[go: up one dir, main page]

JPH0773504B2 - 選択成熟蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主内で合成する方法 - Google Patents

選択成熟蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主内で合成する方法

Info

Publication number
JPH0773504B2
JPH0773504B2 JP56052488A JP5248881A JPH0773504B2 JP H0773504 B2 JPH0773504 B2 JP H0773504B2 JP 56052488 A JP56052488 A JP 56052488A JP 5248881 A JP5248881 A JP 5248881A JP H0773504 B2 JPH0773504 B2 JP H0773504B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
bacterial
polypeptide
protein
host
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP56052488A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS56154999A (en
Inventor
ウオルタ−・ギルバ−ト
カレン・タルマツジ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Harvard University
Original Assignee
Harvard University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22485649&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JPH0773504(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Harvard University filed Critical Harvard University
Publication of JPS56154999A publication Critical patent/JPS56154999A/ja
Publication of JPH0773504B2 publication Critical patent/JPH0773504B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の要約 選択成熟蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主の内部で
合成し、かつ宿主の膜を介して分泌する方法が開示され
る。
この方法は、 ａ） クローニング伝播体を切断して１）クローニング
伝播体の内部の細菌遺伝子またはフアージ遺伝子または
２）細菌遺伝子またはフアージ遺伝子のDNA断片のどち
らかのプロモータの後に切断部位を形成し、 ｂ） 選択蛋白質またはポリペプチドのシグナル配列を
含むところの選択蛋白質またはポリペプチドの先駆体を
暗号づけ（コード）する非細菌性DNA断片を切断部位の
中に挿入することにより雑種遺伝子を形成し、 ｃ） 雑種遺伝子によつて宿主を転換し、 ｄ） 転換した宿主を培養して、選択蛋白質またはポリ
ペプチドを分泌する、 ことを包含する。
この方法によつて、蛋白質またはポリペプチドにシグナ
ル配列またはｆ−メトのような他の化学的置換体のない
成熟蛋白質またはポリペプチドを生産することができ
る。
発明の分野 本発明は、一般的に選択蛋白質またはポリペプチドを細
菌宿主の内部で合成し、宿主の膜を介して分泌する方法
に関するものである。蛋白質またはポリペプチドは、例
えば、真核性の細胞蛋白質、例えば、プロインシユリ
ン、血清アルブミン、ヒト生長ホルモン、上皮小体ホル
モンおよび／またはインターフエロンである。
本発明は、更に特別には細菌宿主から成熟蛋白質または
ポリペプチドを得る方法に関し、これにより、蛋白質ま
たはポリペプチドを更に処理して、細菌宿主によつて合
成する時蛋白質またはポリペプチド先駆体に存在するシ
グナル配列またはｆ−メト（すなわち、最初のメチオニ
ン基のホルムアルデヒド基）のような他の化学的置換を
除去する必要が避けられる。
背景技術 スペイン国特許第481362号及びヴイラーコマロフ等、P.
N.A.S.第75巻第3727〜3731頁（1978年）によると、選択
蛋白質またはポリペプチドを下記方法により細菌宿主の
内部で合成し、そして宿主の膜を介して排泄することが
できる。
細胞外の蛋白質またはポリペプチド、またはペリプラス
ム担体の蛋白質またはポリペプチドを暗号づけした細菌
遺伝子内のクローニング伝播体を切断し、 その切断部位の中に選択蛋白質またはポリペプチドを暗
号づけする非細菌性DNA断片を挿入することにより雑種
遺伝子を形成し、 転換宿主を培養して選択蛋白質またはポリペプチドを分
泌する。
この方法で製造した選択蛋白質またはポリペプチドの問
題は、融合した蛋白質またはポリペプチドとして得られ
ることであり、すなわち選択蛋白質またはポリペプチド
は融合されて細菌担体蛋白質またはポリペプチドとなつ
ている。
この結果、細菌担体蛋白質またはポリペプチドの含まれ
ない選択蛋白質またはポリペプチドを得るためには、細
菌担体蛋白質またはポリペプチドから選択蛋白質または
ポリペプチドを開裂する追加処理が必要とされる。
上述の問題の解決の一提案は、特異アミノ酸のコドンを
選択蛋白質またはポリペプチドのための非細菌性DNA断
片の前面で直接クローニングすることにより、融合細菌
担体蛋白質またはポリペプチドを除去して、そして転換
宿主によつて製造する時に選択蛋白質またはポリペプチ
ドの特異アミノ酸を化学的に開裂させることであつた。
板倉等、サイエンス第198巻第1056−1063頁（1977
年）。
しかし、特異アミノ酸を含まない選択蛋白質またはポリ
ペプチドを得るには別の追加処理を必要とし、この方法
は特異アミノ酸を含まない選択蛋白質またはポリペプチ
ドを製造するために使用することはできない。その理由
は、かかる特異アミノ酸を化学的に開裂することによ
り、蛋白質またはポリペプチドが破壊されるであろうか
ら。
この問題の解決のもう１つの提案は、非細菌性DNA断片
は細菌性DNAの翻訳開始シグナル（ATG）の直接後ろに存
在するように、細菌遺伝子のDNAを都合よく調整するこ
とである。しかし、この方法は細菌宿主中にｆ−メトを
含む選択蛋白質またはポリペプチドを生産し、選択成熟
蛋白質またはポリペプチドそのものを得るためには更に
処理を必要とする。
発明の概要 上述の問題を解決するため、この発明においては、本発
明者等は、選択蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主内
部で合成し、そして宿主の膜を介して分泌する方法にお
いて、クローニング伝播体を切断して切断部位を形成
し、選択蛋白質またはポリペプチドを暗号づけする非細
菌性DNA断片を切断部位中に挿入することにより雑種遺
伝子を形成し、雑種遺伝子によつて宿主を転換し、そし
て転換宿主を培養して選択蛋白質またはポリペプチドを
分泌することから構成され、クローニング伝播体を切断
して切断部位を、クローニング伝播体中の細菌遺伝子ま
たはフアージ遺伝子またはこれらのDNA断片の後ろに形
成し、前記非細菌性DNA断片は選択蛋白質またはポリペ
プチドの先駆体を暗号づけし、前記転換宿主は成熟蛋白
質またはポリペプチドとして選択蛋白質またはポリペプ
チドを滲出することを特徴とする方法を提供するもので
ある。
この方法により、蛋白質またはポリペプチドにシグナル
配列またはｆ−メトのような他の化学的置換のない成熟
蛋白質またはポリペプチドを得ることができる。この点
に関連して、蛋白質またはポリペプチドは、蛋白質また
はポリペプチドの大きさによつて、細菌宿主細胞のペリ
プラスム間隙から、または宿主を培養する培地からのど
ちらかから回集できる。
発明の態様の詳細な説明 この詳細な説明においては、次の定義が適用される： 蛋白質 50個以上のアミノ酸の線状連続を含むポリペプ
チド、例えばプロインシユリン、血清アルブミン、ヒト
生長ホルモン、上皮小体ホルモン、及びインターフエロ
ンなど。
ポリペプチド 隣接するアミノ酸のアミノ基とカルボン
酸基の間のペプチド結合によつて互に結合されたアミノ
酸の線状連続。
蛋白質またはポリペプチドの先駆体 シグナル配列で宿
主細胞内で合成されたポリペプチドまたは蛋白質、例え
ばプリプロインシユリン、プリ血清アルブミン、プリヒ
ト生長ホルモン、プリ上皮小体ホルモン、及びプリイン
ターフエロン。この発明によると、成熟ポリペプチドま
たは蛋白質は、その先駆体のシグナル配列の付随的損失
または削除を伴なつて宿主細胞膜を介して分泌される。
ヌクレオチド 糖部分（ペントース）、燐酸エステル、
及び窒素性複素環式塩基からなるDNAまたはRNAのモノマ
単位。塩基は配糖体炭素（ペントースの１′炭素）を介
して糖部分に結合し、この塩基と糖の結合体がヌクレオ
シドである。塩基はヌクレオチドを特徴づける。４個の
DNA塩基はアデニン（“A"）、グアニン（“G"）、シト
シン（“C"）及びチミン（“T"）である。４個のRNA塩
基はＡ、Ｇ、Ｃ、及びウラシン（“U"）である。
DNA配列 隣接するペントースの３′及び５′炭素間に
燐酸ジエステル結合で互いに結合するヌクレオチドの線
状連続である。
コドン 伝令RNA（“mRNA"）を介して、アミノ酸、翻訳
開始シグナル、翻訳終了シグナルを暗号化する３個のヌ
クレオチド（トリプレツト）のDNA配列である。例え
ば、ヌクレオチドトリプレツトTTA、TTG、CTT、CTC、CT
A、及びCTGはアミノ酸ロイシン（“Leu"）の暗号化、TA
G、TAA、及びTGAは翻訳終了シグナル、そしてATGは翻訳
開始シグナルである。
プラスミド 非染色体２本鎖DNA配列であつて、プラス
ミドが宿主細胞内で複製されるように完全なレプリコン
より構成される。プラスミドが単細胞宿主生物の内部に
置かれると、その生物の特性はプラスミドのDNAのため
に変化または転換する。例えば、テトラサイクリン耐性
（TetR）遺伝子をもつたプラスミドは、以前テトラサイ
クリン感受性宿主細胞をテトラサイクリン耐性のものに
転換する。プラスミドで転換した宿主細胞は“トランス
フオーマント”と呼ばれる。
フアージまたは細菌性フアージ 細菌ウイルスであつ
て、多くは蛋白質エンペロープすなわち外皮（“カプシ
ド”）中にカプセル化されたDNA配列を含んでいる。
クローニング伝播体 宿主細胞内で複製することができ
るところのプロスミド、フアージDNA、または他のDNA配
列であつて、１個または少数のエンドヌクレアーゼ認識
部位を特徴とし、このエンドヌクレアーゼ認識部位のDN
A配列は、DNAの本質的生物学的機能、例えば複製、外皮
蛋白質の生産、あるいはプロモータまたは結合部位の損
失といつたものの付随的損失なしに限定的方法で切断さ
れ、そして転換細胞、例えば耐テトラサイクリンまたは
耐アンピシリンといつたものの識別の使用に適した標識
を含む。クローニング伝播体はまたベクタ（媒介体）と
しても知られている。
宿 主 クローニング伝播体により転換に際し、クロー
ニング伝播体が複製と、他の生物学的機能、例えばプラ
スミドの遺伝子のエクスプレツシヨンを介してポリペプ
チドまたは蛋白質の形成の完成とを可能にするところの
微生物。
エクセプレツシヨン ポリペプチドまたは蛋白質を形成
するに際し、遺伝子によつて経験される過程。それは転
写と翻訳の組合せである。
転 写 遺伝子によりmRNAを形成する過程。
翻 訳 mRNAにより蛋白質またはポリペプチドを形成す
る過程。
プロモータ RNAポリメラーゼが結合し、そして転写を
開始するところの遺伝子のDNAの領域。プロモータは遺
伝子のリゾソーム結合部位の前に位置する。
リボソーム結合部位 翻訳が開始できるように、mRNAが
リボソームに結合するのを助けるところのmRNA部位を暗
号づけする遺伝子のDNAの領域。リボソーム結合部位は
遺伝子のプロモータの後、翻訳開始シグナルの前に位置
する。
遺伝子 mRNAの鋳型として、特定ポリペプチドまたは蛋
白質に特有のアミノ酸の配列を暗号化するところのDNA
配列。遺伝子はプロモータ、リボソーム結合部位、翻訳
開始シグナルおよび構造DNA配列とを含む。分泌蛋白質
またはポリペプチドの場合、遺伝子はまたシグナルDNA
配列を含む。
エクスプレツシヨン調節配列 クローニング伝播体中の
dna配列であつて、これはクローニング伝播体の遺伝子
に作用的に結合される時、その遺伝子のエクスプレツシ
ヨンを調節し制御する。
シグナルDNA配列 ポリペプチドまたは蛋白質に対する
遺伝子内のDNA配列であつて、それはmRNAの鋳型とし
て、ポリペプチドまたは蛋白質のアミノ終端における疎
水性アミノ酸の配列、すなわちポリペプチドまたは蛋白
質の“シグナル配列”または“疎水性リーダ配列”を暗
号化する。シグナルDNA配列はポリペプチドまたは蛋白
質のための遺伝子中において、遺伝子の構造DNA配列の
直前、および遺伝子の翻訳開始シグナル（ATG）の後に
位置する。シグナルDNA配列はポリペプチドまたは蛋白
質の先駆体に特有であるところのポリペプチドまたは蛋
白質のシグナル配列を暗号づけする。蛋白質またはポリ
ペプチドの先駆体のシグナル配列の一部分のみが、宿主
の細胞膜を介して輸送される蛋白質またはポリペプチド
の先駆体として、及び分泌によつて成熟蛋白質またはポ
リペプチドを形成するための先駆体のシグナル配列の正
確な切り抜きの出現として、基本的なものであると考え
られる。それで、“シグナルDNA配列”という語は、宿
主細胞内部で生産される蛋白質またはポリペプチドの先
駆体のシグナル配列の基本的部分を暗号づけするDNA配
列を意味する。
構造DNA配列 遺伝子内のDNA配列であつて、それはmRNA
の鋳型として、特定成熟ポリペプチドまたは蛋白質、す
なわちポリペプチドまたは蛋白質の能動形に特有のアミ
ノ酸配列を暗号づけする。
この発明によると、蛋白質またはポリペプチドまたはRN
A分子のための細菌遺伝子またはフアージ遺伝子を、ま
たは細菌遺伝子またはフアージ遺伝子のプロモータを含
むような細菌遺伝子またはフアージ遺伝子のDNA断片を
含有し、切断されてプロモータの後に断片を形成するこ
とのできるクローニング伝播体ならどれでも使用するこ
とができる。好適には、クローニング伝播体は細胞外ま
たはペリプラスム蛋白質またはポリペプチド（正常な状
態では、すなわち正常では宿主細胞から分泌された蛋白
質またはポリペプチド）を暗号づけする細菌遺伝子また
はフアージ遺伝子またはこれらのDNA断片を含有する。
ここで、正常な状態では、すなわち正常では分泌される
蛋白質またはポリペプチドとは、正常な状態のもとでは
細胞から分泌され、細胞の外へ出てから機能する蛋白質
またはポリペプチドのことを意味し、これに対し、後述
する正常では分泌されない蛋白質またはポリペプチドと
は、正常な状態のもとでは細胞から分泌されず、細胞内
で機能する蛋白質またはポリペプチドのことを意味す
る。このような遺伝子の例として、耐抗生物質遺伝子、
例えば耐ペニシリン遺伝子（すなわちペニシリナー
ゼ）、耐クロラムフエニコール遺伝子、耐テトラサイク
リン遺伝子、アルカリ性ホスフアターゼ遺伝子、細菌性
リボヌクレアーゼ遺伝子が挙げられる。しかし、他の細
菌遺伝子またはフアージ遺伝子またはこれらのDNA断片
を含むクローニング伝播体もまた好適に使用することが
でき、例えばラクトーズオペロンプロモータ、ベータガ
ラクトシダーゼ（最初の2,3のアミノ酸内で切断される
という条件で）及びフアージまたはプラスミドの保有す
るフアージラムダPLが挙げられる。
更に、非細菌遺伝子及び非フアージ遺伝子のDNA断片
（“非細菌性DNA断片”）はどれでも、下記の条件下
で、これをクローニング伝播体中の切断部位の中に挿入
して雑種遺伝子を形成することができる。
非細菌性DNA断片は、 １） 選択蛋白質またはポリペプチドのための遺伝子の
完全な構造DNA配列と、遺伝子のシグナルDNA配列を含
み、それで非細菌性DNA断片は先駆体のシグナル配列を
含んで、選択蛋白質またはポリペプチドの先駆対を暗号
づけする。
２） 遺伝子の翻訳開始シグナルを含み、そしてクロー
ニング伝播体の切断部位が細菌遺伝子またはフアージ遺
伝子またはこれらのDNA断片の翻訳開始シグナルの前ま
たは内部に存在する。
好適には、使用される非細菌性DNA断片は、正常状態に
おいて宿主細胞から分泌される蛋白質またはポリペプチ
ドの先駆体を暗号づけする遺伝子の完全DNA配列を含
む。好適に使用される非細菌性DNA断片の内で、プリプ
ロインシユリン、プリ血清アルブミン、プリヒト生長ホ
ルモン、プリ上皮小体ホルモン及びプリインターフエロ
ンのような真核細胞蛋白質の先駆体を暗号づけするもの
がある。しかし、ウイルス蛋白質の先駆体を暗号づけす
るような他の非細菌性DNA断片も使用できる。好適に
は、使用される非細菌性DNA断片は遺伝子の終了シグナ
ルも含む。
非細菌性DNA断片を挿入するクローニング伝播体中の切
断部位の特異位置は、選択成熟蛋白質またはポリペプチ
ドを製造するのに決定的なものでない。この点に関連し
て、切断部位はクローニング伝播体中のどこにでも位置
を占めることができる。１）細菌遺伝子またはフアージ
遺伝子またはこれらのDNA断片のプロモータの後、好ま
しくは細菌遺伝子またはフアージ遺伝子またはこれらの
DNA断片のリボソーム結合部位の後２）細菌遺伝子また
はフアージ遺伝子またはこれらのDNA断片の構造DNA配列
の終末の前−−細菌遺伝子またはフアージ遺伝子または
これらのDNA断片が正常状態において宿主細胞から分泌
された蛋白質またはポリペプチドを暗号づけする条件
で。正常状態において宿主細胞から分泌されない蛋白質
またはポリペプチドを暗号づけする細菌遺伝子またはフ
アージ遺伝子またはこれらのDNA断片により、切断部位
は遺伝子またはそのDNA断片の翻訳開始シグナルの前、
または内部、またはすこし後、すなわち約40個のヌクレ
オチド以下の後に位置できる。正常状態において宿主細
胞から分泌された蛋白質またはポリペプチドを暗号づけ
する細菌遺伝子またはフアージ遺伝子またはこれらのDN
A断片により、切断部位は遺伝子またはそのDNA断片の翻
訳開始シグナル（すなわち、切断部位は好適には細菌の
またはフアージの蛋白質またはポリペプチドのシグナル
配列のアミノ酸の約20個以下を残す）の前、内部または
後、好ましくは約60個のヌクレオチドの後に位置するこ
とができる。一般的に、切断部位は細菌遺伝子またはフ
アージ遺伝子またはこれらのDNA切断の翻訳開始シグナ
ルの内部または約40個以下のヌクレオチド以後に存在す
るのが特に好適である。−−細菌遺伝子またはフアージ
遺伝子またはこれらのDNA断片が、正常状態において分
泌された蛋白質またはポリペプチドを暗号づけするかま
たは正常状態において分泌されなかつたものを暗号づけ
するとにかかわらず。
この発明によると、非細菌性DNA断片は細菌遺伝子また
はフアージ遺伝子またはこれらのDNA断片のプロモータ
を順序正しく有する雑種遺伝子中に生成した細菌遺伝子
またはフアージ遺伝子またはこれらのDNA断片のプロモ
ータの後、翻訳開始シグナル（細菌遺伝子またはフアー
ジ遺伝子またはこれらのDNA断片からかまたは非細菌性D
NA断片からの）の後、非細菌性DNA断片のシグナルDNA配
列の後、および非細菌性DNA断片の構造DNA配列の後にお
いて切断部位中に挿入される。好ましくは、選択蛋白質
またはポリペプチドの最も効率のよいエクスプレツシヨ
ンにとつて、リボソーム結合部位（細菌遺伝子またはフ
アージ遺伝子またはこれらのDNA断片または非細菌性DNA
断片のいずれかの）は雑種遺伝子中においてプロモータ
と翻訳開始シグナルの間に存在する。更に、もし非細菌
DNA断片が細菌遺伝子またはフアージ遺伝子またはこれ
らのDNA断片の後に挿入されるならば、非細菌の解読わ
くは細菌遺伝子またはフアージ遺伝子またはこれらのDN
A断片の翻訳開始シグナルによつて定められる解読わく
中に存在するであろう。
分泌された蛋白質またはポリペプチドに疎水性リーダ配
列またはｆ−メトのような他のどんな化学的置換もなし
に、選択蛋白質またはポリペプチドを、この発明にかか
るクローニング伝播体により転換された細菌宿主によつ
て高収率で分泌することができる。宿主内にて合成され
た選択蛋白質またはポリペプチドの先駆体に存在した疎
水性リーダ配列と他のどんな化学的置換も、選択蛋白質
またはポリペプチドから切断される。これは宿主から分
泌される過程中に起ると信じられる。
次の実施例により、本発明を更に詳細に説明する。温度
はすべて摂氏（℃）で、すべてのパーセント（％）は重
量で示される。すべての溶液は、別に説明されないかぎ
り水溶液である。“Ug"はマイクログラムを、そして“U
l"はマイクロリツトルを意味する。
実施例において、出発物質、緩衝液、細胞培地及び標準
物質または手段が使用される場合、次の文献が番号で示
される。
１） ボリバー等〔Bolivar et al,Gene ２,95−113（1
977）〕 ２） ヴイラ−コマロフ等〔Villa−Komaroff et al,P.
N.A.S.75,3727−3731（1978）〕 ３） ジヨーンスラド〔Johnsrud,P.N.A.S.75,5314−53
18（1978）〕 ４） ボイヤー等〔Boyer et al,J.Mol.Biol.41,459−4
72（1969）〕 ５） ベドブルーク等〔Bedbrook et al,Cell ９,707−
716（1976）〕 ６） ライナー〔J.Bact.97,1522−1523（1969）〕 ７） レゲルスキー等〔Legerski et al,Nucl.Acids Re
s.５,1445−1464（1978）〕 ８） ヘリング等〔Helling et al.J.Vir.14,1235−124
4（1974）〕 ９） マツクサム等〔Maxam et al,P.N.A.S.74,560−56
4（1977）〕 10） マイゼル等〔Maizel et al,Methods in Vir.５,1
79−246（1970）〕 11） ブルーメ等〔Broome et al,P.N.A.S.75,2746−27
49（1978）〕 12） マクラ等〔Makula et al,Diabetes 18,660−689
（1969）〕 13） ケスラ等〔Kessler,J.Immunol.115,1617（197
5）〕 出発原料 クローニング伝播体．実施例で使用されたクローニング
伝播体は文献１）により構成され記載されている微小プ
ラスミドpBR322である出発クローニング伝播体から誘導
された。クローニング伝播体はすべてエシエリキア・コ
リ（イー・コリ）ペニシリナーゼにより、遺伝子内でPs
t1制限部位において切断することができた。
蛋白質またはポリペプチドの先駆体の非細菌性DNA断
片．実施例で使用された非細菌性DNA断片は：文献２）
により構成され記載されているラツトプリインシユリン
に対する遺伝子のDNA断片のPst−末端、ポリ−Ｇ尾部の
cDNA複写であつて、以下に“DNA断片19"（文献２）にお
いては“Pi19"と呼ばれている）と呼ぶことにし、及びD
NA断片19の誘導体である。非細菌断片は翻訳開始シグナ
ル（ATG）とラツトプリプロインシユリンに対する遺伝
子の最初の２つのコドン以外はすべて暗号化する。
細菌宿主．イー・コリ・Ｋ−12の４つのよく知られた菌
株が実施例で使用された：文献３）に記載のMM294、文
献４）に記載のHB101、文献５）の記載のFMA10/λＣI
857または“FMA10"、及び文献６）に記載のPR13。これ
らの内部に抗生物質テトラサイクリン耐性を暗号づけす
るプラスミド、pBR322にこの耐性が暗号化されてもいる
遺伝子の存在をもとにして宿主を選択した。
緩衝液 トリス−蔗糖緩衝液 100mMトリス−HCl（pH8）と20％蔗糖液 トライトン溶解緩衝液（トライトンはローム＆ハース社
製表面活性剤の商品名） 0.3％トライトンＸ−100、150mMトリス−HCl（pH8）と
0.2M EDTA（pH8） トリス−EDTA緩衝液（“TE緩衝液”） 10mMトリス−HCl（pH8）と1mM EDTA BAL31緩衝液 20mMトリス−HCl（pH8）、12.5mM MgCl2、12.5mM CaC
l2、0.2M NaCl、と1mM EDTA（pH8） NET緩衝液 50mMトリス−HCl（pH7.5）、5mM EDTA、と0.15M NaCl 細胞培地 2YT培地 １当り6gバクト−トリプリン（Difco）、10g酵母抽出
物と5g NaCl グルコース最少量培地 １当り6g Na2HPO4、3g KH2PO4、0.5g NaCl、と1g NH4
Cl、これに20％グリコース溶液10ml、１％ビタミンB1溶
液1ml及び1M MgSO4溶液1.5ml Ｓ培地 １当り2g NH4Cl、6g Na2HPO4、3g KH2PO4、3g NaCl、
及び10mg MgCl2、これに20％グルコース溶液10mlと１％
ビタミンB1溶液1ml 常用の方法、手段 実施例では幾らかの方法が繰返し実
施されている。特に明記しない限り、実施されている時
はすべて正確に下記の方法で実施された。
転 換 プラスミドで転換さるべきイー・コリＫ−12の
細胞は2YT培地でOD5500.5−1.0（2.5−５×108細胞/m
l）まで成長させた。２×109細胞がソルバールSS−34ロ
ータにより5000rpmで10分間遠心分離することにより回
集され、次で細胞を50mMトリス−HCl（pH8）と50mM CaC
l2の0.5mM中で氷上20分間保温して濃化した。濃化した
細胞は上記のようにして回集しそして50mMトリス−HCl
（pH8）と30mM CaCl2よりなる緩衝液50Ulに再び懸濁さ
せた。
この細胞と緩衝液の混合物にプラスミドDNAを0.2Ugまで
添加し、細胞は氷上15分間、次に37℃で３分間、そして
室温（25℃）で10分間保温した。細胞−緩衝液混合物は
2YT培地で2mlに稀釈し、そしてローラで30分間37℃に保
温した。転換細胞を普通の方法により、テトラサイクリ
ン耐性で選択した。すなわち、20Ug/mlのテトラサイク
リンを含有する8mlの2YT培地を添加して液体培養する
か、または2YT培地と0.15％バクト寒天（Difco）及び20
Ug/mlテトラサイクリンを含有する濃厚平板上での単一
集落を平板培養する。
増幅プラスミド プラスミドを保持する細胞を１の2Y
T培地中、37℃で振とう下にOD5500.5−1.0まで増殖させ
た。3.4mlのクロムフエニコール（5mg/mlエタノール）
を添加し、８−16時間振とうを経継した。
分離プラスミド １以上のイー・コリＫ−12の細胞を
ソルバールGSAロータにて5000rpm下の遠心分離によつて
回集し、それをトリス−蔗糖緩衝液5ml中に再懸濁し
た。細胞を（１）リゾチーム（シグマ）5mg/ml水溶液1m
l （２）0.25M EDTA（pH8）2ml （３）5M NaCl2.5ml
の各々の添加後に氷上５分間培養した。細胞に10％ドデ
シン硫酸ナトリウム（“SDS"）1mlと2M NaClを含む30％
ポリウチレングリコール25Ulを添加して分離し、細胞溶
解物は ECA−160ロータにて27,000rpm下に１時間遠心
分離した。プラスミドDNAを透明な上澄液にイソプロパ
ノール0.6容量加えて沈澱物として得た。
沈澱プラスミドDNAをTE緩衝液1mlに再懸濁して精製し、
次に臨床遠心分離機で５分間遠心分離して不溶性蛋白質
沈澱物を除去した。プラスミドDNAを0.3M酢酸ソーダに
溶解した上澄液に３倍容量のエタノールを加えて再沈澱
し、沈澱をTE緩衝液に再懸濁し、TE緩衝液中平衡にされ
たフエノールを等容量２回加えて抽出した。プラスミド
DNAを３倍容量のエタノールで沈澱させ、TE緩衝液1mlに
再懸濁し、リボヌクレアーゼ（ヴオルシングトンバイオ
ケミカル、ニユージヤージー）100Ug/mlにて50℃下１時
間消化させた。プラスミドDNAを等容量のフエノールで
もう一度抽出し、３容量エタノールで沈澱させ、50mMの
酢酸ソーダ（pH4）に再懸濁し、文献７）記載の方法を
若干改良した方法で50mM酢酸ソーダ中平衡にされたフエ
ノールの等容量で２−３回抽出した。プラスミドDNAは
等容量のエーテルで１回抽出し、３容量のエタノールで
沈澱させ、エーテルに再懸濁させ最終濃度1mg/mlとし
た。
OD5500.5−1.0における細胞容量１−25mlからのプラス
ミドDNAに対し、細胞を上記の通りにして回集し、上記
の通りに100Ulのトリス−蔗糖緩衝液に再懸濁して精製
した。次に、細胞を20mMのEDTA（pH8）中のリゾチーム5
mg/mlを加えて氷上15分間培養し、850Ulのトライトン溶
解緩衝液を加えることにより分離した。細胞溶解物はソ
ルバールSA−600ロータで17,000rpm下１時間遠心分離し
た。プラスミドDNAを上記の通りに上澄液からイソプロ
パノールで沈澱させ、沈澱プラスミドDNAは上記の通り
にして精製した。
切断プラスミド プラスミドはニユー イングランド
ビア ラブス、バルサム、MAより購入した通常の制限酵
素Pst I、Eco RI、Sal I、Hin II及びAva IIで切断され
た。制限酵素をプラスミドにニユー イングランド ビ
オ ラブス推奨の緩衝液を用いて通常の濃度と温度下に
添加した。
結紮DNA断片−−重合と環化 DNA断片は総て、10mMのMg
Cl2、10mMのジチオクレイトール（“DTT"）、及び100UM
トリ燐酸アデノシン（“ATP"）添加25mMトリス−HCl（p
H7.6）の結紮緩衝液中で15℃下に結紮した。
結紮操作は２つの処理下に実施された：重合と引継き環
化。互いに結紮さるべきDNA断片を完全な反応に充分な
量のT4DNAリガーゼ（ベテスダ リサーチ ラボラトリ
ーズ、ベテスダ、Md.）を含有する5Ul反応容量中で重合
した。重合断片を次に結紮緩衝液で50Ul反応容量に稀釈
し、そして反応完結に充分なもう１部のT4DNAリガーゼ
を添加することにより環化した。
アガロース ゲル電気泳動 切断プラスミド断片、超ラ
センプラスミド、及び1000−10,000ヌクレオチド長さの
DNA断片を分離するため0.7％アガロース ゲル電気泳動
を文献８）記載の通りに実施した。
ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 100−4000ヌクレ
オチド長さのDNA断片を分離するため５％ポリアクリル
アミド ゲル電気泳動を文献９）記載の通りに実施し
た。分子量5000−20,000の蛋白質を分離するため15％ポ
リアクリルアミド ゲル電気泳動を文献10）記載の通り
実施した。
ゲル溶出 DNA断片を文献９）記載の通りにして、ポリ
アクリルアミドまたはアガロースゲル部分から溶出し
た。
DNA配列化 DNA断片は５′または３′末端に標識を付さ
れ、それらのDNA配列を文献９）に記載の通りにして決
定した。
P2抑制 プラスミドを含有し、ラツトのプリプロインシ
ユリンのDNA断片でクローン化された細胞に関する総て
の研究（細胞転換、細胞増殖、細胞分割を含めて）はフ
エデラルレジスタ第43巻第247号第60,080−50,105頁（1
978年12月22日）に公にされた組換体DNA研究の改訂N.I.
H.指針に従つて、P2抑制下に実施された。
実施例 第１図に示されるＡ−Ｅの工程によりクローニング伝播
体pBR322（Ｉ）からクローニング伝播体（II、IV及びV
I）の生成 工程.A、 ペニシリナーゼ遺伝子Hin II部位の非反復形
成のためpBR322中のHin II−Sal I部位の除去。
プラスミドpBR322中のテトラサイクリン抵抗性のための
遺伝子中のHin II−Sal I部位（第１図中斑点を付した
部分）はプラスミド非反復のペニシリナーゼ遺伝子（第
１図黒色部）のHin II部位を形成するため除去された。
25mgのＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを振とう下に24−72時間34℃で添加した3.4mlのク
ロランフエニコールを含有する2YT培地１中でpBR322
を保持するイー・コリのMM294株を増殖することによりp
BR322を変異誘発し増幅した。プラスミドを分離し、次
にSal Iで徹底的に切断した。切断プラスミド分画はMM2
94の転換に使用された。テトラサイクリン耐性MM297細
胞を選別し、そして選別細胞からプラスミドを分離し
た。次に再びプラスミドをSal Iで切断し、そしてMM294
の転換に使用し、そして上記したようにテトラサイクリ
ン耐性細胞から分離し、最後にSal I耐性分画をアガロ
ース ゲル電気泳動により超らせんプラスミドとして見
出すことができる。このSal I耐性プラスミドを単一集
落から分離し、そしてアガロース ゲル電気泳動を使用
して、Sal IとHin IIの両方による切断に抵抗性を有す
ることを確認するため試験した。Sal IとHin IIに耐性
の単一分離物を第１図の次のＢ工程のプラスミド（II）
として選定した。
工程.B、 Hin IIでプラスミド（II）を切断しそしてペ
ニシリナーゼ遺伝子のプラスミド末端と翻訳開始シグナ
ル（ATG）の間のヌクレオチドの除去。
工程ＡからのプラスミドIIをHin IIで切断して線状プラ
スミド（III）を形成した。ペニシリナーゼ遺伝子の翻
訳開始シグナル（第１図の網目の陰影部）は線状プラス
ミド（III）のHin II−切断末端から約300個のヌクレオ
チドであつた。0.2Ugのプラスミド（III）の末端をエキ
ソヌクレアーゼBAL31 ２単位で200Ul反応容量のBAL31
緩衝液中15℃で５分間咀嚼させた。各種の生成咀嚼プラ
スミドを第１図の次の工程Ｃに使用した。
工程.C、 プラスミド（III）の咀嚼末端の１つのPstリ
ンカー（G Pst C）の挿入及び生成プラスミドを環化し
て、ペニシリナーゼ遺伝子の翻訳開始シグナルの近くに
Pst制限部位を各々有するプラスミド（IV）の形成 0.2Ugの咀嚼プラスミドを0.2Ug Pstリンカー（コラボレ
イテイブ リサーチ、ベテスダ、MD）にT4DNAリガーゼ
を加えたもので２時間要して重合し、次に結紮リンカー
を有する各咀嚼プラスミドの５′末端を文献９）に記載
の方法で賦活した。Pstリンカーの配列は５′−GCTGCAG
−３′であつて、このCTGCAGはPst Iによる切断部位を
明示するものである。Pstリンカーに由来する塩基は第
２図と第３図においてイタリツク書体にしてある。結紮
リンカーを有する咀嚼プラスミドを５時間を要して環化
した。各種の生成プラスミド（IV）をMM294に転換し、M
M294細胞は液体培養でテトラサイクリン耐性に対し選別
した。
工程.D、 ペニシリナーゼ遺伝子の翻訳開始シグナルの
近傍にPst制限部位を有するDNA断片（Ｖ）の分離 ペニシリナーゼ遺伝子の翻訳開始シグナルの近傍のどこ
かに工程Ｃにおいて挿入された各Pstリンカーを有する
各種プラスミド（IV）を10mlsの増幅細胞から分離したM
M294に増幅し、次に制限酵素Eco RIとPst Iで切断し
た。各プラスミド（IV）の翻訳開始シグナルはEco RI部
位からの約200個のヌクレオチドであつた。それで、切
断プラスミド（IV）からのDNA断片を５％ポリアクリル
アミド ゲル電気泳動に付し、約150−300個のヌクレオ
チドを含有する各種DNA断片をキシレンサイアノールを
死標識として使用して同定した。約150−300個のヌクレ
オチドのDNA断片を含むゲル薄片を溶出して第１図の次
の工程に使用した。
工程.E、 結紮DNA断片（Ｖ）はpBR322の中に戻る pBR322をEco RIとPst Iの両方により切断し、テトラサ
イクリン耐性遺伝子を含む大形断片を0.7％アガロース
ゲル電気泳動により分離した。0.2Ugの大形pBR322断
片を２時間を要して重合し、次いで５時間を要して環化
してクローン化プラスミド（VI）を形成することにより
0.2Ug DNA断片（Ｖ）に結紮した。異なる長さの各種DNA
断片を含む各種クローン化プラスミド（VI）を分離する
ため、クローン化プラスミド（VI）をMM294に転換し、
次いで平板上で分離した。この点に関連して、転換MM29
4細胞は単一集落のため平板培養し、単一集落を手当り
しだいに拾いあげ、各分割したプラスミドを各単一集落
の5mlの細胞から分離した。プラスミドを文献９）記載
の方法で20UM3燐酸デオキシグアノシンと2UMα−32P−
３燐酸アデノシンで３′−末端に標識したAva IIで各切
断し、Eco RIで切断し、そして文献９）記載の方法でPs
t部位を越えて配列した。２つのクローン化プラスミド
（VI）、すなわち第２図の“pKT241"と第３図の“pKT21
8"を分離し、この方法で特徴づけし、次いでこの実施例
におけるクローニング伝播体（VI）として使用した。第
２図と第３図はDNA配列とアミノ酸配列を示し、それら
はpKT241とpKT218クローニング伝播体（IV）を形成する
ため、ペニシリナーゼ遺伝子pBR322の断片に結紮された
Eco RI−Pst Iを暗号化した。これらクローニング伝播
体の各々は、ペニシリナーゼ遺伝子の翻訳開始シグナル
からの（pKT218の場合は）４個の（pKT241の場合は）12
個のコドンであるところのPst制限部位を有する変容ペ
ニシリナーゼ遺伝子から構成される。
クローニング伝播体（VI）中のクローン化されるための
非細菌性DNA断片の生成 第４図は、文献２）によつて分離し配列した非細菌性DN
A断片19の５′末端のDNA配列を示す。DNA断片19はラツ
トのプリプロインシユリンに対する遺伝子の断片のPst
−末端化、ポリ−Ｇ尾部化のcDNA複写である。DNA断片1
9は遺伝子の３′末端に終了シグナル（TGA）のみなら
ず、シグナルDNA配列とラツトのプリプロインシユリン
に対する遺伝子の構造DNA配列とを含む。このDNA断片が
暗号づけするアミノ配列も第４図に示されている。第４
図にイタリツク書体で示すアミノ酸はポリ−Ｇ尾部とPs
t部位により暗号づけするアミノ酸である。第４図のDNA
断片19はラツトのプリプロインシユリン遺伝子の最初の
３つのコドン以外は総て含む。DNA断片が暗号づけする
シグナル配列の末端とプロインシユリンの開始はアミノ
酸＋１の前の矢印により示されている。
第５図はDNA配列とアミノ酸配列を示しており、これは
ラツトのプリプロインシユリンに対する遺伝子の他のも
う１つの非細菌性DNA断片“DB6"の５′末端を暗号化し
ている。DNA断片CB6は0.2Ug DNA断片19を文献７）記載
のエキソヌクレアーゼBAL312単位で、1500Ul BAL31緩衝
液中15℃で45秒間保温することにより生成させた。咀嚼
DNA断片を0.2Ug PstリンカーへのT4DNAリガーゼにより
２時間を要して重合し、５％ポリアクリルアミド ゲル
で電気泳動に付した。DNA断片19より約40個のヌクレオ
チド小さいDNA断片を溶出し、Pst Iで切断し、Pst I切
断pBR322のPst部位に結紮した。生成プラスミドをイー
・コリHB101株中に転換し、上記のようにして平板上分
離した。選別されたHB101の単一集落を5mlの2YT培地で
培養した。プラスミドを上記のようにして、３′末端標
識されPst部位を越えて配列されたAva IIで切断した。
配列されたDNA断片中にDNA断片CB6があつた。ラツトの
プリプロインシユリンに対するDNA断片CB6のシグナルDN
A配列は、DNA断片19からの異なつたフレーム中に読み取
られ、そしてポリ−Ｇ尾部により加えられたより少ない
Ｇヌクレオチドを含む以外は、DNA断片19のそれに本質
的に同一であることがわかつた。
第１図に示される工程Ｆによつてクローニング伝播体中
に非細菌性DNA断片のクローニング 工程.F、 クローニング伝播体pKT218中にDNA断片CB6
の、そしてクローニング伝播体pKT241中にDNA断片19の
クローニング 0.2Ugクローニング伝播体pKT218をPst Iで切断した。0.
2Ug Pst I−切断pKT218を0.2UgのPst−端末化DNA断片CB
6に２時間を要して重合し、次いで稀釈することにより
５時間を要して環化した。生成したクローン化プラスミ
ド（VII）、“pKT218.CB6"はイー・コリFMA10株に転換
し、上記したように平板上選別し、そして40Ug/mlのチ
ミヂンを追加した2YT培地で34℃下に培養した。
同じ操作により、0.2UgのDNA断片19を0.2Ugのクローニ
ング伝播体pKT241にクローン化してクローン化プラスミ
ド（VII）、“pKT241.19"を形成した。pKT241.19プラス
ミドを次に上記のようにして転換し、平板上選別しそし
て培養した。
pKT218.CB6またはpKT241.19を有するFMA10トランスハー
マントを分離するため、ラツトのプリプロインシユリン
がクローン化プラスミド（pKT218.CB6またはpKT241.1
9）の１つを含むトランスホーマント、トランスホーマ
ントの単一集落中に形成されるように、細菌性（ペニシ
リナーゼ）遺伝子のプロモータから読取るための正しい
指向に非細菌性DNA断片（CB6または19）を含むクローン
化プラスミドを2YT培地と、0.15％バスト−アガーと40U
g/mlのチミヂンを加えた20Ug/mlのテトラサイクリンと
を含むレプリカ平板に拾いあげた。トランスホーマント
を34℃で増殖し、２時間42℃でラムダフアージの誘発に
よつて平板上で分離した。複製平板の１つの上の２部位
固体相ラジオイムノアツセイは、普通のウサギ血清の代
りに普通のモルモツト血清を洗浄緩衝液に使用した以外
は文献11）に記載の通り行われた。ラツトのインシユリ
ン抗原の存在に対する試験に陽性とでた各トランスホー
マントからのクローン化プラスミド（pKT218.CB6または
pKT241.19）はクローニング伝播体（VII）でありイー・
コリPR13株の細菌宿主に転換された。
クローニング伝播体（VII）で転換された細菌宿主の培
養 ラツトインシユリン抗原をエクスプレスするpKT218.CB6
またはpKT241.19クローニング伝播体（VII）で転換され
たPR13を２％cas（カゼイン加水分解物）アミノ酸（デ
イコフ）を追加したグルコース最少培地中でOD5500.2−
0.4まで、37℃下に増殖した。
培養宿主により分泌された蛋白質の分析 転換したPR13宿主細胞を回集し、次にトリス−蔗糖緩衝
液に懸濁させることにより洗浄した。洗浄細胞をソルバ
ールSS−34ロータで5,000rpm下に10分間遠心分離してペ
レツト化した。細胞の１部を分離して全細胞の内容を放
出させた。洗浄細胞の他の部分はプリプラズルの内容と
細胞膜を加えた細胞質の内容とに分画した。
細胞を100Ulのトリス−蔗糖緩衝液に再懸濁化すること
により全細胞インシユリン抗原から分離し、20mM EDTA
に50Ul5m/mlリゾチームを加えたもので15分間培養し、
そして850Ulのトライトン溶解緩衝液を添加して分離し
た。ソルバールSA−600ロータで17,000rpm下に１時間遠
心分離した細胞溶解物は全細胞インシユリン抗原を含ん
でいた。
細胞を900Ulトリス−蔗糖緩衝液に再懸濁することによ
り分画し、そして20mM EDTA（pH8）に100Ulの5mg/mlリ
ゾチームで氷上15分間培養した。細胞は前のようにして
ペレツト化した。細胞溶解物は細胞ペリプラスムの内容
を含み、そしてペレツトは細胞質と細胞膜の内容を含ん
でいた。インシユリン抗原含有の分析のため細胞溶解物
を分離後、ペレツトを1mlのトリス−蔗糖緩衝液に静か
に再懸濁し、再ペレツト化し、100Ulトリス−蔗糖緩衝
液中に硝子棒を使用して撹拌しながら再懸濁化した。細
胞はトライトン溶解緩衝液で分離し、ソルバールSA−60
0ロータで17,000rpm下１時間遠心分離した。細胞溶解物
は細胞質の内容と細胞膜とを含んでいた。PR13細胞から
得た各分画のインシユリン抗原含量を決定するため、文
献12）記載の通りに標準液体ラジオイムノアツセイを実
施した。試験用細胞分画のアリクオツトを供給標識化イ
ンシユリンの75％をキレート化するに充分な量の抗イン
シユリンIgGをもつて前培養した。文献11）に記載の通
りにしてモルモツトの抗インシユリン血清のIgG分画を
液体及び固相ラジオイムノアツセイに使用し、そして調
製した。
次の表は、pKT241.91クローニング伝播体（VII）を含む
培養PR13とpKT218.CB6クローニング伝播体（VII）を含
む培養PR13の結果を総括するもので、ラツトのインシユ
リン抗原の約90％がPR13宿主細胞のプリプラスム間隙に
存在することを示している。
クローニング伝播体（VII）によつて転換した細胞宿主
により成熟蛋白質が形成されることの決定 40Ug/mlロイシンと40Ug/mlスレオニンを追加したＳ培地
で、pKT218.CB6またはpKT241.19クローニング伝播体（V
II）で転換した5mlのPR13をOD5500.3まで増殖し、次に3
4℃下に5mCiH2 35SO4で30分間培養した。回集した細胞を
上記のようにして全細胞抗原含量のため分離し、細胞溶
解物を文献11）記載のように調製したモルモツト抗豚イ
ンシユリン血清のIgG分画2Ulで培養した。このIgG分画2
Ulは約300ngのインシユリン抗原を結合した。それで200
倍過剰の抗体であつた。37℃で３時間そして氷上で３時
間培養後、抗−インシユリンIgG−ラツトプロインシユ
リン複合体を文献13）記載のようにして免疫沈澱させ
た。NET緩衝液中100Ulグルトールアルデヒド−処理（10
％容量／容量）スタフＡ（スタフイロコツカス・アウレ
ウス）（黄色ブドウ球菌）を複合体に添加し、氷上でも
う１時間培養を経継した。
スタフＡ細胞をソルバールSS−34ロータで５分間10,000
rpm下の遠心分離によりペレツト化して細胞溶解物から
インシユリン抗原抗体複合体を除去した。細胞を100UlN
ET−NON緩衝液（NET緩衝液にノニデントＰ−40表面活性
剤（バーテイクル データ ラボス、インス．、エルム
ハースト、III.）と1mg/mlの卵アルブミンと0.5M NaCl
を加えたもの）に再懸濁して洗浄した。次に、更に900U
lのNET−NON緩衝液を加え、そして細胞を前のようにし
てペレツト化した。この洗浄操作を更に３回繰返した。
２つの最終洗浄は0.5％ノニデントＰ−40表面活性剤を
含むNET緩衝液にて行い、次に細胞を文献10）に記載の
マイゼルゲル含有緩衝液（SDS含有）50Ul中３分間煮沸
した。スタフＡ細胞を上記のようにして遠心分離により
再びペレツト化した。
変性蛋白質（放射活性プロインシユリンを含む）を含む
細胞溶解物を文献10）に記載の通りにして10×８×0.2c
m15％マイゼルゲルに充填した。ゲルを底部にブロムフ
エノールブルー追跡染料が出るまで、40ボルトで30分間
そして110ボルトで４−５時間流し、次にコダツクXR−
５フイルム上で１時間オートラジオグラフイーにかけ
た。顕著に放射活性なゲル部分（フイルムからわかるよ
うに）から構成され放射活性プロインシユリンを含むゲ
ル部分をゲルから切断し、硝子棒で押しつぶしそして50
mM重炭酸アンモニウム（pH7.5）と溶出に対する担体蛋
白質としての0.2mg/ml卵アルブミン（シグマ）と0.1％S
DSと0.2mMDTT中で８時間室温にて溶出した。砕細ゲルを
硝子綿にて別し、蛋白質を凍結乾燥した。蛋白質を10
0Ulの水に再懸濁しそして５容量のアセトンで沈澱させ
た。
蛋白質を200Ulの70％蟻酸に再懸濁し、これに担体蛋白
質として3mg卵アルブミンをシークエンシング用に加
え、シークエネイタカツプに蛋白質結合助長用の200Ul
の70％蟻酸に添加した3mgポリブレン（アルドリツヒ）
を加えた。蛋白質は最新型860Cのベツクマン シークエ
ネイタに詰め、各サイクルは0.1Mクアドロール緩衝液
（ベツクマン）と適合したシークエネイタプログラム下
に運転された。蛋白質のアミノ酸誘導体を各サイクルの
後に集めそして37℃の浴中窒素気流下に乾燥した。200U
lの0.1N HCl中に再懸濁し80℃で10分間保温して各不安
定な誘導体を安定な誘導体に変えた。各安定な誘導体20
−100Ulを2mlアクアゾル（ニユー イングランド ヌク
レアール、ボストン、MA）に添加し、各誘導体の放射線
を液体シンチレーシヨンにより決定した。
１分間当りの液体シンチレーシヨンのカウントをpKT24
1.19またはpKT218.CB6クローニング伝播体（VII）を含
む各培養PR13宿主からの蛋白質のアミノ酸位置に対して
プロツトしてみた。自然においては、成熟プロインシユ
リンは含硫アミノ酸システインをそのアミノ酸鎖に沿つ
て７と19位置に有している。プロツトは各培養PR13宿主
により生産されたフロインシユリンのアミノ酸鎖に沿つ
て７と19位置に放射活性硫黄の定量的回収を示した。こ
のことはpKT218.CB6クローニング伝播体またはpKT241.1
9クローニング伝播体を含む各PR13宿主によつて成熟プ
ロインシユリンが生産されたことを証明した。
この発明とこれに伴う多くの利点は、今迄述べた所によ
り理解され、そして各種変化を、この発明の精神と範囲
を逸脱することなく、そしてその物質的利益の総てを犠
牲にすることなしに、記載された成熟蛋白質合成方法の
工程になされ得ること、以上述べた方法は単なる好適な
実施態様にすぎないことは明らかであることが理解され
よう。
【図面の簡単な説明】
第１図はラツトのプリプロインシユリンを暗号づけする
DNA断片を、プラスミドpBR322から生産され、そしてイ
ー・コリペニシリナーゼ遺伝子のDNA断片を含むクロー
ニング伝播体の中に挿入するための実施例に使用された
方法を示す解説図であり、第２図は３′末端に挿入され
たPst制限部位（Pst Iにより切断した後に現われた時が
示される）を含むEco RI制限部位の後のイー・コリペニ
シリナーゼ遺伝子のDNA断片（pKT241）の完全な塩基配
列を示し、さらにこのDNA断片が暗号づけする対応アミ
ノ酸配列を示し、このDNA断片の最も近い同定可能のプ
ロモータは翻訳出発シグナルの前の14−20個のヌクレオ
チド範囲中に位置し（スユートクリツフエ,P.N.A.S.第7
5巻、第3737−3714頁（1978年））、実施例において、
このイー・コリDNA断片（pKT241）の３′末端は第４図
のラツトのプリプロインシユリンに対するDNA断片（1
9）のシグナルDNA配列に接続しており、第３図は３′末
端に挿入されたPst制限部位（Pst Iにより切断した後に
現われた時が示される）を含むEco RI制限部位の後のイ
ー・コリペニシリナーゼ遺伝子のもう１つのDNA断片（p
KT218）の完全な塩基配列を示し、さらにこのDNA断片が
暗号づけする対応アミノ酸配列を示し、このDNA断片の
最も近い同定可能のプロモータは翻訳出発シグナルの前
の14−20個のヌクレオチド範囲中に位置し、スユートク
リツフエ、上記。実施例において、イー・コリDNA断片
（pKT218）の３′末端は第５図のラツトのプリプロイン
シユリンに対するDNA断片（CB6）のシグナルDNA配列に
接続しており、第４図は５′末端に挿入されたPst制限
部位（Pst Iにより切断した後に現われた時が示され
る）を含むラツトのプリプロインシユリンに対するDNA
断片（19）のシグナルDNA配列に対する完全な塩基配列
を示し、さらにシグナルDNA配列が暗号づけする対応ア
ミノ酸配列を示し、シグナルDNA配列はこのDNA断片の−
21位置から−１位置までであり、構造DNA配列はこのDNA
断片の＋１位置から始まり、実施例においては、ラツト
のプリプロインシユリンに対するDNA断片（19）の５′
末端は第２図のイー・コリDNA断片（pKT241）に接続し
ており、第５図は５′末端に挿入されたPst制限部位（P
st Iにより切断した後に現われた時が示される）を含む
ラツトのプリプロインシユリンに対するもう１つのDNA
断片（CB6）のシグナルDNA配列に対する完全な塩基配列
を示し、さらにシグナルDNA配列が暗号づけする対応ア
ミノ酸配列を示し、シグナルDNA配列はラツトのプリプ
ロインシユリンに対するこのDNA断片の−21位置から−
１位置までであり、構造DNA配列はこのDNA断片の＋１位
置から始まり、実施例においては、ラツトのプリプロイ
ンシユリンに対するこのDNA断片（CB6）の５′末端は第
３図のイー・コリDNA断片（pKT218）に接続している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭55−19092（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−166200（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−137896（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，283（1980）Ｐ．433− 438 Ｓｃｉｅｎｃｅ，205（1979）Ｐ．602− 607 Ｎａｔｕｒｅ，282（1979）Ｐ．525− 527

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】選択蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主
    内部で合成し、かつこれを宿主の膜を介して分泌する方
    法であって、 ａ）クローニング伝播体を切断して切断部位を形成し、 ｂ）この切断部位の中に選択蛋白質またはポリペプチド
    をコードする非細菌性DNA断片を挿入することにより雑
    種遺伝子を形成し、 ｃ）宿主をこの雑種遺伝子により形質転換し、 ｄ）この形質転換された宿主を培養して選択蛋白質また
    はポリペプチドを分泌させる方法において、 （ａ−１） 前記クローニング伝播体は、その伝播体内
    にある細菌性遺伝子またはファージ遺伝子のプロモータ
    の後ろに、或いはその細菌性遺伝子またはファージ遺伝
    子中に、或いはその細菌性遺伝子またはファージ遺伝子
    の後ろに切断部位を形成するように切断されるが、ただ
    し、 （ａ−２） 前記非細菌性DNA断片が細菌性遺伝子また
    はファージ遺伝子内の翻訳開始シグナルの後ろに挿入さ
    れる場合には、 正常では分泌されない蛋白質またはポリペプチドをコー
    ドする細菌性遺伝子またはファージ遺伝子については、
    切断部位が翻訳開始シグナルから約40以下のヌクレオチ
    ドのところに位置するよう前記クローニング伝播体が切
    断され、 一方、正常では分泌される蛋白質またはポリペプチドを
    コードする細菌性遺伝子またはファージ遺伝子について
    は、切断部位が翻訳開始シグナルから約60以下のヌクレ
    オチドのところに位置するよう前記クローニング伝播体
    が切断され、 （ｂ−１） 前記非細菌性DNA断片は、前記選択蛋白質
    またはポリペプチドの先駆体をコードし、かつ前記選択
    蛋白質またはポリペプチドのアミノ末端に位置するシグ
    ナル配列を含み、かつ翻訳開始シグナルにより特定され
    るリーディングフレーム中に位置し、 （ｄ−１） さらに、前記形質転換された宿主は、選択
    蛋白質またはポリペプチドを、成熟蛋白質またはポリペ
    プチドとして発現させることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】イー・コリ・ペニシリナーゼ遺伝子を切断
    することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
    法。
  3. 【請求項３】クローニング伝播体をプラスミドpBR322か
    ら誘導することを特徴とする特許請求の範囲第１項また
    は第２項記載の方法。
  4. 【請求項４】非細菌性DNA断片はプレプロインシュリ
    ン、プレ血清アルブミン、プレヒト成長ホルモンまたは
    プレインターフェロンをコードすることを特徴とする特
    許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記載の方
    法。
JP56052488A 1980-04-11 1981-04-09 選択成熟蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主内で合成する方法 Expired - Lifetime JPH0773504B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/139,225 US4338397A (en) 1980-04-11 1980-04-11 Mature protein synthesis
US139225 1993-10-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS56154999A JPS56154999A (en) 1981-11-30
JPH0773504B2 true JPH0773504B2 (ja) 1995-08-09

Family

ID=22485649

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP56052488A Expired - Lifetime JPH0773504B2 (ja) 1980-04-11 1981-04-09 選択成熟蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主内で合成する方法

Country Status (19)

Country Link
US (1) US4338397A (ja)
EP (1) EP0038182B2 (ja)
JP (1) JPH0773504B2 (ja)
KR (1) KR830005355A (ja)
AT (1) ATE30336T1 (ja)
AU (1) AU531566B2 (ja)
BR (1) BR8102164A (ja)
CA (1) CA1175369A (ja)
DD (1) DD158797A5 (ja)
DE (1) DE3176493D1 (ja)
DK (1) DK161681A (ja)
ES (1) ES8202589A1 (ja)
FI (1) FI811100L (ja)
GR (1) GR74459B (ja)
IL (1) IL62614A (ja)
NZ (1) NZ196768A (ja)
PH (1) PH18603A (ja)
PT (1) PT72834B (ja)
ZA (1) ZA812382B (ja)

Families Citing this family (162)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU545912B2 (en) * 1980-03-10 1985-08-08 Cetus Corporation Cloned heterologous jive products in bacillies
AU564690B2 (en) 1980-04-03 1987-08-20 Biogen Idec Ma Inc. Process for producing human fibroblast interferon-like polypeptides using recombinant dna
FI64813C (fi) * 1980-12-31 1984-01-10 Ilkka Antero Palva Foerfarande foer producering av ett utvalt aeggviteaemne och vid foerfarandet anvaenda rekombinantplasmidvektorer
US5525484A (en) * 1981-01-16 1996-06-11 Genome Therapeutics Corp. Recombinant DNA means and method for producing rennin, prorenin and pre-prorennin
US4666847A (en) * 1981-01-16 1987-05-19 Collaborative Research, Inc. Recombinant DNA means and method
US4438032A (en) 1981-01-30 1984-03-20 The Regents Of The University Of California Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom
US4529695A (en) * 1981-06-18 1985-07-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombinant cloning vector, host for the vector, and method for using same
ZA824218B (en) * 1981-06-29 1983-04-27 Cetus Corp Plasmid for producing human insulin
US5332664A (en) * 1981-07-15 1994-07-26 Celltech Limited Human calcitonin precursor polyprotein structural gene
AU561343B2 (en) * 1981-10-19 1987-05-07 Genentech Inc. Human immune interferon by recombinant dna
US5582824A (en) * 1981-10-19 1996-12-10 Genentech, Inc. Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon
US4663290A (en) * 1982-01-21 1987-05-05 Molecular Genetics, Inc. Production of reverse transcriptase
US5004689A (en) * 1982-02-22 1991-04-02 Biogen, Massachusetts DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing human gamma interferon-like polypeptides in high yields
US4775622A (en) * 1982-03-08 1988-10-04 Genentech, Inc. Expression, processing and secretion of heterologous protein by yeast
EP0090433A1 (en) * 1982-03-31 1983-10-05 Genetics Institute, Inc. Creation of DNA sequences encoding modified proinsulin precursors
US6936694B1 (en) 1982-05-06 2005-08-30 Intermune, Inc. Manufacture and expression of large structural genes
US4666837A (en) * 1982-05-24 1987-05-19 Smithkline-Rit DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing the A and B subunits of cholera toxin and preparations containing so-obtained subunit or subunits
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
US4778759A (en) * 1982-07-09 1988-10-18 Boyce, Thompson Institute For Plant Research, Inc. Genetic engineering in cyanobacteria
US4818694A (en) * 1982-07-20 1989-04-04 American Cyanamid Company Production of herpes simplex viral protein
US4891315A (en) * 1982-10-25 1990-01-02 American Cyanamid Company Production of herpes simplex viral porteins
US4595658A (en) * 1982-09-13 1986-06-17 The Rockefeller University Method for facilitating externalization of proteins synthesized in bacteria
US5151350A (en) * 1982-10-27 1992-09-29 Repligen Corporation Cloned genes encoding recombinant protein a
US4634678A (en) * 1982-12-13 1987-01-06 Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership Plasmid cloning and expression vectors for use in microorganisms
EP0116201B1 (en) * 1983-01-12 1992-04-22 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
EP0114777B1 (fr) * 1983-01-21 1990-08-01 Transgene S.A. Nouveaux vecteurs d'expression et leur application à la préparation d'une protéine ayant l'activité de l'antitrypsine-alpha 1 humaine
FR2539758B1 (fr) * 1983-01-21 1985-11-15 Transgene Sa Nouveaux vecteurs d'expression et leur application a la preparation d'une proteine ayant l'activite de l'antitrypsine-a1 humaine
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
US5169762A (en) * 1983-03-03 1992-12-08 Genentech, Inc. Human nerve growth factor by recombinant technology
US4711844A (en) * 1983-03-09 1987-12-08 Cetus Corporation Modified signal peptides
US4914026A (en) * 1983-04-07 1990-04-03 Chiron Corporation Alpha factor leader sequence directed secretion of insulin
US5015575A (en) * 1983-04-07 1991-05-14 Chiron Corporation Hybrid DNA synthesis of insulin
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DE3312928A1 (de) * 1983-04-11 1984-11-22 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig Human-parathormon produzierende hybridvektoren und human-parathormongen
US4859600A (en) * 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
NZ207842A (en) 1983-04-25 1988-02-12 Chiron Corp Production of human insulin-like growth factor (igf) using cdna
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US5010003A (en) * 1983-04-25 1991-04-23 Genentech, Inc. Use of yeast homologous signals to secrete heterologous proteins
US4588684A (en) * 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
IL71991A (en) 1983-06-06 1994-05-30 Genentech Inc Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes
JPS6030687A (ja) * 1983-08-01 1985-02-16 Wakunaga Seiyaku Kk Ｄνａ遺伝子，その製造法およびそれを含むプラスミド
US4637980A (en) 1983-08-09 1987-01-20 Smithkline Beckman Corporation Externalization of products of bacteria
US4870008A (en) * 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
JPH0646946B2 (ja) * 1984-03-30 1994-06-22 三菱化成株式会社 蛋白の産生方法
US4695542A (en) 1983-10-04 1987-09-22 Dnax Research Institute Of Molecular And Cellular Biology, Inc. cDNA clones coding for polypeptides exhibiting multi-lineage cellular growth factor activity
JPS6083584A (ja) * 1983-10-13 1985-05-11 Rikagaku Kenkyusho 生細胞内への物質移入法
NZ210501A (en) * 1983-12-13 1991-08-27 Kirin Amgen Inc Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
KR850004274A (ko) * 1983-12-13 1985-07-11 원본미기재 에리트로포이에틴의 제조방법
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
MX9203641A (es) * 1983-12-16 1992-07-01 Genentech Inc Interferones gamma recombinantes que poseen estabilidad mejorada y metodos biotecnologicos para su obtencion.
DE3587022T2 (de) * 1984-02-17 1993-06-17 Genentech Inc Menschlicher transformationswachstumsfaktor und vorlaeufer oder fragment hiervon, zellen, dna, vektoren und verfahren zu ihrer herstellung, zusammensetzungen und produkte, die diese enthalten, sowie davon abgeleitete antikoerper und diagnostizierverfahren.
US4777240A (en) 1984-03-08 1988-10-11 Scripps Clinic And Research Foundation SV40 expression vector containing HBxAg as an expression marker
US5766915A (en) * 1984-04-13 1998-06-16 Alko-Yhtiot Oy (Alko Group Ltd.) Yeast strains producing cellulolytic enzymes and methods and means for constructing them
FI841500A0 (fi) * 1984-04-13 1984-04-13 Valtion Teknillinen Foerfarande foer uppbygnande av cellulolytiska jaeststammar.
US5672347A (en) * 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
DE3581528D1 (de) * 1984-07-13 1991-02-28 Chiron Corp Insulinaehnlicher wachstumsfaktor ii.
US5691181A (en) * 1984-08-21 1997-11-25 Celltech Limited DNA encoding lipase from human gastric mucosal tissue
US5747281A (en) * 1984-09-28 1998-05-05 Cornell Research Foundation, Inc. System useful for the production of proteins from recombinant DNA in single celled organisms
US5272254A (en) * 1984-10-02 1993-12-21 Biogen Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
EP0198015B2 (en) * 1984-10-02 1995-07-19 Biogen, Inc. Production of streptavidin-like polypeptides
US4963495A (en) * 1984-10-05 1990-10-16 Genentech, Inc. Secretion of heterologous proteins
US4745056A (en) * 1984-10-23 1988-05-17 Biotechnica International, Inc. Streptomyces secretion vector
JP2549504B2 (ja) * 1984-12-21 1996-10-30 ア−ス製薬株式会社 Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物
EP0216786B1 (en) 1984-12-21 1992-03-18 Biogen, Inc. Purification, production and use of tumor necrosis factors
WO1986005803A1 (fr) * 1985-03-30 1986-10-09 Marc Ballivet Procede d'obtention d'adn, arn, peptides, polypeptides ou proteines, par une technique de recombinaison d'adn
US5013662A (en) * 1985-09-20 1991-05-07 Cetus Corporation Bacterial methionine n-terminal peptidase
US4870017A (en) * 1985-09-20 1989-09-26 Cetus Corporation Bacterial methionine N-terminal peptidase
US4865974A (en) * 1985-09-20 1989-09-12 Cetus Corporation Bacterial methionine N-terminal peptidase
USH2055H1 (en) 1985-09-20 2002-12-03 Zymogenetics, Inc. Expression of tissue-type plasminogen activator in bacteria
JPS63501053A (ja) * 1985-10-11 1988-04-21 ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド 異種タンパク質の生産方法
US4801536A (en) * 1985-10-11 1989-01-31 Genetics Institute, Inc. Method for producing heterologous proteins
US5576195A (en) * 1985-11-01 1996-11-19 Xoma Corporation Vectors with pectate lyase signal sequence
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5200327A (en) * 1985-11-06 1993-04-06 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from streptomyces
GB8529014D0 (en) * 1985-11-25 1986-01-02 Biogen Nv Enhanced secretion of heterologous proteins
SE8505921D0 (sv) * 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab A method to export gene products to the growth medium of gram negative bacteria
FR2594846B1 (fr) * 1986-02-21 1989-10-20 Genetica Procede de preparation de la serum albumine humaine mature
US4743679A (en) * 1986-02-24 1988-05-10 Creative Biomolecules, Inc. Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof
DE3622221A1 (de) * 1986-07-02 1988-01-14 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur gentechnologischen gewinnung von proteinen unter verwendung gramnegativer wirtszellen
US6348191B1 (en) 1986-07-08 2002-02-19 Genetics Institute, Inc. Production and use of IL-6
US20060008806A1 (en) * 1986-07-17 2006-01-12 University Of Washington Method for producing novel DNA sequence with biological activity
DE3750106T3 (de) * 1986-08-06 1999-04-22 Ajinomoto Co., Inc., Tokio/Tokyo Rekombinanter B-Zell-Differenzierungsfaktor.
JPS6368087A (ja) * 1986-09-09 1988-03-26 Oji Paper Co Ltd 蛋白質の発現と分泌に関与する領域を含むｄｎａ
AU627147B2 (en) 1986-10-22 1992-08-20 Peter Alestrom Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US5010010A (en) * 1986-10-22 1991-04-23 Selmer-Sande, A.S. Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US5420242A (en) * 1986-10-22 1995-05-30 Kaare M. Gautvik Production of human parathyroid hormone from microorganisms
US4929700A (en) * 1987-04-16 1990-05-29 Cetus Corporation Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1
CA1339757C (en) * 1987-04-16 1998-03-17 Robert F. Halenbeck Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1
US5266474A (en) * 1987-06-24 1993-11-30 Genentech, Inc. Balanced inducible transcription system
US5472702A (en) * 1987-08-26 1995-12-05 United States Surgical Corporation Sterilization of growth factors
US5222978A (en) 1987-08-26 1993-06-29 United States Surgical Corporation Packaged synthetic absorbable surgical elements
US5366081A (en) 1987-08-26 1994-11-22 United States Surgical Corporation Packaged synthetic absorbable surgical elements
US5221620A (en) * 1987-10-06 1993-06-22 Oncogen Cloning and expression of transforming growth factor β2
JP2791418B2 (ja) * 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
DE68923107T2 (de) * 1988-02-26 1996-01-18 Biogen Inc DNA-Sequenzen, rekombinante DNA-Moleküle und Verfahren zur Herstellung von Lipocortin III, IV, V, und VI.
US5223409A (en) * 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5082767A (en) * 1989-02-27 1992-01-21 Hatfield G Wesley Codon pair utilization
EP0700997B1 (en) 1989-05-10 2003-07-30 Baxter Biotech Technology S.à.r.l. Production in bacteria and yeast of hemoglobin and analogues thereof in non-erythrocyte cells
US5545727A (en) 1989-05-10 1996-08-13 Somatogen, Inc. DNA encoding fused di-alpha globins and production of pseudotetrameric hemoglobin
US5599907A (en) * 1989-05-10 1997-02-04 Somatogen, Inc. Production and use of multimeric hemoglobins
US5359831A (en) 1989-08-01 1994-11-01 United States Surgical Corporation Molded suture retainer
US5246104A (en) * 1989-08-01 1993-09-21 United States Surgical Corporation Molded suture retainer
US7413537B2 (en) * 1989-09-01 2008-08-19 Dyax Corp. Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins
US7144731B2 (en) * 1989-10-16 2006-12-05 Amgen Inc. SCF antibody compositions and methods of using the same
JP2657113B2 (ja) * 1989-10-16 1997-09-24 アムジエン・インコーポレーテツド 幹細胞因子
US6852313B1 (en) 1989-10-16 2005-02-08 Amgen Inc. Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor
US20040181044A1 (en) * 1989-10-16 2004-09-16 Zsebo Krisztina M. Method of stimulating growth of epithelial cells by administering stem cell factor
ES2157889T3 (es) * 1990-06-27 2001-09-01 Biogen Inc Linfotoxina complejada de superficie.
US5670149A (en) * 1990-06-27 1997-09-23 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, Lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
US7030080B2 (en) * 1990-06-27 2006-04-18 Biogen, Inc. Lymphotoxin-β, lymphotoxin-β complexes, pharmaceutical preparations and therapeutic uses thereof
AU8740491A (en) * 1990-09-28 1992-04-28 Protein Engineering Corporation Proteinaceous anti-dental plaque agents
CA2059245C (en) * 1991-02-08 2004-07-06 Michael P. Chesterfield Method and apparatus for calendering and coating/filling sutures
US5935777A (en) * 1991-02-19 1999-08-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. Entomopoxvirus expression system
DK1279731T3 (da) * 1991-03-01 2007-09-24 Dyax Corp Fremgangsmåde til udvikling af bindende miniproteiner
DE69226197T2 (de) * 1991-11-08 1999-02-11 Somatogen, Inc., Boulder Hämoglobine als arzneimittelabgabesystem
US5472871A (en) * 1992-02-28 1995-12-05 The University Of Colorado Foundation, Inc. Isolation and characterization of the nematode HER-1 Gene and protein product
US6001604A (en) * 1993-12-29 1999-12-14 Bio-Technology General Corp. Refolding of proinsulins without addition of reducing agents
US5470719A (en) * 1994-03-18 1995-11-28 Meng; Shi-Yuan Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides
US6475806B1 (en) 1995-06-07 2002-11-05 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Anchor libraries and identification of peptide binding sequences
US5925351A (en) 1995-07-21 1999-07-20 Biogen, Inc. Soluble lymphotoxin-β receptors and anti-lymphotoxin receptor and ligand antibodies as therapeutic agents for the treatment of immunological disease
JP2676139B2 (ja) * 1995-11-21 1997-11-12 樹脂化工株式会社 ガラス繊維プリフォ−ムの製造方法
EP0920533A2 (en) * 1996-08-15 1999-06-09 Abbott Laboratories Method for removing amplification inhibitors from test samples
SE9702401D0 (sv) * 1997-06-19 1997-06-19 Astra Ab Pharmaceutical use
ATE364624T1 (de) 1997-12-11 2007-07-15 Univ Saskatchewan Multisystemisches kümmerwuchssyndrom durch viren in schweine
US6369201B1 (en) 1998-02-19 2002-04-09 Metamorphix International, Inc. Myostatin multimers
US6210931B1 (en) * 1998-11-30 2001-04-03 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Ribozyme-mediated synthesis of circular RNA
EP1950302B1 (en) 1998-12-23 2012-12-05 ID Biomedical Corporation of Quebec Streptococcus antigens
CA2356836C (en) 1998-12-23 2011-09-13 Shire Biochem Inc. Novel streptococcus antigens
EP1734050A3 (en) 2000-06-12 2012-12-05 University Of Saskatchewan Immunization of dairy cattle with GapC protein against streptococcus infection
AU2001270381B2 (en) 2000-06-20 2007-05-24 Id Biomedical Corporation Streptococcus antigens
US6911204B2 (en) * 2000-08-11 2005-06-28 Favrille, Inc. Method and composition for altering a B cell mediated pathology
MXPA03001142A (es) * 2000-08-11 2004-08-02 Favrille Inc Metodo y composicion para alterar una patologia mediada por celulas t.
CA2424275A1 (en) 2000-10-02 2002-04-11 Shire Biochem Inc. Haemophilus influenzae antigens and corresponding dna fragments
MXPA03006042A (es) 2001-01-04 2005-02-14 Univ British Columbia Vacuna de escherichia colienterohemorragica.
EP2025754A3 (en) 2001-05-15 2009-05-13 ID Biomedical Corporation Moraxella (Branhamella) catarrhalis antigens
CA2455254A1 (en) 2001-06-18 2002-12-27 Shire Biochem Inc. Moraxella (branhamella) catarrhalis antigens
CN103232539B (zh) * 2001-06-26 2015-06-03 安姆根弗里蒙特公司 抗opgl抗体
AR045702A1 (es) 2001-10-03 2005-11-09 Chiron Corp Composiciones de adyuvantes.
JP4481646B2 (ja) * 2001-11-13 2010-06-16 アイディー バイオメディカル コーポレーション 緑膿菌のポリペプチド
AU2003287429A1 (en) * 2002-11-01 2004-06-07 Five Prime Therapeutics, Inc. Stem cell libraries
DK1618183T3 (en) * 2003-04-29 2015-02-23 Danisco Us Inc New Bacillus cellulase 029cel
WO2004099369A2 (en) * 2003-04-30 2004-11-18 Genencor International, Inc. Novel bacillus bagcel cellulase
US7449318B2 (en) * 2003-04-30 2008-11-11 Danisco A/S, Genencor Division Bacillus mHKcel cellulase
WO2004101763A2 (en) 2003-05-12 2004-11-25 Genencor International, Inc. Novel lipolytic enzyme lip1
EP1625208A4 (en) * 2003-05-12 2006-10-18 Genencor Int NEW LIPOLYTIC ENZYME LIP2
US7511005B2 (en) * 2003-05-12 2009-03-31 Danisco Us Inc., Genencor Division Lipolytic enzyme elip
US20060035242A1 (en) 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
EP2360175B1 (en) 2005-11-22 2014-07-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and Sapovirus virus-like particles (VLPs)
US8338376B2 (en) * 2006-10-20 2012-12-25 Biogen Idec Ma Inc. Compositions comprising variant LT-B-R-IG fusion proteins
AU2007311052B2 (en) * 2006-10-20 2014-01-16 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of demyelinating disorders with soluble lymphotoxin-beta-receptor
US20090192554A1 (en) 2008-01-29 2009-07-30 Confluent Surgical, Inc. Bioabsorbable block copolymer
ES2626297T3 (es) 2011-08-12 2017-07-24 Merial, Inc. Preservación asistida por vacío de productos biológicos, en particular de vacunas
BR112014011560A2 (pt) 2011-11-14 2017-05-09 Novartis Ag complexos imunogênicos de carbômeros polianiônicos e polipeptídeos env, e métodos de fabricação e uso dos mesmos
BR112015023239A8 (pt) 2013-03-14 2018-04-17 Abbott Lab ensaio de combinação de anticorpo-antígeno de hcv e métodos e composições para uso do mesmo
BR112015023355A8 (pt) 2013-03-14 2018-01-30 Abbott Lab antígenos recombinantes ns3 de hcv e mutantes dos mesmos para detecção de anticorpos aprimorada.
WO2014143343A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Abbott Laboratories Hcv core lipid binding domain monoclonal antibodies
CN105764917B (zh) 2013-09-26 2021-10-08 新加坡国立大学 利用溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法
EP3313863B1 (en) 2015-06-29 2020-12-23 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Degron fusion constructs and methods for controlling protein production
US20190030153A1 (en) 2015-07-22 2019-01-31 University Of Saskatchewan Mycoplasma vaccines and uses thereof
EP3500590A4 (en) 2016-08-18 2020-04-29 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University PRODUCTION AND USE OF PHOSPHOETHANOLAMINE CELLULOSE AND DERIVATIVES
JP7200100B2 (ja) 2016-10-19 2023-01-06 アバイブ， インコーポレイテッド 心臓血管系疾患の処置のためのアペリンの新規ペグ化リポソーム製剤

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521032A (en) 1974-08-08 1978-08-09 Ici Ltd Biological treatment
US4237224A (en) * 1974-11-04 1980-12-02 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Process for producing biologically functional molecular chimeras
US4082613A (en) * 1976-04-23 1978-04-04 The Regents Of The University Of Minnesota Process for the production of insulin by genetically transformed fungal cells
US4190495A (en) 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
NZ187300A (en) 1977-05-27 1982-08-17 Univ California Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism
ZA782933B (en) 1977-09-23 1979-05-30 Univ California Purification of nucleotide sequences suitable for expression in bacteria
US4411994A (en) * 1978-06-08 1983-10-25 The President And Fellows Of Harvard College Protein synthesis
GR71912B (ja) * 1978-08-11 1983-08-16 Univ California
ZA802992B (en) * 1979-06-01 1981-10-28 Univ California Human pre-growth hormone
GR70279B (ja) * 1979-09-12 1982-09-03 Univ California
CA1200773A (en) * 1980-02-29 1986-02-18 William J. Rutter Expression linkers
AU545912B2 (en) * 1980-03-10 1985-08-08 Cetus Corporation Cloned heterologous jive products in bacillies
JPS56137896A (en) * 1980-03-10 1981-10-28 Cetus Corp Genetic recombination gram positive bacteria , production thereof and protein for mammal produced by said gram positive bacteria

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｎａｔｕｒｅ，２８２（１９７９）Ｐ．５２５−５２７
Ｎａｔｕｒｅ，２８３（１９８０）Ｐ．４３３−４３８
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０５（１９７９）Ｐ．６０２−６０７

Also Published As

Publication number Publication date
KR830005355A (ko) 1983-08-13
ES501196A0 (es) 1982-02-01
PH18603A (en) 1985-08-21
IL62614A0 (en) 1981-06-29
ATE30336T1 (de) 1987-11-15
EP0038182A2 (en) 1981-10-21
FI811100A7 (fi) 1981-10-12
JPS56154999A (en) 1981-11-30
IL62614A (en) 1985-01-31
AU531566B2 (en) 1983-08-25
PT72834B (en) 1982-06-18
EP0038182B1 (en) 1987-10-21
ES8202589A1 (es) 1982-02-01
FI811100L (fi) 1981-10-12
ZA812382B (en) 1982-04-28
CA1175369A (en) 1984-10-02
US4338397A (en) 1982-07-06
GR74459B (ja) 1984-06-28
EP0038182B2 (en) 1993-12-15
BR8102164A (pt) 1981-10-13
DE3176493D1 (en) 1987-11-26
PT72834A (pt) 1981-05-01
DD158797A5 (de) 1983-02-02
AU6935481A (en) 1981-10-15
EP0038182A3 (en) 1982-05-26
NZ196768A (en) 1985-03-20
DK161681A (da) 1981-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0773504B2 (ja) 選択成熟蛋白質またはポリペプチドを細菌宿主内で合成する方法
KR900005776B1 (ko) 인터페론의 제조방법
JP2659530B2 (ja) ストレプトアビジン様ポリペプチドの製造
EP0035384B1 (en) Deoxynucleotide linkers to be attached to a cloned dna coding sequence
US4411994A (en) Protein synthesis
JP2763024B2 (ja) 牛のプレ成長および成長ホルモンの製造方法
EP0531404B1 (en) Ubiquitin-specific protease
JP3878207B2 (ja) ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド
JPH0513630B2 (ja)
JPH1014586A (ja) オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド
JPH0838176A (ja) 改良組換ｄｎａ分子
GB2073203A (en) Method of producing a polypeptide product and a plasmidic expression vehicle therefor,a method of creating an expression plasmid,a method of cleaving double stranded dna and specific plasmids
JPS5863390A (ja) Ｄｎａ配列を微生物によつて発現する方法及びその生産物
JP2010119396A (ja) 連続的ｉｎｖｉｔｒｏ進化
JPS6019493A (ja) 組換え体プラスミド，形質転換体微生物，ポリデオキシリボヌクレオチド断片，生物学的に活性な蛋白質およびその製法
JPH0376580A (ja) 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法
US4795706A (en) Novel expression control sequences
EP0052002A2 (en) Plasmid vectors, production and use thereof
AU775681B2 (en) Production of proteins by autoproteolytic cleavage
IE52781B1 (en) Human proinsulin and preproinsulin genes
GB2024229A (en) Process for producing proteins by the expression of the corresponding ADN in bacteria, modified DNA and vectors applicable in such processes
JPS63185385A (ja) プラスミドベクタ−
EP0109428B1 (en) Cloning vector with indicator genes which have been inactivated by frameshift
JPH06311884A (ja) プラスミド及びそれで形質転換されたエ シェリチア・コリ
EP0136090A2 (en) Improvements in or relating to expression plasmids