JPH0780914B2 - ヒト腫瘍壊死因子に対する抗体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト型腫瘍壊死因子に対して特異性があるモ
ノクロナル抗体に関する。

従来、ある抗原に対する特異抗体の取得は、抗原で免疫
した動物から抗血清を得ることにより達成されてきた。
しかし、この抗血清中の特異抗体は、他の抗体群との混
合状態にあり、必要な特異抗体を他の抗体群から分離す
ることは非常に困難である。また、得られた特異抗体
も、異なる抗原決定基に対して反応する性質の異なる特
異抗体の混合物である。さらに、一つの抗原決定基に対
しても結合力の異なる種々の特異抗体が産生されてく
る。以上の理由から、従来の抗血清からの特異抗体と抗
原との反応は混合反応であり、用途上種類の制限をうけ
てきた。

分子生物学の分野における研究は、現在では上記の諸問
題を解決しうる抗体の代替源を提供している。リンパ球
細胞と哺乳動物（例えばマウスやラツト）に由来する骨
髄腫細胞との間の融合は、試験管内において増殖し、複
製可能な雑種細胞を産み出すことができるということ
（コーラーとミルシヤタイン、ネイチヤー、256巻、495
〜497頁、1975年参照）が発見されている。このような
雑種細胞は、予め決つた特異性のある抗体を分泌すると
いう特性を有する。この特異性というのは、融合に関与
したリンパ球によつて産生された抗体の持つ特異性であ
る。雑種細胞は、クロン化し、また安定な培養条件下で
培養を続けることにより、ある抗原決定基に対してのみ
特異性をもつた抗体を含む試料を無限に産生し続ける。
このようにして産生された抗体は、当該技術分野におい
てモノクロナル抗体として知られている。

上述した雑種細胞を造り出す一般的方法としては、哺乳
動物（通常にはマウスかラツトであるが、必ずしもこの
２者には限らない）に抗原を投与し、免疫し、抗原に対
し抗体を分泌する白血球細胞を多く産生させるのに充分
な抗原投与回数と免疫時間の経過ののち、動物を殺し、
脾臓細胞の懸濁液を調製する。これらの細胞と骨髄腫細
胞との融合は、融合促進剤（例えば、ポリエチレングリ
コール）の存在下で両者を接触させることによつて達成
される。極く僅かの細胞だけが融合して雑種細胞ができ
る。免疫反応の結果として、異なる抗原決定基に対し
て、それぞれ抗体を分泌している複数の異なるリンパ球
ができ、これらの形質は雑種細胞へ遺伝的に伝達されて
ゆく。慎重なスクリーニングを行うことによつて、培養
雑種細胞群の中から所望の特異性を持つた抗体を分泌す
る細胞を分離することができる。このような細胞はクロ
ン化して培養しうる。

この技術の利点は、免疫させる抗原又は免疫物質に含ま
れる抗原性のある不純物中の、他の抗原決定基に対応す
る抗体を含まない、特異性のある抗体源を提供すること
にある。

本発明は、ヒト型腫瘍壊死因子（以下ヒトTNFという）
に対するモノクロナル抗体に関する。ヒトTNFは網内系
賦活化作用を有する種々の物質、例えば各種グラム陽性
菌やエンドトキシンによつて、マクロフアージ系細胞群
より誘導されることが知られている。

網内系賦活化作用を有する種々の物質により誘導され、
抗腫瘍細胞能力などの生理活性を有する物質の存在は多
数報告されている。例えばCarswellらは、CD−1 Swiss
マウスにBacillus Calmette Gurin（BCG）を投与し、
その２週間後にエンドトキシンを静脈内注射して得られ
る該マウスの血清が、培養した細胞に対して殺細胞作用
を有すること、およびMeth A sarcomaで担癌させた（BA
LB/C×5.7BL/6）F₁マウスの腫瘍を出血性壊死に至らし
める現象を見出し、TMFと名づけた〔Proc.Nat.Acad.Sc
i.USA 72巻（No.9）、3666頁、（1975年）〕。その後、
Reedら〔J.Immunol.125巻（No.4）、1671頁、（1980
年）〕およびMattewsら〔Br.J.Cancer42巻、416頁、（1
980年）〕は、前記Carswellらの方法に準じて調製した
ウサギ血清からTNFの精製を試みて、それぞれ原血清に
比べて約2000倍および約1000倍精製されたものを得てい
る。しかし、いずれの場合にも精製されたものに関して
は動物実験において抗腫瘍効果を確認していない。また
Ruffら〔J.Immunology115巻、395頁、（1975年）〕は、
ヒト末梢血単球および骨髄性単球性白血病患者由来の白
血病細胞より、TNF様の活性を有する因子を見出したと
の報告をしているが、動物実験における抗腫瘍効果すら
確認されていないなど、その本体については明確ではな
い。

本発明者らは、ヒト由来の活性化マクロフアージを含む
組織培養系に誘発される、制癌作用を有する蛋白性の生
理活性物質について鋭意研究を続けていたが、分子量約
4.0万、等電点約6.0の優れた抗腫瘍活性を有する新しい
蛋白性生理活性物質を見出し、発明を完成するに至り、
すでに出願を行つている。

この抗腫瘍活性を有する生理活性物質、すなわち、ヒト
TNFはきわめて微量で強い生理活性を有するために、大
きな注目をあつめ、その分離精製および定量分析の手段
として、特異抗体の獲得が望まれていたが、TNFは種特
異性が少ないために抗原性が低く、精製度の低いTNFを
抗原として用いた場合には、特異的な反応性を有するモ
ノクロナル抗体を得ることはできなかつた。

本発明者らは、ヒトのTNFに対して特異的な抗体を得る
ために種々の検討を行なつた結果、精製したヒト型TNF
を抗原としてマウスを免疫することにより、抗体産生細
胞を得、該細胞と骨髄腫細胞との雑種細胞により、はじ
めて、ヒトのTNFに対して特異性を有するモノクロナル
抗体を安定に製造できることを見出して、本発明を完成
した。

すなわち、本発明は、少なくとも下記の性質を有するヒ
ト型腫瘍壊死因子に対しては反応し、ウサギ、マウス、
モルモット及びハムスター由来の腫瘍壊死因子に対して
は該腫瘍壊死因子のそれぞれとの共存下でＬ−Ｍ細胞障
害活性を阻害しないモノクロナル抗体に関するものであ
る。

１）ヒトマクロファージ細胞により産生される蛋白質で
ある。

２）分子量 40,000±4,000（ゲル濾過法） 20,000±4,000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法） ３）Ｌ−Ｍ細胞に対して細胞障害活性を有する。

４）meth A sarcoma担癌マウスに対して、出血性壊死反
応を起こさせる。

本発明にかかるモノクロナル抗体は、TNFの分離精製や
イムノアツセイなどに使用てできる。

以下、細胞融合方法について具体的に説明を加える。

（ａ）抗体産生細胞の調製 抗体産生細胞き調製は常法に準じて行えばよい。すなわ
ち、抗原である、ヒトTNFで動物を免疫し、その動物の
抗体産生細胞を取得する方法によればよい。

動物としては、マウス、ラツト、ウサギ、モルモツト、
ヒツジ、ウマ、ウシなどが例示され、抗体産細胞として
は脾細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞などが使用され
る。

（ｂ）骨髄腫細胞の調整 細胞融合方法において使用される骨髄腫細胞には特に限
定はなく、多くのマウス、ラツト、ウサギ、ヒトなどの
動物の細胞株が適用できる。使用する細胞株は好ましく
は薬剤抵抗性のものであつて、未融合の骨髄腫細胞が選
択培地で生存できず、雑種細胞のみが増殖するようにす
べきである。最も普通に用いられるものは、８−アザグ
アニン抵抗性の細胞株で、これはヒポキサンチン・グア
ニン・ホスホリボシル・トランスフエラーゼを欠損し、
ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（HAT）培
地中では生育できない性質を有する。また、使用する細
胞株はいわゆる「非分泌型」のものであることが好まし
い。たとえば、マウス骨髄腫株MOPC−21由来のP₃/X63−
Ag8U1（P₃U1）、P₃/X63−Al・６・５・３、P₃/NS1−１
−Ag4−１、Sp2/O−Ag14、ラツト骨髄腫細胞210・RCY3
・Ag1・２・３などが好適に用いることができる。

（ｃ）細胞融合 通常イーグル最少基本培地（MEM）、ロズウエル・パー
ク・メモリアル・インステイチュート（RPMI）1640培地
などの培地中で１〜５×10⁷個の骨髄腫細胞と抗体産生
細胞１〜５×10⁸個を混合（混合比は通常1:4〜1:10）、
細胞融合が行われる。融合促進剤としては、平均分子量
が1,000〜6,000のポリエチレングリコール（PEG）が好
ましいが、他にウイルスなども使用できる。PEGの使用
濃度は通常30〜50％である。

（ｄ）雑種細胞の選択的増殖 細胞融合を終えた細胞は、20％ウシ胎児血清含有RPMI16
40培地などで適当に希釈し、マイクロタイタープレート
に10⁵〜10⁶程度に植えつける。各ウエルに選択培地（た
とえばHAT培地）を加え、以後適当に選択培地の交換を
行ない、培養する。骨髄腫細胞として８−アザグアニン
抵抗性株を用いれば、未融合の骨髄腫細胞はHAT培地中
では10日目ぐらいまでに全部死滅し、また抗体産生細胞
は正常細胞なのでインビトロ（in vitro）では長時間生
育できない。したがつて、培養10〜14日ぐらいから生育
してくるものはすべて雑種細胞である。

（ｅ）抗体産生雑種細胞の検索 雑種細胞のスクリーニングは常法によればよく、特に限
定はない。たとえば、雑種細胞の増殖したウエルの上清
の一部を採取し、ヒトTNF又は固定化ヒトTNFと反応させ
たのち、酵素、ラジオアイソトープ、螢光物室、発光物
質で標識した第２抗体との反応によつて、標識量を測定
し、抗ヒトTNF抗体の存在を検定することができる。

（ｆ）クローニング 各ウエル中には２種以上の雑種細胞が生育している可能
性があるので、限界希釈法などにより、クローニングを
行ない、モノクロナル抗体産生雑種細胞を取得する。

（ｇ）抗体取得 最も純粋なモノクロナル抗体は、所望の雑種細胞を10％
程度のウシ胎児血清を含むRPMI1640培地などの適当な培
養液で培養し、その培養上清液から得ることができる。

一方、さらに大量の抗体を取得するためには、骨髄腫細
胞の由来動物と同系の動物にプリスタン（2,6,10,14−
テトラメチルヘンタデカン）などの鉱物油を復腔内投与
し、その後雑種細胞を投与することにより、インビボ
（in vivo）で雑種細胞を大量に増殖させればよい。こ
の場合、10〜18日位で腹水腫瘍を形成し、血清および腹
水中に高純度の抗体が生ずる。

ここで、本発明にいう抗原ヒトTNFとは、下記に示すア
ミノ酸組成を有する。

アミノ酸 含有量（モル％） アスパラギン＋アスパラギン酸 7.8 トレオニン 3.6 セリン 8.2 グルタミン＋グルタミン酸 12.9 グリシン 7.1 アラニン 8.5 バリン 7.8 シスチン 1.4 トリプトフアン 1.4 イソロイシン 5.0 ロイシン 11.4 チロシン 4.6 フエニルアラニン 2.7 リジン 3.9 ヒスチジン 2.0 アルギニン 5.3 プロリン 6.5 ポリペプチドのサブユニツトからなく構造を有し、か
つ、下記特性を有する蛋白質である。

ａ）分子量40,000±4,000（ゲル濾過法） 20,000±4,000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法） ｂ）等電点 6.0±0.5（等電点電気泳動法） ｃ）本文定義のＬ−Ｍ細胞を用いる評価における比活性
が１×10⁶単位/mg蛋白質 更に、本発明き物質は、実験例４に記載のMeth A sarco
ma担癌BALB/C系マウスを用いる生物評価において、１匹
当り100〜200単位を腫瘍内に投与した場合の活性が
（＋）以上である。

本発明におけく抗原ヒトTNFは、ヒト由来活性化マクロ
フアージより誘導される。ヒト由来活性化マクロフアー
ジとは脾臓または肺組織マクロフアージなどの組成マク
ロフアージ、分化誘導能を有する物質共存下で培養した
末梢血単球もしくはある種の骨髄性単球性白血病患者の
白血病細胞から樹立された株細胞などを用いることがで
きく。株細胞としてはHL−60細胞〔Nature270巻、347頁
（1977年）〕THP−１細胞（Int.J.Cancer26巻、171頁
（1980年）〕などがあげられる。分化誘導能を有する物
質としては12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−13−
アセテート、ホルボール−12,13−ジデカノエート、ホ
ルボール−12,13−ジベンゾエートなどのホルボールエ
ステル類、メゼレインなどのジテルベン類、テレオシジ
ン、ビタミンＡ酸、ビタミンＡアルコールなどのビタミ
ンＡ誘導体、ジメチルスルホキシド、ペプトンまたはカ
ゼイン加水分解物などが好適に用いられる。

本発明における活性化マクロフアージはグラム陰性菌由
来のエンドトキシンもしくはグラム陽性菌または酵母の
菌体壁を共存下に培養することによりヒトTNFをより多
量に産生する。

本発明における抗原を得るためのヒトTNFの好まし精製
法の骨子は、活性化マクロフアージの培養液を次の工程
に付すことである。

（１）電気泳動的等電点分画法 （２）塩基性陰イオン交換体クロマトグラフイー （３）ゲル濾過 （４）アフイニテイクロマトグラフイー （５）ゲル濾過 抗原物質として精製したヒトTNFの物性は、以下に記載
する実験方法１〜８の各方法によつて測定したものであ
る。

実験方法 １）分子量測定法 Ａ）セフアクリルＳ−200（フアルマシア社製、スエー
デン）のカラム（1.5×100cm）を用い、0.1M塩化ナトリ
ウム/50mMリン酸緩衝液（pH7.4）にてゲル濾過を行つた
ところ、分子量は40,000±4,000であつた。

Ｂ）Segrestらの方法〔Method in Enzymology28−Ｂ
巻、54頁（1972年）〕に従い、トリス／グリシン/SDS
（pH8.3）でSDS/ポリアクリルアミドゲルに10μｇの試
料を付与し、電気泳動を行つたところ、分子量20,000±
4,000の位置に、染色バンドと活性を示した。

２）等電点測定法 アトー株式会社製の等電点電気泳動装置（SJ−1071EC
型）を用い、フアルマライト（ファルマシア社製、pH4
〜6.5）とグリセロールを含む５％ポリアクリルアミド
平板ゲル（厚み1mm、長さ10cm、巾10cm）を作成した。
陽極側に0.04M、DL−グルタミン酸、陰極側に0.2M、Ｌ
−ヒスチジンを使用して、700Vで50分間の前泳動を行つ
た。続いて試料50μｇを付与し、700Vで１時間、500Vで
16時間泳動を行つた。泳動終了後ゲルを2.5mm巾で切出
し、次いで各ゲル片を0.15M塩化ナトリウムを含む0.02M
トリス−塩酸緩衝液（pH8.2）0.2mlで抽出し、各抽出液
についてＬ−Ｍ細胞を用いた活性評価を行つたところ、
ヒトTNFの等電点は6.0±0.5であつた。

３）Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価 Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価は、Ruff〔Lymphokine Rep
orts 2巻、E.Pick編集、Academic Press 235頁（1980
年）〕あるいは（J.Immunol.126巻、235頁（1981年）〕
の方法に準じ、本発明者らが改良したものであり、本発
明による生理活性物質がＬ−Ｍ細胞（アメリカン・タイ
プ・カクチヤー・コレクシヨン、CCL1.2）を殺す効果を
測定するものである。すなわち、順次培地で希釈した試
料0.1mlと10⁵コ/mlの濃度のＬ−Ｍ細胞の培地懸濁液0.1
mlを96穴の組織培養用マイクロプレート（フロー・ラボ
ラトリー社）に加えた。培地は1V/V％のウシ胎児血清を
含むイーグルのミニアム・エツセンシヤル培地（その組
成は、たとえば、「組織培養」中井準之助他編集、朝倉
書店、1967年に記載されている）を用いた。マイクロプ
レートを５％の炭酸ガスを含む空気中、37℃で48時間培
養した。培養終了後、グルタルアルデヒド20μｌを加え
細胞を固定した。固定後、マイクロプレートを洗滌、乾
燥して、0.05％メチレンブルー溶液を0.1ml加え、生き
残つた細胞を染色した。余分なメチレンブルーを洗い流
し乾燥した後、残つたメチレンブルーを0.36N塩酸溶液
で抽出し、その665nmにおける吸光度をタイターテツク
・マルチスキヤン（フロー・ラボラトリー社）で測定し
た。この吸光度は、生き残つた細胞数に比例する。Ｌ−
Ｍ細胞の50％を殺すために必要な生理活性量を１単位/m
lと定義し、試料を加えない対照の吸光度の50％の血に
相当する試料の希釈率を、グラフあるいは計算によつて
求め、その希釈率の逆数を試料の生理活性量（単位/ml
で表記する）とした。

一方、蛋白質量は、Branfordらの方法〔Anal.Biochem.7
2巻、248頁（1976年）〕により、クーマシー・ブリリア
ント・ブルーG250を用いる色素結合法から算出した。

本発明における抗原ヒトTNFの比活性は、１×10⁶単位/m
g蛋白質であつた。

４）Meth A sarcoma担癌マウスを用いる活性評価 BALB/Cマウスの腹部皮内に２×10⁵コのMeth A sarcoma
細胞を移植し、７日後移植した腫瘍の大きさが直径７〜
8mmとなり、出血性壊死がなく良好な血行状態にある腫
瘍を有するマウスを選び、腫瘍内に生理食塩水で希釈し
た0.05mlの試料を注射し、24時間後に次の判定基準に則
り壊死反応の測定を行つた。

（−）：変化なし （＋）：かすかな出血性壊死 （）：中等度の出血性壊死 （移植癌表面の真中から50％以上にわたつて壊死） （）：顕著な出血性壊死 （移植癌の中央部が重度に壊死し、周囲の癌組織がわず
かに残つた状態） また、試料投与後20日目に癌が完全に退縮したかどうか
を観察し完治率を求めた。

以上の方法により測定したヒトTNFの活性を下表に示
す。

５）アミノ酸組成決定 本発明におけるヒトTNFを用いて次の検討を行なつた。

試料調製用の厚み1mm、長さ11cm、巾15cmのポリアクリ
ルアミド15％を含むSDS−ポリアクリルアミド平板ゲル
を作成した。作成法の詳細は、アトー株式会社「スラブ
型SDS−アクリルアミドゲル電気泳動」のパンフレツト
によつた。装置はアトー株式会社製SJ−1060・SDH型を
用いた。

該平板ゲル１枚当り、本発明におけるヒトTNFを400μｇ
付与した。付与に際して前処理として、１％SDS水溶液1
00μｌと40％蔗糖水溶 該平板ゲル１枚当り、ヒトTNFを200μｇ付与した。付与
に際して前処理として、１％SDS水溶液100μｌと40％蔗
糖水溶液50μｌに200μｇのヒトTNFを含む500μｌの水
溶液を混合し、50℃30分の熱処理を行なつた。電気泳動
は150V定電圧で、４時間30分を要した。この操作を５回
くりかえして行つた。泳動後、一部をクーマシー・ブリ
リアント・ブルーG250で５分間染色を行ない、脱色後明
瞭に見える染色バンドを中心に2.5mm間隔で５本に切出
しを行なつた。次いで１％の重炭酸アンモニウム1.5ml
の中に該ゲル片を浸漬して、４℃24時間抽出を行なつ
た。抽出後、ピペツトにて抽出液を取り出し、同液で洗
滌を行なつて、各2.5mlずつの抽出液を５スライス分、
取得した。得られた抽出液は、確認のためＬ−Ｍ細胞を
用いる活性評価を行なつた。中心のバンドの部分に活性
の多くが回収された。

該抽出試料溶液をセフアデツクスG25のカラム（0.9×10
cm）に付し、脱塩を行なつた。次いでトミー精工社製、
遠心真空乾燥機コンセントレーター（EC−10）を用い
て、25℃、２時間1,500rpmで乾燥を行ない、アミノ酸組
成用分析試料とした。

試料を真空中にて、4Mメタンスルホン酸で110℃、24時
間加水分解を行ない、高速アミノ酸分析計（日立、835
型）を用いてアミノ酸組成（モル％）を測定した。

なお、システインは加水分解後、空気酸化してシスチン
に変換した。

ヒトTNFのアミノ酸組成は以下に示すごとくの血であつ
た。

アミノ酸 含有率（モル％） アスパラギン＋アスパラギン酸 7.8 トレオニン 3.6 セリン 8.2 グルタミン＋グルタミン酸 12.9 グリシン 7.1 アラニン 8.5 バリン 7.8 シスチン 1.4 トリプトフアン 1.4 イソロイシン 5.0 ロイシン 11.4 チロシン 4.6 フエニルアラニン 2.7 リジン 3.9 ヒスチジン 2.0 アルギニン 5.3 プロリン 6.5 以上説明したように、本発明におけるヒトTNFは極めて
優れた抗腫瘍効果を有し、その作用は種特異性が少な
く、しかも広範囲な効果を持ち、加えて毒性がほとんど
認められないことから、極めて有用な抗腫瘍剤として期
待できるものである。

上述のヒトTNFは種特異性が少ないために、抗原性に乏
しく、抗体を得ることが困難であつたが、不純物をでき
るだけ除去し、高度に精製したヒトTNFを用いることに
よつて、はじめてヒトTNFに対するモノクロナル抗体を
作成することが可能となつた。

本発明によれば、ヒト型腫瘍壊死因子（ヒトTNF）に対
して特異性があることを特徴とするモノクロナル抗体が
雑種細胞系によつて提供される。

本発明を下記の実験結果によつて説明するが、これらは
例示であつて、本発明がこれらに限定されるものではな
いことは当然である。

実施例 抗原の精製 THP−１細胞を1.5×10⁶個/mlの濃度にて、５％牛胎児血
清含有RPMI−1640培地に分散させたのち、径10cmのプラ
スチツク・シヤーレに20mlずつ分注した。37℃に加温し
た該細胞溶液に、12−Ｏ−テトラデカノイルホルボール
−13−ジアセテートおよびビタミンＡ酸をそれぞれ最終
濃度１μg/mlおよび0.5μg/mlとなるように添加し、５
％炭酸ガス培養器中にて、37℃、１時間培養した。

１時間後、シヤーレ中の培養液を除去し、0.5μg/mlビ
タミンＡ酸、100mg/mlポリペプトンを含有する５％牛胎
児血清−RPMI−1640培地20mlで置換え、あらに24時間37
℃にて培養を行つた後、培地を除去し、20mlのRPMI−16
40培地20mlに置換し、72時間さらに培養を継続した。

その後、培養液を集め、3000rpmにて30分間、遠心処理
を行つて、細胞沈渣を除去したのち、Ｌ−Ｍ細胞に対す
る細胞障害性を検討し、180単位/mlの活性を有する培養
液を得た。

つぎに培養液4lの精製実験例を例示する。

精製工程１（等電点電気泳動） 該培養液4lを、限外濾過法にて10倍に濃縮したのち、Am
pholine 〔キヤリヤー・アンフオライツ（Carrier・Am
pholytes）〕（LKB社製、スウエーデン）−蔗糖密度勾
配カラム（440ml）ち添加したのち、約42時間通電し、
泳動を行つたのち、カラムの下端より細いチユーブでゾ
ーンを乱さないように約2ml/分の流速で分画した。

pH5.5〜6.5の分画を採取したのち、pHを約7.4に調整し
たのち、透析にて、Ampholine および蔗糖を除去し
た。

精製工程２（陰イオン交換クロマトグラフイー） 該分画液0.5lに2lの0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）
を加えた後、0.02M塩化ナトリウムを含む0.02Mトリス−
塩酸緩衝液（pH7.8）で充分に平衡化した塩基製陰イオ
ン交換体DEAE−セフアロースCL−6B（フアルマシア社
製）のカラム（10×90cm）に徐々に付した。次いで1.5l
のカラム平衡化緩衝液（0.02M塩化ナトリウムを含む0.0
2Mトリス−塩酸緩衝液、pH7.8）で洗浄した後、0.05M塩
化ナトリウムを含む0.02Mトリス−酢酸緩衝液（pH7.8）
１で洗浄後、0.1M塩化ナトリウムを含む0.02Mトリス
−塩酸緩衝液（pH7.2）を用いて溶出を行なつた。流速
は0.5l/hrとし、溶出液は50mlずつ分画して活性画分を
集めた。該活性画分に同容量の0.02Mトリス−塩酸緩衝
液（pH7.8）を加えて希釈した後、0.2l/hrの流速でDEAE
−セフアロースCL−6Bのカラム（10×13cm）に付した。

次いで0.05M塩化ナトリウムを含む0.02Mトリス−塩酸緩
衝液（pH7.8）2lを用いて、流速20ml/hrで洗浄を行なつ
た後、0.1M塩化ナトリウムを含む0.02Mトリス−塩酸緩
衝液（pH7.2）１を用いて、流速20ml/hrで溶出を行な
つた。溶出液は25mlずつ分画して活性画分を集めた。こ
の段階で活性の回収率は60％、精製度は300倍であつ
た。

精製工程３（ゲル濾過） 0.1M塩化ナトリウムを含む0.005Mリン酸緩衝液（pH7.
4）で充分に平衡化したセフアクリルＳ−200（フアルマ
シア社製）のカラム（５×80cm）に該濃縮液を付し、同
緩衝液にてゲル濾過溶出を行つた。流速は4ml/hrで、4m
lずつ分画して活性画分を採取し、活性画分を限外濾過
により濃縮した。精製工程１〜３を通しての活性回収率
は45％、精製度は４×10³倍であつた。

精製工程４（アフイニテイクロマトグラフイー） ゲル濾過によつて得られた活性画分の濃縮液をZn²⁺キレ
ートセフアロースカラムに付した。キレートセフアロー
ス（イミノジ酢酸固定化樹脂）を充填したカラム（1.6
×10cm）に、1mg/mlの塩化亜鉛水溶液60mlを流速10ml/h
rで流した。次いで0.1M塩化ナトリウムを含む0.05Mリン
酸緩衝液（pH7.4）で充分に平衡化した後、前工程で得
られた濃縮液を流速10ml/hrで付し、更に60mlの同緩衝
液で溶出した非吸着画分を採取した。Ｌ−Ｍ細胞に対す
る障害活性はこの画分にのみ回収された。

精製工程１〜４を通しての活性回収率は30％、精製度は
１×10⁴倍であつた。

精製工程５（ゲル濾過） 前精製工程で得られた活性画分を濃縮し、0.15M塩化ナ
トリウムを含む0.005Mリン酸緩衝液（pH7.4）で充分に
平衡化したトヨパールHW−55（東洋ソーダ株式会社）の
カラム（1.5×90cm）に付与した。同緩衝液にて流速4ml
/hrでゲル濾過溶出を行ない、活性画分を採取した。全
精製工程を通しての活性の回収率は20％、精製度は２×
10⁴倍であつた。このようにして得られたヒトTNFの比活
性は８×10⁵単位/mg蛋白質であつた。

上述のごとく精製したヒトTNFはセルロースアセテート
膜電気泳動にてγ−グロブリン領域に泳動された。また
ヒトTNFは各種レクチン固定化樹脂（ConA−セフアロー
ス、WGA−セフアロース（以上 フアルマシア社製）、R
CA−Ｉ−ゲル、UEA−Ｉ−ゲル、LPA−Ｉ−ゲル（以上
E.Y.ラボラトリー社製））に対して吸着性を示さなかつ
た。

さらに、このようにして得られたヒトTNFは、各種同系
移植マウス癌およびヌードマウス移植ヒト癌に対して腫
瘍内および静脈内投与において優れた制癌効果を示し
た。すなわち、マウス由来の結腸癌Colon26を移植したB
ALB/C系マウスあるいは神経芽腫Neuro2aを移植したＡ系
マウスに、ヒトTNF5,000〜10,000単位を１回ないし３回
静脈内投与した試験において、対照群（生理食塩水投与
群）に比して有意な癌の増殖抑制と退縮が認められた。
また、ヒト由来の肺癌PC−10、神経芽腫GOTOを移植した
BALB/C系ヌードマウスに、ヒトTNF10,000〜30,000単位
を１回ないし７回静脈内投与した試験において、対照群
（生理食塩水投与群）に比して有意な癌の増殖抑制と退
縮が認められた。

動物の免疫 上述のごとく精製したヒトTNF100μｇを、フロイント・
コンプリート・アジユバントに乳濁化させ、マウスBALB
/C♂群の皮下に２週間の間隔をあけて投与し、免疫を行
なつた。

これらのマウス中で、最も高い血清抗ヒトTNF抗体価を
もつたマウスにヒトTNF100μｇを静脈内注射し、免疫を
完了した。

細胞融合 最終免疫の３日後に、マウスを殺し、脾臓を取り出し、
細断したのちステンレスメツシユにて濾過することによ
つて得た脾細胞をイーグルのミニマルエツセンシヤル培
地（MEM）で３回洗浄し、マウス骨髄腫細胞（P₃/X63−A
g8U1）をMEMで１回洗い、脾細胞と骨髄腫細胞とを10:1
て混合して遠心後、ペレツトに44％ポリエチレングリコ
ール2000、MEM溶液1mlを徐々に加え、１分間遠心管をゆ
つくり回転させて細胞融合を行つた。１分後MEM1mlを加
えてゆつくり回転させ、さらに30病ごとにMEMを1mlづつ
加えて最終的に8mlとした。再び遠心し、ペレツトを20
％ウシ胎児血清含有ロズウエル・パーク・メモリアル・
インステイチユート（RPMI）1640培地に骨髄腫細胞とし
て５×10⁴個/0.1mlになるように懸濁し、96ウエルマイ
クロプレートに0.1mlづつ植えつけた。

１日後、HAT培地を各ウエルに0.1mlづつ添加し、その後
３〜４日ごとに半分量をHAT培地で交換したところ、７
日目ぐらいからいくつかのウエルで雑種細胞の生育が認
められ、２〜３週間後にはほぼ全ウエルで雑種細胞が増
殖した。

抗体産生細胞の検索とクローニング 雑種細胞の生育してきたウエルの培養上清0.1mlをと
り、ポリスチレン製の96穴マイクロプレート上に固定し
たヒトTNFとインキユベーシヨンし、これと結合するも
のを探したところ、５〜10％の確率でヒトTNFに対して
結合能をもつ抗体を分泌しているウエルを認めることが
できた。結合能の高いものをいくつか選び、96ウエルマ
イクロプレートに１個／ウエルの濃度で細胞を植えつけ
る限界希釈法によりクローニングを行ない、８個のクロ
ーンが得られた。

クローニングした細胞を10％ウシ胎児血清含有RPMI−16
40培地を用いて96ウエルプレート→24ウエルプレート→
25cm²フラスコとスケールアツプして培養し、培養上清
を集めた。

各上清を、1,000単位/mlのヒトTNF溶液と混合したの
ち、Ｌ−Ｍ細胞を用いる活性評価を行なつたところ、１
クローンのみがヒトTNFの活性を阻害した。この雑種細
胞はP3TTと名づけた。この細胞は液体窒素温度にて保存
可能であつて、本発明者は常に保存している。（さら
に、通産省工業技術院微生物工業技術研究所に寄託を申
請したが、受託を拒否された。） 次に、２×10⁶個以上の細胞を、プリスタン0.5mlで予じ
め処理したマウスBALB/C腹腔内に投与し、腹水腫瘍をつ
くらせて腹水を採取した。この腹水は１万倍希釈におい
ても100単位のヒトTNFのＬ−Ｍ細胞に対する細胞障害活
性を完全に抑制した。

またP3TT由来の抗体は、ヒトの肺マクロフアージから得
られる抗腫瘍活性物質の活性（Ｌ−Ｍ細胞障害活性にて
評価）を抑制するのに対して、ウサギ、マウス、モルモ
ツト、ハムスターに由来するTNFのＬ−Ｍ細胞の障害活
性は全く抑制しなかつた。

以上、詳細に述べてきたように、本発明にかかるP3TTに
由来するモノクロナル抗体はヒトTNFに対して特異的に
反応するものであつて、ヒトTNFの分離精製に応用可能
であるのみならず、酵素やラジオアイソトープを用いた
イムノアツセイにてヒトTNFの定量分析に広く応用可能
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 １．Ｋｏｒｅａｎ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，11〔１〕（1979）Ｐ．１−９ ２．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，42 〔１〕（1983）Ｐ．385−393 ３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ．ＵＳＡ，80〔17〕（1983）Ｐ．5397 −5401 ４．Ｎａｔｕｒｅ，256（1975）Ｐ．495 −497

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】少なくとも下記の性質を有するヒト型腫瘍
   壊死因子に対しては反応し、ウサギ、マウス、モルモッ
   ト及びハムスター由来の腫瘍壊死因子に対しては該腫瘍
   壊死因子のそれぞれとの共存下でＬ−Ｍ細胞障害活性を
   阻害しないモノクロナル抗体。 １）ヒトマクロファージ細胞により産生される蛋白質で
   ある。 ２）分子量 40,000±4,000（ゲル濾過法） 20,000±4,000（SDS−ポリアクリルアミド電気泳動法） ３）Ｌ−Ｍ細胞に対して細胞障害活性を有する。 ４）Meth A sarcoma担癌マウスに対して、出血性壊死反
   応を起こさせる。