JPH0783720B2

JPH0783720B2 - 解糖を阻止する方法及び解糖阻止剤の製造方法

Info

Publication number: JPH0783720B2
Application number: JP63210528A
Authority: JP
Inventors: 弘二中島; 道代中山; 三知夫浜; 博幸坪田
Original assignee: 株式会社ヤトロン
Priority date: 1988-08-26
Filing date: 1988-08-26
Publication date: 1995-09-13
Anticipated expiration: 2010-09-13
Also published as: JPH0259668A

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉この発明は、従来容易に得られなかった高純度のＤ−マ
ンノースを使用する、血液の解糖（Ｄ−グルコースの解
糖）を阻止する方法、及び解糖阻止剤の製造方法に関す
るものである。

〈従来の技術と発明が解決しようとする問題点〉臨床化学検査の分野で最も重要なものの一つである血液
中のグルコースの測定に際しては、採血から測定までの
時間中にグルコースが分解しないように、通常採血時に
解糖阻止剤といわれる製剤を血液に溶解しグルコースの
解糖を抑制している。

近年、本発明者等はＤ−マンノース及びその誘導体が従
来までの解糖阻止剤の欠点を解消する優れた効果を持つ
ことを明らかにし、先に特許出願した（特願昭61−1480
36号、特願昭62−112289号、及び特願昭62−287014
号）。

従来、Ｄ−マンノースは次の（Ａ）〜（Ｅ）に記載する
方法により製造されている。

（Ａ）マンナンを多量に含むゾウゲヤシの実、コンニャ
ク粉粒、イナゴマメのゴム等の加水分解（Ｂ）ホルムアルデヒドの重合（Ｃ）マンニット（マンニトール）の酸化（Ｄ）エミールフィシャー（E.Fischer）法（化学大辞
典第１巻第44ページ：共立出版昭和35年発行参
照）（Ｅ）Lobry de Bruyn−van Ekenstein転移しかしこれらの方法の内、（Ａ）のマンナンを加水分解
する方法は、マンナンには量的な差はあってもグルコー
スがその構成成分として含まれているので、通常の物理
・化学的精製処理では微量のＤ−グルコースの混入（残
存）を避けるのは困難であり、また（Ｂ）〜（Ｅ）の方
法においても、Ｄ−グルコースの共存溶液に、物理・化
学的精製処理を施してＤ−マンノースを得るものである
ため微量のＤ−グルコースの混入（残存）を避けるのは
不可能である。

しかしながら、解糖阻止剤として使用するＤ−マンノー
スは、この中に夾雑物質としてＤ−グルコースが混入し
ていると、このＤ−グルコースは血糖の測定値に直接影
響（正誤差）を与えるから、Ｄ−マンノースを可能な限
り精製して、Ｄ−グルコースを除去しなければ、解糖阻
止剤として致命的な欠点を有することになる。

これは、例えばＤ−グルコース１％を含有するＤ−マン
ノースを解糖阻止剤として、通常の濃度の300mg/dl血液
で使用すれば、血液中のグルコースの値を３％以上高く
する結果を招くことになり、糖尿病前状態の受信に対し
て誤診を招く結果にもなりかねない。

〈問題を解決するための手段〉そこで、本願は前記（Ａ）〜（Ｅ）の方法で得られるＤ
−マンノースを含む溶液を従来の精製法で精製し、Ｄ−
グルコース含有量を一定の値以下とした後、従来の精製
法では除去することが極めて困難であった残存する微量
のＤ−グルコースを、ピラノース酸化酵素、グルコース
脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれか一種、またはこ
れらを組み合せて作用させて効率よく分解し、Ｄ−グル
コース含有量を血糖測定値に影響を及ぼさないレベルに
まで低下させて得られる高純度のＤ−マンノースを使用
した、血液の解糖を阻止する方法、及び解糖阻止剤の製
造方法を提供しようとするものである。

本願は次の（１）〜（４）に記載する４個の請求項から
構成されている。

（１）不純物（夾雑物）として微量のＤ−グルコースを
含有するＤ−マンノースに対して、ピラノース酸化酵
素、グルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれか
一種、またはこれらを組み合せて作用させて、Ｄ−グル
コース含有量をＤ−マンノースに対して0.5重量％以下
としたＤ−マンノースを血液に添加することを特徴とす
る解糖を阻止する方法。

（２）不純物（夾雑物）として微量のＤ−グルコースを
含有するＤ−マンノースに対して、ピラノース酸化酵
素、グルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれか
一種、またはこれらを組み合せて作用させて、Ｄ−グル
コース含有量をＤ−マンノースに対して0.5重量％以下
としたＤ−マンノースに、必要に応じて血液凝固阻止剤
または血液凝固促進剤を添加することを特徴とする解糖
阻止剤の製造方法。

（３）マンナンを加水分解した後、この加水分解を精製
してＤ−マンノースを製造し、このＤ−マンノースを血
液に添加して解糖を阻止する方法において、Ｄ−マンノ
ースの不純物（夾雑物）として含まれるＤ−グルコース
含有量をＤ−マンノースに対して２重量％以下まで精製
した粗Ｄ−マンノースに対し、ピラノース酸化酵素、グ
ルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれか一種、
またはこれらを組み合せて作用させて、Ｄ−グルコース
含有量をＤ−マンノースに対して0.5重量％以下とした
Ｄ−マンノースを血液に添加することを特徴とする解糖
を阻止する方法。

（４）次の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）工程を順次経て製造
される解糖阻止剤の製造方法において、（Ｂ）工程に対
し、この工程における精製中のＤ−マンノースの純度
が、不純物としてＤ−グルコースをＤ−マンノースに対
して２重量％〜0.5重量％含有する範囲に達したとき、
この粗Ｄ−マンノースに対し、ピラノース酸化酵素、グ
ルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれか一種、
またはこれらを組み合せて作用させ、Ｄ−グルコース含
有量をＤ−マンノースの0.5重量％以下とする工程を付
加することを特徴とする解糖阻止剤の製造方法。

（Ａ）工程：マンナンを加水分解する工程（Ｂ）工程：（Ａ）工程により得られる加水分解液を常
法（再結晶法）により精製してＤ−マンノースを製造す
る工程（Ｃ）工程：（Ｂ）工程により得られるＤ−マンノース
に必要に応じて血液凝固阻止剤または血液凝固促進剤を
添加する工程本願発明は、Ｄ−マンノース中のＤ−グルコースを分解
除去できるばかりではなく、Ｄ−マンノースと同様に血
液の解糖阻止剤として使用されるＤ−マンノース誘導体
（例えばＤ−マンノサミン）中のＤ−グルコースを同様
に分解除去することも可能である。また、血糖測定ばか
りではなく、広くグルコース測定系を利用した他の項目
測定用の、干渉を与えない血液試料を提供できるという
点で重量である。

本願発明に使用可能な酵素は、ピラノース酸化酵素（Yo
go Machida and Toru Nakanishi,Agric.Biol Chem.,48
（10）,2463,1984）、グルコース脱水素酵素（H.U.Berg
meyer et al.,Method of Enzymatic Analysis,vol.VI 3
rd ed.,pp 172,1984）、グルコキナーゼ（富田耕右,Bio
Industry,3（９）,5,1986）であり、好ましくはピラノ
ース酸化酵素である。その理由は次の通りである。

（イ）すべてのグルコース酸化酵素はＤ−マンノースと
反応するが、ピラノース酸化酵素、グルコース脱水素酵
素、グルコキナーゼはＤ−マンノースと反応しない（第
５表参照）。

（ロ）しかし、グルコース脱水素酵素には、遊離のNAD
（補酵素）、グルコキナーゼには、同様にATPが必要と
なる。従って、酵素処理後に未反応物、及び反応生成物
をＤ−マンノースから分離除去する工程が必要となり、
剤型化までの操作過程が幾分複雑なものとなりコスト高
となり易い。

（ハ）一方、ピラノース酸化酵素は単独で触媒活性を発
現するから酵素とＤ−マンノース溶液との接触のみで目
的を達成できる。

本願発明において、ピラノース酸化酵素、グルコース脱
水素酵素、グルコキナーゼ等を作用させる、微量のＤ−
グルコースを含有するＤ−マンノース（粗Ｄ−マンノー
ス）は、マンナンの加水分解に由来するものに限らず、
他の如何なる方法に由来するものであってもよい。

〈実施例〉マンナンの原料として、ゾウゲヤシの実とコンニャク粉
を原料として使用し、下記に記載する方法で加水分解、
結晶化、再結晶化を繰り返しＤ−マンノース（試料Ａ、
試料Ｂ）を製造した。

（ａ）加水分解：ゾウゲヤシの実、またはコンニャク粉
1000gに75％硫酸を1000g加えてミキサーにかけスラリー
とした後35〜40℃で12時間放置した。これに水10lを加
えて攪拌し、布でロカしてロ液を得た。このロ液の容量
が減らないように水を加えつつ６時間煮沸した。

（ｂ）結晶化：この煮沸液を炭酸バリウムで中和し、活
性炭を加えてロカし脱色した。ロ液を約85％に濃縮し、
温メタノール100mlを加えた後、更にイソプロピルアル
コール2000mlで稀釈した。デカンテイションにより上澄
みを採取し、ゴム状残分はメタノールと、イソプロピル
アルコールで数回抽出し、上澄みを合せ、活性炭を加え
てロカ脱色し、約60％のシロップに濃縮した。このシロ
ップを氷酢酸250mlに溶かし、Ｄマンノースの種を加え
て、室温で数日放置し、生成した結晶をエタノール−メ
タノール混液で洗浄した後結晶を採取した。母液は再濃
縮し、前記と同様な操作でＤ−マンノースの結晶を採取
した。両者を合せて約350gのＤ−マンノースの結晶（粗
結晶）が得られた。

（ｃ）再結晶:D−マンノースの粗結晶に水を同重量加え
て溶解し、酢酸１滴と脱色炭0.5gを加えてロカし、ロ液
を約85％に減圧濃縮した。このシロップを前記結晶化の
項に記載したと同様な方法でＤ−マンノースを結晶化さ
せた。

得られた試料Ａ、試料ＢのＤ−マンノースの結晶のＤ−
グルコースの含量と、参考として市販のＤ−（＋）−マ
ンノース（試薬）中のＤ−グルコースの含量を第１表
（巻末）に示す。

第１表によれば、Ｄ−マンノース中のＤ−グルコースの
含量は非常に高いものもあり、これをこのまま解糖阻止
剤として使用すれば、血糖の測定値に大きな影響を与
え、無視することができないことがわかる。

（ｄ）ピラノース酸化酵素によるＤ−マンノース中のＤ
−グルコースの酸化： 1mMリン酸緩衝液（pH7.0）に溶解した10mMのＤ−マンノ
ース溶液（試料Ａから調製）100mlを、予じめ37℃に加
温しておき、ピラノース酸化酵素（100U/ml）1mlを加
え、攪拌下、グルコース量とマンノース量の経時変化を
調べた。酵素添加後、20分、40分、60分、120分、の各
時点で一部を採取し下記の試薬（Ｉ）、（II）を使用す
る酵素法により比色定量（GOD法）した。

すなわち、下記の試薬（Ｉ）、（II）各1mlを37℃に予
め加温しておき、前記夫々の酵素反応後の試料200μｌ
を添加して反応を始めた。580nmで１分後の１分間当り
の吸光度変化量と、３分後と４分後の１分間当りの吸光
度変化量を測定した。同様に試料を検量用標準液に変え
て測定を行ない、各々Ｄ−グルコース量とＤ−マンノー
ス量を算出した。その結果を第２表（巻末）に示す。

第２表の結果によれば、ピラノース酸化酵素を添加後、
60分で約90％のＤ−グルコースを分解させることができ
る。

試薬（Ｉ）:1.7mM 3,5−ジメトキシアニリノプロパンス
ルホン酸を含む0.15Mリン酸緩衝液（pH6.0）試薬（II）：ムタロターゼ1.6U/ml、グルコース酸化酵
素1.7×10⁴U/ml、ペルオキシターゼ5600U/ml、1.0mM 4
−アミノアンチピリン、0.2％Triton×100を含む50mM
リン酸緩衝液（pH7.2）検量用標準液は、Ｄ−マンノースの6mg/mlと、Ｄ−マン
ノースの0.2mg/mlを使用した。

（ｅ）グルコキナーゼによるＤ−マンノース中のＤ−グ
ルコースの分解： 8mM MgCl₂,2mM NADPH,2mM ATPを含む20mM トリス塩酸
緩衝液（pH8.5）に溶解した10mMのＤ−マンノース溶液
（試料１から調製）100mlを37℃に予じめ加温し、グル
コキナーゼ（188U/ml）1mlとグルコース−６−リン酸脱
水素酵素（126U/ml）1mlを加え攪拌下に、グルコース量
とマンノース量の経時変化を調べた。その結果を第３表
に示す。酵素添加後、120分で約90％のＤ−グルコース
を分解させることができる。

（ｆ）グルコース脱水素酵素によるＤ−マンノース中の
Ｄ−グルコースの酸化 0.5mMNADを含む20mMトリス塩酸緩衝液8pH8.2）に溶解し
た10mMのＤ−マンノース溶液（試料１から調製）100ml
を37℃に予じめ加温し、グルコース脱水素酵素（500U/m
l）1mlとムタロターゼ（80U/ml）1mlを加え攪拌下に、
グルコース量とマンノース量の経時変化を（ｄ）と同様
に調べた。その結果を第４表に示す。この結果によれ
ば、酵素添加後、120分で約70％のＤ−グルコースを分
解させることができる。

（ｇ）ピラノース酸化酵素処理済みＤ−マンノースを使
用した解糖阻止効果：前記（ｄ）で120分間ピラノース酸化酵素処理したＤ−
マンノース溶液を70℃で30分間加温し酵素を失活させた
後、冷却し、その後凍結乾燥した（−60℃,12時間）。

この凍結乾燥品100mg（88mgのＤ−マンノースを含有）
を蒸留水880μｌで溶解し、その150μｌを、予め採血し
た血液（ヘパリン30IU/ml含有）5mlに加え、室温に放置
した。

同様にピラノース酸化酵素未処理標品を添加したもの
（試料１）及びＤ−マンノース標品無添加（試料２）の
各血漿を作製した。

１時間、２時間、３時間、８時間後、各々その1mlを採
取し、12000r.p.m.で６分間の遠心分離を行ない、その
上清を使って血漿中のグルコース含量を測定した。同様
にピラノース酸化酵素未処理標品（試料１）、及びＤ−
マンノース無添加の試料（試料２）を用いて血漿中のグ
ルコース含量を測定し、三者を比較した。その結果図面
（巻末）に示す。

図面によれば、ピラノース酸化酵素処理を行なったＤ−
マンノースは、未処理標品（試料１）と比較して、全て
の放置時間経過後の測定区分において、一定の低いグル
コースの値（血糖値）を示した。これは、処理品はグル
コースを含まないため真の値に近く、一方未処理品はグ
ルコースを含有しているため真の値より大きい値を示し
たものと考えられる。

また、ピラノース酸化酵素処理品もＤ−マンノース無添
加（試料２）に比較して充分な解糖阻止効果を維持して
いた。

なお、グルコキナーゼ、或いはグルコース脱水素酵素を
用いたときも同様な効果が認められた。

〈発明の効果〉本願発明は、以上のように構成したから解糖阻止作用を
有するＤ−マンノースを使用しても、Ｄ−グルコースが
混入することがなく、血糖及びグルコース反応系を利用
した他の生化学的測定に干渉を与えない血液試料を提供
できるという効果を有する。

【図面の簡単な説明】

図面は、解糖阻止剤を使用した血液中の血糖値を示すグ
ラフである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】不純物（夾雑物）として微量のＤ−グルコ
ースを含有するＤ−マンノースに対して、ピラノース酸
化酵素、グルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいず
れか一種、またはこれらを組み合せて作用させて、Ｄ−
グルコース含有量をＤ−マンノースに対して0.5重量％
以下としたＤ−マンノースを血液に添加することを特徴
とする解糖を阻止する方法。
【請求項２】不純物（夾雑物）として微量のＤ−グルコ
ースを含有するＤ−マンノースに対して、ピラノース酸
化酵素、グルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいず
れか一種、またはこれらを組み合せて作用させて、Ｄ−
グルコース含有量をＤ−マンノースに対して0.5重量％
以下としたＤ−マンノースに、必要に応じて血液凝固阻
止剤または血液凝固促進剤を添加することを特徴とする
解糖阻止剤の製造方法。
【請求項３】マンナンを加水分解した後、この加水分解
液を精製してＤ−マンノースを製造し、このＤ−マンノ
ースを血液に添加して解糖を阻止する方法において、Ｄ
−マンノースの不純物（夾雑物）として含まれるＤ−グ
ルコース含有量をＤ−マンノースに対して２重量％以下
まで精製した粗Ｄ−マンノースに対し、ピラノース酸化
酵素、グルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれ
か一種、またはこれらを組み合せて作用させて、Ｄ−グ
ルコース含有量をＤ−マンノースに対して0.5重量％以
下としたＤ−マンノースを血液に添加することを特徴と
する解糖を阻止する方法。
【請求項４】次の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）工程を順次経
て製造される解糖阻止剤の製造方法において、（Ｂ）工
程に対し、この工程における精製中のＤ−マンノースの
純度が、不純物としてＤ−グルコースをＤ−マンノース
に対して２重量％〜0.5重量％含有する範囲に達したと
き、この粗Ｄ−マンノースに対し、ピラノース酸化酵
素、グルコース脱水素酵素、グルコキナーゼのいずれか
一種、またはこれらを組み合せて作用させ、Ｄ−グルコ
ース含有量をＤ−マンノースの0.5重量％以下とする工
程を付加することを特徴とする解糖阻止剤の製造方法。（Ａ）工程：マンナンを加水分解する工程（Ｂ）工程：（Ａ）工程により得られる加水分解液を常
法（再結晶法）により精製してＤ−マンノースを製造す
る工程（Ｃ）工程：（Ｂ）工程により得られるＤ−マンノース
に必要に応じて血液凝固阻止剤または血液凝固促進剤を
添加する工程