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JPH0820445B2 - 決定方法 - Google Patents

決定方法

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Publication number
JPH0820445B2
JPH0820445B2 JP5077331A JP7733193A JPH0820445B2 JP H0820445 B2 JPH0820445 B2 JP H0820445B2 JP 5077331 A JP5077331 A JP 5077331A JP 7733193 A JP7733193 A JP 7733193A JP H0820445 B2 JPH0820445 B2 JP H0820445B2
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JP
Japan
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polymer
water
water treatment
antibodies
aqueous
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Application number
JP5077331A
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JPH0678762A (ja
Inventor
ウェザービィー ポーリン
ハワード ステムソン ウィリアム
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FMC Technologies Ltd
Original Assignee
FMC Corp UK Ltd
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Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10711299&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0820445(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by FMC Corp UK Ltd filed Critical FMC Corp UK Ltd
Publication of JPH0678762A publication Critical patent/JPH0678762A/ja
Publication of JPH0820445B2 publication Critical patent/JPH0820445B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2430/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving synthetic organic compounds as analytes
    • G01N2430/60—Synthetic polymers other than synthetic polypeptides as analytes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は決定方法、とくに水性媒
質中の水処理化学物質の免疫分析にもとづく決定法、お
よびこの新規な方法に有用な新規な抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】大部分の天然水、および一般の水性系は
カルシウム、マグネシウム、バリウム、およびストロン
チウムのような溶解金属塩を含む。天然水または水性系
を加熱すると、溶解塩は不溶性塩に転化することがあ
り、その際に水または水性系に接触する伝熱表面にスケ
ールとしてこれらが析出することがある。不溶性塩スケ
ールは水または水性系を加熱なしに単に濃縮するときで
さえ生成しうる。
【０００３】このような沈澱およびスケール析出はやっ
かいであり、水性系を良好な操作秩序に保つに必要なコ
ストの増大をもたらしうる。スケール析出によって生ず
る問題のなかでも、流体流の障害、伝熱抵抗、金属部品
の摩耗、装置寿命の短縮、局在化腐食の攻撃、貧弱な腐
食防止剤の性能、およびスケジュールにないシャットダ
ウンが重要である。これらの問題はたとえば循環水系に
起こりうる。たとえば油井さく孔、スチーム動力プラン
ト、水の脱塩プラント、逆浸透装置、熱交換装置および
水性媒質中の生成物および副生物の輸送に関する装置、
たとえば電力生産における石炭燃焼中に生成するフライ
アッシェの輸送に関する装置、においてこれらの問題が
起こりうる。
【０００４】多数の添加物とくにポリカルボキシレート
が水性系への添加に有効なスケール防止剤として提供さ
れた。
【０００５】同様に、天然水および水性系はそれらと操
作上接触状態にある金属に対して腐食性である。その後
果として、このような系は防食剤たとえばホスホネート
で処理してこのような金属たとえば配管の劣化を防がな
ければならない。
【０００６】水処理化学試剤は非常に低濃度で有効であ
りうるけれども、水性系をトラブルなしに操作しようと
する場合にはある種の最小濃度を保たなければならな
い。時間の経過と共に、系からの水処理化学試剤の損失
が起こり、上記の問題を避けるため補充が必要である。
他方、過度の水処理化学試剤の使用は操作コストを増大
させる。それ故、処理、化学試剤の有効性とコストを均
衡させる必要性は、水性系の水処理化学試剤の濃度モニ
タするための方法と装置の開発に導く。
【０００７】たとえば、ポリカルボキシレートのような
スケール防止剤の決定には比色法が利用できる。然しな
がら、比色法はそれらが外来物質からの妨害を受けると
いう欠点をもつ。油井の利用において、たとえば妨害は
鉄および油誘導有機物質から主として起こる。
【０００８】この妨害を克服する試みにおいて、妨害性
の種を除き、水処理化学試剤を濃縮する試料調製（予備
処理）カートリッジを使用することができる。然しなが
ら不幸なことに、このような技術はカートリッジの吸着
の場の有機物からの競合のために決定される水処理化学
物質の損失をもたらしうる。このような方法は時間がか
かり、丈夫さを欠き、そして必要な感度（僅か１〜２ｐ
ｐｍの検出限度）を欠く。またそれらは必要な決定を行
うために有効に使用するためにはある量の経費を必要と
する。
【０００９】更に近年になって、免疫学的方法が有機化
合物の決定のために開発された。
【００１０】タンパク、細胞、ホルモン、ビタミン、薬
物およびミコトキシンなどを決定するための免疫学的方
法は多岐にわたって知られており、文献類に広範囲に報
告されている。このような方法において、動物、多くの
場合マウスまたはラビットがアナライトまたはタンパク
−アナライト複合体のいずれかにより免疫化される。こ
の動物によって生産される抗体を次いで免疫分析の形体
で使用してアナライトを決定する。これらの方法はアナ
ライトと抗体との間の特異反応にもとづいている。
【００１１】文献に報告された免疫分析は天然分子にま
で上昇させた抗体をくみ入れている。然しながら最近、
ＥＰ２６０８２９Ａは塩素化フェノールとくにペンタク
ロロフェノールに反応性のある新規なモノーおよびポリ
クローナル抗体を開示した。この抗体は農薬および保存
薬として広く使用されているペンタクロロフェノールを
同定し且つ分析するのに使用することができる。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】我々は水溶液中の水処
理ポリマーの検出に免疫分析法を適用して、本発明以前
の方法論によっては達成されなかった感度の高い、特異
性の、迅速でしっかりした且つ比較的に安価に個人的に
操作しうる決定法を提供することに成功した。
【００１３】寸法と形状にかなり変化があり、種々の分
子量をもつ多分散物である分子に抗体を有効に使用しう
るということは驚くべきことである。競合分析の結果
は、反復モノマー単位の数は変化しうるけれども、生成
物中の分子ごとに存在する部分のコア活性中心にまで高
められることを実証している。
【００１４】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、水処理
ポリマーに対するポリクローナルまたはモノクローナル
抗体を生成させ、このようにしてえられた抗体を水性試
料について行う免疫分析の試剤として使用することを特
徴とする水性試料中の水処理ポリマーの存在および／ま
たは濃度を決定する方法を提供するものである。
【００１５】本発明はまた、水処理ポリマーにまで上昇
させたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の
有効量を許容しうるキャリヤーと組み合わせて含むこと
を特徴とする水性試料中の水処理ポリマーの存在および
／または濃度を決定するための組成物をも提供するもの
である。
【００１６】本発明の方法で決定するための水処理ポリ
マーは次式Ｉのリン酸含有カルボン酸テロマーまたはそ
の塩である。
【００１７】
【化４】
【００１８】Ｒ”は水素、メチルまたはエチルであり、
Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２シクロ
アルキル、アリール、アラルキル、次式の残基
【００１９】
【化５】
【００２０】（Ｒ”は上記の定義をもち、そしてｍとｎ
の合計は多くても１００の整数である）であるが、ある
いはＲは残基−ＯＸ（Ｘは水素またはＣ１〜Ｃ４アルキ
ル）であり、そしてＲ１は残基−ＯＸ（Ｘは上記の意味
をもつ）である。
【００２１】式Ｉのテロマーおよびその製造法は米国特
許第４，０４６，７０７号に詳細に記載されている。
【００２２】特に好ましい式Ｉのテロマーは次式ＩＡを
もつものである。
【００２３】
【化６】
【００２４】ただしｍ’とｎ’の合計は４〜３２とくに
１５〜２０の範囲の整数である。
【００２５】決定すべき水処理ポリマーが存在しうる水
性系に関して、とくに関心のあるのは冷却水プラント流
のスチーム発生プラント、海水エバポレータ、逆浸透圧
装置、製紙装置、砂糖エバポレータ装置、土壌灌注プラ
ント、水圧クッカー、ガス・スクラビング装置、密閉回
路加熱系、水性基材冷凍系、およびダウン・ウエル系で
ある。
【００２６】本発明の方法と装置に使用する抗体は周知
の技術によって製造することができる。
【００２７】特定の水処理ポリマーと反応性のあるポリ
クローナル抗体について、該ポリマーとマクロ分子キャ
リヤーとの免疫原複合体をまず生産し；次いで動物をこ
の複合体、ポリマー単独、補薬またはそれぞれの別々の
混合物を用いて免疫させ；動物から血液を除いて血清を
この血液から分離し；そして最後にポリクローナル抗体
を血清から回収することができる。
【００２８】然しながら水処理ポリマー上の特異エピト
ープに反応性のあるモノクローナル抗体を本発明の方法
および組成物において使用するのが特に特定ポリマーに
対するそれらのすぐれた特異性に鑑み好ましい。
【００２９】モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒおよび
ＭｉｌｓｔｅｉｎによってＮａｔｕｒｅ２６５：４９５
（１９７５）に始めて記載された技術を応用してえられ
る。
【００３０】具体的には特異性水処理ポリマーの免疫発
生源の形体をまず提供し；動物をこれで免疫させ；この
動物から抗体産生細胞を取得し；このようにしてえられ
た細胞を骨髄腫系細胞と融合させてハイブリドーマを製
造し；このハイブリドーマから特異性水処理ポリマーと
反応性のある抗体を製造し；そしてその後にモノクロー
ナル抗体をえらばれたハイブリドーマから分離する。
【００３１】従って本発明は式Ｉの水処理ポリマーに対
する抗体であって該ポリマーと特異的に反応しうる抗体
を生成するハイブリドーマからなる水性媒体中の水処理
ポリマーの決定方法で用いるためのハイブリドーマをも
提供する。
【００３２】水処理ポリマーは一般に低い分子量をもつ
が、それ自身は抗体の生産を誘発しない。然しながらそ
れらは、高分子量の免疫発生性キャリヤーと組み合わせ
てハプテンのように使用することができる。たとえばそ
れらはＴｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏ
ｌ ５０，１３７−１４６（１９７９）にＡｌｂｒｏら
によって開示されている技術を使用してタンパクと組み
合わせて使用することができる。
【００３３】このようにしてえられる複合体を次いで使
用して動物宿主を通常の技術たとえば加温によって免疫
することができる。動物宿主はたとえばラビットまたは
ラットまたはマウスのような「けっし類」でありうる。
【００３４】宿主動物が投与複合体に対する抗体を産生
した後に、ポリクローナル抗体を動物から通常の技術に
よって回収することができる。
【００３５】たとえば、血液を動物から除去し、このよ
うにして除いた血液から血清を分離することができる。
次いで所望の抗体をこの血清からたとえば親和精製また
は塩フラクションによって除くことができる。
【００３６】水処理ポリマーに対するモノクローナル抗
体を製造するためには、抗体を産生する細胞を免疫動物
から回収することができる。動物の脾臓から取り出した
Ｂリンパ細胞が好ましい。
【００３７】除いた細胞を骨髄腫系細胞と融合させてハ
イブリドーマを製造し、次いでこれを再び標準技術を使
用して、たとえば限定希釈によるクローニングを使用し
て、分離する。
【００３８】ひとたびハイブリドーマが分離されたなら
ば、選択を行って本発明の方法において決定されるべき
特異性が水処理ポリマーに対する抗体を生産するものを
確認する。見出された特異性ハイブリドーマを次いで周
知の方法によって単離し、適切な抗体をそれらから通常
の技術によって分泌させることができる。
【００３９】
【実施例】次の実施例によって本発明を更に具体的に説
明する。尚実施例２，５〜１３，１９，２５〜２７は参
考例である。
【００４０】実施例１ １．タンパク複合体の製造 １６モルのアクリル酸と１モルの次亜リン酸とから誘導
された且つ米国特許第４，０４６，７０７号の方法によ
って製造したテロマー（テロマー１）を、１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
塩酸塩（ＥＤＣ）を使用して、キャリヤーたんぱくキイ
ホール・ハエモシアニン（ＫＬＨ）に結合させる。ま
た、この生成物を第２のたんぱくであるオバルブミン
（ＯＶＡ）に結合させてスクリーニングの目的に使用す
る。
【００４１】実質的に２ｍｇのＫＬＨまたはＯＶＡを２
００μｌの脱イオン水にとかす。また、結合させるべき
２ｍｇのペプチドを０．５ｍｌの共役緩衝液（０．１Ｍ
の（２−Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）ＭＥ
Ｓ、０．９ＭのＮａＣｌおよび０．０２％のＮａＮ３、
ｐＨ４．７）にとかす。
【００４２】５００μｌのペプチド溶液を２００μｌの
キャリヤーたんぱく溶液に加える。ＯＶＡ共役体につい
て、この溶液を１００ｍｇのＥＤＣに加え、温和な場合
によって溶解させる。ＫＬＨ共役体について、１０ｎｇ
のＥＤＣを１ｍｌの脱イオン水にとかし、５０μｌのこ
の溶液を直すにキャリヤー−ペプチド溶液に加える。
【００４３】反応を室温で２時間進行させる。精製の前
に遠心分離を使用して沈澱を除く。
【００４４】共役体をゲル濾過またはセファデックスＧ
５０（０．５×５ｃｍ）を使用して精製する。このカラ
ムを５ｍｌのリン塩緩衝食塩水ＰＢＳを使用して洗浄す
る。このペプチド・キャリヤー混合物をカラムの頂部に
直接に加え、溶離液を集める。０．５ｍｌの分別量のＰ
ＢＳを加え、それぞれのフラクションを別の管に集め
る。１５ｍｌずつのＰＢＳを共役体とペプチドの双方の
溶離液に加える。免疫源溶離液はフラクション４〜６の
間にあり、そして遊離ペプチドと試剤はフラクション８
の後にある。
【００４５】ハプテンとキャリヤーの比は分光計で決定
し、そして共役後の試剤の濃度の評価を行った。キャリ
ヤー１００，０００モル重量当りのポリマーのモル比は
６〜１１である。
【００４６】２．動物の免疫化 ａ）生後６〜８週間のマウス（ＮＺＢ／ＮＺＷ Ｆｌヒ
ブリド雌、およびＢＡＬＢ−ｃ雌）は、０．１ｍｌのＦ
ｒｅｕｎｄｓ完全補薬（ＦＣＡ）および１００μｇのポ
リマー複合体（タンパク濃度基準）を０．１ｍｌの食塩
水中で混合した０．１ｍｌの１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液中
の０．２ｍｇのポリマーを受け取る。その後にこの動物
に１８〜２１日毎に同じ抗原処方物および調剤量を注射
する。ただしＦｒｅｕｎｄｓ不完全補薬（ＦＩＡ）をＦ
ＣＡの代わりに使用する。すべての注射は腹腔内であ
り、動物の血液および脾臓を犠牲に供する。
【００４７】ｂ）生後１２から１６週間のラット（Ｓｐ
ｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ 雌）に（２ａ）に示すのと
同じプロトコールで注射を行った。血液は心臓孔あけに
よって得た。
【００４８】ｃ）生後４ヶ月のラビット（ＮＺＷ 雌）
に次のとおり注射を行った。０日目筋肉内、１４日目
筋肉内、２４日目 腹腔内。すべての処理は５０μｇタ
ンパクまたは２００μｇポリマー／０．２ｍｌを含み、
０．２ｍｌのＦＣＡ（０日目）、０．２ｍｌのＦＩＡ
（１４日目）、０．２ｍｌの食塩水（２４日目）と共に
与える。３４日目に静脈孔あけによって血液を得る。こ
れを室温で凝固させ、血清を遠心分離（２０００Ｇ、１
５分、４℃）によって分離する。
【００４９】３．モノクローナル抗体の製造 上記のようにして免疫にさせたマウスに３日間ポリマー
または複合体を（２ａに示す投与量で）注射してから犠
牲に供した。
【００５０】脾臓を取り出し、ハンクス平衡塩溶液中の
解体によって脾臓細胞を得る。これらの脾臓細胞を、指
数増殖で、３７℃３分間温和に混合しながらＲＰＭ１
１６４０中の４６％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコー
ル１５５０（Ｓｅｒｖａ）の１ｍｌの添加により４：１
の比で、Ｘ６３．Ａｇ８６．５．３ネズミ骨髄種株から
の細胞と融合させる。室温で２分間放置後に、混合物を
５分間にわたる２０ｍｌのＲＰＭ１ １６４０の滴下状
添加によって、次いで室温で１０分間の放置によって混
合物を除々に希釈した。ＲＰＭＩ １６４０による２回
の洗浄後に、これらの細胞を重炭酸塩緩衝のＲＰＭＩ
１６４０中で３７℃で２ｈｒ培養する。このＲＰＭＩ
１６４０は１０％（ｖ／ｖ）仔牛血清、２ミリモル／ｌ
のＬ−グルタミン、５０ ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよ
び５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（フロー）を補
充し、１×１０−４モル／ｌのハイポキサンチンおよび
１．６×１０−５モル／ｌのチミジン（ＵＴ媒質）を含
むものである。この細胞懸濁液（１００μｌ）を次いで
３つの異なった濃度（２．５、１．２５および６×１０
６細胞／ｍｌ）で９６個のウエルの組織培養プレート
（Ｃｏｓｔａｒ）に分配する。最後に、４×１０−７モ
ル／ｌのアミノプテリンを含むＨＴ媒質（ＨＡＴ媒質）
の２００μｌをそれぞれのウエルに加える。これらのプ
レートを空気中５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中３７℃で培養
する。ハイブリドーマ細胞を始めにＨＡＴ媒質中で成長
させるが、これはＨＴ媒質にステップ状に置き換えるこ
とによって１４日後に無くなる。上澄液をスクリーンし
て間接の非競合ＥＬＩＳＡ １４−１８ｄポスト融合に
よって特異性抗体を求める。特異性ハイブリドーマを次
いでフラスコ中に膨張させ、３回または１００％クロー
ニング効力がえられるまでクローニングする。この操作
は非免疫ＮＺＢ／ＤＡＬＢ−Ｃ ハイブリッド・マウス
からの脾臓細胞（２×１０５細胞／ウエル）のフィーダ
ー層を含む９６個のウエルの組織培養プレート中の希釈
を限定することによって行われる。関心のある細胞株を
試験管内の培養媒質中に保持し、３０％ウシ血清と１５
％ジメチルスルホキシド（シグマ）を含むＲＰＭＩ １
６４０中で５×１０６細胞／ｍｌの濃度で凍結し、液体
窒素中で貯蔵する（ＩＳｌａｍ，Ｍ．Ｓ．およびＳｔｉ
ｍｓｏｎ，Ｗ．Ｈ ，Ｌｅｔｔ，Ａｐｐｌｄ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，４，８５−８９（１９８７））。
【００５１】４．ＥＬＩＳＡ操作法 ａ）間接非競合ＥＬＩＳＡ−抗ポリマー抗体の存在のた
めの動物からのハイブリトーマ上澄液および血清をスク
リーニングするため。 ｉ）平底の９６個のウエルのミクロタイター・プレート
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）をポリマー共役体−１０μｇ タ
ンパク／１ｍｌ ０．０２Ｍ トリス／ＨＣｌ緩衝液、
ｐＨ９．０で被覆する。分別量（１００μｌ／ウエル）
をミクロタイター・プレートに分布し、３７℃で１時間
加温する。次いで溶液を除いて０．０２Ｍ トリス／Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ９．０中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ溶液の１０
０μｌで３７℃で３０分間かけて置換する。その後にプ
レートを、０．２ＭのＮａＣｌおよび０．０５％（ｖ／
ｖ）トウイーン２０（洗浄緩衝液）を含む０．２Ｍトリ
ス／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４、を用いて洗浄する（×
４）。これらのプレートは真空乾燥して１年間まで乾燥
状態で保存することができ、あるいは直ちに分析に使用
することができる。
【００５２】ｉｉ）ハイブリドーマ上澄液または動物血
清通常は１：１０〜１：１５に希釈）をプレートに加え
る（１００μｌ／ウエル）。３７℃で４５分間加温後
に、プレートを洗浄用緩衝液で３回洗う。
【００５３】ｉｉｉ）羊抗マウスγ−グロブリン／ホー
スラディッシュパーオキサイド複合体（ＳＡＰＵ，Ｃａ
ｒｌｕｋｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を２５％（ｖ／ｖ）羊
血清含有の０．１５Ｍ ＮａＣｌ中で１：２０００に希
釈する。分別量（１００μｌ）をそれぞれのウエルに加
え、３７℃で４５分間加温し、その後に洗浄用緩衝液で
３回洗う。酵素活性を２００μｌのテトラメチルベンチ
ジン基質（ｐＨ５．５）で測定し、３０分後に５０μｌ
の２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を用いて室温で反応を停止させる。
【００５４】ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡ 試料中のポ
リマー濃度を推定するためのもの。
【００５５】ｉ）抗血清を（ＮＨ４）２ＳＯ４溶液で沈
澱させ、０．１５ＭのＮａＣｌ溶液に再溶解させて１５
ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。これを０．０２Ｍのトリス／
ＨＣｌ（ｐＨ９．０）中で１：５００〜１０，０００に
希釈して、マイクロタイター・プレート・ウエル（１０
０μｌ／ウエル）をコートするのに使用する（３７℃で
１時間）。このプレートを洗浄用緩衝液で５回洗ってか
ら使用する。
【００５６】ｉｉ）ポリマー標準（１０ナノグラム（ｎ
ｇ）／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌ）、０．１５ＭのＮａＣｌ
溶液および試料（１００μｌ）を３７℃で４５分間ウエ
ルに加える。プレートをそれぞれの緩衝液中で３回洗
う。
【００５７】ｉｉｉ）抗体／抗血清の酵素複合体処方物
をホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）の過
沃素酸塩カップリングによって達成する。
【００５８】５ｍｇのＨＲＰを１．２ｍｌの水に再懸濁
させ、１０ｍＭのナトリウムホスフェート（ｐＨ７．
０）中の新しく調節した０．１Ｍの過沃素酸塩の０．３
ｍｌを加える。
【００５９】この溶液を室温で２０分間加温してから、
ＨＲＰ溶液対１ｍＭナトリウムアセテート（ｐＨ４．
０）を４℃で一夜、いくつかの変化を伴って透析する。
【００６０】２０ｍＭ炭酸塩（ｐＨ９．５）中の１０ｍ
ｇ／ｍｌの抗体溶液を製造する。
【００６１】ＨＲＰを透析管から除き、０．５ｍｌの抗
体溶液に加え、室温で２時間加温する。
【００６２】このようにして生成したシッフ塩基をナト
リウムボロハイドライド（水中４ｍｇ／ｍｌ）の１００
μｌの添加によって還元し、４℃で２時間培養する。
【００６３】ＰＢＳをいくつか変化させて溶液を透析す
る。
【００６４】ｉｖ）上記（ｉｉｉ）のようにして製造し
た抗体・酵素複合体を１：５００〜１：３００，０００
に希釈して加えて、反応／読みを上記４ａ（ｉｉｉ）の
ようにしてとる。
【００６５】Ｃ．競合ＥＬＩＳＡ ｉ）上記４ａ（ｉ）のようにして行う。
【００６６】ｉｉ）化合物／試料（１００μｌ）をウエ
ルに加え、同時に１００μｌの抗体／酵素複合体を加え
る（上記の４ｂ（ｉｉｉ＋ｉｖ）を参照）。プレートを
３７℃で４５分間加温し、４ａ（ｉｉｉ）で述べた操作
法を行う。
【００６７】この方法の結果を図１に示す。
【００６８】結 果 競合分析を行って真の水性試料中の遊離生成物を検出す
る。ＯＶＡ複合体をミクロ滴定のウエルの壁に結合さ
せ、下記のものを使用して培養する。
【００６９】１）遊離形体に高めたポリクローナル抗血
清（希釈１：１００〜１：８０００）および遊離生成
物；範囲１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ（図１参
照）。
【００７０】２）ＫＬＨ複合体に高めたポリクローナル
抗血清（希釈１：１００〜１：３５，０００）および遊
離生成物；範囲１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ。
【００７１】３）遊離形体に高めたモノクローナル抗体
（希釈１：１０４〜１：１０６）および遊離生成物；範
囲１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ。および４
【００７２】４）ＫＬＨ複合体に高めたモノクローナル
抗体（希釈１：１０４〜１：１０６）および遊離生成
物；範囲１０ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ。
【００７３】複合体にポリクローナルまたはモノクロー
ナル抗体をくみ入れるアッセイは１０μｇ／ｍｌに低下
したときにのみ感受性がある。遊離形体にポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体をくみ入れるアッセイは
０．１μｇ／ｍｌにまで低下して感受性がある（図１参
照）。
【００７４】マトリックス妨害 生成物を種々の合成水および２つの代表的な北海の海水
処方の水の中で製造し、生成物をふつうに加えてマトリ
ックスの妨害を決定する（表１参照）。
【００７５】蒸留水の存在下の正のポリマーの対照標準
の吸収（Ａ ４５０）は１．６８±０．１９Ａｕであ
る。
【００７６】負のポリマーの対照標準のＡ４５０は、合
成水の存在下で０．０８±０．０４Ａｕ、Ａ４５０であ
り、そして北海の海水処方の水の１つは＞１．５８±
０．２８Ａｕであった。第２の処方の水はテトラメチル
ベンチジン基質に加えたとき色調変化をもたらした。
【００７７】
【表１】
【００７８】
【表２】
【００７９】
【表３】
【００８０】実施例２〜２６ 同様の構造の次の化合物を実施例１で述べた方法におけ
る遊離生成物の代わりに競合分析において置換する。表
２に示す結果は同様の構造の化合物の物質に対する５０
％の最大吸収を与えるポリマー物質の比の％として示し
てある。抗体はホスフイノカルボン酸の決定に対して特
異性がある。
【００８１】
【表４】
【００８２】実施例２７ ３モルのマレイン酸と１モルのビニルアセテートと１モ
ルのエチルアクリレートとから誘導されたテロマーをＫ
ＬＨと複合させる試みは、実施例１において述べたよう
な反応試剤のすべての合理的な比において完全な沈澱を
もたらした。生成物とＯＶＡおよびＥＤＣとの低い比の
カップリング（重量基準で１：４）は成功である。ま
た、スクリーニングのために第２タンパクすなわちウシ
血清アルブミン（ＢＳＡ）への低い比のカップリングも
行った。
【００８３】マウスおよびラビットを実施例１のように
して免疫にする。ミクロ滴定ウエルの壁上への第２のＢ
ＳＡ複合体の不動化の後に抗体の生産を決定し、そして
実施例１に記載の方法を行う。
【００８４】複合体の形体の生成物は免疫源であること
を示す。遊離形体からは応答は検出されない。これは免
疫系を刺激するには小さすぎる（Ｍｗ＜１０００ダルト
ン）分子の寸法に一致する。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の方法の結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ウィリアム ハワード ステムソン イギリス国 グラスゴー ジー62 ６キュ ウエル ミルゲイビュー ファーウエーズ ラウン パーク ７ (56)参考文献 特開 平４−284110（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−220060（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の式Ｉ （Ｒ”は水素、メチルまたはエチルであり、Ｒは水素、
    Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ５〜Ｃ１２シクロアルキル、
    アリール、アルアルキル、次式 の残基（Ｒ”は上記の意味をもち、ｍとｎの合計は多く
    て１００の整数である）であるか、あるいはＲは残基−
    ＯＸ（Ｘは水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルである）であ
    り、そしてＲ１は残基−ＯＸ（Ｘは上記の意味をもつ）
    である）をもつポリマーまたはその塩からなる水処理ポ
    リマーに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗
    体を生成させ、そしてこのようにして生成させた抗体を
    水性試料中で行う免疫分折の試剤として使用することを
    特徴とする水性試料中の水処理ポリマーの存在および／
    または濃度を決定する方法。
  2. 【請求項２】 水処理ポリマーが下記の式ＩＡ （ｍ１とｎ１の合計は８〜３２の範囲の整数である）を
    もつ請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 ｍ１とｎ１の合計が１６である請求項２
    記載の方法。
  4. 【請求項４】 水冷却プラント流発生プラント、海水エ
    バポレータ、逆浸透圧装置、製紙装置、砂糖エバポレー
    タ装置、土壌灌注プラント、水圧クッカー、ガス・スク
    ラビング系、密閉回路加熱系、水性基材冷凍系、および
    ダウン・ウエル系に使用した試料から水性試料を取るこ
    とを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項記載の方
    法。
  5. 【請求項５】 式Ｉのポリマーから生成させたモノクロ
    ーナルまたはポリクローナル抗体の有効量を許容しうる
    担体中に含むことを特徴とする水性試料中の水処理ポリ
    マーの存在および／または濃度を決定するための組成
    物。
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