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JPH083051A - アレルギー疾患治療のための植物自己不和合性受容体蛋白（ｓｌｇおよびｓｒｋ）組成物 - Google Patents

アレルギー疾患治療のための植物自己不和合性受容体蛋白（ｓｌｇおよびｓｒｋ）組成物

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Publication number
JPH083051A
JPH083051A JP7000238A JP23895A JPH083051A JP H083051 A JPH083051 A JP H083051A JP 7000238 A JP7000238 A JP 7000238A JP 23895 A JP23895 A JP 23895A JP H083051 A JPH083051 A JP H083051A
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JP
Japan
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protein
pollen
arnus
glutinosa
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Application number
JP7000238A
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English (en)
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JP2918795B2 (ja
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Pelaez Ricardo Palacios
リカルド・パラシオス・ペラエス
Garate Alberto Martinez
アルベルト・マルティネス・ガラテ
Quesada Jorge Martinez
ホルヘ・マルティネス・ケサーダ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Industrial Farmaceutica y de Especialidades SA
Original Assignee
Industrial Farmaceutica y de Especialidades SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Industrial Farmaceutica y de Especialidades SA filed Critical Industrial Farmaceutica y de Especialidades SA
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 植物起源のアレルギー疾患治療薬を提供す
る。 【構成】 開花１〜数日前に対応する成熟過程の被子植
物の雌蘂から抽出した自己不和合性受容体蛋白（ＳＬＧ
およびＳＲＫ）を有効成分とすることを特徴とするＩｇ
Ｅが介在するアレルギー疾患治療薬。 【効果】 アレルギー疾患治療に有効な植物起源の治療
薬が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ＩｇＥが介在するアレ
ルギー疾患の治療のための植物起源の産物の技術分野に
関する。より詳細には、本発明は、インビトロでのＩｇ
Ｅアレルゲンを抑制する能力に基づく植物の自己不和合
性受容体（ＳＬＧおよびＳＲＫ）の該疾患の有効な治療
における使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】花を有する植物（被子植物）の大部分
（９５％）は雌雄同体であり、換言すれば、それらは同
一の個体中に雄性の性器官（葯により産生される花粉）
および雌蘂に対応する雌性の性器官を有する。この事実
は、植物が移動しないことと相俟って、自己繁殖、すな
わち種がその生存を可能にする遺伝的変化の可能性を失
う現象の素因となっている。これを回避するためには、
植物が、花粉管の成長を停止することによる自己不和合
性機構を有することである。該機構は１９７７年以来、
被子植物に広く分布していることが知られている
（（１）ネタン−コート，ディー（Nettan-Court D.）
「インコンパティビリティー・イン・アンギオスパーム
ス（incompatibility in angiosprems），ニューヨーク
のスプリンガー−フェアラーク（Springer-Verlag）
（１９７７年））。
【０００３】同種の別個体の花粉粒が柱頭と呼ばれる雌
蘂の頂部の孔に到達する場合にこれらの植物の交雑が起
こる。柱頭では、一旦花粉が認識されると、花粉管の成
長が始まり、花粉が雌蘂（花柱）の首の部分に下降し、
内部に存在する子房に花粉が到達し、そこで受精が起こ
る。
【０００４】植物生理学の分野に適用される分子遺伝学
的手法の発達により、基本的には２つの植物種（キャベ
ツ（ブラッシカ・オレラセア（Brassica oleracea）お
よび鑑賞用タバコ（ニコチアナ・アラタ（Nicotiana al
ata））における自己不和合性機構に関する知識が発展
した。特別には、メルボルン大学（オーストラリア）の
アドリアンヌ・クラーク（Adrianne Clarke）のグルー
プにより１９８６年にニコチアナ・アラタにおける自己
不和合性に関する遺伝子（Ｓ遺伝子と呼ばれる）が同定
され（（２）アンダーソン，エム・エイ（Anderson,M.
A.）、コーニッシュ，イー・シー（Cornish,E.C.）、マ
ブ，エス・エル（Mav,S.L.）、ウィリアムス，イー・ジ
ー（Wiliams,E.G.）、ホガート，アール（Hogert,
R.），「クローニング・オブ・ｃＤＮＡ・フォー・ア・
スタイラー・グリコプロテイン・アソシエイティッド・
ウィズ・イクスプレッション・オブ・セルフ−インコン
パティビリティー・イン・ニコチアナ・アラタ（Clonin
g of cDNA for a stylar glycoprotein associated wit
h expression of self-incompatibility in Nicotianaa
lata）」，ネイチャー（Nature）第３２１巻：３８〜４
４頁（１９８６年））、そして１９８５年には米国コー
ネル大学のマイク（Mike）およびジューン（June）・ナ
スララー（Nasrallah）のチームによりＳ遺伝子がブラ
ッシカ・オレラセアにおいて最初に同定された（（３）
ナスララー，ジェー・ビー（Nasrallah,J.B.）、カオ，
ティー・エイチ（Kao,T.H.）、ゴールドベルグ，エム・
エル（Goldberg,M.L.）、ナスララー，エム・イー（Nas
rallah,M.E.），「ア・ｃＤＮＡ・クローン・エンコー
ディング・アン・Ｓ−ローカス−スペシフィック・グリ
コプロテイン・フロム・ブラッシカ・オレラセア（A cD
NA clone encoding an S-locus-specific glycoprotein
from Brassica oleracea）」，ネイチャー第３１８
巻：２６７〜２６７頁（１９８５年））。
【０００５】ブラッシカは、ニコチアナよりも発達した
自己不和合性モデルを有しているように思われ、以来多
くの研究の中心となっている。よって、Ｓ遺伝子により
発現されたグリコプロテインのアミノ酸配列が特徴づけ
られており（（４）ナスララー，ジェー・ビー、カオ，
ティー・エイチ、チェン，シー・エイチ（Chen,C.
H.）、ゴールドベルグ，エム・エル、ナスララー，エム
・アール，「アミノ・アシッド・シークエンス・オブ・
グリコプロテインズ・エンコーディッド・バイ・スリー
・アリールズ・オブ・ザ・Ｓ・ローカス・オブ・ブラッ
シカ・オレラセア（Amino acid sequence of glycoprot
eins encoded by tgree alleles of the S locus of Br
assica oleracea）」，ネイチャー第３２６巻：６１７
〜６１９頁（１９８７年））、それは花粉粒を認識し、
同じ個体からの花粉の中和をする受容体分子である。こ
れらの蛋白のうちの１つのタイプは、以前ＳＬＳＧ（Ｓ
−位置特異的グリコプロテイン）と呼ばれていた。それ
らは多形性であり、異なる対立遺伝子によりコードされ
ており、５７ないし６５キロダルトンの分子量を有する
（（５）ナスララー，ジェー・ビー、ナスララー，エム
・イー，「ザ・モレキュラー・ジェネティクス・オブ・
セルフ−インコンパティビリティー・イン・ブラッシカ
（The molecular genetics of self-incompatibility i
n Brassica）」，アニュアル・レビュー・オブ・ジェネ
ティクス（Annu.Rev.Genet）第２３巻：１２１〜１３９
頁（１９６８９年））。
【０００６】異なる対立遺伝子は、超可変領域と交替し
た充分に保存された領域を有し（（６）ナスララー，ジ
ェー・ビー、ナスララー，エム・イー，「セルフ・イン
コンパティビリティー・ジーンズ・オブ・ブラッシカ・
オレラセア：イクスプレッション，アイソレイション・
アンド・ストラクチャー（Self-incompatibility genes
of Brassica oleracea:Expression,isolation and str
ucture）」，プロシーディングス・オブ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）第８５巻：５５５１〜５５５５
頁（１９８８年））、自分自身の花粉と他の個体の花粉
との間の認識を決定する抗体または組織和合性に関する
大きいほうの複合体の遺伝子の構造と類似性を示す。こ
の場合、逆に言えば、自分自身の花粉を識別するのは該
機構であって、該機構により自分自身の花粉が拒絶さ
れ、他の花粉が許容される。
【０００７】ブラッシカのＳＬＧに関しては、それらが
柱頭において合成されることも知られており（（７）ナ
スララー，ジェー・ビー、ドニー，アール・シー（Done
y,R.C.）およびナスララー，エム・イー，「バイオシン
セシス・オブ・グリコプロテインズ・インボルブド・イ
ン・ザ・ポーレン−スティグマ・インターラクション・
オブ・インコンパティビリティー・イン・ディベロッピ
ング・フラワーズ・オブ・ブラッシカ・オレラセア・エ
ル（Biosynthesis of glycoproteins involvedin the p
ollen-stigma interaction of incompatibility in dev
eloping flowers of Brassica oleracea L.）」，プラ
ンタ（Planta）第１６５巻：１００〜１０７頁（１９８
５年））、それらが、不和合性花粉の成長に対する障害
が作られる乳頭状細胞中に蓄積されることも知られてい
る（（８）カンダサムト，エム・ケイ（Kandasamt,M.
K.）、パオリロ，ディー・ジェー（Paolillo,D.J.）、
ファラデイー、シー・ディー（Farady,C.D.）、ナスラ
ラー，ジェー・ビー、ナスララー，エム・イー，ザ・Ｓ
・ローカス・スペシフィック・グリコプロテインズ・オ
ブ・ブラッシカ・アキュミュレイト・イン・ザ・セル・
ウォール・オブ・ディベロッピング・スティグマ・パピ
ラエ（The S locus specific glycoproteins of Brassi
ca accumulate in the cell wall of developing stigm
a papillae）」，ディベロップメンタル・バイオロジー
（Dev.Biol.）第１３４巻：４６２〜４７２頁（１９８
９年））。自己免疫応答は、アンセシス（anthesis）
（あるいは花の葯からの花粉の放出）の１日または２日
前には明らかであり、正確にこれらの日々の間に該蛋白
の蓄積および合成が柱頭において行われることが証明さ
れた（（７）および（９）リバーツ，アイ・エヌ（Ribe
rts,I.N.）、ステッド，エイ・ディー（Sread,A.D.）、
オケンドン，ディー・ジェー（Ockendon,D.J.）、ディ
キンソン，エイチ・ジー（Dickinson,H.G.）「ア・グリ
コプロテイン・アソシエイティッド・ウィズ・ザ・アク
イジション・オブ・ザ・セルフ−インコンパティビリテ
ィー・システム・バイ・マチュアリング・スティグマス
・オブ・ブラッシカ・オレラセア（A glycoprotein ass
ociated with the aqcuisition of theself-incompatib
ility system by maturing stigmas of Brassica olera
cea）」，プランタ第１４６巻：１７９〜１８６頁（１
９７９年））。
【０００８】これらの自己不和合性受容体蛋白（ＳＬＳ
Ｇ）に関する知識の程度は非常に高度なので、それらを
発現する遺伝子（ＳＧＬ遺伝子）のヌクレオチド配列が
知られており（（１０）スコット，シー・ピー（Scott,
C.P.）、ゲイツ，ピー・ジェー（Gates,P.J.）、ゲイト
ハウス，ジェー・エイ（Gatehouse,J.A.）、ブルター，
ディー（Boulter,D.）、クロイ，アール・ディー（Cro
y,R.D.），「ア・ｃＤＮＡ・エンコーディング・アンド
・Ｓ−ローカス・スペシフィック・グリコプロテイン・
フロム・ブラシア・オレラセア・プランツ・コンテイン
ミング・ザ・Ｓ5・セルフ−インコンパティビリティー
・アリール（A cDNA encoding S-locus specific glyco
protein from Brassica oleracea plants containing t
he S5 self-incompatibility allele）」，モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Ge
net.）第２２０巻：４０９〜４１３頁（１９９０
年））、そのアミノ酸および配糖体成分が知られている
のみならず（（１１）タカヤマ，エス（Takayama,
S.）、イソガ，エイ（Isoga,A.）、ツカモト，シー（Ts
ukamoto,C.）、ウエダ，ワイ（Ueda,Y.）、ヒナタ，ケ
イ（Hinata,K.），ストラクチャー・オブ・カーボハイ
ドレイト・チェインズ・オブ・Ｓ−グリコプロテインズ
・イン・ブラッシカ・カンペストリス・セルフ−インコ
ンパティビリティー・ローカス（Structure of Carbohy
drate chains of S-glycoproteins in Brassica campes
tris self-incompatibility locus）」，ネイチャー第
３２６巻：１０２〜１０４頁（１９８７年））、ＳＬＳ
Ｇに対するモノクローナル抗体も生産され、それにより
乳頭状細胞内でのＳＬＳＧの合成ならびに続いて起こる
乳頭状細胞細胞壁への取り込みが免疫細胞化学的手法に
よって確認されている（（８）および（１２）ロバー
ツ、アイ・エヌ（Roberts,I.N.）、ハロード，ジー（Ha
rrod,G.）およびディキンソン，エイチ・ジー（Dickins
on,H.G.），「ポーレン−スティグマ・インターラクシ
ョンズ・イン・ブラッシカ・オレラセア・Ｉ ウルトラ
ストラクチャー・アンド・フィジオロジー・オブ・ザ・
スティグマティック・パピラリー・セルズ（Pollen-sti
gma interactions in Brassica oleracea I. Ultrastru
cture and Physiology of the stigmatic papillary ce
lls）」ジャーナル・オブ・セルラー・サイエンス（J.C
ell.Sci.）第６６巻：２４１〜２５３頁（１９８４
年））。これにもかかわらず、ちょうどデュマス（Duma
s）らが観察しているように、ＳＬＧ蛋白により示され
た自己和合性システムによる自己の花粉の中和の分子機
構はまだ明らかにされていない（（１３）デュマス，シ
ー（Dumas,C.）、ガウデ，ティー（Gaude,T.）、ハイツ
マン，ピー・ルジェ（Heizmann,P.Rougier），ラ・レシ
ェルシェ（La Recherche）第１３巻：５７６〜５７８頁
（１９９３年））。しかしながら、自己不和合性応答
が、柱頭において花粉粒が接触する乳頭状細胞と花粉粒
との間の細胞−細胞相互作用において作動していること
が指摘されている。
【０００９】２番目のタイプの蛋白であるＳＲＫもまた
受容体であり、スポロフィティック・コントロール・シ
ステム（sporophytic control systems）（ブラッシカ
およびアルヌス（Alnus）において作動するシステムの
ごとき）における自己不和合性に関連しており、ここ数
年来さらなる研究対象でもある（農学研究に応用される
分子遺伝学の分野において）。よって、該蛋白はキナー
ゼ蛋白であり、それゆえ、細胞生理学における変化を起
こさせる蛋白のリン酸化を増加させることが知られてい
る。ＳＲＫ蛋白は柱頭の乳頭状細胞においてＳＬＧと同
時に発現される。ＳＲＫ蛋白はＳＬＧ蛋白と同じ範囲の
分子量を有し、乳頭状細胞の膜においてＳＬＧ蛋白と複
合体を形成して花粉の蛋白と全体的に相互作用し、それ
を許容または拒絶する認識を行う（（１４）ナスララ
ー，ジェー・ビー、シュタイン，ジェー・シー（Stein,
J.C.）、カンダサミー，エム・ケイ（Kandasamy,M.
K.）、ナスララー，エム・イー，サイエンス（Scienc
e）第２２６巻：１５０５〜１５０８頁（１９９４
年））。
【００１０】このタイプの蛋白ＳＲＫ（Ｓ−受容体キナ
ーゼ）がＳＬＧとは異なる遺伝子によりコードされてい
ることも知られている。該蛋白は完全に明らかにされた
アミノ酸配列（およびその遺伝子のヌクレオチド配列）
を有しており、その細胞外ドメインに対応する部分にお
いてＳＬＧ蛋白の配列と非常に相同的であり、また、科
を越えて存在する免疫グロブリンの免疫グロブリン領域
とも多くの類似性を有する（（１５）グラビン，ティー
・エル（Glavin,T.L）、ゴリング，ディー・アール（Go
ring,D.R.）、シェファー，ユー（Shafer,U.）ロートシ
ュタイン，エス・ジェー（Rothstein,S.J.），モレ・ジ
ェネ（Mol.Gen.）第２４４巻：６３０〜６３７頁（１９
９４年））。
【００１１】他の植物の花においては、自己不和合性シ
ステムはブラッシカにおけるように完全には研究されて
いないので、プルヌス・アビウム（Prunus avium）（チ
ェリー）（（１６）マウ，エス・エル（Mau,S.L.）、ラ
フ，ジェー（Raff,J.）、クラーク，エイ・イー（Clark
e,A.E.），アイソレイション・アンド・パーシャル・キ
ャラクタリゼイション・オブ・コンポーネント・プルヌ
ス・アヴィウム・スタイルス，インクルーディング・ア
ン・Ｓ−アリール−アソシエイティッド・アンタイジェ
ニック・グリコプロテイン（Isolation and partial ch
aracterization of component prunus avium styles, i
ncluding an S-allele-associated antigenic glycopro
tein）」，プランタ第１５６巻：５０５〜５１６頁（１
９８２年））、リコペルシコン・ペルナヴィウム（Lyco
persicon perunavium）（トマト）（（１７）マウ，エ
ス・エル、ウィリアムス，イー・ジー（Williams,E.
G.）、アトキンソン，エイ（Atkinson,A.）、アンダー
ソン、エム・エイ（Anderson,M.A.）、コーニッシュ，
エム・シー（Cornish,M.C.）、グレコ、ビー（Greco,
B.）、シンプソン，アール・ジェイ、ケイヤー−プー
ル，エイ（Kheyr-Pour,A.）、クラーク，エイ・イー，
「スタイル・プロテインズ・オブ・ア・ワイルド・トマ
ト（リコペルシコン・ペルナヴィウム）・アソシエイテ
ィッド・ウィズ・イクスプレッション・オブ・セルフ−
インコンパティビリティー（Style proteinsof a wild
tomato (Lycopersicon perunavium) associated with e
xpression of self-incompatibility）」，プランタ第
１６９巻：１８４〜１９１頁（１９８６年））、ニコチ
アナ・アラタ（鑑賞用タバコ）（（１８）ジャーネン，
ダブリュ（Jahnen,W.）、バターハム，エム・ピー（Bat
terham,M.P.）、クラーク，エイ・イー、モリッツ，ア
ール・エル（Moritz,R.L.）シンプソン，アール・ジェ
ー（Simpson,R.J.），「アイデンティフィケイション・
アイソレイション・アンド・Ｎ−ターミナル・シークエ
ンシング・オブ・スタイル・グリコプロテインズ・アソ
シエイティッド・ウィズ・セルフ−インコンパティビリ
ティー・イン・ニコチアナ・アラタ（Identification,I
solation and N-terminal sequencing ofstyle glycopr
oteins associated with self-incompatibility in Nic
otiana alata）」，プランタ・セル第Ｉ巻：４９３〜４
９９頁（１９８９年）；（１９）クロダ，エス（Kurod
a,S.）、イシハラ，ケイ（Ishihara,K.）、サキヤマ，
エフ（Sakiyama,F.），「ユース・オブ・ＳＭＥＲＴ・
システム・フォー・マイクロプレパレイション・オブ・
ア・プラント・プロテイン（Use of SMART System for
micropreparation of a plant protein）」，サイエン
ス・ツールズ（ScienceTools）第６巻：８〜９頁（１９
９２年））およびペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybr
ida）（（２０）リンスケンス，エイチ・エフ（Linsken
s,H.F.），「インコンパティビリティー・イン・ペチュ
ニア（Incompatibility in Petunia）」プロシーディン
グス・オブ・ロイヤル・ソサエティー・オブ・ロンドン
（Proc.R.Soc.Lond.）第１８８巻：２９９〜３１１頁
（１９７５年）；（２１）ブロータエルツ，ダブリュ・
ジェー（Broothaerts,W.J.）、バン・ラエレ，エイ（Va
n Laere,A.）、ウィッタース，ジェー・シー（Witters,
J.C.），「ピューリフィケイション・アンド・Ｎ−ター
ミナル・シークエンシング・オブ・スタイル・グリコプ
ロテインズ・アソシエイティッド・ウィズ・セルフ−イ
ンコンパティビリティー・イン・ペチュニア・ヒブリダ
（Purification and N-terminal sequencing of style
glycoproteins associated with self-incompatibility
in Petunia hybrida）」，プラント・モレキュラー・
バイオロジー（Plant Molecular Biology）第１４巻：
９３〜１０２頁（１９８９年））のごとき種における花
粉認識プロセスに関連する花柱の蛋白、およびその後の
花粉管における花粉の成長が調べられているにすぎな
い。これらの植物のＳＬＧ蛋白は全体として、その基本
的性質および２４ないし６５ｋＤａの間の分子量（２
１）といった共通の特性を有している。そのほか、ペチ
ュニアにおいては、花粉管に対する阻害が花柱全体にわ
たって行われ、これらの蛋白が柱頭のみならず花柱の細
胞内マトリックスにも見い出されることが記載されてい
る（（２０）および（２１））。ＳＭＡＲＴクロマトグ
ラフィーシステムを用いることによって、ニコチアナの
ＳＬＧ蛋白が数個の花柱から生理学的に活性状態で均一
に精製された（１９）。
【００１２】上記参考文献に示されているように、植物
生理学および分子遺伝学の分野において、植物の繁殖お
よび交雑に関連した問題における使用を考慮して、ＳＬ
ＧおよびＳＲＫ蛋白の研究はすでに着手されているが、
明細書において以下に示す使用のケースはない。
【００１３】現在に至るまで、アレルギー疾患の治療の
ための該蛋白の使用は特許されておらず、また、出版あ
るいは報告もされておらず、示唆されされていない。出
願人の使用は以下の２つの仮定に基づいている。
【００１４】１）アレルギーまたは過敏症を有する患者
は、共通のパターンとして、免疫グロブリンＥ抗体（Ｉ
ｇＥ）の血清指数が増加している。このＩｇＥは、患者
が感作されるアレルゲンについて特異的であり、それに
対する高い親和性を有する。通常、ＩｇＥのＦｃフラグ
メントに対する受容体を有する細胞型は２種類存在す
る。すなわち、血液中の好塩基球と、結合組織内に多い
マスト細胞とである。
【００１５】ＩｇＥは、ひとたびＦｃフラグメントによ
って上記の細胞型に固定されると、アレルゲンに対して
二量体のごとく橋かけし、感作された組織におけるマス
ト細胞の位置に応じて、対応するアレルギー状態（例え
ば、鼻炎、結膜炎、喘息など）を引き起こす隣接組織に
向けて、細胞質顆粒や他の予備形成された伝達物質中に
貯蔵されたヒスタミンを放出させる。
【００１６】現在、即時型過敏症に起因するアレルギー
は、免疫療法または薬物療法による治療が成功してい
る。原因治療である最初の療法では、アレルギーを引き
起こす蛋白を患者へ徐々に導入すると、特異的な「遮
断」ＩｇＧ抗体の産生や他の細胞性事象の発生が刺激さ
れることによって、この患者は次第に脱感作される。
【００１７】アレルギーの（対症）治療に最もよく用い
られる薬物は、抗ヒスタミン薬（ヒスタミン受容体に対
する類似競合物質）、膜安定化薬（クロモグリケート
（chromoglycate）およびネドクロミル（nedocromi
l））、コルチコステロイド類、β-作動薬、抗コリン作
動薬および気管支拡張薬である（(22)ホルゲート・エス
・ティー（Holgate S.T.），チャーチ・エム・ケイ（Ch
urch M.K.），アレルギー（Allergy），ガウアー・メデ
ィカル・パブリシング（Gower Medical Publishing），
ロンドン，ニューヨーク（1993年））。
【００１８】２）最近２年間に、汎アレルゲンとして定
義されるプロフィリンの研究に並々ならぬ関心が寄せら
れてきた。それは、プロフィリンが遍在性の高い蛋白で
あり、アールバース（Aalberse）のオランダ・グループ
（(23)ヴァン・リー・アール（Van Ree R.），ヴォイテ
ンコ・ヴィー（Voitenko V.），ヴァン・レオイネン・
ダブリュー・エイ（Van Leeunen W.A.），アールバース
・アール・シー（Aalberse R.C.）「プロフィリンは花
粉や野菜の交差反応性アレルゲンである（Profilin is
a cross-reactive allergen in pollen and vegetable
foods.）」インターナショナル・アーカイブズ・オブ・
アレルギー・アンド・アプライド・イムノロジー（Int.
Arch. Allergy Immunol.）98巻：97-104頁（1992
年））およびヴァレンタ（Valenta）のオーストリア・
グループ（(24)ヴァリアー・ピー（Vallier P.），デチ
ャンプ・シー（Dechamp C.），ヴァレンタ・アール（Va
lenta R.），ヴァイアル・オー（Vial O.），デヴィラ
ー・ピー（Deviller P.）「他のいくつかの植物種に存
在するアレルゲンと免疫化学的に関連したセロリからの
アレルゲンの精製および特徴付け（Purification and c
hracterization of an allergen from celery immunoch
emically related to an allergen present in several
other plant species.）。プロフィリンとしての同定
（Identification asa profilin.）」クリニカル・アン
ド・エクスペリメンタル・アレルギー（Clin. and Expe
r. Allergy）22巻：774-782頁（1992年））によって、
多数種の花粉や食物に関する研究において重要なアレル
ゲンであり、その交差反応性の原因であることが示され
ているからである。蜂蜜や膜翅類の毒液中にも構造の類
似した物質が存在するのではないかと思われている（(2
5)アールバース・アール・シー（Aalberse R.C.），コ
ステ・ヴィー（Koshte V.），クレメンス・ジェイ・ジ
ー・ジェイ（Clemens J.G.J.）「野菜、花粉および膜翅
類の毒液と交差反応する免疫グロブリンＥ抗体（Immuno
globulin E. antibodies that cross-react with veget
ables foods, pollen and hymenoptera venom.）」ジャ
ーナル・オブ・アレルギー・アンド・クリニカル・イム
ノロジー（J. Allergy Clinn Immunol.）68巻：356-364
頁（1981年））。プロフィリンが真核細胞におけるアク
チンの重合を調節する蛋白であること（(26)アデレム・
エイ（Aderem A.）「シグナル・トランダクションおよ
びアクチン細胞骨格：マルックスおよびプロフィリンの
役割（Signal transduction and the actin cytoskelet
on：the roles of Marcks and ｐrofilin.）」TIBS，17
巻：438-443頁（1992年））、およびプロフィリンが、
アクチン細胞骨格におけるそれらの機能によって花粉管
の発達において基本的な役割を果たしていること（(27)
ヴァレンタ・アール（Valenta R.）ら「プロフィリンは
機能性植物汎アレルゲンの新規な系を構成する（Profil
ins constitutes a novel family of functional plant
pan-allergens.）」ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディスン（J. Exper. Med.）175巻：377-385
頁（1992年））は知られている。
【００１９】上記のような技術分野の現在の水準とは対
照的に、本発明は、花粉プロフィリン（重要な汎アレル
ゲン）が、引用した受容体蛋白によって花の柱頭（また
は花柱）において中和されるのであれば、これらアレル
ゲンが、雌蘂の湿度および温度と同様の条件下で、アレ
ルギー患者の標的器官（例えば、鼻、気管支または眼）
の粘膜と接触したとき、予め体内に導入されたＳＬＧお
よびＳＲＫ蛋白によって、これらアレルゲンが中和され
うることを考慮して、ＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白を、抗イ
ディオタイプまたは免疫グロブリンへの結合の妨害因子
として用いることを提案する。
【００２０】従って、本発明者らは、即時過敏症に起因
するアレルギーに罹患した患者に対し、これら疾患の有
用な治療法として、ＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白を用いるこ
とを提案する。
【００２１】本発明は、その名称に示されているとお
り、植物の自己不和合性受容体蛋白（ＳＬＧおよびＳＲ
Ｋ）を、ＩｇＥによって媒介されるアレルギー疾患の治
療に用いることに関する。
【００２２】ＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白を単離する原料
は、顕花植物（被子植物）の雌蘂または雌性器官からな
る。これらは、特定の成熟状態、すなわち開花の１また
は２日前に対応する状態で見い出さなければならない。
単離は、生化学的方法または遺伝学的方法という２通り
の方法のいずれかによって実施することができる。
【００２３】ａ）生化学的方法：抽出は、磁気的に撹拌
しながら、水性媒体中で実施されるが、剪断による粉砕
を伴うより激しい均質化システムを用いることによって
補強することができる。媒体の疎水性は、低濃度の界面
活性剤を添加することによって増大させることができ
る。水性媒体中に可溶化した蛋白は、残りの固形植物構
造体から遠心分離法によって分離した後、それらを含む
上清を接線限外濾過法によって透析するか、あるいは受
動的拡散によって透析する。透析後、抽出物を濾過して
清澄化することにより、ＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白を含有
する雌蘂の原料抽出物が溶液状で得られる。この調製物
は、冷凍または凍結乾燥による安定な方法で保存すれば
よい。
【００２４】引き続いて、ＳＬＧ蛋白の精製は、（糖蛋
白に特異的な）セファロース・コンカナバリンＡカラム
でのクロマトグラフィー、またはモノ-エス（Mono-S）
フィルターを用いたカチオン交換体（SMART系）でのイ
オン交換クロマトグラフィーによって実施することがで
きる。
【００２５】ｂ）遺伝学的方法：ブラッシカ（Brassic
a）という特定の場合には、ＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白を
コードする遺伝子の配列が判明すれば、第１の便利なオ
リゴヌクレオチドを選択し、これら遺伝子をＰＣＲ法
（ポリメラーゼ連鎖反応法）によって増幅することがで
き、引き続いて、得られた組換えプラスミドで形質転換
したイー・コリ（E.coli）系の微生物中で発現させるこ
とにより、上記ＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白が得られ、まず
組換え蛋白を天然型のものと比較検討し、それらの相同
性を確認する。
【００２６】柱頭から抽出したＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白
は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動（ドデシル硫酸ナトリウ
ムの存在下におけるポリアクリルアミドゲル中での電気
泳動）において、分子量が近くて約２,０００ダルトン
しか異ならない平均分子量が５７〜６５ｋＤａである数
種による複雑な様相を呈する。この多形性は、花粉の特
異的な認識が必要とする変異性を反映していると推定す
ることができる。
【００２７】最もよく発現した場合、それは雌蘂の柱頭
で合成される全可溶性蛋白の５％を構成する。
【００２８】ＳＬＧは、この蛋白のＮ末端に、５〜７個
のオリゴ糖側鎖を有する。これらオリゴ糖が、蛋白１モ
ルあたり４.１：９：１２.１モルのキシロース、フルク
トースおよびマンノースからなる中性糖組成を有するこ
とが判明している。グリコ糖結合は、Ｎ-アセチルグル
コサミンのアノマー炭素を有するアスパラギン残基のア
ミド基からなる。この分子の糖部分は、花粉・柱頭間の
相互作用における特異性の原因ではない。
【００２９】ＳＬＧ蛋白の平均的なアミノ酸数は４３６
個であり、塩基側の等電点が約８.６付近であるが、Ｓ
ＲＫ蛋白のアミノ酸数は４６２個であり、ＳＬＧに対し
て相同性の高い領域を有する。
【００３０】本発明者らは、精製した抽出物中に含有さ
れるＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白を用いて、ラスト（ＲＡＳ
Ｔ；放射アレルゲン吸着試験）反応を阻害させたが、こ
のラスト反応は、アレルゲン反応のin vitroモデルを構
成するものであり、それゆえ、アレルギーを有する患者
における作用機構を予想できるようになる。
【００３１】ラスト法は、ＩｇＥ型抗体によって媒介さ
れるアレルギー疾患であるＩ型アレルギー疾患（即時過
敏症）のインビトロ診断用に設計された（(28)チェスカ
・エム（Ceska M.），ルンドグイスト・ユー（Lundguis
t U.）「ＩｇＥ定量用の新しい簡単な放射免疫アッセイ
法（A new and simple radioimmunoassay method forth
e determination of IgE）」イムノケミストリー（Immu
nochemistry）９巻：102-105頁，1972年）。このアレル
ギーの実証された基礎が、アレルゲン蛋白がその特異的
ＩｇＥのＦａｂフラグメントに結合することにあり、そ
のＦｃ部分によってマスト細胞および好塩基球の膜に結
合し、引き続いて、２つのＩｇＥ分子が架橋する結果と
して、細胞に脱顆粒反応を起こさせ、アレルギー性の総
体的症状を引き起こす媒介物質が放出されるのであれ
ば、あるシステムが確立された。このシステムによれ
ば、チューブの底に入れたペーパーディスクにアレルゲ
ンが（化学的活性化反応によって）結合する。問題のア
レルゲンで感作した患者の血清を添加すると直ちに、患
者の特異的ＩｇＥは、そのＦａｂ部分によって、ディス
クのアレルゲン蛋白に固定される。これらＩｇＥ分子
は、次いで、化学的に共役した酵素を有するヒト抗Ｉｇ
Ｅ抗体を添加することによって表示され、引き続いて無
色の基質を添加すると、容易に定量可能な着色物が出現
する。
【００３２】ＲＡＳＴによる in vitro における診断と
アレルギー患者の臨床皮膚試験の間に著しい相関関係が
あることが証明されている（（２８）ファダル・アール
・ジー、ナレバフ・ディー・ジェイ（Fadal R.G.，Nale
buff D.J.），in "ＲＡＳＴ”in Ｃlinical Ａllergy、
イアー・ブック（Year Book），メディカル・パブリッ
シャーズ，シカゴ，１９８１）。それは、in vitro 実
験が非常に類似しており、アレルギー性病状の発病にて
起こることを表していることを意味する。
【００３３】この基本的技法に基づき、イマン（Yman）
ら（（３０）Ｙman Ｌ.，Ｐonterious Ｇ.，Ｂrandt
Ｒ．ＲＡＳＴ−bases allergen assay methods. In：Ｒ
igamy,Ａ.Ｐ.,Ｈennessen Ｗ.,Ｐerkins Ｆ.Ｔ.（編）
Ｄeveloping Ｂiological Ｓtandars. Ｂasel：Ｓ.Ｋar
ger Ｖerlag, 29：151-165, 1975）は、液相中のアレル
ゲンを添加し、血清ＩｇＥによりディスクのアレルゲン
と競合させることからなる変法を設計した。そのような
方法において、新規技法（ＲＡＳＴ−阻害法と称する）
を用いて液相中に加えたアレルギー性蛋白の強度（親和
力）を評価した。
【００３４】この技術的構成の範囲内で、ＳＬＧおよび
ＳＲＫ蛋白が花粉のアレルゲンおよびそのすべての類似
構造体の中和能を有するという仮説に基づき、出願人
は、種々のアレルゲン-陽性血清系を用いるＲＡＳＴ−
阻害実験にて、ＩgＥ−アレルゲン結合について、種々
の植物の雌蘂より単離した蛋白の干渉能を試験する一連
の試験を実施した。
【００３５】前記したように、ＲＡＳＴのin vitro 実
験が、in vivo で起こることと一致するとした場合、液
相中の蛋白、すなわちイムノグロブリンＥのアレルゲン
への結合を明らかに抑制する蛋白を添加することによる
ＲＡＳＴ阻害法は、おそらく、マスト細胞および好塩基
球の細胞環境への in vivo でのその封入が、アレルゲ
ンの細胞膜を覆っているＩｇＥへの接触を抑制すること
と同様であると予測され、それによりアレルギー性病状
の発病は阻害されるであろう。
【００３６】特に、 ａ）アルヌス・グルチノサ（ハンノキ属）の未成熟な花
房 ｂ）パリエタリア・ユーダイカ（ピレトリウム）の未成
熟な花房 ｃ）チューリッパ・エス・ピー（チューリップ）の雌蘂 ｄ）ポピュルス・アルバ（ポプラ）の雌蘂 より抽出した蛋白を用いた。
【００３７】これらのケースの各々を、以下のパラグラ
フに示すように詳細に分析する： ａ）アルヌス・グルチノサ（ハンノキ属）はすでに多く
の研究がなされている植物である。該アルヌスの花房は
その構造の９０％以上が雌蘂からなる。水性抽出操作に
より、そのＳＬＧ−ＳＲＫ蛋白を共に単離し、測色学的
に定量され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴付られる未精
製の抽出物を得た。水性および弱疎水性溶媒（トリトン
Ｘ−１００を含む）の抽出を２回行った。２つの異なる
濃度での両方の抽出物を用いた場合、パリエタリア・ユ
ーダイカ（ピレトリウム）花粉、オーレ・ヨーロピア
（オリーブ）花粉、草花粉の混合物、ダーマトファゴイ
デス・プテロニシヌス（家チリダニ）およびアピス・メ
リフェラ（ミツバチ）毒についてＲＡＳＴが著しく阻害
された。すべてのケースにおいて、ＲＡＳＴ−阻害試験
を、比較対象として異なる濃度の各アレルゲンを用いて
実施した。硫酸アンモニウムを用いる沈降法により抽出
物を濃厚にし、阻害レベルを増加させた。最大濃度のＳ
ＬＧおよびＳＲＫ抽出物で、すべてのアレルゲン性の系
において、５０と７０％の間にて同様の阻害レベルが見
られた。
【００３８】トリトンＸ−１００での抽出物は、オーレ
・ヨーロピア花粉およびパリエタリア・ユーダイカ花粉
についてＲＡＳＴを最大限にまで阻害し、一方水性抽出
物は草およびミツバチ毒について類似するレベルの阻害
を示した。細胞受容体としてそれらの機能を理論的に考
えた場合、これらの結果はＳＬＧおよびＳＲＫ蛋白があ
る種疎水性であることを示唆する。
【００３９】ｂ）パリエタリア・ユーダイカの雌蘂の蛋
白では、試験した２つのアレルゲン系にて阻害が得られ
た。それは高レベル（８０−９０％）までパリエタリア
・ユーダイカ花粉についてＲＡＳＴを阻害し、またより
低い程度で家チリ、ダーマトファゴイデス・ファリナエ
の別のダニについてＲＡＳＴを阻害した。水性抽出物、
ならびに界面活性剤（トリトンＸ−１００）で得られる
抽出物は阻害作用を示した。
【００４０】ｃ）チューリップの花は数個の非常に大き
な雌蘂を有するが、その蛋白抽出物で阻害は得られなか
った。それはおそらく自己不和合性受容体蛋白の発現期
間にある植物を得ることが困難であることによるもので
ある。
【００４１】ｄ）ポピュルス・アルバ（ポプラ）雌蘂の
抽出物を用いた場合、試験したすべてのアレルゲン系：
ヘリアンタス・アンヌス（ヒマワリ）花粉、パリエタリ
ア・ユーダイカ花粉、ロリウム・ペレンネ（オリーブ）
花粉、草混合物、および家チリダニ、ダーマトファゴイ
デス・プテロニシヌスは阻害された。あらゆる場合で、
ＲＡＳＴは、アレルゲン系、および使用した雌蘂抽出物
の濃度に依存して、４４％から７３％まで変化するレベ
ルで阻害された。
【００４２】最後に、研究したすべての植物系で、ＳＬ
Ｇ蛋白ならびにＳＲＫ蛋白と和合する、抽出物中の、４
５〜６５ＫｄａのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分子量の領域
にある蛋白の存在が確認された。
【００４３】
【実施例】さらに本発明を以下の実施例にて示すが、そ
れは本発明の範囲を限定するものではなく、該範囲は請
求の範囲によってのみ、独占的に限定されるものであ
る。
【００４４】実施例１：ＳＬＧ−ＳＲＫ複合体のアルヌ
ス・グルチノサからの単離 原材料として、開花前の過程のアルヌス・グルチノサ
（ハンノキ属）の未成熟の雌蘂を用いた。植物の別の部
分または花粉の不存在を顕微鏡で試験した。（予め−２
０℃に凍結した）該材料（４０ｇ）を、超高純度の水
（２００ｍｌ）に懸濁させて抽出した。２５,０００ｒ
ｐｍでバーチ・シェア２５装置（剪断ホモジナイザー）
を用いて均質化し、４００〜６００μｍのガラス球を５
０％容量まで加え、細胞壁の破壊を容易にした。
【００４５】固体構造の残部からの可溶化蛋白の分離を
５,０００ｒｐｍで３０分間遠心分離に付すことにより
行った。遠心分離液の上清を、５,０００ダルトンの切
断膜を用いるペリコン（Pellicon）（ミリポール）系の
接線限外濾過により超高純度の水に対して透析した。全
工程を４〜８℃で行った。この場合、特徴を有する、直
接（０.２２μの孔の膜を介して濾過した後であるか、
またはその使用まで凍結乾燥状態にて貯蔵される）用い
られる水性抽出物が得られた。
【００４６】前記の遠心分離からの沈殿物を、もう一
度、２００ｍｌの容量の、トリトンＸ−１００（０.１
％）を有するココナッツ液中、マグネチック・スターラ
ーで撹拌（１１,０００ｒｐｍ）しながら４℃で４８時
間の抽出操作に付した。その後、遠心分離、限外濾過、
濾過および凍結乾燥の過程を、水性抽出操作について記
載した条件と同一の条件にて行った。
【００４７】実施例２：実施例１にて得られたアルヌス
・グルチノサ抽出物の特徴 アルヌス・グルチノサ雌蘂抽出物の蛋白含量を、以下の
プロトコルに従って、ブラッドフォード法（Bradford m
ethod）（BIO-RADとして公知）により測定した：
【００４８】ＢＩＯ−ＲＡＤ法による蛋白測定。ミクロ
アッセイ操作 それはブラッドフォードにより設計された方法を基礎と
するものであり、蛋白に結合した場合、４６５〜５９５
ｎｍのクーマシー（Coomassie）Ｇ−２５０ブルーとな
る最大吸収波長の置換に基づいている。
【００４９】標品の調製：１４９８μｇ／ｍｌの濃度
の、ＢＳＡまたはメルク（MERCK）アルブミン・フラク
ションの市販溶液（ＢＩＯ−ＲＡＤ II）（以下、溶液
Ａと称する）から、７種類の新たな溶液（Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）を調製した。そのうちの後の５種類
（Ｄ−Ｈ）を用いてゲージラインを作成した。
【００５０】溶液Ａ（１４９８μｆ／ｍｌ）：市販の標
品のアリコートを解凍 溶液Ｂ（１５０μｇ／ｍｌ）：溶液Ａ（０.１ｍｌ）＋
Ｈ2ＯまたはＳＳＦＦ（０.９ｍｌ） 溶液Ｃ（７５μｇ／ｍｌ）：溶液Ｂ（１ｍｌ）＋Ｈ2Ｏ
またはＳＳＦＦ（１ｍｌ） 溶液Ｄ（３７.５μｇ／ｍｌ）：溶液Ｃ（２ｍｌ）＋Ｈ2
ＯまたはＳＳＦＦ（２ｍｌ） 溶液Ｅ（１８.８μｇ／ｍｌ）：溶液Ｄ（２ｍｌ）＋Ｈ2
ＯまたはＳＳＦＦ（２ｍｌ） 溶液Ｆ（９.４μｇ／ｍｌ）：溶液Ｅ（２ｍｌ）＋Ｈ2Ｏ
またはＳＳＦＦ（２ｍｌ） 溶液Ｇ（４.７μｇ／ｍｌ）：溶液Ｆ（２ｍｌ）＋Ｈ2Ｏ
またはＳＳＦＦ（２ｍｌ）
【００５１】手順：０.８ｍｌの溶液Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−
Ｈおよびターゲット（Ｈ2ＯまたはＳＳＦＦ）を二重反
復試験用に採取し、それに濃縮した試薬０.２ｍｌを添
加した。該混合物を撹拌した後、５６０ｎｍ〜５９５ｎ
ｍでの吸光度を測定し、蛋白濃度に対する５９５ｎｍで
の吸光度を得た。相関係数が０.９８以上であったの
で、該試験は、有効なものであった。
【００５２】結果：前記方法によって、水性抽出物につ
いては、５.４％の蛋白含量が測定され（全凍結乾燥質
量に関して）、トリトン（Ｔriton）Ｘ−１００で得ら
れた抽出物については、９.１％が測定された。
【００５３】得られた蛋白の分子量の特徴付けは、以下
に説明する方法に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル
硫酸ナトリウムの存在下、ポリアクリルアミドゲル上で
の電気泳動）によって行った。
【００５４】基本的には、わずかな適正な変形および使
用した電気泳動（横型）装置：Ｍini−Ｐrotean II
［バイオ−ラド（Ｂio−Ｒad）］の製造者によって計画
された変形を伴ったレムリ（Ｌaemmli）法によって行っ
た。
【００５５】使用したバッファーおよび溶液は、以下の
とおりであった：
【００５６】 ａ．ビス−アクリルアミド溶液 アクリルアミド ８７.６ｇ（２９.２ｇ／１００ｍｌ） Ｎ−Ｎ’−ビス−メチレン− アクリルアミド ２.４ｇ（０.８ｇ／１００ｍｌ） 蒸留水 ３００ｍｌ 濾過し、次いで、暗所で４℃で貯蔵した。
【００５７】 ｂ．１.５Ｍトリス（Ｔris）−ＨＣｌ［pＨ８.８］（ランニング） トリス塩基 ２７.２３ｇ（１８.１５ｇ／１００ｍｌ） 蒸留水 １５０ｍｌ １Ｎ ＨＣｌでpＨを８.８に調整し、使用するまで、４
℃で貯蔵した。
【００５８】ｃ．０.５Ｍトリス−ＨＣｌ［pＨ６.８］
（スタッキング） トリス塩基 ６ｇ 蒸留水 １００ｍｌ １Ｎ ＨＣｌでpＨを６.８に調整し、４℃で貯蔵した。
【００５９】ｄ．１０％ＳＤＳ溶液 ＳＤＳ １０ｇ 蒸留水 １００ｍｌ
【００６０】ｅ．試料バッファー 蒸留水 ４.０ｍｌ ０.５Ｍ トリス−ＨＣｌ［pＨ６.８] １.０ｍｌ グリセロール ０.８ｍｌ １０％ＳＤＳ １.６ｍｌ ２−Ｂ−メルカプトエタノール ０.４ｍｌ ０．５％ブロモフェノールブルー ０.２ｍｌ 該試料を１００℃で５分間加熱した。
【００６１】 ｆ．電極バッファー［pＨ８.３］（５Ｘ） トリス塩基 ９ｇ（１５ｇ／リットル） グリシン ４３.２ｇ（７２ｇ／リットル） ＳＤＳ ３.０ｇ（５ｇ／リットル） 蒸留水 ６００ｍｌ ４℃で貯蔵し、沈殿が生じた後、３７℃に加熱した。５
Ｘバッファー母液６０ｍｌを蒸留水２４０ｍｌで希釈し
た。
【００６２】ｇ．クマシーブルー溶液（染色） クマシーブルーＲ−２５０ １ｇ メタノール ４００ｍｌ 酢酸 １００ｍｌ 蒸留水 ５００ｍｌ 染色時間：３０分間
【００６３】ｈ．脱色溶液 メタノール ４００ｍｌ 酢酸 １００ｍｌ 蒸留水 ５００ｍｌ 脱色時間：１〜３時間
【００６４】方法： １．プレートの装備 Ｍini-protean II二重スラブセルカタログにおける指
示に従った。
【００６５】 ２．分離用ゲルの調製（アクリルアミドの％：１２.５％） 蒸留水 ３.１ｍｌ １.５Ｍ トリス−ＨＣｌ［pＨ８.８] ２.５ｍｌ（０.３７６Ｍ） １０％ＳＤＳ １００μｌ（０.１％） ビス／アクリルアミド溶液 ４.３ｍｌ (９.６８％ＡＣＡ;０.２６％ＢＩＳ) −−−−−−−−−−−−−−脱気１０分間−−−−−−−−−−−−−− 過硫酸アンモニウム（新しい） ７５μｌ（３０ｍｇ／ｍｌ） ＴＥＭＥＤ ６μｌ プレート当たりの使用量：３.２ｍｌ（重合時間：１時
間） 中間期：プレートの各側当たり０.１％ＳＤＳ４０μｌ
【００６６】 ３．調製用ゲルの調製（アクリルアミドの％：４％） 蒸留水 ６.１ｍｌ ０.５Ｍトリス−ＨＣｌ［pＨ６.８] ２.５ｍｌ １０％ＳＤＳ １００μｌ ビス−アクリルアミド溶液 １.３ｍｌ（３.７９％ＡＣＡ） −−−−−−−−−−−−−−脱気１０分間−−−−−−−−−−−−−− 過硫酸アンモニウム（新しい） ７５μｌ ＴＥＭＥＤ １０μｌ
【００６７】４．電気泳動の条件 電圧：２００ボルト 時間：４５分間
【００６８】分子量の測定 一連の蛋白の分子量（公知）の対数に対するそれらによ
って示された移動度（ｎｍ）を表すゲージ線を作成する
ことによって行った。移動度は、分離用ゲルの開始から
バンドの中間点まで測定した。両方の変数の間の相関関
係（ｒ ０.９０）が判明した後、問題の蛋白またはポ
リペプチドの分子量をそれらの移動度から測定した。標
準として使用した蛋白は、低分子量についてのバイオ−
ラッド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）キット（Ｒef.１６１−０３
０４）のものであった。
【００６９】 蛋白 分子量（ダルトン） ホスホリラーゼｂ ９７,４００ ウシ血清アルブミン ６６,２００ 卵アルブミン ４２,６９９ 炭酸脱水酵素 ３１,０００ トリプシン阻害剤 ２１,５００ リゾチーム １４,４００
【００７０】結果 対応する電気泳動スキームにおいて、アルヌスの雌蘂抽
出物が、分子量６０ｋＤａの領域において強くて幅広い
バンドを生じることが観察された。これは、ＳＬＧ−Ｓ
ＲＫ蛋白の多分散性と一致する。このバンドは、抽出物
の９０％を超える蛋白を示す。
【００７１】実施例３：ＳＬＧ−ＳＲＫ蛋白によるＲＡ
ＳＴ−阻害実験 ＩｇＥの妨害因子として使用されるべきＳＬＧ−ＳＲＫ
保護蛋白の許容量をＲＡＳＴ−阻害法によって測定し
た。該試験は、以下に説明するプロトコールに従って行
われた。
【００７２】セルロースディスクの固相を用いるＥＬＩ
ＳＡ−阻害（ＲＡＳＴ−阻害） 注意：遊離相におけるアレルゲン溶液を調製するため
に、以下のインキュベーションバッファーを使用した。
【００７３】インキュベーションバッファー ＮａＣｌ ９ｇ Ｎa2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ ７.２ｇ ＮaＨ2ＰＯ4・Ｈ2Ｏ １.３ｇ ２０％ヒトアルブミン １５ｍｌ アジ化ナトリウム ０.５ｍｌ 蒸留水 全量が１リットル
になるまで
【００７４】１．該スキームに従って、種々のアレルゲ
ン濃度をインキュベーションバッファー中で調製した
（遊離相中のアレルゲン：阻害剤） (ａ)：１０ｍｇ／ｍｌ（凍結乾燥物の乾燥重量に基づ
く） (ｂ)：１ｍｇ／ｍｌ (ｃ)：０.１ｍｇ／ｍｌ (ｄ)：０.０１ｍｇ／ｍｌ
【００７５】２．アレルゲンディスク（固相）をチュー
ブ中に置き、真空下でピペットを用いた吸引によって、
それらをよく乾燥させた。 ３．陽性血清５０μｌおよび各々の濃度のアレルゲンを
添加した。 ４．該チューブを密封し、室温で３時間インキュベート
した。 ５．各チューブを、ファデチム（Ｐhadezym）ＲＡＳＴ
トレーサーキットの洗浄溶液で３回洗浄した。
【００７６】６．コンジュゲート（β−ガラクトシダー
ゼ−抗ＩｇＥ酵素）５０μｌを該ディスク（ファデチム
ＲＡＳＴトレーサー）の各々に添加した。 ７．該チューブを密封し、４℃で一晩じゅうインキュベ
ートした。 ８．それらを、前記５と同様に３回洗浄した。
【００７７】９．展開溶液（ファデチムＲＡＳＴトレー
サー）２００μｌを添加した。展開溶液２００μｌを、
遊離相中にディスクまたはアレルゲンを含まない、ある
いは、ターゲットの測定を行うべき血清を含まない別の
２つのチューブに入れた。 １０．該チューブを密封し、３７℃で２時間、厳密にイ
ンキュベートした。 １１．停止溶液（ファデチムＲＡＳＴトレーサー）１ｍ
ｌを添加した。 停止溶液：蒸留水１００ｍｌ中の炭酸ナトリウム４.２
ｇ。 １２．ターゲットで０に調節し、４２０ｎｍでの吸光度
を測定した。
【００７８】結果 前記方法によって得られた最も代表的な結果のいくつか
を「図１」〜「図６」に示し、以下に説明する。
【００７９】３種類のアレルゲン系：ダーマトファゴイ
デス・プテロニシヌス（ダニ）、フレウム・プラテンス
（草）花粉およびパリエタリア・ユーダイカ（アンダー
ブラッシュ）花粉中において、種々の濃度のＳＬＧおよ
びＳＲＫ蛋白を含有する水性アルヌス・グルチノサ抽出
物を用いて阻害を行った。数種類の濃度のアレルゲンお
よびアルヌスを試験して、阻害線を作成し、この方法
で、それらの２つの基本的な比較パラメーターを評価し
た：得られた線の傾き（ｍ）は、比較した系のホモロジ
ーを示し、５０％のＲＡＳＴ−阻害を生じる液相におけ
るアレルルゲンの濃度として定義されるＵＩ50値は、抗
原−抗体系のそれぞれの親和力（または強度）について
の情報を示す。
【００８０】ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス系
（「図１」）において、アルヌス抽出物は、ダーマトフ
ァゴイデス・プテロニシヌス抽出物（１６ １０ｍｇ／
ｍｌ）の自己阻害８２％に対して、同一濃度で５０.７
％までの阻害を生じた。該図において見られるとおり、
線の傾きは、同様であり、アルヌス抽出物は、ダーマト
ファゴイデス・プテロニシヌスよりも３８倍低い強度因
子で阻害する（相対ＵＩ50の商によって算出した）。ダ
ーマトファゴイデス・プテロニシヌスについてのＵＩ50
は０.３０１、ｍは２６.０４であり、アルヌス花房につ
いてのＵＩ50は１１.５６、ｍは１６.５１であった。
【００８１】フレウム・プラテンス花粉（「図２」）に
対するＲＡＳＴ−阻害は、同一の抽出物およびアルヌス
抽出物の線間で非常に大きな類似性を示した。後者は、
最大阻害５３.１％（フレウムの８８.３％に対して）を
生じ、相対強度は、９６倍低かった。フレウム・プラテ
ンスについてのＵＩ50は０.０４１ｍｇ／ｍｌ、ｍは１
６.９１であり、アルヌス花房についてのＵＩ50は３.９
６ｍｇ／ｍｌ、ｍは１５.３３であった。
【００８２】アルヌス花房（Ａlnus influorescence）
抽出物（９０％を超える雌蘂）によって生じたパリエタ
リア・ユーダイカ花粉（「図３」）に対するＲＡＳＴ−
阻害の線もまた、花粉抽出物自体によって生じたものと
平行であり、使用した最大濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）で５
１.８％阻害を達成した。パリエタリアのものは、８７.
６％であった。ＵＩ50の商は、アルヌス抽出物中で４７
倍低い強度（親和力）を示した。パリエタリア・ユーダ
イカについてのＵＩ50は０.１７４、ｍは２２.９６であ
り、アルヌス花房についてのＵＩ50は８.２５、ｍは１
７.３９であった。
【００８３】別の実験系（「図４」〜「図６」）におい
て、アルヌス抽出物（水性抽出物および弱疎水性の抽出
物（トリトンＸ−１００を含む））の阻害を、３つのア
レルゲン系：草混合物、オーレ・ヨーロピア（オリー
ブ）花粉およびミツバチ毒における２つの固定した濃度
１０および１ｍｇ／ｍｌで試験した。
【００８４】草花粉に対するＲＡＳＴ−阻害を「図４」
に示す。花粉抽出物自体によって得られた最大値は、９
３.８％であったが、両方のアルヌス抽出物について、
最大阻害６４.７％および６３.０％を得た。洗剤（トリ
トンＸ−１００）を用いて得られた抽出物の方が高い。
【００８５】オーレの花粉系（「図５」）において、洗
剤によって得られたアルヌス抽出物によって生じた阻害
は、水性抽出物５５.４％に対して１０ｍｇ／ｍｌで７
１.４％であり、同一濃度でオーレ抽出物自体９１.５％
であった。
【００８６】ミツバチ毒とは異なる系は阻害され（「図
６」）、洗剤および水によるアルヌス抽出物について、
各々、７０.４％および６９.６％の最大阻害（同様に）
を達成し、同一抽出物、すなわちミツバチ毒抽出物で８
３.７％を達成した。１ｍｇ／ｍｌの濃度で、再度、疎
水性抽出物は阻害され、このことにより、阻害蛋白（Ｓ
ＬＧおよびＳＲＫ）がわずかに疎水性を有することが再
度確認される。それらは、水性溶媒で抽出されうるか、
または低濃度の洗剤を添加することによって抽出されう
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アルヌス抽出物を用いたダーマトファゴイデ
ス・プテロニシヌスのＲＡＳＴ阻害を示す図。 ・；ダーマトファゴイデス・プテロニシヌス ＋；アルヌス花房
【図２】 アルヌス抽出物を用いたフレウム・プラテン
スのＲＡＳＴ阻害を示す図。 ・；フレウム ＋；アルヌス花房
【図３】 アルヌス抽出物を用いたパリエタリア・ユー
ダイカのＲＡＳＴ阻害を示す図。 ・；パリエタリア・ユーダイカ ＋；アルヌス花房
【図４】 アルヌス抽出物を用いた草混合物のＲＡＳＴ
阻害を示す図。 ・；混合草 …；アルヌス花房（水性） ‐‐‐；アルヌス花房（トリトン）
【図５】 アルヌス抽出物を用いたオーレ・ヨーロピア
のＲＡＳＴ阻害を示す図。 ・；オーレ・ヨーロピア …；アルヌス花房（水性） ‐‐‐；アルヌス花房（トリトン）
【図６】 アルヌス抽出物を用いた蜜蜂の毒液のＲＡＳ
Ｔ阻害を示す図。 ・；ミツバチ毒 …；アルヌス花房（水性） ‐‐‐；アルヌス花房（トリトン）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 // Ｃ０７Ｋ 14/415 8318−4Ｈ (72)発明者 リカルド・パラシオス・ペラエス スペイン、マドリッド、チャレット・パル セラ・セー、アベニーダ・モスカテラル６ −８番 (72)発明者 アルベルト・マルティネス・ガラテ スペイン、サントゥルセ（ビスカヤ）、ホ セ・ミゲル・デ・バランディアラン11番 クアルト・イスキエルダ (72)発明者 ホルヘ・マルティネス・ケサーダ スペイン、ビルバオ、ブルダ・デ・エパル サ13番 クアルト・アチエ

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 開花１〜数日前に対応する成熟過程の被
    子植物の雌蘂から抽出した自己不和合性受容体蛋白（Ｓ
    ＬＧおよびＳＲＫ）の、ＩgＥが介在するアレルギー疾
    患の治療薬製造への使用。
  2. 【請求項２】 該蛋白を遺伝子操作技術で得る請求項１
    記載の使用。
  3. 【請求項３】 該蛋白がブラッシカ（Ｂrassica）植物
    に属する植物からのものである請求項１または２記載の
    使用。
  4. 【請求項４】 該蛋白がアルヌス・グルチノサ（Ａlnus
    glutinosa）（ハンノキ属）植物からのものである請求
    項１または２記載の使用。
  5. 【請求項５】 該蛋白がパリエタリア・ユーダイカ（Ｐ
    arietaria judaica）（ピレトリウム）植物からのもの
    である請求項１または２記載の使用。
  6. 【請求項６】 該蛋白がポピュルス・アルバ（Ｐopulus
    alba）（ポプラ）植物からのものである請求項１また
    は２記載の使用。
  7. 【請求項７】 アルヌス・グルチノサ蛋白が、in vitro
    でダーマトファゴイデス・プテロニシヌス（Ｄermatoph
    agoides pteronyssinus）（家チリダニ）に対するアレ
    ルギー反応を総合的または部分的に阻害する請求項５記
    載の使用。
  8. 【請求項８】 アルヌス・グルチノサ蛋白が、in vitro
    でフレウム・プラテンス（Ｐheleum pratense）花粉に
    対するアレルギー反応を総合的または部分的に阻害する
    請求項５記載の使用。
  9. 【請求項９】 アルヌス・グルチノサ蛋白が、in vitro
    でパリエタリア・ユーダイカ花粉に対するアレルギー反
    応を総合的または部分的に阻害する請求項５記載の使
    用。
  10. 【請求項１０】 アルヌス・グルチノサ蛋白が、in vit
    roで混合草花粉に対するアレルギー反応を総合的または
    部分的に阻害する請求項５記載の使用。
  11. 【請求項１１】 アルヌス・グルチノサが、in vitroで
    オーレ・ヨーロピア（Ｏlea europea）（オリーブ）花
    粉に対するアレルギー反応を総合的または部分的に阻害
    する請求項５記載の使用。
  12. 【請求項１２】 アルヌス・グルチノサ蛋白が、in vit
    roでアピス・メリフェラ（Ａpis mellifera）（ミツバ
    チ）に対するアレルギー反応を総合的または部分的に阻
    害する請求項５記載の使用。
  13. 【請求項１３】 開花１〜数日前に対応する成熟過程の
    被子植物の雌蘂から抽出した自己不和合性受容体蛋白
    （ＳＬＧおよびＳＲＫ）を有効成分とすることを特徴と
    するＩgＥが介在するアレルギー疾患治療薬。
JP7000238A 1994-01-05 1995-01-05 アレルギー疾患治療のための植物自己不和合性受容体蛋白（ｓｌｇおよびｓｒｋ）組成物 Expired - Lifetime JP2918795B2 (ja)

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ES09400017A ES2081255B1 (es) 1994-01-05 1994-01-05 Aplicacion de las proteinas receptoras de autoincompatibilidad (slsg) de plantas para el tratamiento de las enfermedades alergicas.

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JPH083051A true JPH083051A (ja) 1996-01-09
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JP2004507509A (ja) * 2000-09-01 2004-03-11 ナツミン　ファルマ　エイビー 疾患関連体重増加の処置のための、花粉抽出物を含む組成物の使用

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BR9500112A (pt) 1995-10-03
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CA2139552C (en) 1999-01-19
AU1004795A (en) 1995-07-13
AU691211B2 (en) 1998-05-14
ES2081255A1 (es) 1996-02-16
CA2139552A1 (en) 1995-07-06
EP0662327A1 (en) 1995-07-12
ES2081255B1 (es) 1996-09-01

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