JPH0787792B2 - Cloned DNA fragment encoding corticotropin releasing factor - Google Patents
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-
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、視床下部において発現されるペプチドである
コルチコトロピン放出因子（cortico-tropin releasing
factor、以下CRFと略す）の遺伝子工学的生産に有用な
クローン化DNA、それを組込んだベクターDNAならびに形
質転換微生物に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a peptide expressed in the hypothalamus, cortico-tropin releasing factor.
factor, hereinafter abbreviated as CRF), to a cloned DNA useful for genetic engineering production, a vector DNA incorporating the same, and a transformed microorganism.
さらに詳しくは、脳下垂体からアドレノコルチコトロピ
ン（ACTH）、β−エンドルフイン（β‐EP）、β−リポ
トロピン（β‐LPH）などの放出を促す視床下部におい
て発現されるCRFをコードする遺伝子に由来し、第１図
で表わされる塩基配列を含むクローン化DNAフラグメン
ト、このクローン化DNAフラグメントを組込んだベクタ
ーDNAおよびこの組換体ベクターでトランスホームした
微生物ならびにその製造法に関する。More specifically, it is derived from a gene encoding CRF expressed in the hypothalamus that promotes the release of adrenocorticotropin (ACTH), β-endorphin (β-EP), β-lipotropin (β-LPH) from the pituitary gland. The present invention relates to a cloned DNA fragment containing the nucleotide sequence shown in FIG. 1, a vector DNA incorporating this cloned DNA fragment, a microorganism transformed with this recombinant vector, and a method for producing the same.
産業上の利用分野と従来技術 CRFは脳下垂体からACTHの放出を促す視床下部因子とし
てその存在が確認されているものである［Guillemin,R.
et al,Endocrinology 57,599（1955）およびSaffran,M.
et al,Can.J.Biochem.Physiol.33,408（1955）］。CRF
の単離は長い間成功しなかつたが、最近ようやくベイル
らのグループがヒツジ視床下部よりCRFと考えられる41
個のアミノ酸からなるペプチドを単離し、そのアミノ酸
配列を決定した［Vale W.et al,Science 213,1394（198
1）およびSpiess,J.et al,Proc.natl.Acad.Sci.U.S.A.,
78,6517（1981）］。現在までに得られている知見によ
れば、視床下部のCRFはACTH-β‐LPH前駆体またはプレ
プロオピオメラノコルチンと呼ばれる共通前駆体から作
られるACTH、β‐EP、β‐LPHなどのペプチドホルモン
の脳下垂体における合成および放出を促進する［Yasud
a,N.et al,Endocr.Rev.3,123（1982）およびNuma,S.et
al,Trends biochem.Sci.6,274（1981）］。またヒツジC
RFはin vitroおよびin vivoでラツトおよびヒトにおけ
るACTHを放出させることが知られている［Vale,W.et a
l,Science 213,1394（1981）、Turkelson,C.M.et al,Pe
ptides 2,425（1981）、Rivier,C.et al,Endocrinology
110,272（1982）、およびGrossman,A.at al,Lanceti,9
21（1982）、Chan,J.S.D.et al,Endo-crinology 111,13
88（1982）、White,M.C.et al,Lancet,May 29,1251（19
82）］。Industrial field of application and prior art CRF has been identified as a hypothalamic factor that stimulates the release of ACTH from the pituitary gland [Guillemin, R. et al.
et al, Endocrinology 57 , 599 (1955) and Saffran, M.
et al, Can. J. Biochem. Physiol. 33 , 408 (1955)]. CRF
Has long been unsuccessful, but recently the group of Vail et al. Is considered to be CRF from the hypothalamus of sheep 41
A peptide consisting of 4 amino acids was isolated and its amino acid sequence was determined [Vale W. et al, Science 213 , 1394 (198
1) and Spiess, J. et al, Proc.natl.Acad.Sci.USA,
78, 6517 (1981)]. According to the findings obtained to date, the hypothalamic CRF is produced by a common precursor called ACTH-β-LPH precursor or preproopiomelanocortin, which is associated with peptide hormones such as ACTH, β-EP, and β-LPH. Promotes synthesis and release in the pituitary gland [Yasud
a, N.et al, Endocr.Rev. 3 , 123 (1982) and Numa, S.et
al, Trends biochem. Sci. 6 , 274 (1981)]. See also sheep C
RF is known to release ACTH in rats and humans in vitro and in vivo [Vale, W. et a.
l, Science 213 , 1394 (1981), Turkelson, CMet al, Pe
ptides 2 , 425 (1981), Rivier, C. et al, Endocrinology
110 , 272 (1982), and Grossman, A. at al, Lanceti, 9
21 (1982), Chan, JSD et al, Endo-crinology 111 , 13
88 (1982), White, MCet al, Lancet, May 29,1251 (19
82)].
CRFは脳下垂体−副腎皮質系の神経支配を仲介している
ので、ストレスに対する内分泌反応に重要な役割を果し
ていると考えられ、従つてそれらと関係のある疾病に対
する医薬品として有用と考えられるペプチドである。し
かしながらこのような高分子ペプチドの製造は従来の技
術では困難であつた。Since CRF mediates innervation of the pituitary-adrenal cortex, it is thought to play an important role in the endocrine response to stress, and thus the peptide considered to be useful as a drug for diseases related to them. Is. However, the production of such high-molecular peptides has been difficult with conventional techniques.
発明の目的 本発明者は、このようなCRFを近年目ざましい進歩をと
げている遺伝子工学技術を応用することにより効率よく
生産する方法を見出すべく種々研究を重ねた結果、本発
明を完成したものである。OBJECT OF THE INVENTION The present inventors have completed the present invention as a result of various studies to find a method for efficiently producing such CRF by applying genetic engineering technology that has made remarkable progress in recent years. is there.
CRFを遺伝子工学技術を応用して生産するには、CRFまた
はその前駆体のmRNAに相補的なcDNAをクローン化するこ
とが極めて重要である。本発明者は、ヒツジの視床下部
より抽出される全RNAからmRNAを単離し、これを鋳型に
してcDNAを合成し、これを用いてクローン化を行なうこ
とによりCRFcDNAの一部または全てを含むクローン化DNA
フラグメントの作成に成功した。In order to produce CRF by applying genetic engineering technology, it is extremely important to clone a cDNA complementary to mRNA of CRF or its precursor. The present inventors isolated mRNA from total RNA extracted from the hypothalamus of sheep, synthesized cDNA using this as a template, and cloned using this to clone containing a part or all of CRF cDNA. DNA
The fragment was created successfully.
しかして、本発明は、脳下垂体からACTH、β‐EP、β‐
LPHなどのペプチドの放出を促す視床下部において発現
されるCRFをコードする遺伝子に由来し、第１図に示さ
れる塩基配列を含むクローン化DNAフラグメントを提供
するものであり、さらにこのクローン化DNAフラグメン
トを適当なベクターに組込んだ組換え体ベクターDNA、
ならびにそのベクターDNAを用いてトランスホームして
得られる形質転換微生物を提供するものである。Therefore, the present invention can detect that ACTH, β-EP, β-
The present invention provides a cloned DNA fragment containing a nucleotide sequence shown in Fig. 1, which is derived from a gene encoding CRF expressed in the hypothalamus that promotes the release of peptides such as LPH. Recombinant vector DNA in which a suitable vector has been incorporated,
And a transformed microorganism obtained by transformation using the vector DNA.
上記クローン化されたCRFcDNAの一部または全てを含むD
NAフラグメントはさらに大きなCRF前駆体cDNAや異種動
物（ヒトを含む）のCRFcDNAのクローニングにプローブ
またはプライマーとして有用であり、またCRFまたはそ
の前駆体の全翻訳領域を含むcDNAはそれ自体CRF生産微
生物を作るための材料となる。D containing part or all of the cloned CRF cDNA
NA fragments are useful as probes or primers for cloning larger CRF precursor cDNAs or CRF cDNAs of heterologous animals (including humans), and cDNAs containing the entire translation region of CRF or its precursors themselves generate CRF-producing microorganisms. It becomes the material for making.
発明の構成および効果 クローン化DNAフラグメントを調製するには、通常ヒツ
ジ視床下部から抽出される全DNAより目的とする遺伝子
のmRNAをできるだけ高濃度に精製濃縮して取り出し、こ
のmRNAを鋳型として、オリゴデオキシチミジレートをプ
ライマーとして逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、この
cDNAを適当なベクターの適当な位置に組込んで組換え体
ベクターDNAとし、これを適当な標識プローブを用いて
ハイブリダイゼーシヨンに付し、スクリーニングにかけ
て目的とするcDNAを含むクローンを捜し出す方法が採用
される。Structure and effect of the invention To prepare a cloned DNA fragment, mRNA of the gene of interest is purified and concentrated to a high concentration as much as possible from the total DNA extracted from the hypothalamus of sheep, and this mRNA is used as a template for oligo synthesis. CDNA was synthesized using reverse transcriptase with deoxythymidylate as a primer.
A method of incorporating a cDNA into an appropriate position of an appropriate vector to give a recombinant vector DNA, subjecting this to hybridization with an appropriate labeled probe, and performing screening to find a clone containing the desired cDNA is a method. Adopted.
目的とする物質のアミノ酸配列が判明している場合はプ
ローブとして合成オリゴデオキシヌクレオチドを用いる
場合が多いが、極めて微量にしかmRNAの存在しない視床
下部ペプチドホルモンの場合、このような方法が適用で
きるかどうかは明らかでない。実際に、ヒツジCRFの場
合、通常用いられるこのような方法では、100万個以上
のトランスホーマントのスクリーニングにもかかわら
ず、CRFcDNAを持つクローンを検出することは出来なか
つた。Synthetic oligodeoxynucleotides are often used as probes when the amino acid sequence of the target substance is known, but is this method applicable to hypothalamic peptide hormones in which mRNA is present in very small amounts? I'm not sure. In fact, in the case of sheep CRF, it was not possible to detect clones with CRF cDNA by such a method commonly used, despite the screening of more than one million transformants.
本発明者はCRFcRNAの濃度を高めるためCRFのアミノ酸配
列の一部に対応する合成オリゴデオキシヌクレオチド混
合物をプライマーとしてmRNAより逆転写でcDNA断片を合
成し、これをベクターに組込んでCRFcDNAライブラリー
を作製したのち、CRFのアミノ酸配列の一部に対応する
別の合成オリゴデオキシヌクレオチド混合物をプローブ
としてこのライブラリーをスクリーニングし、CRFのア
ミノ酸コード領域の一部に相当するcDNA断片をクローニ
ングした。クローン化されたcDNA断片はプライマーとし
て用いた塩基配列の下流に相当する部分の塩基配列を欠
いているため、その部分の欠けていないcDNAを取る目的
で岡山らの方法［Okayama et al,Mol.Cell.Biol.2,161
（1982）］に従つて作製したcDNAライブラリーを前述の
クローン化CRFcDNAの制限酵素で切断したDNA断片をプロ
ーブとしてスクリーニングすることにより所望のCRFア
ミノ酸配列の全部をコードする塩基配列を含有する各種
クローン化DNAフラグメントを得た。これらのクローン
化DNAの制限酵素切断断片をプライマーまたはプローブ
として用いスクリーニングを繰り返すことにより、さら
に多数のCRF前駆体のDNA断片クローンを得て、それらの
塩基配列を調べることにより、ヒツジCRF前駆体mRNAお
よびcDNAの一次構造が決定された。The present inventor synthesizes a cDNA fragment by reverse transcription from mRNA using a synthetic oligodeoxynucleotide mixture corresponding to a part of the amino acid sequence of CRF as a primer to increase the concentration of CRFcRNA, and incorporates this into a vector to prepare a CRF cDNA library. After preparation, this library was screened using another synthetic oligodeoxynucleotide mixture corresponding to a part of the amino acid sequence of CRF as a probe, and a cDNA fragment corresponding to a part of the amino acid coding region of CRF was cloned. Since the cloned cDNA fragment lacks the nucleotide sequence of the portion corresponding to the downstream of the nucleotide sequence used as a primer, the method of Okayama et al. [Okayama et al, Mol. Cell.Biol. 2 , 161
(1982)], and the various clones containing a nucleotide sequence encoding all of the desired CRF amino acid sequence by screening the cDNA library prepared according to A modified DNA fragment was obtained. By repeating screening using a restriction enzyme cleavage fragment of these cloned DNAs as a primer or a probe, a DNA fragment clone of a larger number of CRF precursors is obtained, and their nucleotide sequences are examined to obtain sheep CRF precursor mRNAs. And the primary structure of the cDNA was determined.
なお、上記の方法で合成cDNAを組込むためのベクターと
しては、該cDNAを組込んだのちに微生物をトランスホー
ムした場合にそれら微生物中で増殖するものはすべて用
いられ、例えばプラスミド（大腸菌プラスミドpBR322な
ど）、フアージ（ラムダフアージ誘導体など）、ウイル
ス（SV40など）が挙げられ、これらは単独でもまたそれ
らの組合せ、例えばpBR322-SV40ハイブリツドプラスミ
ドなど、の形で用いてもよい。As the vector for incorporating the synthetic cDNA by the above-mentioned method, all that grow in the microorganism when the microorganism is transformed after incorporating the cDNA are used, for example, plasmid (E. coli plasmid pBR322, etc. ), Phage (lambda derivative, etc.), virus (SV40, etc.), and these may be used alone or in combination thereof, for example, in the form of pBR322-SV40 hybrid plasmid.
本発明のクローン化DNAフラグメントは、脳下垂体からA
CTH、β−EP、β−LPHなどのペプチドの放出を促す視床
下部において発現されるCRFをコードする遺伝子に由来
し、第１図で示される塩基配列を含有している。この第
１図に示される塩基配列は後記ヒツジCRF前駆体mRNAの
一次構造（第２図を参照）のうち、CRFに対応する部分
のみを示したものであり（ただし、第２図のＵをＴと読
みかえたもの）、‐X-および‐Y-は任意の塩基配列であ
つて変り得るものである。The cloned DNA fragment of the present invention is derived from the pituitary gland by A
It is derived from a gene encoding CRF expressed in the hypothalamus which promotes the release of peptides such as CTH, β-EP and β-LPH, and contains the nucleotide sequence shown in FIG. The nucleotide sequence shown in FIG. 1 shows only the portion corresponding to CRF in the primary structure of sheep CRF precursor mRNA (see FIG. 2) described below (however, U in FIG. (Replaced as T), -X- and -Y- are arbitrary nucleotide sequences and can vary.
本発明者の研究により、本発明で得られる多数のクロー
ン化DNAフラグメントの塩基配列に基づいて、ヒツジCRF
前駆体mRNAの一次構造が初めて明らかにされた。それを
第２図（Ｉ）および（II）に示す（図中、ＵをＴとすれ
ばcDNAの一次構造を示す）。Based on the nucleotide sequences of a large number of cloned DNA fragments obtained by the present invention, the study by the present inventor revealed that sheep CRF
The primary structure of the precursor mRNA was first revealed. It is shown in FIGS. 2 (I) and 2 (II) (in the figure, U represents T, which indicates the primary structure of cDNA).
第２図（第２図（II）は第２図（Ｉ）のつづきである）
において、下段の数字は翻訳開始コドンAUGの最初の塩
基を１番とし、３′末端へは＋、５′末端へは−として
塩基につけた番号である。上段の数字は翻訳領域の最初
のアミノ酸メチオニンを１とし、Ｎ末端からＣ末端にか
けてアミノ酸につけた番号である。３′非翻訳領域にお
けるAAUAAA（アンダーライン）はポリ（Ａ）付加信号、
矢印はポリアデニル化部位である。翻訳領域は塩基配列
１〜570番で190個のアミノ酸配列に相当する。１〜72番
は分泌蛋白のＮ末端にしばしば見られるシグナルペプチ
ドに相当する配列と考えられる。442〜564番（箱で囲ま
れた部分）はCRFのアミノ酸配列をコードする配列であ
り、その前に４個の連続した塩基性アミノ酸:Arg-Lys-A
rg-Argをコードする配列またその後にGly-Lysをコード
する配列、続いて終止コドン（UGA）がある。またCRFコ
ードの上流２箇所に塩基性アミノ酸対がある（アミノ酸
配列116〜117番のArg-Argおよび127〜128番のLys-Arg。
ただし、127番のLysはクローンによつてはGluに変化し
ている）。Figure 2 (Figure 2 (II) is a continuation of Figure 2 (I))
In, the number in the lower row is the number assigned to the base as the first base of the translation initiation codon AUG is number 1 and as + for the 3'end and-for the 5'end. The numbers in the upper row are the numbers assigned to amino acids from the N-terminal to the C-terminal, with the first amino acid methionine in the translation region as 1. AUAUAAA (underline) in the 3'untranslated region is a poly (A) addition signal,
Arrows are polyadenylation sites. The translated region corresponds to 190 amino acid sequences having a nucleotide sequence of 1 to 570. Nos. 1 to 72 are considered to be sequences corresponding to signal peptides often found at the N-terminus of secretory proteins. Numbers 442 to 564 (enclosed by a box) are the sequences encoding the amino acid sequence of CRF, and preceded by 4 consecutive basic amino acids: Arg-Lys-A.
There is a sequence encoding rg-Arg followed by a sequence encoding Gly-Lys, followed by a stop codon (UGA). In addition, there are basic amino acid pairs at two positions upstream of the CRF code (Arg-Arg of amino acid sequences 116 to 117 and Lys-Arg of 127 to 128).
However, Lys at number 127 has changed to Glu depending on the clone).
CRF前駆体のmRNAの塩基配列は多形性を示し、翻訳領域
の３箇所（塩基配列369、377および480番）および非翻
訳領域の２箇所（塩基配列578および923番）でクローン
により塩基が異つている。すなわち、前述した方法によ
り第１図に示すCRFアミノ酸配列を含む点では共通する
が他の塩基配列ならびに鎖長を異にするクローン化DNA
フラグメントが調製され、例えば後記実施例で得られる
pCRF8、pCRF25、pCRF30およびpCRF31では、上記５箇所
の塩基は下記のとおりであつた。The nucleotide sequence of the mRNA of CRF precursor shows polymorphism, and the nucleotides are cloned at 3 positions in the translated region (nucleotide sequences 369, 377 and 480) and 2 positions in the untranslated region (nucleotide sequences 578 and 923). It's different. That is, the cloned DNA which is common in that it contains the CRF amino acid sequence shown in FIG. 1 by the above-mentioned method but has different base sequences and chain lengths.
Fragments are prepared, eg obtained in the Examples below.
In pCRF8, pCRF25, pCRF30 and pCRF31, the above-mentioned 5 bases were as follows.
369番目:pCRF31およびpCRF25ではＧ、pCRF30ではＵ。369th: G for pCRF31 and pCRF25, U for pCRF30.
379番目:pCRF31、pCRF25およびpCRF8ではＡ、pCRF30で
はＧ。379th: A for pCRF31, pCRF25 and pCRF8, G for pCRF30.
480番目:pCRF31、pCRF25およびpCRF8ではＵ、pCRF30で
はＣ。480th: U for pCRF31, pCRF25 and pCRF8, C for pCRF30.
923番目:pCRF31ではＵ、pCRF30ではＣ。923: U for pCRF31, C for pCRF30.
578番目:pCRF31およびpCRF25ではＧ（オーバーライ
ン）、pCRF30では欠失。これはmRNA抽出の原料となつた
ヒツジ視床下部が多数の個体からプールしたものであつ
たためではないかと思われる。塩基配列379番目の塩基
がＡからＧに変ることにより127番目のアミノ酸はリジ
ンからグルタミン酸に変り、127〜128番のLys-Argの塩
基性アミノ酸対が消失して、CRF前駆体のプロセシング
が若干変ると考えられる。塩基配列369、480、578およ
び923番目の塩基の変化はアミノ酸配列に変化を与えな
いので、機能的には同義と考えられる。CRFのアミノ酸
配列は調べた限りでは全く同じで多形性は見られなかつ
た。578th: G (overline) in pCRF31 and pCRF25, deletion in pCRF30. This may be because the hypothalamus of sheep, which was the raw material for mRNA extraction, was pooled from many individuals. When the 379th base in the nucleotide sequence changes from A to G, the 127th amino acid changes from lysine to glutamic acid, the basic amino acid pair of Lys-Arg at 127th to 128th disappears, and the processing of CRF precursor is slightly changed. It is thought to change. Since changes in the nucleotide sequences 369, 480, 578 and 923 do not change the amino acid sequence, they are considered to be functionally synonymous. The amino acid sequence of CRF was the same as far as I examined, and no polymorphism was found.
なお、上記mRNAの一次構造から推定されるる塩基性アミ
ノ酸部位は蛋白分解時の切断部位と考えられる［Steine
r,D.F.et al,Ann.N.Y.Acad.Sci.313,1（1980）］ので、
CRF前駆体がプロセスされるとCRF以外に２〜３個の新し
いペプチドが生ずると思われる。すなわち、ヒツジCRF
前駆体の構造を模式的に示すと第３図に示すようにな
る。第３図において、CRF部分は黒棒で示され、シグナ
ルペプチドと推定される部分は点棒で示されている。塩
基性アミノ酸対のある部位は上部に縦の二本線が付けら
れている。塩基性アミノ酸対部分は蛋白分解酵素による
プロセス部位と考えられている。上部の数字はＮ末端の
アミノ酸を１番としＣ末端の方へ順に付けたアミノ酸配
列番号である。The basic amino acid site deduced from the primary structure of the above mRNA is considered to be the cleavage site during proteolysis [Steine
r, DFet al, Ann.NYAcad.Sci. 313 , 1 (1980)],
It is believed that the CRF precursor is processed to yield a few new peptides in addition to CRF. That is, sheep CRF
The structure of the precursor is schematically shown in FIG. In FIG. 3, the CRF portion is shown by a black bar, and the putative signal peptide portion is shown by a dotted bar. A site with a basic amino acid pair is marked with a vertical double line at the top. The basic amino acid pair part is considered to be a process site by a protease. The number at the top is the amino acid sequence number in which the N-terminal amino acid is numbered 1 and is sequentially assigned to the C-terminal.
本発明のクローン化DNAフラグメントを適当な形質発現
ベクターに組込んでCRF生産用ベクターが得られる。用
いられるベクターは前述のようないずれのものも用いら
れ、そのDNAフラグメント組込み部位も任意に選択され
る。すなわち、適当な形質発現ベクターの適当なオペロ
ンを常法により適当な制限酵素を作用させて開裂させ、
その開裂部位に該クローン化DNAフラグメントを適当な
長さに処理して組込むことができる。A vector for CRF production can be obtained by incorporating the cloned DNA fragment of the present invention into an appropriate expression vector. As the vector to be used, any of those described above can be used, and its DNA fragment integration site is also arbitrarily selected. That is, an appropriate operon of an appropriate trait expression vector is cleaved by the action of an appropriate restriction enzyme by a conventional method,
The cloned DNA fragment can be incorporated into the cleavage site by treating it with an appropriate length.
上記クローン化DNAフラグメントを組込んだベクターを
常法により適当な微生物に作用させてトランスホームす
ることにより形質発現微生物が得られる。A vector expressing the cloned DNA fragment is applied to an appropriate microorganism for transformation by a conventional method to obtain a trait-expressing microorganism.
形質発現用オペロンとしてはβ−ガラクトシダーゼ、ト
リプトフアン、β−ラクタマーゼ、アルカリフオスフア
ターゼなどのオペロンが例示できる。さらにトランスホ
ームに用いられる微生物としては大腸菌、枯草菌、酵母
などが挙げられる。Examples of the operon for expression of genes include operons such as β-galactosidase, tryptophan, β-lactamase, and alkaline phosphatase. Furthermore, examples of microorganisms used for transformation include Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast.
つぎに、本発明によるクローン化DNAフラグメントの合
成から形質転換微生物の製造までの工程の一例を説明す
る。Next, an example of steps from the synthesis of the cloned DNA fragment according to the present invention to the production of the transformed microorganism will be described.
ヒツジ視床下部から例えばチヤーウインらの方法［Chir
gwin,J.M.et al,Biochemistry 18,5294（1979）］によ
り全RNAを抽出し、これを常法に従つてオリゴ（dT）セ
ルロースカラムクロマトグラフイ［Aviv,H.et al,Proc.
natl.Acad.Sci.U.S.A.69,1408（1972）］で精製してポ
リ（Ａ）mRNAを分離する。このmRNAを鋳型とし、CRF前
駆体のアミノ酸残基176〜179番のGln-Gln-Ala-Hisに対
応する合成オリゴヌクレオチド をプライマーとして逆転写酵素を用いてcDNAを合成し、
これを二重鎖cDNAに変換し、pBR322のPstI部位にノダら
の方法［Noda,M.et al,Nature 295,202（1982）］に従
い、ポリ（dG）−ポリ（dC）ホモポリマー伸長法により
組込む。得られた組換えプラスミドをコーエンらの方法
［Cohen,N.S.et al,Proc.Nacl.Acad.Sci.69,2110（197
2）］に準じて大腸菌をトランスホームしてテトラサイ
クリン耐性株を取る。テトラサイクリン耐性トランスホ
ーマントを５′‐32P標識オリゴヌクレオチド （CRF前駆体のアミノ酸残基167〜171番のGlu-Met-Thr-L
ys-Alaに対応）とハイブリダイゼーシヨンさせこのプロ
ーブと相補性のある塩基配列を含んだプラスミドを持つ
コロニーをスクリーニングする。このようにして、CRF
アミノ酸配列の大部分をコードする塩基配列を含むクロ
ーン化DNAプラスミド（pCRF8）を含む菌株を得る。From the sheep hypothalamus, for example, the method of Cheerwin et al. [Chir
gwin, JM et al, Biochemistry 18 , 5294 (1979)] was used to extract total RNA, and oligo (dT) cellulose column chromatography [Aviv, H. et al, Proc.
natl.Acad.Sci.USA 69 , 1408 (1972)] to isolate poly (A) mRNA. Using this mRNA as a template, a synthetic oligonucleotide corresponding to Gln-Gln-Ala-His at amino acid residues 176 to 179 of the CRF precursor CDNA is synthesized using reverse transcriptase as a primer,
This is converted into a double-stranded cDNA, and a poly (dG) -poly (dC) homopolymer extension method is performed at the PstI site of pBR322 according to the method of Noda et al. [Noda, M. et al, Nature 295 , 202 (1982)]. Incorporated by. The resulting recombinant plasmid was subjected to the method of Cohen et al. [Cohen, N Set al, Proc. Nacl. Acad. Sci. 69 , 2110 (197
2)] Transform Escherichia coli and take a tetracycline resistant strain. Tetracycline-resistant transformants with 5'- 32 P-labeled oligonucleotides (Glu-Met-Thr-L at amino acid residues 167-171 of the CRF precursor
(corresponding to ys-Ala) and screened for colonies having a plasmid containing a nucleotide sequence complementary to this probe. In this way, the CRF
A strain containing a cloned DNA plasmid (pCRF8) containing a nucleotide sequence encoding most of the amino acid sequence is obtained.
上記菌株はCRFに対するmRNAの一部に対応する塩基配列
を含んだプラスミドを持つているが、その塩基配列はプ
ライマーとして用いた部分より下流の配列を欠いてい
る。そこで、以下に詳述するように、このクローン化さ
れたcDNAフラグメントをプローブとして、前記岡山らの
方法に従つて作成したcDNAライブラリーをスクリーニン
グすれば、より完全なcDNAフラグメントを得ることがで
きる。The above strain has a plasmid containing a nucleotide sequence corresponding to a part of mRNA for CRF, but the nucleotide sequence lacks a sequence downstream from the portion used as a primer. Therefore, as described in detail below, a more complete cDNA fragment can be obtained by screening a cDNA library prepared according to the method of Okayama et al. Using the cloned cDNA fragment as a probe.
すなわち、pBR322とSV40とのハイブリドプラスミドを制
限酵素KpnIで消化し、常法でDNAを回収する。これにタ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼに
よりKpnIの開裂部位にオリゴ（dT）テールを付加させ
る。こうして得たオリゴ（dT）テールDNAを制限酵素Hpa
Iエンドヌクレアーゼで切断したのち、長い方のDNA断片
を分離精製し、プラスミドプライマーを調製する。That is, a hybrid plasmid of pBR322 and SV40 is digested with a restriction enzyme KpnI, and DNA is recovered by a conventional method. An oligo (dT) tail is added to the cleavage site of KpnI by terminal deoxynucleotidyl transferase. The oligo (dT) tail DNA thus obtained was digested with the restriction enzyme Hpa.
After cutting with I endonuclease, the longer DNA fragment is separated and purified to prepare a plasmid primer.
また別にpBR322とSV40とのハイブリドプラスミドを制限
酵素PstIエンドヌクレアーゼで切断し、ターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフエラーゼによりオリゴ
（dG）テールを付加させる。これを更に制限酵素HindII
Iエンドヌクレアーゼで消化し、短い方のDNA断片を分離
精製し、オリゴ（dG）テールリンカーDNAを得る。Separately, a hybrid plasmid of pBR322 and SV40 is cleaved with a restriction enzyme PstI endonuclease, and an oligo (dG) tail is added by terminal deoxynucleotidyl transferase. This is further restricted by HindII
After digestion with I endonuclease, the shorter DNA fragment is separated and purified to obtain oligo (dG) tail linker DNA.
こうして得たmRNA原料、プラスミドプライマーを逆転写
酵素の存在下でdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPと反応さ
せ、プラスミド−cDNA:mRNA複合体を調製する。得られ
たプラスミド−cDNA:mRNA複合体をターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフエラーゼの存在下でdCTPと反
応させてオリゴ（dC）テールを付加させる。オリゴ（d
C）テールを付加したプラスミド−cDNA:mRNA複合体を制
限酵素HindIIIで消化したのち、先に調製したオリゴ（d
G）テールリンカーDNAとDNAリガーゼの存在下で反応さ
せて環化させる。こうして得た環状cDNA:mRNA複合体プ
ラスミドを４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸
塩、すなわちdATP、dTTP、dGTPおよびdCTPと、DNAリガ
ーゼ、DNAポリメラーゼおよびリボヌクレアーゼＨの存
在下で反応させてRNA鎖をDNA鎖で置換し、cDNAフラグメ
ント含有プラスミドを調製する。The thus obtained mRNA raw material and plasmid primer are reacted with dATP, dTTP, dGTP and dCTP in the presence of reverse transcriptase to prepare a plasmid-cDNA: mRNA complex. The resulting plasmid-cDNA: mRNA complex is reacted with dCTP in the presence of terminal deoxynucleotidyl transferase to add an oligo (dC) tail. Oligo (d
C) The tail-added plasmid-cDNA: mRNA complex was digested with the restriction enzyme HindIII, and the oligo (d
G) Tail linker DNA is reacted in the presence of DNA ligase to cyclize. The circular cDNA: mRNA complex plasmid thus obtained was reacted with four kinds of deoxyribonucleotide triphosphates, ie, dATP, dTTP, dGTP and dCTP, in the presence of DNA ligase, DNA polymerase and ribonuclease H to separate the RNA strand from DNA. A strand-displacing and cDNA fragment-containing plasmid is prepared.
こうして得たプラスミドを用い、例えば前記コーエンら
の方法に準じて大腸菌をトランスホームしてアンピシリ
ン耐性株をとる。Using the thus obtained plasmid, Escherichia coli is transformed according to the method of Cohen et al. To obtain an ampicillin resistant strain.
こうしてトランスホームした微生物を前述のクローン化
DNAフラグメントをプローブとして、そのコロニーのう
ちこのプローブと相補性のある配列を含んだプラスミド
を持つコロニーをピツクアツプする。The thus transformed microorganism is cloned as described above.
Using the DNA fragment as a probe, a colony having a plasmid containing a sequence complementary to this probe is picked up from the colony.
こうして得られる大腸菌の菌株は本発明のクローン化さ
れたDNAフラグメントを含むプラスミド（pCRF31、pCRF3
0、pCRF25など）を持つている。そしてその増殖により
このプラスミドを複製することができる。この菌株はま
たこのプラスミドに由来する性質、例えばこのプラスミ
ドがpBR322起源であることに基づくアンピシリン耐性な
どを示すが、その他の性質は親株と共通である。The E. coli strain thus obtained is a plasmid (pCRF31, pCRF3 containing the cloned DNA fragment of the present invention.
0, pCRF25, etc.). This plasmid can then be replicated by its growth. This strain also exhibits properties derived from this plasmid, such as ampicillin resistance based on the origin of this plasmid, but other properties are common to the parent strain.
本発明の組換えDNAプラスミドはこうして得られる大腸
菌などの菌株から慣用の方法により容易に取得すること
ができる。またこのプラスミドを慣用の方法で、制限酵
素などで分解することにより本発明のクローン化DNAフ
ラグメントを容易に得ることができる。The recombinant DNA plasmid of the present invention can be easily obtained from the thus obtained strains such as Escherichia coli by a conventional method. Also, the cloned DNA fragment of the present invention can be easily obtained by degrading this plasmid with a restriction enzyme or the like by a conventional method.
上記のクローンはCRFの全翻訳領域を有していたが、CRF
前駆体の翻訳領域の一部を欠失していたので、欠失部位
を再度クローニングするために、mRNAの塩基配列224〜2
38番目に相補的なオリゴデオキシリボヌクレオチド５′
‐GGGTCTCATCGAGGT-3′をトリエステル法［Ito,H.et a
l,Nucleic Acids Res.10,1755（1982）］で合成し、こ
れをプライマーとしてポリ（Ａ）mRNAよりcDNAを合成
し、前述の方法に従いpBR322ベクターに組込み、pCRF31
のDdeI（131）‐XmaI（237）断片を32P標識し、これを
プローブとして60℃でハイブリダイゼーシヨンを行な
い、組換え体DNAプラスミド（pCRF38）を得る。このpCR
F38のHaeIII（88）‐DdeI（131）断片をプローブとして
50℃でさらにハイブリダイゼーシヨンを行ない、CRF前
駆体のＮ末端部位をコードするcDNA断片を含有するDNA
プラスミド（pCRF43）を得、またこのpCRF43のPst I
（−26）‐XmaI（94）断片をプローブとして60℃でハイ
ブリダイゼーシヨンを行ない、さらに他のDNAプラスミ
ド（pCRF90およびpCRF95）を得る。Although the above clone had the entire translation region of CRF,
Since a part of the translation region of the precursor was deleted, in order to re-clon the deletion site, the mRNA nucleotide sequence 224-2
38th complementary oligodeoxyribonucleotide 5 '
‐GGGTCTCATCGAGGT-3 ′ by the triester method [Ito, H. et a
l, Nucleic Acids Res. 10 , 1755 (1982)], and using this as a primer to synthesize cDNA from poly (A) mRNA, and incorporating into the pBR322 vector according to the method described above, pCRF31
The DdeI (131) -XmaI (237) fragment of is labeled with 32 P and is used as a probe for hybridization at 60 ° C. to obtain a recombinant DNA plasmid (pCRF38). This pCR
Using the HaeIII (88) -DdeI (131) fragment of F38 as a probe
DNA containing a cDNA fragment encoding the N-terminal portion of the CRF precursor, which is further hybridized at 50 ° C
A plasmid (pCRF43) was obtained and the PstI of this pCRF43 was obtained.
Using the (-26) -XmaI (94) fragment as a probe, hybridization is performed at 60 ° C to obtain other DNA plasmids (pCRF90 and pCRF95).
上記のようにして得られたクローン化されたCRF前駆体c
DNA断片の種類とそれらの塩基配列決定方法の概略を図
示すると第４図に示すとおりである。Cloned CRF precursor c obtained as described above
An outline of the types of DNA fragments and the method for determining their nucleotide sequences is shown in FIG.
第４図において下方の太線はクローン化cDNAフラグメン
トであり、矢印のついた細線は塩基配列決定に用いた制
限酵素消化DNAフラグメントの大きさと方向を示す。
５′末端のラベルは短かい縦線で、３′末端のラベルは
白丸で示す。矢印の端の斜線は５′末端のラベルがベク
ターDNA上にある事を示す。上部には関連する制限酵素
切断部位が切断によつて生ずる５′末端塩基の番号
［（ ）で示す］と共に示されている。黒棒はプライ
マーとして用いた塩基配列部位、斜線の棒はハイブリダ
イゼーシヨンに用いたプローブの塩基配列部位を表わ
す。最上段の数字はCRF前駆体Ｎ末端のメチオニンのコ
ドンの最初の塩基を１番とし、３′末端にかけて＋、
５′末端にかけて−として順に付けた塩基配列番号であ
る。In FIG. 4, the thick line at the bottom is a cloned cDNA fragment, and the thin line with an arrow shows the size and direction of the restriction enzyme-digested DNA fragment used for nucleotide sequence determination.
The label at the 5'end is indicated by a short vertical line and the label at the 3'end is indicated by a white circle. The diagonal line at the end of the arrow indicates that the label at the 5'end is on the vector DNA. In the upper part, the relevant restriction enzyme cleavage site is shown together with the number of the 5'terminal base [indicated by ()] generated by the cleavage. The black bar represents the base sequence site used as a primer, and the shaded bar represents the base sequence site of the probe used for hybridization. The number on the top is the first base of the methionine codon at the N-terminus of the CRF precursor as number 1, and + to the 3'-terminus,
It is a nucleotide sequence number sequentially assigned as-to the 5'end.
第４図からも明らかなように、本発明により調製される
クローン化DNAプラスミドpCRF31、pCRF30およびpCRF25
はいずれもCRFをコードする442〜564番の塩基配列を含
んでおり、このようなクローン化DNAフラグメントを適
当に処理してベクターに組込み、それによつて微生物を
トランスホームすることにより形質発現微生物が得られ
る。As is clear from FIG. 4, the cloned DNA plasmids pCRF31, pCRF30 and pCRF25 prepared according to the present invention.
All of them contain the nucleotide sequences of nucleotides 442 to 564 encoding CRF, and such a cloned DNA fragment is appropriately treated and integrated into a vector, which transforms the microorganism so that the expressed microorganism becomes can get.
本発明のクローン化DNAフラグメントの塩基配列解析に
より、CRFはより大きな前駆体蛋白質よりプロセスされ
て生ずる事が明らかとなつた。一般にインシユリンなど
の短鎖ペプチドは菌体内で速やかに分解されることが多
いため、形質発現の際、高分子量の融合蛋白質として合
成する方法が取られている。しかし、そのような融合蛋
白質は活性を失なつている場合が多く、生物活性のある
蛋白質を得るには、融合蛋白質を適当な方法で処理しな
ければならない。前述したCRF前駆体蛋白質の場合に
は、必ずしもそのような融合蛋白質の処理の必要はなく
そのcDNAの上流に適当なプロモーターとそれに続く蛋白
合成開始シグナルを持つベクターとCRFcDNA前駆体フラ
グメントを連結するだけで目的が達成される。なぜなら
CRF前駆体遺伝子の発現される視床下部においては適当
な酵素の働きによつてCRF前駆体は適切にプロセスさ
れ、CRFが切り出されると考えられるからである。この
ことはCRF前駆体蛋白質またはCRFを含むCRF前駆体蛋白
質の一部を用いる際の有利な点である。Nucleotide sequence analysis of the cloned DNA fragment of the present invention revealed that CRF was produced by processing from a larger precursor protein. In general, short-chain peptides such as insulin are often rapidly decomposed in the bacterial cells, and therefore, a method of synthesizing them as a high-molecular-weight fusion protein at the time of expression is adopted. However, such a fusion protein often loses its activity, and in order to obtain a protein having biological activity, the fusion protein must be treated by an appropriate method. In the case of the above-mentioned CRF precursor protein, it is not always necessary to treat such a fusion protein, and a vector having an appropriate promoter and a subsequent protein synthesis initiation signal and a CRF cDNA precursor fragment may be ligated upstream of the cDNA. The purpose is achieved in. Because
This is because it is considered that in the hypothalamus in which the CRF precursor gene is expressed, the CRF precursor is appropriately processed and CRF is excised by the action of an appropriate enzyme. This is an advantage when using a CRF precursor protein or a part of a CRF precursor protein containing CRF.
実施例 つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。EXAMPLES Next, the present invention will be described more specifically with reference to Examples.
［Ｉ］pCRF8の分離 ［ヒツジ視床下部からのmRNA分画の調製］ ヒツジ視床下部５個（30g）にグアニジルチオシアネー
ト水溶液（4M）100mlを添加し、ホモジナイズした。こ
のホモジネートを塩化セシウム水溶液（5.9M）上に重層
し、30,000×ｇ、20時間の遠心操作によりmRNAを含む分
画をペレツト状で得た。この分画をTris-HClおよびEDTA
をそれぞれ10mMおよび1mMの濃度で含む水溶液（pH7.4）
（以下、10mMTris-HCl-1mMEDTA（pH7.4）と略記す
る。）2mlに溶解し、これにKCl溶液を0.5Mとなるように
加えたのち、オリゴ（dT）セルロースカラムクロマトグ
ラフイで精製［溶出液:10mMTris-HCl-1mMEDTA（pH7.
4）］してポリ（Ａ）mRNA分画を得た。[I] Separation of pCRF8 [Preparation of mRNA Fraction from Sheep Hypothalamus] To 5 sheep hypothalamus (30 g), 100 ml of an aqueous guanidyl thiocyanate solution (4M) was added and homogenized. This homogenate was layered on an aqueous cesium chloride solution (5.9 M) and centrifuged at 30,000 xg for 20 hours to obtain a fraction containing mRNA in pellet form. This fraction was added to Tris-HCl and EDTA.
Aqueous solution containing 10 mM and 1 mM respectively (pH 7.4)
(Hereinafter, abbreviated as 10 mM Tris-HCl-1 mM EDTA (pH7.4).) Dissolve in 2 ml, add KCl solution to this to make 0.5 M, then purify by oligo (dT) cellulose column chromatography [ Eluent: 10 mM Tris-HCl-1 mM EDTA (pH 7.
4)] to obtain a poly (A) mRNA fraction.
［cDNAの合成］ 50mMTris-HCl（pH8.3）、8mM MgCl2、30mMKCl、0.3mMジ
チオスレイトール、2mMdATP、2mMdTTP、2mMdGTPおよび2
mMdCTPを含む水溶液10μｌに、上記で得られたポリ
（Ａ）mRNA分画200μｇおよび合成オリゴデオキシヌク
レオチド 7.2μｇを加え、トリ骨髄性白血病ビールスの逆転写酵
素100Uの存在下で42℃90分間反応させcDNAを合成した。
反応液に10％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反
応を停止させ、水飽和フエノール−クロロホルム混合溶
媒で抽出後、水層にエタノールを加えてcDNA:mRNA複合
体を沈澱させ、これをエタノールで洗浄後、回収した。
得られたペレツトを100μｌの水に溶解し、これに1.8NN
aOH、50mMEDTAを含む水溶液20μｌを加えて70℃、30分
間反応させ、mRNAを分解除去した。これに2NHCl水溶液1
8μｌを加えて中和したのち、エタノールを加えて一本
鎖cDNAを沈澱させ、回収した。この一本鎖cDNAを含んだ
沈澱を各0.5mMのdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP、5mMMgCl
2、70mMKCl、15mM-β−メルカプトエタノールおよびDNA
ポリメラーゼ（ラージサブユニツト）8Uを含む100mMHep
es緩衝液（pH6.9）40μｌに溶解し、15℃で４時間反応
させて二本鎖cDNAを合成した。反応液にドデシル硫酸ナ
トリウム水溶液を加えて反応を停止させ、水飽和フエノ
ール−クロロホルム混合溶媒で抽出後、水層にエタノー
ルを加えて二本鎖cDNAを沈澱させ、これをエタノールで
洗浄後、回収した。得られたペレツトを50mM酢酸ナトリ
ウム、1mMZnSO4、250mMNaClおよびS1ヌクレアーゼ0.25U
を含む水溶液50μｌに溶解し、15℃で30分間反応させ
た。反応液にドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加して
反応を停止させ、水飽和フエノール−クロロホルム混合
溶媒で抽出後、水層からエタノール沈澱によつてcDNAを
回収した。[Synthesis of cDNA] 50mM Tris-HCl (pH8.3), 8mM MgCl 2 , 30mM KCl, 0.3mM dithiothreitol, 2mMdATP, 2mMdTTP, 2mMdGTP and 2
In 10 μl of an aqueous solution containing mMdCTP, 200 μg of the poly (A) mRNA fraction obtained above and the synthetic oligodeoxynucleotide were obtained. 7.2 μg was added thereto, and reacted in the presence of 100 U of avian myeloid leukemia virus reverse transcriptase at 42 ° C. for 90 minutes to synthesize cDNA.
After adding 10% sodium dodecylsulfate aqueous solution to the reaction mixture to stop the reaction and extracting with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent, ethanol was added to the aqueous layer to precipitate the cDNA: mRNA complex, which was washed with ethanol. , Recovered.
The pellet obtained was dissolved in 100 μl of water, and 1.8 NN was added to this.
20 μl of an aqueous solution containing aOH and 50 mM EDTA was added and reacted at 70 ° C. for 30 minutes to decompose and remove mRNA. 2N HCl aqueous solution 1
After adding 8 μl for neutralization, ethanol was added to precipitate single-stranded cDNA, which was recovered. The precipitate containing this single-stranded cDNA was treated with 0.5 mM each of dATP, dTTP, dGTP and dCTP, and 5 mM MgCl.
2 , 70 mM KCl, 15 mM β-mercaptoethanol and DNA
100mM Hep containing 8U of Polymerase (Large Subunit)
It was dissolved in 40 μl of es buffer (pH 6.9) and reacted at 15 ° C. for 4 hours to synthesize double-stranded cDNA. The reaction was stopped by adding an aqueous solution of sodium dodecyl sulfate to the reaction solution, extracted with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent, ethanol was added to the aqueous layer to precipitate double-stranded cDNA, which was washed with ethanol and then recovered. . The pellet obtained was treated with 50 mM sodium acetate, 1 mM ZnSO 4 , 250 mM NaCl and S1 nuclease 0.25 U.
It was dissolved in 50 μl of an aqueous solution containing and reacted at 15 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by adding an aqueous solution of sodium dodecyl sulfate to the reaction solution, extracted with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent, and then cDNA was recovered from the aqueous layer by ethanol precipitation.
［オリゴ（dC）テールcDNAの調製］ cDNAを含んだペレツトを1mMCoCl2、0.1mMジチオスレイ
トール、0.2μｇポリ（Ａ）、0.1mM3H‐dCTP（1200cpm/
pmol）およびターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフエラーゼ20Uを含む130mMカコジル酸ナトリウム−30
mMTris-HCl緩衝液（pH6.8）25μｌに溶解した。末端当
りdCMPの10〜15残基を付加するため37℃で20分間反応さ
せ、ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加して反応を停
止させた。水飽和フエノール−クロロホルム混合溶媒で
抽出後、水層にエタノールを加えてオリゴ（dC）テール
cDNAを沈澱させ、得られたペレツトをエタノールで洗浄
後、回収した。これを100mMTris-HCl（pH7.4）10mMEDTA
および200mMNaClを含む水溶液に1ml当り0.2μｇのオリ
ゴ（dC）テールcDNAを含むように溶解した。[Preparation of Oligo (dC) Tail cDNA] The pellet containing the cDNA was added to 1 mM CoCl 2 , 0.1 mM dithiothreitol, 0.2 μg poly (A), 0.1 mM 3 H-dCTP (1200cpm /
pmol) and terminal deoxynucleotidyl transferase 20U containing 130 mM sodium cacodylate-30
It was dissolved in 25 μl of mMTris-HCl buffer (pH 6.8). In order to add 10 to 15 residues of dCMP per terminal, the reaction was carried out at 37 ° C for 20 minutes, and the reaction was stopped by adding an aqueous solution of sodium dodecyl sulfate. After extraction with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent, add ethanol to the aqueous layer and add oligo (dC) tail.
The cDNA was precipitated, and the obtained pellet was washed with ethanol and then recovered. 100mM Tris-HCl (pH7.4) 10mM EDTA
And 0.2 mM of oligo (dC) tail cDNA was dissolved per ml in an aqueous solution containing 200 mM NaCl.
［オリゴ（dG）テールプラスミドpBR322DNAの調製］ 20mMTris-HCl（pH7.4）、10mMMgCl2、50mM(NH4)2SO4お
よび1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液10
0μｌにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素PstIエンドヌ
クレアーゼ15Uを加え、37℃で１時間反応させた。反応
終了後、反応液をフエノール抽出し、水層からエタノー
ル沈澱によつてDNAを回収した。得られたDNAを前述のオ
リゴ（dC）テール付加に用いた水溶液（ただし、3H‐dC
TPの代りに0.1mM3H‐dGTPを含む）200μｌに溶解し、タ
ーミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ80
Uを用いて37℃で20分間反応させ、これに約10〜15個のd
G残基を取り込ませた。反応液を水飽和フエノール−ク
ロロホルム混合溶媒（1:1）で抽出し、水層からエタノ
ール沈澱によつてオリゴ（dG）テールプラスミドpBR322
DNAを回収した。これをオリゴ（dC）テールcDNAの場合
と同様の緩衝液に1ml当り２μｇのオリゴ（dG）テール
プラスミドpBR322DNAを含むように溶解した。[Preparation of oligo (dG) tail plasmid pBR322 DNA] Aqueous solution containing 20 mM Tris-HCl (pH7.4), 10 mM MgCl 2 , 50 mM (NH 4 ) 2 SO 4 and 0.1 mg bovine serum albumin per ml 10
10 μg of pBR322 was dissolved in 0 μl, 15 U of restriction enzyme PstI endonuclease was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, the reaction solution was extracted with phenol, and DNA was recovered from the aqueous layer by ethanol precipitation. The obtained DNA was used for the oligo (dC) tail addition described above (however, 3 H-dC
Dissolved in 200 μl containing 0.1 mM 3 H-dGTP instead of TP, and added terminal deoxynucleotidyl transferase 80
The reaction was carried out with U for 20 minutes at 37 ° C., to which about 10 to 15 d
The G residue was incorporated. The reaction solution was extracted with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent (1: 1), and the oligo (dG) tail plasmid pBR322 was extracted from the aqueous layer by ethanol precipitation.
The DNA was recovered. This was dissolved in the same buffer as in the case of oligo (dC) tail cDNA so that 2 μg of oligo (dG) tail plasmid pBR322 DNA was contained per ml.
［組換え体プラスミドの作製］ オリゴ（dC）テールcDNA溶液50μｌをオリゴ（dG）テー
ルpBR322DNAを含む水溶液50μｌに溶解し、65℃で10分
間、ついで46℃で120分間、37℃で60分間および室温で6
0分間インキユベートしてアニーリングを行ない、組換
え体プラスミド溶液を調製した。[Preparation of Recombinant Plasmid] 50 μl of oligo (dC) tail cDNA solution was dissolved in 50 μl of an aqueous solution containing oligo (dG) tail pBR322 DNA, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 10 minutes, then at 46 ° C. for 120 minutes, and at 37 ° C. for 60 minutes. 6 at room temperature
A recombinant plasmid solution was prepared by incubating for 0 minutes and annealing.
［トランスホーマントの選択］ 上記で得られたプラスミド溶液を用い、前記コーエンら
の方法に多少変更を加えてE.coli X1776株をトランスホ
ームした。[Selection of Transformant] Using the plasmid solution obtained above, the E. coli X1776 strain was transformed by a slight modification of the method of Cohen et al.
すなわち、E.coliX1776株を、ジアミノピメリン酸100μ
g/mlおよびチミジン40μg/mlを補つたＬ−ブロス液20ml
中、37℃で吸光度（600nm）が0.5となるまで培養し、菌
体を冷却器付遠心分離機で集め、50mMCaCl2を含んだ10m
MTris-HCl緩衝液（pH7.3）10mlに分散し、０℃で再度遠
心沈降させた。集めた菌体を同じ緩衝液2mlに分散し、
０℃で５分間静置した。この分散液0.2mlに上記組換え
体プラスミド溶液0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静
置し、さらに42℃で２分間保持したのち、前の培養で用
いたのと同一組成のＬ−ブロス液0.5mlを加えて１時間
振盪培養を行なつた。この培養液の一部を取り、前述の
成分の他にテトラサイクリン15μg/mlを含んだＬ−ブロ
ス寒天平板に拡げ37℃で約12時間培養した。That is, E. coli X1776 strain was treated with diaminopimelic acid 100 μ
20 ml of L-broth solution supplemented with g / ml and thymidine 40 μg / ml
Medium, cultured at 37 ℃ until the absorbance (600nm) becomes 0.5, collect the cells with a centrifuge with condenser, and 10m containing 50mM CaCl 2 .
It was dispersed in 10 ml of MTris-HCl buffer (pH 7.3), and centrifuged again at 0 ° C. Disperse the collected bacterial cells in 2 ml of the same buffer,
It was left still at 0 ° C. for 5 minutes. To 0.2 ml of this dispersion, 0.1 ml of the above recombinant plasmid solution was added and mixed, and the mixture was allowed to stand at 0 ° C for 15 minutes and further held at 42 ° C for 2 minutes, and then L of the same composition as used in the previous culture was added. -0.5 ml of broth solution was added and shake culture was carried out for 1 hour. A part of this culture solution was taken and spread on an L-broth agar plate containing 15 μg / ml of tetracycline in addition to the above-mentioned components and cultured at 37 ° C. for about 12 hours.
［ハイブリダイゼーシヨン試験］ CRFをコードするcDNAを含むプラスミドを持つ菌体をス
クリーニングするため、CRFのアミノ酸配列の一部に対
応する32P標識合成オリゴヌクレオチド （第２図のアミノ酸配列167〜171番のGlu-Met-Thr-Lys-
Alaに対応する塩基配列のうちAlaコドンの第３番目の塩
基は欠けている）の混合水溶液を用い、ハナハンおよび
メセルソンの方法［Hanahan,D.＆ Meselson,N.,Gene,1
0,63（1980）］に従い、これらの標識された合成ヌクレ
オチドをプローブとして、スクリーニングし、このプロ
ーブと相補性のある配列を含んだプラスミドを持つた菌
株をピツクアツプした。約7.5×105個のコロニー中４個
のコロニーが陽性であつた。[Hybridization test] A 32 P-labeled synthetic oligonucleotide corresponding to a part of the amino acid sequence of CRF for screening cells having a plasmid containing a cDNA encoding CRF. (Glu-Met-Thr-Lys- of amino acid sequence 167-171 in FIG. 2)
Of the base sequence corresponding to Ala (the third base of the Ala codon is deleted), and the method of Hanahan and Meselson [Hanahan, D. & Meselson, N., Gene, 1
0 , 63 (1980)], these labeled synthetic nucleotides were used as a probe for screening, and a strain having a plasmid containing a sequence complementary to this probe was picked up. Four colonies were positive out of about 7.5 × 10 5 colonies.
［クローン化DNAフラグメントの調製］ こうして選択した菌株を前述のジアミノピメリン酸およ
びチミジンを添加したＬ−ブロスで培養して菌体を得
た。[Preparation of cloned DNA fragment] The strain thus selected was cultured in L-broth to which the above-mentioned diaminopimelic acid and thymidine were added to obtain a bacterial cell.
この菌体をシユリーフらの方法［Schleif,R.et al,“Pr
actical Methods in Molecular Biology"（1981）,Spri
nger Verlag,101頁）に従つて処理し、プラスミドDNAを
得た（収量:200μg/培養液１）。こうして得たプラス
ミドDNAを制限酵素PstIで分解し、精製分離してクロー
ン化DNAフラグメントを得た。このクローン化DNAフラグ
メントについて後述の方法で塩基配列の決定を行なつた
結果、プラスミドpCRF8の持つクローン化DNAフラグメン
トはCRFのアミノ酸コード領域の一部を含むことが判明
した。This cell was prepared by the method of Shurief et al. [Schleif, R. et al, “Pr
actical Methods in Molecular Biology "(1981), Spri
nger Verlag, p. 101) to obtain plasmid DNA (yield: 200 μg / culture liquid 1). The plasmid DNA thus obtained was digested with the restriction enzyme PstI, purified and separated to obtain a cloned DNA fragment. As a result of determining the nucleotide sequence of this cloned DNA fragment by the method described below, it was revealed that the cloned DNA fragment contained in the plasmid pCRF8 contained a part of the amino acid coding region of CRF.
［II］pCRF25、pCRF30およびpCRF31の分離 pCRF8はプライマーとして用いたCRFの塩基配列より下流
の塩基配列を欠いているので、より完全なCRFcDNAをク
ロニングするため、前記pCRF8のHpaII（346）‐HaeIII
（512）断片をプローブとして用い、前記岡山らの方法
により作製したヒツジ視床下部のmRNAに対するcDNAライ
ブラリーのスクリーニングを行なつた。[II] Separation of pCRF25, pCRF30 and pCRF31 Since pCRF8 lacks a nucleotide sequence downstream of the nucleotide sequence of CRF used as a primer, it is necessary to clone more complete CRF cDNA.
The (512) fragment was used as a probe to screen a cDNA library for the mRNA of the hypothalamus of the sheep prepared by the method of Okayama et al.
［プラスミドプライマーの調製］ pBR322とSV40とのハイブリツドプラスミド（マツプユニ
ツト0.71〜0.86）600μｇを6mMTris-HCl（pH7.5）、6mM
MgCl2、6mMNaCl、6mM2−メルカプトエタノールおよび1m
l当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液1.5mlに
溶解し、制限酵素KpnIエンドヌクレアーゼ1,200Uを加
え、37℃で４時間反応させたのち、10％ドデシル硫酸ナ
トリウム水溶液を加えて反応を停止させ、得られた消化
液から常法に従いエタノール沈澱によつてDNAを回収し
た。これを140mMカコジル酸ナトリウム、30mMTris-HCl
（pH6.8）、1mMCoCl2、0.1mMジチオスレイトールおよび
0.25mMdTTPを含む水溶液0.3mlに溶解し、ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ400Uを添加し
て37℃で30分間反応させ、KpnIの開裂部位に約60個の
（dT）テールを付加した。10％ドデシル硫酸ナトリウム
水溶液の添加によつて反応を終結させたのち、再びエタ
ノール沈澱を行ないDNAを回収した。[Preparation of plasmid primer] 600 μg of hybrid plasmid (map unit 0.71 to 0.86) of pBR322 and SV40 was added to 6 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM.
MgCl 2 , 6 mM NaCl, 6 mM 2- mercaptoethanol and 1 m
It was dissolved in 1.5 ml of an aqueous solution containing 0.1 mg of bovine serum albumin per liter, 1,200 U of restriction enzyme KpnI endonuclease was added, and the reaction was carried out at 37 ° C for 4 hours. Then, the reaction was stopped by adding a 10% sodium dodecyl sulfate aqueous solution. DNA was recovered from the resulting digested solution by ethanol precipitation according to a conventional method. This is 140 mM sodium cacodylate, 30 mM Tris-HCl
(PH6.8), 1mM CoCl 2 , 0.1mM dithiothreitol and
It was dissolved in 0.3 ml of an aqueous solution containing 0.25 mM dTTP, 400 U of terminal deoxynucleotidyl transferase was added and reacted at 37 ° C for 30 minutes, and about 60 (dT) tails were added to the cleavage site of KpnI. After the reaction was terminated by the addition of a 10% sodium dodecylsulfate aqueous solution, ethanol precipitation was carried out again to recover the DNA.
回収したDNAを10mMTris-HCl（pH7.4）、10mMMgCl2、20m
MKCl、1mMジチオスレイトールおよび1ml当り0.1mgのウ
シ血清アルブミンを含む水溶液に溶解し、制限酵素HpaI
エンドヌクレアーゼ100Uを加えて37℃で５時間反応させ
てDNAを切断した。Collected DNA from 10mM Tris-HCl (pH7.4), 10mM MgCl 2 , 20m
It was dissolved in an aqueous solution containing MKCl, 1 mM dithiothreitol and 0.1 mg bovine serum albumin per ml, and the restriction enzyme HpaI was added.
100 U of endonuclease was added and reacted at 37 ° C. for 5 hours to cut the DNA.
反応液を１％アガロースゲル電気泳動に付し、ガラスパ
ウダー法［Volgelstein,B.et al,Proc.Natl.Acad.Sci.7
6,615（1979）］に多少変更を加えた方法で大きい方のD
NAを回収した。このDNAをさらに10mMTris-HCl（pH7.
3）、1mMEDTAおよび1MNaClを含む水溶液1mlに溶解して
０℃でオリゴ（dA）クロマトグラフイに付し、水で溶出
させたのち、エタノールで沈澱させ、オリゴ（dT）テー
ルを有するプラスミドプライマー約140μｇを得た。The reaction solution was subjected to 1% agarose gel electrophoresis and subjected to a glass powder method [Volgelstein, B. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 7
[ 6,615 (1979)] with a slight modification to the larger D
NA was recovered. This DNA was further added to 10 mM Tris-HCl (pH 7.
3), dissolved in 1 ml of an aqueous solution containing 1 mM EDTA and 1 M NaCl, subjected to oligo (dA) chromatography at 0 ° C., eluted with water and then precipitated with ethanol to prepare a plasmid primer having an oligo (dT) tail. 140 μg was obtained.
［オリゴ（dG）テールリンカーDNAの調製］ 前記岡山らの方法に従つてオリゴdG）テールリンカーDN
Aを調製した。pBR322とSV40（マツプユニツト0.19〜0.3
2）とのハイブリドプラスミド100μｇを6mMTris-HCl（p
H7.4）、6mMMgCl2、6mM2−メルカプトエタノール、50mM
NaClおよび1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水
溶液0.2mlに溶解し、制限酵素PstIエンドヌクレアーゼ1
20Uを加え37℃で１時間半反応させた。反応後反応液を
フエノールで抽出し、水層からエタノール沈澱によつて
DNAを回収した。得られたDNAを前述のプラスミドプライ
マー調製のdTテール付加に用いた水溶液（ただし、0.25
mMのdTTPに代えて0.1mMのdGTPを含む）50μｌに溶解
し、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラ
ーゼ60Uを用いて37℃で20分間反応させ、これに約10な
いし約15個のdG残基を取り込ませた。反応液を水飽和フ
エノール−クロロホルム混合溶媒（1:1）で抽出し、水
層からエタノール沈澱によつてDNAを回収した。[Preparation of oligo (dG) tail linker DNA] Oligo dG) tail linker DN according to the method of Okayama et al.
A was prepared. pBR322 and SV40 (map unit 0.19 to 0.3
100 μg of the hybrid plasmid with 2) was added to 6 mM Tris-HCl (p
H7.4), 6mM MgCl 2 , 6mM 2- mercaptoethanol, 50mM
The restriction enzyme PstI endonuclease 1 was dissolved in 0.2 ml of an aqueous solution containing NaCl and 0.1 mg of bovine serum albumin per ml.
After adding 20 U, the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour and a half. After the reaction, extract the reaction solution with phenol and precipitate it from the aqueous layer by ethanol precipitation.
The DNA was recovered. The obtained DNA was used as an aqueous solution (however, 0.25
Dissolve in 50 μl (containing 0.1 mM dGTP instead of mM dTTP) and react with terminal deoxynucleotidyl transferase 60U for 20 minutes at 37 ° C., to which about 10 to about 15 dG residues were added. I took it in. The reaction solution was extracted with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent (1: 1), and DNA was recovered from the aqueous layer by ethanol precipitation.
このDNAを20mMTris-HCl（pH7.4）、7mMMgCl2、60mMNaCl
および1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む水溶液
50μｌに溶解し、これに制限酵素HindIIIエンドヌクレ
アーゼ50Uを加え、37℃で１時間反応させ、反応液を1.8
％アガロースゲル電気泳動に付し、制限酵素HindIIIエ
ンドヌクレアーゼ消化によつて生成した小さいオリゴ
（dG）テールリンカーDNAを、前述したプラスミドプラ
イマーの回収と同様の方法で回収した。This DNA was added to 20mM Tris-HCl (pH7.4), 7mM MgCl 2 , 60mM NaCl
And an aqueous solution containing 0.1 mg bovine serum albumin per ml
Dissolve in 50 μl, add 50 U of restriction enzyme HindIII endonuclease, and incubate for 1 hour at 37 ℃.
% Agarose gel electrophoresis, and the small oligo (dG) tail linker DNA generated by digestion with the restriction enzyme HindIII endonuclease was recovered by the same method as the recovery of the plasmid primer described above.
［cDNAライブラリーの作製］ 50mMTris-HCl（pH8.3）、8mMMgCl2、30mMKCl、0.3mMジ
チオスレイトール、2mMdATP、2mMdTTP、2mMdGTPおよび
32PdCTP（1600cpm/pmol）を含む水溶液10μｌに、前記
［Ｉ］［ヒツジ視床下部からのmRNA分画の調製］で得ら
れたポリ（Ａ）mRNA分画２μｇおよび前記［II］［プラ
スミドプライマーの調製］で得たプラスミドプライマー
1.4μｇを加え、トリ骨髄性白血病ウイルスの逆転写酵
素5Uの存在下、37℃で20分間反応させ、プラスミドcDN
A:mRNA複合体を合成した。反応液にドデシル硫酸ナトリ
ウム水溶液を加えて反応を停止させ、エタノール沈澱に
よつてプラスミドcDNA:mRNA複合体をペレツト状で回収
した。[Preparation of cDNA library] 50mM Tris-HCl (pH8.3), 8mM MgCl 2 , 30mM KCl, 0.3mM dithiothreitol, 2mMdATP, 2mMdTTP, 2mMdGTP and
To 10 μl of an aqueous solution containing 32 PdCTP (1600 cpm / pmol), 2 μg of the poly (A) mRNA fraction obtained in the above [I] [Preparation of mRNA fraction from sheep hypothalamus] and the above [II] [plasmid primer Preparation] plasmid primer obtained in
1.4 μg was added and reacted for 20 minutes at 37 ° C in the presence of avian myeloid leukemia virus reverse transcriptase 5U.
A: mRNA complex was synthesized. The reaction was stopped by adding an aqueous solution of sodium dodecyl sulfate, and the plasmid cDNA: mRNA complex was recovered in pellet form by ethanol precipitation.
上記プラスミドcDNA:mRNA複合体を含んだペレツトを1mM
CoCl2、0.1mMジチオスレイトール、0.2μｇポリ
（Ａ）、66μＭ32P‐dCTP（1,200cpm/pmol）およびター
ミナルデオキシヌクレオチジルトランスフエラーゼ18U
を含む130mMカコジル酸ナトリウム−30mMTris-HCl緩衝
液（pH6.8）15μｌに溶解した。末端当りdCMP10〜15残
基を付加するため37℃で５分間反応させ、ドデシル硫酸
ナトリウム水溶液を添加して反応を停止させた。水飽和
フエノール−クロロホルム混合溶媒で抽出後、水層にエ
タノールを加えてオリゴ（dC）テールプラスミドcDNA:m
RNA複合体を沈澱させ、得られたペレツトをエタノール
で洗浄後回収した。1 mM of pellet containing the above plasmid cDNA: mRNA complex
CoCl 2 , 0.1 mM dithiothreitol, 0.2 μg poly (A), 66 μM 32 P-dCTP (1,200 cpm / pmol) and terminal deoxynucleotidyl transferase 18U
15 mM of 130 mM sodium cacodylate-30 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing To add 10 to 15 residues of dCMP per terminal, the reaction was carried out at 37 ° C for 5 minutes, and the reaction was stopped by adding an aqueous solution of sodium dodecyl sulfate. After extraction with a water-saturated phenol-chloroform mixed solvent, ethanol was added to the aqueous layer to add oligo (dC) tail plasmid cDNA: m.
The RNA complex was precipitated, and the obtained pellet was washed with ethanol and recovered.
得られたペレツトを20mMTris-HCl（pH7.4）、7mMMgC
l2、60mMNaClおよび1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミン
を含む緩衝液に溶解し、制限酵素HindIIIエンドヌクレ
アーゼ2.5Uで37℃１時間消化し、エタノールで沈澱させ
て回収した。これを10mMTris-HCl-1mMEDTA（pH7.3）10
μｌに溶解し、さらにエタノール３μｌを加え、オリゴ
（dC）テールcDNA-mRNAプラスミド溶液を得た。20mM Tris-HCl (pH7.4), 7mM MgC
It was dissolved in a buffer containing l 2 , 60 mM NaCl and 0.1 mg of bovine serum albumin per ml, digested with the restriction enzyme HindIII endonuclease 2.5 U for 1 hour at 37 ° C., and precipitated with ethanol to recover. 10 mM Tris-HCl-1 mM EDTA (pH7.3) 10
It was dissolved in μl, and 3 μl of ethanol was further added to obtain an oligo (dC) tail cDNA-mRNA plasmid solution.
この溶液１μｌを10mMTris-HCl（pH7.5）、1mMEDTA、0.
1MNaClおよび前述の［オリゴ（dG）テールリンカーDNA
の調製］で得たリンカーDNA0.04pmolを含む水溶液10μ
ｌに溶解し、65℃で２分間インキユベートしたのち、42
℃で30分間アニーリングを行なつた。これを０℃に冷却
し、E.coliDNAリガーゼ0.6μｇを加えて一夜インキユベ
ートした。1 μl of this solution was added to 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM EDTA, 0.1 mM.
1M NaCl and the aforementioned [oligo (dG) tail linker DNA
Preparation of 10 μl of aqueous solution containing 0.04 pmol of linker DNA
Dissolve in 1 l and incubate at 65 ℃ for 2 minutes, then 42
Annealing was performed at 30 ° C. for 30 minutes. This was cooled to 0 ° C., 0.6 μg of E. coli DNA ligase was added, and the mixture was incubated overnight.
この溶液に各40μＭのdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP、0.
15mMβ‐NAD、0.4μg E.coli DNAリガーゼ、0.3μg E.c
oli DNAポリメラーゼならびに１μg E.coliリボヌクレ
アーゼＨを加え、全量を100μｌとしたのち、最初12℃
で、ついで室温で各１時間インキユベートした。反応液
に冷10mMTris-HCl（pH7.3）0.9mlを加えて反応を停止さ
せてプラスミド溶液を調製した。Add 40 μM each of dATP, dTTP, dGTP and dCTP to this solution.
15 mM β-NAD, 0.4 μg E. coli DNA ligase, 0.3 μg Ec
Add oli DNA polymerase and 1 μg E. coli ribonuclease H to make 100 μl total volume, then at 12 ° C for the first time.
Then, it was incubated at room temperature for 1 hour each. Cold 10 mM Tris-HCl (pH 7.3) (0.9 ml) was added to the reaction solution to stop the reaction to prepare a plasmid solution.
このプラスミド溶液を用い前記［Ｉ］の［トランスホー
マントの選択］で述べた方法によりトランスホーメーシ
ヨンを行ないアンピシリン50μg/mlを含むＬ−ブロス寒
天平板上に拡げ耐性菌を選択してcDNAライブラリーを作
製した。Using this plasmid solution, transformation was carried out by the method described in [Selection of transformants] in [I] above, spread on an L-broth agar plate containing 50 μg / ml of ampicillin, and resistant bacteria were selected. A rally was made.
［CRFcDNAフラグメントのクローニング］ CRFをコードするmRNAに対するcDNAを含むプラスミドを
持つ菌株をスクリーニングするために、前記［Ｉ］の
［クローン化DNAフラグメントの調製］の項で述べたpCR
F8のクローン化DNAフラグメントのHpaII-HaeIII断片を
32P標識し、これをプローブとして用い前記ハナハンお
よびメセルソンの方法に従つて前項で作製したcDNAライ
ブラリーをスクリーニングし、このプローブとハイブリ
ダイズする菌株を選択した。約1.5×106個のコロニー中
５個のコロニーが陽性であつた。[Cloning of CRF cDNA Fragment] In order to screen a strain having a plasmid containing cDNA for mRNA encoding CRF, pCR described in the above section [Preparation of cloned DNA fragment]
HpaII-HaeIII fragment of the cloned DNA fragment of F8
The cDNA library prepared in the previous section was screened according to the method of Hanahan and Meselson, which was labeled with 32 P, and was used as a probe to select a strain that hybridizes with this probe. Five colonies were positive out of about 1.5 × 10 6 colonies.
上記で得られた陽性菌株より前記［Ｉ］の［クローニン
化DNAフラグメントの調製］と同様の方法によりプラス
ミドDNAを抽出し、これを制限酵素PstIで完全消化し、
制限酵素RsaIで部分分解、精製分離してクローン化DNA
フラグメントを得た。これを下記のように塩基配列の決
定を行なつた結果、３個のクローンpCRF25、pCRF30およ
びpCRF31のDNAフラグメントはいずれもCRFアミノ酸配列
に対応する塩基配列全てを含んだCRFcDNAフラグメント
であつた。From the positive strain obtained above, plasmid DNA was extracted by the same method as in [Preparation of cloninized DNA fragment] of [I] above, and this was completely digested with restriction enzyme PstI,
Cloned DNA partially digested with restriction enzyme RsaI, purified and separated
A fragment was obtained. As a result of the determination of the nucleotide sequence as described below, the DNA fragments of the three clones pCRF25, pCRF30 and pCRF31 were all CRF cDNA fragments containing all the nucleotide sequences corresponding to the CRF amino acid sequence.
［クローン化DNAの塩基配列の決定］ こうして得たプラスミドDNAを種々の制限酵素で分解
し、適当な制限酵素断片につき塩基配列の決定を行なつ
た。[Determination of Nucleotide Sequence of Cloned DNA] The plasmid DNA thus obtained was digested with various restriction enzymes, and the nucleotide sequence of appropriate restriction enzyme fragments was determined.
すなわち、該プラスミドDNA（例えばpCRF31）50μｇを6
mMTris-HCl（pH7.4）、6mMMgCl2、50mMNaCl、6mM2−メ
ルカプトエタノールを含む水溶液200μｌに溶解し、50U
のHaeIIIで37℃１時間消化し、５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により200bpのHaeIIIフラグメント１μｇ
を回収した。これを20mMTris-HCl緩衝液（pH7.9）50μ
ｌ中、E.coliアルカリフオスフアターゼ0.11Uを用いて5
5℃で30分間反応させ、脱リン酸化を行なつた。つい
で、50mMTris-HCl（pH7.6）、10mMMgCl2および10mM2−
メルカプトエタノールを含む水溶液50μｌ中でポリヌク
レオチドキナーゼ0.1Uおよびγ‐32P‐ATP（＞5000Ci/m
mol）を用いて37℃で１時間反応させ、５′末端を32Pで
標識した。標識したDNAを6mMTris-HCl（pH7.4）、50mMN
aCl、5mMMgCl2、および6mM2−メルカプトエタノールを
含む水溶液40μｌ中Sau3AI2Uを用いて37℃で１時間反応
させ、125bpのHaeIII-Sau3AIフラグメントを回収した。That is, 6 μg of 50 μg of the plasmid DNA (eg pCRF31)
Dissolve in 200 μl of an aqueous solution containing mMTris-HCl (pH7.4), 6 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl, 6 mM 2- mercaptoethanol, and add 50 U.
Of HaeIII fragment of 200 bp by digestion with 3% of HaeIII for 1 hour at 37 ℃ and electrophoresis on 5% polyacrylamide gel
Was recovered. 20mM Tris-HCl buffer (pH7.9) 50μ
5 ml of 0.11 U of E. coli alkaline phosphatase in
Dephosphorylation was performed by reacting at 5 ° C for 30 minutes. Then 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 and 10 mM 2 −
Polynucleotide kinase 0.1U and γ- 32 P-ATP (> 5000Ci / m in 50μl of aqueous solution containing mercaptoethanol)
mol) and reacted at 37 ° C. for 1 hour to label the 5 ′ end with 32 P. Labeled DNA with 6mM Tris-HCl (pH7.4), 50mM
A 125 bp HaeIII-Sau3AI fragment was recovered using Sau3AI2U in 40 μl of an aqueous solution containing aCl, 5 mM MgCl 2 , and 6 mM 2- mercaptoethanol at 37 ° C. for 1 hour.
このDNAフラグメントに対し、塩基特異的化学反応［Max
am,A.M.et al,“Method of Enzymology"65,499（198
0）;Rubin,C.M.et al,Nucleic Acids Research,8,4613
（1980）］を行ない、DNAの部分分解物を得た。これを
８％ポリアクリルアミド、8M尿素ゲルおよび20％ポリア
クリルアミド、8M尿素ゲルで電気泳動させた。泳動終了
後、ゲルをオートラジオグラフイにかけ塩基配列を決定
した。その結果、その塩基配列は第２図（ただし、Ｕを
Ｔと読みかえる）の塩基配列における312番目の より413番目の までであつた。Base-specific chemical reaction [Max
am, AMet al, “Method of Enzymology” 65 , 499 (198
0); Rubin, CM et al, Nucleic Acids Research, 8 , 4613
(1980)] to obtain a partially degraded product of DNA. This was electrophoresed on 8% polyacrylamide, 8M urea gel and 20% polyacrylamide, 8M urea gel. After completion of the electrophoresis, the gel was subjected to autoradiography to determine the nucleotide sequence. As a result, the base sequence is the 312nd position in the base sequence of Fig. 2 (where U is read as T). 413th from It was up to.
さらに同じプラスミドDNA10μｇを6mMTris-HCl（pH8.
0）、10mMMgCl2、60mMNaClおよび6mM2−メルカプトエタ
ノールを含む水溶液に溶解し、AvaII10Uを用いて37℃１
時間反応させたのち、５％ポリアクリルアミドゲル電気
泳動により2300bpのAvaIIフラグメントを４μｇ回収し
た。これを前述した脱リン酸化と32Pによる末端標識を
行なつた。標識したDNAを6mMTris-HCl（pH8.0）、12mMM
gCl2、50mMNaClおよび6mM2−メルカプトエタノールを含
む水溶液に溶解し、RsaI4Uを用いて消化し、350bpのAva
II-RsaIフラグメントを回収した。HaeIII-Sau3AIフラグ
メントの塩基配列の場合と同様にして塩基特異的化学反
応およびポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、オ
ートラジヲグラフイにより塩基配列を決定した。決定さ
れた塩基配列は第２図の370番目の より577番目の までであつた。Furthermore, 10 μg of the same plasmid DNA was added to 6 mM Tris-HCl (pH 8.
0), 10mM MgCl 2 , 60mM NaCl and 6mM 2- mercaptoethanol dissolved in an aqueous solution, and AvaII10U at 37 ° C 1
After the reaction for 4 hours, 4 µg of 2300 bp AvaII fragment was recovered by 5% polyacrylamide gel electrophoresis. This was subjected to the dephosphorylation described above and the end labeling with 32 P. Labeled DNA with 6mM Tris-HCl (pH8.0), 12mMM
Dissolved in an aqueous solution containing gCl2, 50 mM NaCl and 6 mM 2- mercaptoethanol, digested with RsaI4U and 350 bp Ava
The II-RsaI fragment was recovered. Base-specific chemical reaction and polyacrylamide gel electrophoresis were performed in the same manner as for the base sequence of HaeIII-Sau3AI fragment, and the base sequence was determined by autoradiography. The determined nucleotide sequence is the 370th position in Figure 2. 577th from It was up to.
これらの結果からHaeIII-Sau3AIフラグメントおよびAva
II-RsaIフラグメントは少なくとも43bpのオーバーラツ
プがあり、これは連続した塩基配列であると決定した。
これらの結果およびさらにこのプラスミドDNAを種々の
制限酵素で切断して得たDNAフラグメントについて同様
な方法で塩基配列を決定した結果から、CRF前駆体mRNA
は第２図に示すような塩基配列を持つものであると決定
した。From these results the HaeIII-Sau3AI fragment and Ava
The II-RsaI fragment had an overlap of at least 43 bp, which was determined to be a continuous nucleotide sequence.
From these results and the results of nucleotide sequence determination of the DNA fragments obtained by cleaving this plasmid DNA with various restriction enzymes by the same method, CRF precursor mRNA
Was determined to have a nucleotide sequence as shown in FIG.
第１図はCRFに相当する塩基配列、第２図（Ｉ）および
（II）はヒツジCRF前駆体mRNAの一次構造、第３図はヒ
ツジCRF前駆体の構造を模式的に示した図面、第４図は
クローン化されたCRF前駆体cDNA断片の種類とそれらの
塩基配列決定方法の概略を示したものである。FIG. 1 is a nucleotide sequence corresponding to CRF, FIGS. 2 (I) and (II) are primary structures of sheep CRF precursor mRNA, and FIG. 3 is a drawing schematically showing the structure of sheep CRF precursor. FIG. 4 shows the outline of the cloned CRF precursor cDNA fragments and the method for determining their nucleotide sequences.
Claims (6)
ピン放出因子（以下、CRFと略す）をコードする遺伝子
に由来し、下記の塩基配列 TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
T CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT または TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
C CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT を含むクローン化DNAフラグメント。1. A gene derived from a gene encoding a corticotropin-releasing factor (hereinafter abbreviated as CRF) expressed in the hypothalamus and having the following base sequence TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA.
T CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT or TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
C CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
A cloned DNA fragment containing G GAC ATT GCT.
する遺伝子に由来し、下記の塩基配列 TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
T CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT または TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
C CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT を含むクローン化DNAフラグメントを組込んだベクターD
NA。2. The following nucleotide sequence derived from a gene encoding CRF expressed in the hypothalamus: TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
T CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT or TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
C CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
Vector D incorporating a cloned DNA fragment containing G GAC ATT GCT
NA.
する遺伝子に由来し、下記の塩基配列 TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
T CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT または TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
C CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT を含むクローン化DNAフラグメントを組込んだベクターD
NAによりトランスホームした微生物。3. The following nucleotide sequence derived from a gene encoding CRF expressed in the hypothalamus: TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
T CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
G GAC ATT GCT or TCC CAG GAA CCT CCC ATT TCC CTG GAT CTC ACC TTC CA
C CTC CTC CGA GAA GTC TTG GAA ATG ACC AAG GCC GAT
CAG TTA GCG CAG CAA GCT CAT AGC AAT AGG AAA CTG TT
Vector D incorporating a cloned DNA fragment containing G GAC ATT GCT
Microorganisms transformed by NA.
許請求の範囲第（３）項記載の微生物。4. The microorganism according to claim 3, wherein the transformed strain is Escherichia coli.
ートで全RNAを抽出し、アフィニテイーカラムクロマト
グラフイでmRNA分画を分離し、これを鋳型にCRFアミノ
酸配列の一部に対応する合成オリゴデオキシヌクレオチ
ドをプライマーとして逆転写酵素によりcDNA断片を合成
し、これをベクターに組込み、ついで、このベクターDN
Aにて微生物をトランスホームしたのち、このトランス
ホーマントをCRFアミノ酸配列の別の一部に対応する標
識合成オリゴデオキシヌクレオチドをプローブとして用
い、スクリーニングして、一旦CRFcDNA断片を含むクロ
ーンを取り、ついでこのクローン中のCRFcDNA断片の一
部をプローブとなし、ベクタープライマーとリンカーを
用いて作成したcDNAライブラリーをスクリーニングした
CRFの全アミノ酸コード領域の塩基配列を有するDNA断片
を含むクローンを取ることを特徴とする、CRF遺伝子に
由来するcDNAフラグメントを組込んだベクターDNAを保
有する微生物の製造方法。5. Total RNA is extracted from sheep hypothalamus with guanidyl thiocyanate, and mRNA fraction is separated by affinity column chromatography. Using this as a template, a synthetic oligo corresponding to a part of CRF amino acid sequence is isolated. A cDNA fragment was synthesized by reverse transcriptase using deoxynucleotide as a primer, and this was incorporated into a vector.
After transforming the microorganism in A, this transformant was screened using a labeled synthetic oligodeoxynucleotide corresponding to another part of the CRF amino acid sequence as a probe, and a clone containing the CRF cDNA fragment was once taken, and then A part of the CRF cDNA fragment in this clone was used as a probe to screen a cDNA library prepared using vector primers and linkers.
A method for producing a microorganism having a vector DNA incorporating a cDNA fragment derived from a CRF gene, which comprises taking a clone containing a DNA fragment having a nucleotide sequence of the entire amino acid coding region of CRF.
組込んだベクターDNAを保有する微生物が大腸菌である
特許請求の範囲第（５）項記載の製造方法。6. The production method according to claim 5, wherein the microorganism having a vector DNA incorporating a cDNA fragment derived from the CRF gene is Escherichia coli.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1351183A JPH0787792B2 (en) | 1983-01-29 | 1983-01-29 | Cloned DNA fragment encoding corticotropin releasing factor |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP1351183A JPH0787792B2 (en) | 1983-01-29 | 1983-01-29 | Cloned DNA fragment encoding corticotropin releasing factor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59140884A JPS59140884A (en) | 1984-08-13 |
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ID=11835165
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Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
| WO1996008265A1 (en) * | 1994-09-12 | 1996-03-21 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Corticotropin release inhibiting factor and methods of using same |
| CN1301729A (en) * | 1999-12-24 | 2001-07-04 | 上海博德基因开发有限公司 | New polypeptide-corticotropin-releasing factor 13 and polynucleotide coding such polypeptide |
| CN1361180A (en) * | 2000-12-26 | 2002-07-31 | 上海博德基因开发有限公司 | New polypeptide corticotrophin releasing factor 8.8 and polynucleotides encoding this polypeptide |
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-
1983
- 1983-01-29 JP JP1351183A patent/JPH0787792B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｖｏｌ．２１３（１９８１）Ｐ．１３９４〜１３９７ |
Also Published As
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| JPS59140884A (en) | 1984-08-13 |
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