニット／ml パーオキシダーゼ溶液 １００μl ０．１Ｍ トリス−塩酸緩衝液(pＨ８．０) １０００μl １６ユニット／ml ＦＡＯＤ溶液 １５μl 蒸留水で全量を２．６mlとした。１６ユニット／ml Ｆ
ＡＯＤ溶液は、実施例１の方法で得たＦＡＯＤを１６ユ
ニット／mlになるよう、０．１Ｍ リン酸カリウム緩衝
液(pＨ７．５)で希釈して調製した。ＦＡＯＤ反応液を
３０℃で２分間インキュベートした後、上記の各処理基
質を４００μl加え、さらに３０分インキュベートした
後の７２７nmにおける吸光度を測定した。この方法で得
られる基質のヘモグロビンＡ１c値と吸光度との関係を
図９に示す。図中の縦軸は７２７nmの吸光度(過酸化水
素の量に対応)、横軸はヘモグロビンＡ１c値を表す。図
は、ヘモグロビンＡ１c値と過酸化水素発生量が相関関
係にあることを示している。

【００４１】

【発明の効果】本発明のＦＡＯＤは、フルクトシルバリ
ンおよびフルクトシルリジンのいずれにも特異的に作用
する。従って、新たな臨床分析および食品分析法の開発
に有用であり、糖尿病の診断や食品の品質管理の面で寄
与するところが大きい。特に、血中の糖化タンパク量及
び／又は糖化率又はフルクトシルアミン量を指標とし
て、糖尿病の病状の診断に役立つと考えられる。また、
本発明のＦＡＯＤを用いるアマドリ化合物の分析試薬お
よび分析方法によって、正確に糖化タンパクを定量する
ことができ、糖尿病の診断、症状管理に貢献することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＦＡＯＤの培養培地での産生量と培養時間の
関係を示すグラフ。

【図２】 ＦＡＯＤの溶媒中での活性と至適ｐＨの関係
を示すグラフ。

【図３】 ＦＡＯＤの溶媒中での活性と至適温度の関係
を示すグラフ。

【図４】 スーパーデックス２００pgを用いたゲルろ過
による分子量測定の結果を示すグラフ。

【図５】 ペニシリウム・ヤンシネルムＳ−３４１３由
来の精製ＦＡＯＤをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナ
トリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）にかけて
得た移動パターンを示す写真。

【図６】 精製Ｓ−３４１３由来ＦＡＯＤの吸収スペク
トル。

【図７】 糖化ヘモグロビン量とＦＡＯＤ作用により生
成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

【図８】 糖化ヘモグロビン量とＦＡＯＤ作用により生
成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

【図９】 ヘモグロビンＡ１c値とＦＡＯＤ作用により
生成された過酸化水素量との関係を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:82） (72)発明者 八木 雅之 京都府京都市右京区西京極三反田町１ 西 京極団地４棟302号室 (72)発明者 船津 文代 大阪府枚方市茄子作４丁目40番地の２

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ産生
   能を有するペニシリウム属（Penicillium）の菌をフル
   クトシルリジン含有培地で培養することにより産生され
   るフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ。
2. 【請求項２】 フルクトシルリジン含有培地が、グルコ
   ースと、リジン及び／又はＮ^α−Ｚ−リジンを温度１０
   ０〜１５０℃において３〜６０分間オートクレーブ処理
   することにより得られる、フルクトシルリジンを含有す
   るものである請求項１記載のフルクトシルアミノ酸オキ
   シダーゼ。
3. 【請求項３】 フルクトシルバリン及び／又はフルクト
   シルリジンに対する活性を有する請求項１記載のフルク
   トシルアミノ酸オキシダーゼ。
4. 【請求項４】 ペニシリウム属の菌が、ペニシリウム・
   ヤンシネルムS-3413(Penicillium janthinellum S-341
   3)(FERM BP-5475)、ペニシリウム・ヤンシネルム(IFO N
   O.4651,6581,7905)(Penicillium janthinellum)、ペニ
   シリウム・オキサリクム(IFO NO.5748)(Penicillium ox
   alicum)、ペニシリウム・ヤバニクム(IFO NO.7994)(Pen
   icillium javanicum)、ペニシリウム・クリソゲヌム(IF
   O NO.4897)(Penicillium chrysogenum)、ペニシリウム
   ・シアネウム(IFO NO.5337)(Penicillium cyaneum)から
   なる群から選択されるものである請求項１記載のフルク
   トシルアミノ酸オキシダーゼ。
5. 【請求項５】 下記の理化学的特性を有するものである
   請求項１〜４のいずれかに記載のフルクトシルアミノ酸
   オキシダーゼ： １）酸素の存在下でアマドリ化合物を酸化し、α−ケト
   アルデヒド、アミン誘導体および過酸化水素を生成する
   反応を触媒し； ２）安定ｐＨは４.０〜１１.０、至適ｐＨは７.５であ
   り； ３）安定温度は１５〜５０℃、至適温度は２５℃であ
   り； ４）スーパーデックス２００ｐｇを用いたゲルろ過法で
   測定した場合、分子量は約３８,７００（３８.７ｋＤ
   ａ）である。
6. 【請求項６】 ペニシリウム・ヤンシネルムS-3413(Pen
   icillium janthinellum S-3413)(FERM BP-5475)。
7. 【請求項７】 遊離又は保護基を有するアミノ酸の糖化
   物及び／又はタンパクの糖化物を含有する培地で、ペニ
   シリウム属の菌を培養することによって該菌類にフルク
   トシルアミノ酸オキシダーゼを産生させることを特徴と
   する、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの製造方法。
8. 【請求項８】 ペニシリウム属に属し、フルクトシルア
   ミノ酸オキシダーゼを産生することができる菌株をフル
   クトシルリジン及び／又はフルクトシルＮ^α−Ｚ−リジ
   ン含有培地に培養し、培養物からフルクトシルアミノ酸
   オキシダーゼを回収することを特徴とする請求項７記載
   の方法。
9. 【請求項９】 アマドリ化合物を含有する試料と、請求
   項１記載のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを接触さ
   せ、酸素の消費量または過酸化水素の発生量を測定する
   ことを特徴とする、試料中のアマドリ化合物の分析法。
10. 【請求項１０】 試料が生体成分であり、アマドリ化合
    物の分析が、該生体成分中の糖化タンパクの量及び／又
    は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量に
    よりなされることを特徴とする請求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項１記載のフルクトシルアミノ酸
    オキシダーゼを含有するアマドリ化合物の分析試薬又は
    キット。
12. 【請求項１２】 生体成分中の糖化タンパクの量及び／
    又は糖化率の測定、あるいはフルクトシルアミンの定量
    のために用いられることを特徴とする請求項１１記載の
    分析試薬又はキット。