JPH07507440A - 結合親和性を高めた抗体構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 結合親和性を高めた抗体構築物 従来（ＱｉｉＪ 本発明は癌の画像診断試薬および癌の治療薬、より具体的には、画像診断試薬お よび／まＬは癌の治療薬として存用な抗体構築物の調製に関するものである。特 に、本発明は抗原結合親和性が高められ、上旦　ｖｉｖｏで短い半減期を持つ生 合成による抗体構築物に関するものである。

全身の薬剤療法は普遍的に使用される治療様式である。　Ｉｌｒ＆または器官の 画像診断のためのラジオアイソトープなど、４５識試薬の投与も同様である。し かしながら゛　、このような薬剤や放射性ラベルの投与は、それ自身では、薬剤 が標的選択１゛シか無いのが普通であるということから危険をはらんでいる。癌 の治療において使用される化学的治療薬やラジオアイソトープの効果を制限する ことは特に困難である。なぜならこれらの化学薬品は大抵の細胞、特に増殖期に ある細胞の代謝過程に干渉する能力を持っているからである。それ故、本分野は しばしば、このような薬物を特定の組織または癌細胞タイプにターゲツティング できる試薬に結合させることを示唆している。

抗体分子は種々の薬剤、酵素、毒素、およびラジオアイソトープにつなげられて いる（ボーズ（Ｇｈｏｓｅ）とプレア（Ｂｌａｉｒ）（１９７Ｂ）Ｊ、Ｎａｔｌ 。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５Ｌ、Ｇ上：６５７−６７６のレビューを参照）０例えば、 抗体は、磁気共鳴面像分析、Ｘ線解析、およびコンピューターを用いた断層撮影 法などの従来の検出法では検出されない隠れた腫瘍をｉ！！ｉ像診断するのにう まく利用されている（ゴールデンハーグ（Ｇｏ　ｌｄｅｎｂｅｒｇ　（１９８Ｂ ）Δｒｃｈ、ＰａＬｈｏ１．Ｌａｂ、Ｍｅｄ、１１２＋５８０−５８７参照）。

しかしながら、ターゲツティング試薬としての抗体分子の利用には多くの問題が つきまとう、腫ｊＨｂ’ＬＩ京に対する特異性を持つ放射性ラベルした抗体は標 的とされた腫瘍において０．０１％から０．００１％の付着率しか示さないこと もある（ゴールデンバーグ、上記）、加えて、特定の＆ｌＩｗ＆に関連した抗原 に対して特異性があるにも拘らず、１°ンタクトな抗体シこよる高レベルの非特 異的な結合が生じることもある。この非特異的な結合のいくらかは、その結合ド メインというよりは、むしろそのＦｃ部による抗体の接着に起因している。さら に、インタクトな抗体は、抗体分子の断片などのより小さな分子に比べ、除去速 度が遅い。

こうした問題を軽減しようとして、以前の研究から、特異性および抗原結合能を 保持した抗体断片の利用が示唆されている。抗体断片はインタクトな抗体よりも 迅速な特異的ターゲツティング能を示す（ツール（Ｗａｈｌ）ら、（１９８３） Ｊ。

Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄ、２４：３Ｌ７−３２５）、現在では、酵素により産生 されたＦ（ａｂ“）２フラグメントがこのような応用に最も広く利用されている 。こうした断片はインタクトな抗体分子の中で潜在的な問題を抱えたＦｃ部分を 欠いているため、インタクトな抗体に比べ、肝臓や１ｌＩｐＷ＆における非特異 的蓄積が低く除去速度も速いことが示されている１例えば、放射性標識したイン タクトな抗体１ｇＧを投与して数日後では、循環している放射活性および非特異 的に結合した放射活性のレベルは高く、除去は４日もしくはそれ以上かかって徐 々に起こる（ゴールデンバーグ、上記）、これに対し、Ｆｃドメインを欠いた抗 体断片の利用は腫瘍画像診断を２４−４８時間以内に可能にし、従って１ｆｆｉ ３　１や””　Ｔｃなどの半減期の短いラジオアイソトープの使用が可能となる （ゴールデンバーグ、上記）。

しかしながら、Ｆ（ａｂ’）ｔフラグメントの利用に問題がないわけではない。

酵素学的に生産することが困難なことに加え、これらの断片は結合特性が低下す ることもある（例、ワールら、上記参照）、それ故、特異性を持ち、結合活性が 高められ、非特異的結合能が最小限に抑えられた、そして１旦　ヱ土ヱ且でより 短い半６Ｊｉ期を持つターゲツティング分子こそが必要とされる。

この目的に対し、定常部に突然変異を持ち、抗原結合活性の増大したモノクロー ナル抗体が同定されている（例、ポロ７り（ＰｏｌＬｏｃｋ）ら、（１９ＢＢ） Ｐｒｏｃ、　ＮａＬｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５：２２９８−２ ３０２）、さらに、遺伝子工学により抗体に手を加え、それをトランスフェクト した細胞内で再び発現させることができることにより、免疫グロブリン分子の様 りな部分を融合タンパク質として組み合わせることが可能になっているにューベ ルゲール（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３上ス：６１ ４；モリソン（Ｍ。

ｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８７）八ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、へｃａｄ、Ｓｃｉ、５０ ユニ１８７；およびモリソンら、　（１９８８）ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｒｎ、３４ 　：１６６Ｂ）。

またＦａｂ（ホルビッッＣＩ（ｏｒｗｉＬｚ）ら、（１９８Ｂ）Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　１．八ｃａｄ、　Ｓｃ　ｔ、　Ｕ、　Ｓ、Δ、８５−１６８７）またはＦ（ ａｂ’）＊様７−７グメントなどの免疫グロブリン欠失変異を遺伝的にコードさ せることも可能である、ある研究では、免疫グロブリン重鎮のトランケート型で ある、Ｆｄ’　フラグメントを大腸菌内で発現させた（カビリー（Ｃａｂｉｌｌ ｙ）ら、（１９８４）Ｐｒ。

ｃ、ＮａＬｌ、へｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳへ　８１　：３２７３−３２７７）、別 の研究では、ヒ）Ｃｒ３Ｈ鎖の特異的な定常部を、抗体合成および組み立てに対 する影響を評価するために、欠失させたり付加したりした（モリリンら、（１９ ８７）Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、−５０７：１８７３）。

従って、腫瘍抗原を第２識し、それ故腫瘍の画像診断および／または破壊に有用 と考えられる抗体を招共することが、本発明の一つの目的である。またＦｃ受容 体への結合性が減少しそのため＊ｍや人体のその他の部分における非特異的蓄積 が減少した、腫瘍画像診断および／または癌治療に有用な抗体構築物を提供する ことも本発明の目的である。さらに別の目的としては、腫瘍抗原にすばやく結合 できる抗体構築物の提供およびインタクトな抗体全分子よりも半減期の短い抗体 構築物の提供が含まれる。

発朋Φ概要 ＣＨｌ、ｉ；よびＣＨ３ドメインは保持しているが、ＣＨ２ドメインを欠く抗体 構築物が驚くべきことに、インタクトな抗体分子と比較して、短い半減期を持つ とバに結合親和性が高められており、同じ特異性を持ちながら非特異的な結合が 予想外に低レベルであることが発見された。この発見は、様々な腫瘍抗原上にあ るエピトープに対して特異性を持つ抗体構築物に関する本発明の開発に利用され ている。

＋［ＧおよびＩｇＤクラスのネイティブな抗体分子は２本の重（Ｈ）鎖と２木の 軽（Ｃｕｆｆからなり、これらは共有（ジスルフィド）結合および非共有相互作 用によって互いに結ばれている。２本の鎖のアミノ末端にある可変（ｖ）ドメイ ンは一緒になって抗原結合８Ｕ域を形成する。Ｈ鎖の第１定常（Ｃ）ドメイン（ ＣＨＩ）は疎水性相互作用およびジスルフィド結合によっても、し鎖のＣ領域と 相互作用している。Ｈ鎖の次なるドメインはヒンジ部の隣でＣＨ２と呼ばれる。

このドメインはある報告によれば、補体固定およびＦｃ受容体の媒介する抗体依 存性細胞障害（ａｎＬｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｒｌｃ　ｃｅｌｌｌａｒ　ｃ ｙｔｏＬｏｘｉｃｉｔｙ；ＡＤＣＣ）を担う配列を含んだ、抗体のエフェクター 機能の多くを含んでおり、ヒ）（、ｒｌ鎖においては唯一のＮ結合型グリコジル 化部位である。Ｈ鎖のカルボキシ末端のＣＨ３ドメインはＨｆｆｌの組み立てに 重要な役割を果たしていると考えられている。

本発明の抗体構築物は、予め決定された特異性の免疫グロブリン結合領域をもつ 第１の部分を含んでいる。この結合領域は、同じエピトープに対して特異性を持 つネイティブな抗体の超可表部に相同な超可表部を複数持つ０本杭体構築物はさ らに、本質的にＣＨＩドメインとヒンジ部（羊のＣ端はＣＨ３ドメインのＮ端に 繋がっている）からなる第２の部分、即ちネイティブな抗体では通常存在するＣ Ｈ２ドメインが除かれたハイブリッド定常ドメインを含んでいる。ＣＨ２ドメイ ンの欠失した抗体構築物を本明細書中では以陣ΔＣＨ２ｔｌ築物と呼ぶ、ΔＣＨ ２ｌ１築物は、同じ特異性だがインタクトな定常ドメインを持つ抗体構築物の結 合活性と比べて、少なくとも２倍は高い結合活性を示すことが特徴である。

一つの好適な１！様においては、ΔＣＨ２抗体構築物の結合領域はネズミ免疫グ ロブリンなどの非ヒト免疫グロブリンの結合領域を含んでいる０本発明のある様 相では、本免疫グロブリン結合領域は、モノクローナル抗体８７２．３の結合領 域のようにムチンに対して予め決定された特異性を持つ、あるいはモノクローナ ル抗体１４．１８の結合領域のようにＧｅｔガングリオシドに対して予め決定さ れた特異性を持つものである０本発明の別の態様においては、本免疫グロブリン 結合領域はメラノーマに特異的なプロテオグリカンに対して予め決定された特異 性を持つ、改変された好適な定常領域はヒト免疫グロブリン定常ドメインを含ん でいる。

本抗体構築物は典型的には免疫グロブリン軽鎖にジスルフィド結合した免疫グロ ブリン重鎮を含んでいる。

本抗体構築物はさらに、腫瘍を破壊するタンパク質を含み第２の部分のカルボキ シ末端に緊かった第３の部分を含むこともできる。この第３蛋白の部分はリンホ トキシン、インターロイキン２、表皮成長因子（ＥＧＦ）　、その類憤活性物質 、またはその活性断片であることが望ましい０本発明の好適な態様においては、 第３の部分はリジンなど、エンドペプチダーゼで切断可能なアミノ酸残基を通じ て第２の部分のＣＨ３ドメインのカルボキシ末端に繋げられたペプチドである。

また、第３の部分は例えば、化学的架橋によって第２の部分に連結されていても よい。

さらに別の態様においては、画像診断試薬として使用するために、ΔＣＨ２抗体 構築物はそれに付けられた放射活性ラベルを含んでいる。

凹面史直艶久説朋 本発明の前述および他の目的、その種々の特徴は、その発明物と同様、下に説明 する付属の図面とともに読めば以下の解説から十分に理解されることができる。

図１は、ヒ）ＣＴ１遺伝子のΔＣ１１２欠失変異型の構築物を示す概略図である ：（Ａ）はＣｙｌゲノム遺伝子セグメントと制限部位を含むＨｉｎｄ　ｌ　Ｉ　 Ｉ−ＰｖｕＩＩ断片のマツプ；　（Ｂ）は制限酵素および連結処理後のＡｆ　ｌ 　ｌ　ｌ　Ｉ−Ａｖａ　１１断片（ＣＨ２エクソン）を欠いたΔＣＨ２欠失遺伝 子；（Ｃ）はＣＨ３遺伝子内に導入されたＳｍａ　１部位を示ず；　（Ｄ）はＩ Ｌ２ｉｊｌ伝子を含むＰｖｕｌｌ−Ｘｈｏ１断片（Ｅ）を連結させるために使わ れるＳｍａ　［−Ｆ”ｔｕ　Ｉ　Ｉリンカ−のマツプである；そして（Ｆ）はＸ ｈｏ１部位とポリＡＳＩＩ域を含むベクターの残りの部分である。

図２は種々のへＣＨ２キメラ椹築物の抗原結合活性のグラフである＝　（Ａ）Δ Ｃｔ（２ｃｈ１４．１部位体ｍｓ物；　（Ｂ）ΔＣＨ２キメラＢ７２．　３　（ ｃｈＢ、７２．３）抗体構築物。

図３は、（Ａ）３７”Ｃ１２時間インキュベーション後、および（Ｂ）４°Ｃ１ １８時間インキュヘーション後の、インタクトなｃｈ１４．１２抗体とΔＣＨ２ ｃｈ１４．１８抗体構築物の競合的抗原結合解析のグラフである。

図４はインタクトな抗体とΔＣＨ２ＣＨ２抗体構築物依存性細胞障害性（Ａ　Ｄ 　ＣＣ）のグラフである。

図５はインタクトな抗体とΔＣＨ２抗体構築物の補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ ）のグラフである。

図６はＭ２１異種移植片腫瘍を持っ胸腺のないヌードマウス内でのある時間にゎ たっての（Ａ）インタクトなｃｈ１４．１部位体と（Ｂ）ｃｈ１４．１８　ΔＣ Ｈ２抗体構築物の組織分布を表すグラフである。

図７はＭ２１異種移植片腫瘍を持つヌードマウス内でのＦ（ａｂ’）！フラグメ ントとΔＣＨ２抗体構築物の組織分布を表すグラフである。

図８はＭ２１異種移植片腫瘍を持つ胸腺のないヌードマウスの直液循環からのΔ ＣＨ２抗体構築物、インタクトな抗体、およびＦ（ａｂ’）ｔフラグメントの除 去を表すグラフである。

元型９説朋 本発明は、［１１ｍ１．に関連した抗原または他の抗原に対する特異性を持ち、 高められた結合活性、比較的短い半減期、そして比較的低いレベルの非特異的結 合という１旦　ヱ１ヱ旦における特性を表す、トランケートした抗体構築物を主 に取り扱う。

これらのΔＣＨ２１ｌ築物は腫瘍画像診断や全身薬剤療法による治療のためのタ ーゲツティング試薬として適したものである。

本発明はヒトの腫瘍抗原上のエピトープに対する結合特異性を持つ抗体構築物を 提供する０本杭体の特異性；よ当の腫瘍の選択的ターゲツティングを可能にする ＩＩｒｇＩ抗原に対するものが好適である、即ち、本構築物は腫瘍に独特なマー カーに結合する。残念ながら、ヒトの癌に対してはわずかな抗原特異的マーカー しか同定されていない、しかしながら、ヒト腫瘍細胞は胚細胞などの正常な細胞 にも少量存在する腫瘍関連抗原も持っている。そのような抗原にはアルファフェ トプロティン（ＡＦＰ）や癌胚抗原（ＣＥＡ）が含まれる。これらの抗原やムチ ン（８７２，３抗体）やジルアロガングリオシドＧ、、（１４，１８抗体）など の腫瘍に関連した抗原を認識する抗体構築物は本発明に含まれている。

本発明のΔＣＨ２構築物は、抗体の様りなドメインをコードするＤＮＡを遺伝子 旦作することにより調製できる（例、ニューベルゲールら、（１９８４）Ｎａｔ ｕｒｅ３１２：６０４；モリリンら、（１９８７）Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、５０ユニ１８７；モリリンら、（１９８Ｂ）ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、３ ４　：　１６６８；ホルビッツら、（１９８８）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、　■：　８６８７を参照）。

ヒトにおけるΔＣＨ２構築物の免疫原性を減らすために、本ΔＣＨ２構築物は非 ヒトタンパク質を最小限し力峙たないように設計された。これは、定常部は少な くともヒトのものであり哺乳動物（例、マウス）の可変部を持っキメラ抗体分子 を作り出すことによっても達成できる。

予め決定された特異性を持つ組み換えキメラ抗体の産生は、クローン化されたゲ ノムＤＮＡ断片を利用するのが典型であった０例えば、ＨおよびＬｉｉをコード するゲノムＤＮＡ配列を再編成した形で（即ち、Ｂ細胞の成熟の際の組み換え現 象から生じるＤＮＡ配列の形で）クローン化することが可能である。これらのゲ ノム配列はそれ自体で発現に必要な情報（即ち、５°非翻訳配列、プロモーター 、エンハンサ−、タンパク質コード領域、およびドナースプライス部位）を含ん でいる。■遺伝子セグメントの３°端にあるドナースプライスシグナルは、他の 種の１ｇｌ域の５°瑞にあるスプライスアクセプターシグナルと適合性である。

即ち、二者からのスプライス産物は正しい読み枠を維持している０例えば、マウ ス■とヒトＣ，セグメントをつなげ適当な宿主細胞タイプにトランスフェクトす れば、１次転写産物は正しくスプライシングさね、■およびＣ領域の両方にわた るオーブンリーディングフレームを持つ成熟メツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ ）を生じる。

キメラムＣＨ２１！築物を産生する好適な方法には、免疫グロブリン定常部をコ ードするカセットのｊＪｉｍが含まれる。このカセットは、本免疫グロブリン定 常部をコードするセグメントの免疫グロブリン可変部（適合性のスプライス配列 を持つ）をコードするＤＮＡセグメントへのスプライシングを可能にするＤＮＡ 配列を含んでおり、従って免疫グロブリン重鎮または軽鎖の次の転写および翻訳 を可能にしている。この方法は、同時係属中の米国特許出願４０９，８８９号（ 発明の名称”融合タンパク質産生の方法”、１９８９年９月２０日出願、本明細 書中に参考文献として取り入れられている）に記載されている。

簡単に述べると、ＤＮＡカセ−／　トはスプライスドナ一部位の３°端を再構築 し、可変ＣＶ）１４域をコードするＤＮＡ配列もしくはエクソンの３°端にそれ を付けることによって調製される。そのカセットを、５′端に適合性のスプライ スアクセプター昭立を持つ定常（Ｃ）Ｓｉ域遺伝子に対する発現可能なりＮＡ　 （構造遺伝子）とともにトランスフェクトする。

トランスフェクトされた細胞における融合タンパク質の発現を導く一連の現象の 中で、２つのＤＮＡ配列由来のｍＲＮＡはスプライシングを受けて、完全な■、 または■、をコードする５′端およびヒトＣ，またはｃＬドメインをコードする ３゜端を持つ成ｐｍＲＮＡを生み出す、その結果生じる単鎖ポリペプチドは、本 構造遺伝子のエクソンにコードされる■領域と定常ドメインとの融合物である。

さらに、腫瘍破壊因子をコードするカセットをスプライシングによりＩｇＣ８ｌ 域につなげてもよい、そのＩｇｃｓＪｔ域は免疫グロブリンのＶＳｉ域にスプラ イスされるのでごマジックプリント（ｍａｇｉｃ　ｂｕｌｌｅｔ）”型の治療薬 ができあがる。

本ｃＤＮＡはＩＩ瘍抗原に特異的なＨまたはＬ鎖ＶＭ域（非ヒトである場合が多 い、例、マウス）をコードし、一方、本ｃｌ域エクソンは別の（ヒトである場合 が多い）１８種（７）ＨｔたはＬ鎮Ｃ６Ｉ域（ＣＨＩ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメ イン）をコードする。有用なり領域は、多くの神経芽細胞腫、メラノーマ、グリ オーマ、および肺小癌の細胞系列や組織の表面上にあるジシアロガングリオシド Ｇ１を認識するネズミモノクローナル抗体１４．１８　仏ジｚ−（Ｍｕｊｏｏ） ら（１９Ｂ？）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、土ユニ　１０９８−１１０７１）のＶ、 およびｖＬ　ドメインを含んでいる。他の有用なＶＳＩ域は、多くの乳ガンや結 腸癌上のムチン様構造を認識するネズミモノクローナル抗体８７２．３（ジッン ソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４６：８５０） のＶ＠６よびｖＬドメインを含んでいる。これらの■領域は、１ｇヒトガンマ（ Ｈ）鎖および力７バ（Ｌ）鎖のＣｆｉｌ域などの種々のＣＨＩ域と組み合わせる ことが可能である。また、本ＶＳＩ域はヒトオリジンのものでもよい、単一のコ ンピテント宿主細胞におけるＨおよびＬ構築物の発現は請求める特異性を持つイ ンタクトなキメラ免疫グロブリンおよび例えば、インタクトなヒト定常部の産生 をもたらす。

ΔＣＨ２構築物を生産するために、一つのＶＳＩ域カ上カセツト築し、Ｃ領域を コードするＤＮＡ配列とともにそれを適当なベクターに導入する。このＣＳＩ域 はＣＨ２ドメインを特異的に欠いており図１に示すように設計されている０図Ｉ ＡはヒトゲノムＣγｌ遺伝子セグメントを含むＨｉｎｄｌｌｌ−Ｐｖｕｌｌ断片 のマツプを示している０図ＩＢは、制限酵素処理し合成リンカ−（へｆｌｌ１１ 端とＡｖａｌＩ端を接続する）で２つの断片を連結した後のΔＣＨ２１ｌ築物の Ｃ８９域をコードするＤＮＡを示している。

この変異Ｃｅ１ｌ域をコードするベクターを、本ベクターを発現させる能力を持 つ適当な宿主にトランスフェクトする。２つのＤＮＡの共発現の際に、組積の核 内酵素は正常なスプライシング現象を実行することによりｍＲＮＡを生産し、融 合タンパク質をコードするｍＲＮＡが生しる。キメラ結合タンパク質の場合にお いては、本ｍＲＮＡは（５°から３゛の方向に）ｖｏまたはｖＬドメインをコー ドすることもでき、それはＶＣジャンクソヨンまでネイティブな配列と同一で、 少なくとも一つのＣｓ、ｉｆ域ドメインの少なくとも一部のように他のポリペプ チドに直接つながっていてもよく、そのＣ６ｉ域は例えばヒトの配列であっても よい、ドナースプライス部位の３′側半分（および下流のヌクレオチド）とアク セプタースプライス部位の５゜側半分（および上流のヌクレオチド）はイントロ ンとして取り除かれ、適切な融合タンパク質をコードするｍＲＮＡを生ずる。

通常、２つのエクソンはともに単一の調節配列の制御下に、同じベクター上に置 かれる。また、宿主細胞がインタクトな融合タンパク質を分泌するよう、Ｌｔｉ とＨ鎮の両方の構築物を共発現させることも好適である０本手法はＤＮＡスプラ イスシグナルを認識し適切なスプライシングを実行する酵素を持つ宿主細胞の利 用を要する。

特定のヘクターｆＭ築、宿主細胞選択、形質転換、および発現方法は、本来、本 発明の一つの様相を構成するわけではないが、各人の好みゃ都合により本分野に たずされる者によって選択、実施されうるちのである０本発明で利用可能な技術 は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ＰｒｏＬｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉ。

Ｌ９ＪＬＬ（Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、４３ ０Ｆｏｕｒｔｈ　５ＬｒｅｅＬ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、Ｎ、Ｙ、、１９８９）に開 示されている。有用なベクターとしては、対象となる遺伝子の転写および翻訳の ための正しいソゲナルを含む既知の多くのプラスミドが含まれる。エンハンサ− エレメントが存在していてもよく、ポリアデニル化やスプライシングのための付 加的なシグナルは、その遺伝子自身がら提供されない場合は存在していなければ ならない０例えば、機能的に再編成されたＩｇｉｆｌ伝子の発現のためのシグナ ルのすべては一連のＤＮＡストレンチ上に存在しており、転写プロモーター、イ ントロン配列の排除やポリアデニル化のためのスプライシングシグナルおよび終 結部位を含んでいる。さらにベクターにより提供されなければならない情報は選 択マーカー遺伝子である。

この遺伝子は選択的表現型（通常、例えばメソトレキセートなどの毒性薬剤の致 死効果に対する耐性）の発現のためのシグナルも含んでいなければならない、そ れ故、ベクターが第１および第２ポリペプチドの両方をコードしていれば、ベク ターは限られた量のスペースに３つの独立した転写単位に対する配列情報を提供 しなければならない。

組み換えカセットを含むベクターを適当な布種細胞にトランスフェクトする。宿 主細胞選択の選択は、先に注意した基準に加え、増殖培地における増殖能にも基 づき、形質転換後の選択の容易性と同様に商業的に入手可能で血清を含まないも のが好適である。キメラ抗体の産生にあたって、有用な宿主細胞には例えば、ネ ズミ■ｇ非生産５ｐ２１０　Ａｇ　１４ハイブリド一マ細胞系列などのミエロー マやハイプリイドーマ、酵母、細菌、および植物細胞が含まれる。有用な布種細 胞はさまざまな倉庫においてそして商業ソースから広く入手可能で、本分野に熟 達したものにより天然ソースから容易に分離することもできる。

組み換えＤ　Ｎ　Ａを細胞に導入する一つの方法としてはエレクトロポレーシヨ ン（例、ボッター（ＰｏＬＬｅｒ）ら、（１９８４）Ｐｒｏｃ、ＮａＬ　ｌ、Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦１ニア１６１−７１６５を参照）がある、これは特殊な装置 と高度の精製されたＤＮＡを入手しなければならない、しかしながら、特定の細 胞タイプに条件を最適に設定すれば、この方法を用いて異なる多くの細胞系列を 形質転換することが可能である。

別のトランスフェクション法はプロトプラスト（スフェロプラスト）融合法（例 、サンドリーゴルジン（Ｓａｎｄｒ　１−Ｇｏ　ｌｄ　ｉｎ）ら、（１９８１） Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏｌ、１ニア４３−７５２を参照）である、対象と なる＆１１み換えプラスミドを持つ細菌を化学試薬（一般的には４５−５０％ポ リエチレングリコールの等張性緩衝溶液）でリンパ細胞と融合させる。この方法 は簡単でプラスミドＤＮＡの徹底的な精製を要しない、加えて、非常に高い形質 転換効率を得ることができ、そしてこのトランスフェクション法は多コピーのプ ラスミドを含むトランスフェクトントを与える可能性が高いので生産性の高いト ランスフェクト細胞クウーンを得るまでの時間が軽減される。

本ベクターで首尾よく形質転換された細胞は次に、そうでないものから分離され なければならない、トランスフェクトされた細胞の選択には多くの方法力侑”効 である０例えば、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｃ）やネオ マイシン（ｎｅｏ）耐性マーカーをリンパ細胞の選択目的に利用することができ る。マーカーをコードする遺伝子はｖ領域をコードするベクターに含まれること であろう。

ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の耐性型も、ハイブリドーマ細胞形質転換体 の選択のため、さらにマーカーとそれに隣接する産物遺伝子の増幅のために利用 することができる。

次にトランスフェクトされた細胞を培養しカセットにコードされたポリペプチド を発現させる。培養は１旦　ｖｉｔｒｏで行なってもよいし、あるいは組み換え 抗体の場合には腹水液中での上ユ　ｖｉｖ＋）培養などの他のストラテジーをと ることによって達成することもできる。

インタクトな抗体分子から欠失されたヒトＣｒ１重鎮のＣＨ２ドメインは以下の 配列を含んでいる：長い半減期をもたらす配列；エフェクター細胞上のＦｃ受容 体への結合を担う配列；単一のＮ結合型糖鎖が付（配列；および第４捕体成分、 Ｃ１ｑが結合する配列。

これらの配列が様々な抗体機能にどの程度必要とされるかを決定するために、Δ ＣＨ２ＣＨ２構築物く試験しｆこ、インタクトな抗体を発現させた細胞の上積と ΔＣＨ２抗体を発現させた細胞の上清をまず、結合したヒトに鎖を測定すること により定量しそのデータを抗原結合ドメイン数（抗体分子は抗原結合部位あたり １つのに軽鎖を含んでいる）にたいして１５学化し、次に直接的な抗原結合アッ セイで比較したところ、図２に示すように、へＣＨ２構築物の方がずっと高い活 性を示した。Ｃｈ１４．１８　ΔＣＨ２４１！染物はＣＩＩＫでコートしたプレ ート上で、一方ｃｈＢ７２．３　ΔＣＨ２ｆＸ構築物ムチンでコートしたプレー ト上でアッセイした。

ＥＬＩＳＡプレートに関する非特異的相互作用の可能性を排除するため、ΔＣＨ ２ＣＨ２構築物結合活性をさらに競合的結合型において検定した０図３に見られ るように、ｃｈ１４．１８　ΔＣＨ２椹築物は、正常な抗体が自身と競合するよ りもずっと効果的に、ラベルした１ンタクトなｃｈ１４．１Ｂ構築物と競合した 。結合アッセイの長さを２時間（図３Ａ）から１８時間（図３Ｂ）に伸ばすと、 結合における相違はそれほど劇的ではない、ごれはＣＨ２ドメインの除去によっ て全体的親和性ではないが抗原結合速度が増加することを示唆するものである。

ΔＣＨ２抗体構築物の抗原結合の増加は抗体分子におけるコンフォメーシッン変 化を反映していると仮定される。Ｃ１１２ドメインの除去によって、ＦａｂｊＪ 域（Ｖ領域、ＣＬおよびＣＨＩ配列を含む）はもはやＣＨ２ドメインとの相互作 用によって１１ｉＩｌｌｌ！！されることがない、こうしたドメイン間相互作用 を取り除くことにより抗体との会合速度が増加するように見える。さらにＣＬ（ ２ドメインの炭水化物部分の除去は、（九体と１２との空間的相互作用を減らず こともあるであろう。

Ｃ８２Ｍ域によるエフェクター機能がΔＣＨ２抗体ではもはや保有されないこと を確かめるためには、インタクトなｃｈ１４．１８抗体を比較対照として用いた ＡＤＣＣアッセイによることができる。ＡＤＣＣアフセイにおいては未分画の末 梢血管系白血球（ＰＢＬＳ）のメラノーマを標的とした溶解能を、加えた抗体ｌ に対して測定する。その典型的な結果を図４に示す０図において、ｃｈ１４．１ Ｂ抗体およびΔＣＨ２構築物をある濃度で与えた条件下におけるＭ２１ヒトメラ ノーマの特データのポイントについては３回行った実験の平均値をとった。イン タクトなｃｈ１４．１Ｂ抗体はｌｎｇ／ｍｌといった低濃度においても高いＡＤ ＣＣ活性を持っている。覧りべきことにΔＣＨ２構築物はきわめて低いΔＤＣＣ 活性しか示さなかったＡＤＣＣ活性の失活はＦｃ受容体への結合能の消失を反映 している。高親和性受容体（ＦＣＲ）への結合部位がヒンジ領域に隣接したＣＨ ２６１域に限定されているので、ΔＣＨ２変異により結合活性が消失することは 驚（にあたらない、腫瘍の放射性画像診断において重要なのは、Ｆｃ受容体への 結合を低減してやることによりＦｃ受容体をもつ細胞が局在している［への非特 異的な石積を抑えることである、ここで記載したΔＣＨ２ＣＨ２構築物点におい ても有用である。

さらに予想されていたことであるが、ΔＣＨ２Ｉｊｉ築物においては補体による メラノーマ標的ｗｉｌ胞の溶解の誘導能が低下していることが観察された０図５ においては、ΔＣＨ２変異を用いた場合ヒト補体の存在下でｈｉ２１７の溶解能 を検出できる程急好色 農には示さないのに対し、ｃｈ１４．１Ｂ抗体はきわめて高い溶解能を持つこと が示されている。

坑腫瘍へＣＨ２抗体は腫瘍細胞に特異的かつ迅速に局在しうるちのであるため治 療薬の生体内の配送に際して理想的な運搬体となりうる。たとえば図１　（Ｃ） 　−（Ｅ）に示したように、ヒトインターロイキン−２（ｌＬ２）をコードする ＤＮＡ配列をＩａｆｔｉΔＣ１４２構築物のカルボキシル末端につなぎ、ΔＣＨ ２／Ｉ　Ｌ２２重蛋白質を発現させることにより、ｔＬ２を１ｍ部位に配送する ことができる０局所的なＩＩ、２のＴ；積は腫瘍部におけるＴ細胞を活性化し、 Ｉｆ！瘍の破壊を促進する。ΔＣ１（２抗体の半減期は全抗体よりは短いが、Δ ＣＨ２／ＩＬ、２融合蛋白質の半減期はｌＬ２より長いはずである。

もう一つの例として抗１１７Ｂサイトカインであるリンホトキシンもしくは腫瘍 壊死因子β（ＴＮＦβ）を、ΔＣ１１２抗体のカルボキシル末端に融合したもの が考えられる。この融合蛋白質もまた、こうした細胞傷害性の蛋白質を腫瘍に特 異的に局在させ潜在的な全身的副作用を低域するのに有効である。同様に他の毒 性蛋白質をΔＣＨ２抗体に融合することがかのうである。こうした蛋白質として かんがえられるのはりンン（ｒ　ｉ　ｃ　ｉｎ）、ジフテリア機素、シュードモ ナス（Ｐｓｅｕｄｏｒｎ。

ｎａ　ｓ）の外毒素である。またｌ＼ＤＰリボシル化酵素活性の部分だけで哺乳 類細胞の延長因子２を失活させることができるように、毒素分子全体のなかで毒 性に重要な部分だけでも有効である。

種々の抗体構築物のｉｎ　ｖｉ〜・０における組織特異性および半減期は生体内 の分布を調べることで決定することができる。外来性のＭ２１１１１１をもつ動 物に、インタクトな抗体、ΔＣＨ２またはＦ（ａｂ’）、を注射し、種りの体内 器官および組織における各構築物の蟹を一定のＭ間中または一定の時間に測定す る０図６と表１は（Ａ）インタクトなｃｈ１４．１Ｂ抗体および（Ｂ）ΔＣＨ２ ４１１ｉ築物の生体内分布を時間に対して示したものであるが、後者が迅速に（ ４時間以内に）腫瘍に特異的に標的作用していることが実証されている。

表１ キ間□ 抗体　試料組ｗ８　４時間　２４時間　９６時間（＾）　ｃｈ１４．１Ｂ Ｍｌｌ、／血液　０．１８　０．５６　１．０８肝Ｎ／血液　０．７９　２．０ ２　４．５５＜８）　ΔＣｌＩ２ 腫瘍／血ｆｉ　Ｏ，８６２，２０１，１９肝臓／血液　２．９８　７．３７　２ ．２８図７はヒトＴｇＦ　（ａｂ’　）ｔＭ片石よびｃｈ１４．１８ΔＣＨ２横 築物の注射後２４時間における生体内分布を示したものであり、ΔＣＨ２ｔｌｌ ｌ築物の標的作用の特異性が実証されている。

ΔＣＨ２抗体構築物の血流中での半減期の決定は、ＩＩ瘍をもった動物の血流中 にこれらの構築物をａＪＩルで、血液中での存在量を時間とともに測定すること により可能である１図８は、外来性のＭ２１腫瘍をもつヌードマウスの血流中で 、ΔＣＨ２ＣＨ２構築物ｉ期がＦ（ａｂ’）□断片およびインタクトな抗体に比 べて短いことを示している。

ΔＣＨ２抗体は迅速にＬｔ度エピトープに結合し、他の組織への非特異的な結合 も比較的僅かであるので、種々の治療薬を腫瘍に標的作用させるのに利用するこ とができる。特に有効な治療薬としてはインターロイキン−２、リンホトキシン 、上皮性生長因子などの直接または間１妾的な腫瘍殺傷活性をもつ薬剤が挙げら れる。例えば細胞傷害性Ｔ細胞と結合しこれを活性化する抗体と、ＥＧＦを融合 させれば、Ｔ細胞とＥＧＦ受容体をもつ細胞とが作用しうるようになる。またこ のようなｍ殺傷活性をもつ蛋白質の部分断片や生合成類縁体も有用である。これ らの蛋白質はこの分野で知られている種々の架橋剤によりＣＨＪ　ＳＩ域に化学 的に結合することが可能であり、またこれまでに記したようにＣＨ３５Ｉ域のカ ルボキシ末端にペプチド結合することもできる０例えばΔＣＨ２構築物をコード するように構築したベクターには、さらにｔｔ瘍殺傷性の蛋白質を挿入すること が可能である。

ΔＣＨ２ｆＪｌｌ築物の結合活性の増大は、ｉｎ　ｖｉｖｏにおける半減期の短 縮、および非特異的結合のレベルの低下とあいまって、腫瘍の放射性面像診断お よび放射性治療に際してもこの分子を飛躍的に有用なものとする０例えば低エネ ルギー核種である沃素−１２３、インジウム−Ｉｌｌ　、テクネチウム−９９ｍ 、また構築物に取り込まれても結合活性を変えない沃素−１２５などの放射性同 位元素によりラベルすれば、放射線を外部から検出することにより、ΔＣＨ２抗 体の構築物を用いて腫を用いることも可能である。またΔＣＨ２抗体の構築物を ガドリニウムなどの強磁性体物質でラベルし、腫瘍の周辺に局在する抗体の濃度 差を核磁気共鳴画像法により画像化することも考えられる。

腫瘍殺傷性の物質と融合させた、および／または放射性核種を取り込ませた横築 物の標的作用に際しては、構築物は高濃度で画像処理に要するよりも長い半減期 を持つことが必要である。また画像診断に要する放射活性のレベルの決定要因と しては、抗体構築物が周囲の＆ｌＩｗ＆に比べて腫瘍を選択的にラベルする能力 、腫瘍の大きさ、注射した部分から腫瘍までの距離なども挙げられる。

、ΔＣＨ２抗体構築物の３“または５′末端のいずれかに、例えば２〜２０残基 よりなるリジン（Ｉｙｓｉｎ）に富んだポリペプチド配列を化学的に結合させて 、上で述べたように遠隔的に検出可能な成分の取込み部位としてやることである 。ガンマ線または陽電子放射性のイオンは、リシン残基上のｔｉ離のアミノ基と の電気的相互作用またはキレート反応によりこうしたリンカ−に取り込ませるの が好ましい。

例えばノエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）をＴｃ−９９またはＩｎ− １１１によるラベルに用いることができる。Ｉｎおよび■の同位元素はオキシン 塩（８−ヒドロキシキノリン）を用いて取り込ませることができる。ヨードゲン （１，３，４，６テトラクロロー３α、６αジフ工ニルグルコルリルーＰｉｅｒ ｃｅＣｈｃｍ、Ｃｏ、、Ｒｏｓｋｖｉｌｌｅ、ＩＩＩ）は、＋ｚｓｌによるラベ ルに用いることが可能である（例えばＴｈａｋｕｒ　ｅｔ　ａｔ、　Ｔｈｒｏｍ ｂ、Ｒｅｓ。

９：３４５　（１９７６）、ＭｃＦａｒｌａｎｅ、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｉｎｖｅｓ ｔ、４２：３４６　（１９６３）、Ｋｎｉｇｈｔ　ｅＬ　ａｌ、Ｒａｄｉｏｐｈ ａｒｍａｃｅｕＬｉｃａｌｓ、Ｎ、Ｙ、Ｓｏｃ、ｏｆ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｍｅｄ ｉｃｅｎｅ。

１９７５、ｐｐ、１４９およびＨａｒｗｉｇ　ｅＬ　ａｌ、、ＩｎＬ、Ｊ、Ａｐ ｐｌ、Ｒａｄｉａｔ、ｌ５ｏＬ、２７：５．１９７６を参照）、その他いくつか の方法が当業者に知られている。

前述の考え方にたてば、通常の手段により既知の他の１１類の試薬もΔＣＨ２構 築物に結合できることは明らかであろう、ここで例として挙げられるのは治癒促 進効果をもつ薬剤であり、カルシトニン、表皮生長因子、腫瘍生長因子αおよび β、血小板由来生長因子、インシュリン様生長因子■　（ソマトメジン−Ｃ）、 結合組織活性化ペプチド、ヒトコラゲナーゼインヒビターなどが代表的である。

本発明にしたがって生産されたΔＣＨ２構築物群の投与濃度および方法は、薬剤 のもつ性質、結合物にしたとき万一生理活性の低下があればその度合い、個々の 患者の免疫寛容、治療の対象としている病気の症状内容により決定される必要が ある、ポリペプチドが画像診断のための薬剤に結合している場合には、シンチレ ーシツンスキャニング、またはオートラジオグラフィーなどの腫瘍に局在する放 射線を外部から検出出来るような放射線検出法を用いて検出するために十分な量 が投与されなければならない、一般に５〜２０マイクロキユリーを投与する必要 がある。もっとも好ましくは、約１０マイクロキユリーである。実際の投与量が 腫瘍に関連する抗原の局在により決定されることは、本分野において周知のこと である。必要であれば、−Ｃ的に安全基準とされる範囲内の量の放射性ペプチド をさらに注射できる腫瘍の画像診断および治療は、静脈注射によるΔＣＨ２ＣＨ ２構築物投与で行うことができる。この場合の好ましい用量は約０．０１〜１０ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。

以下に記載する非限定的実施例により、本発明の理解をより深めることができよ 実施例 （１９８９）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、ＭＣｔｈ、１２５：１９１−２０２をｐＢＲ３ ２２にサブクローニングしたものを１１鎖変異株の作成に用いた。ＣＨ２Ｓｉ域 を欠いた欠失変異体（ΔＣＨ２）は、Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ　−Ａｔ　ｌｌｌｌＦｒ 片（Ｃ１（２とヒンジのエクソンを含む）をＡｖａｌＩ−Ｐｖｕｌ＋断片（ＣＨ ３エクソンを含む）に合成二本鎖オリゴヌクレオチド断片によりつなげることで 作成した。へＣＨ２構築物はＤＮＡ塩基配ダ１％析により確認した。その後マウ スモノクローナル抗体１４．１８のＶｅＩＭＣＭｕｊｏｏ　ｅＬ　ａｌ、（１９ ８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７：１９０Ｂ）を含むｐｄＨＬ２−ＶＣ７１Ｃ ｚ（Ｇｉｌｌｉｅｓ　ｅｔ　ａｌ、同上）をキメルポキシ末端の近傍に変異改変 によりＳｍａ１部位を導入した（図１　（ｃ）　）　、この変異により２３７３ 番目の塩基（Ｈｕｃｋ　ｅＬ　ａｌ、、（１９８６）Ｎｕｃｌ、ΔｃｉｄＳ、Ｒ ｃｓ、１４：１７７９−１７８９の番号付けによる）は、ＴからＣに置換される が、これはセリンコドンのゆらぎ位置に相当するのでアミノ酸配列には変化はな い０合成りＮＡ＠片を用いて成り＋　Ｌ２蛋白質の配列をこのＳｍａ１部位につ ないだ（図ＩＤ−巳）、この配列は５°から３゛に向けて、Ｓｍａ［部位列の単 一のＰｖｕｌ［部位までを含んでいる。残りの［Ｌ２配列をさらにｐｖｕ［１部 位につなぎ、翻訳終了シグナルの３′側に位置する単一のＸｈｏ１部位までのコ ード配列がこれに含まれる。つないだＤＮＡのＸｈｏｒ末端をヘクターにライゲ ーションすることにより、マウスχ定常領域の３”非翻訳領域とｐｏｌｙＡ付加 部位を付は加えた（図ＩＦ）、作成した構築物は、ΔＣＨ２ヒトガンマ１鎖にカ ルボキン末端でＩＬ２が結合した形となる。

形質転換と選択は、基本的には参照により含まれるＧ１１ｌｉｅｓ　ｅｔ　ａｔ 、ＣＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ１．　（１９Ｂ９）７：７９９−８０４）の方法によ り行った。簡単に述べると、非１ｇ生産性のマウスハイブリドーマ系５ｐ２１０ 　Ａｇ１４を１０％ウシ胎児血清を含むダルベンコの修飾イーグル培地（ＤＭＥ Ｍ）で培養した。Ｇ１１ｌｉｅｓ　ｌ！Ｌ　ａｌ−（（１９８３）Ｃｅｌｌ、３ ３ニア１７−７２８）の方法に実質的にしたがってプラスミドをプロトプラスト 融合法により細胞内に導入した。形質転換体は初濃度が０．１μＨのメトトレキ セート（ＭＴＸ）を含む増殖培地中で選択した。ＭＴＸ耐性のクローンについて ＥＬＩＳＡアッセイによりヒト抗体の分泌を調べた。マイクロクイタープレート をヤギの抗ヒト［ｇＧ（ＨおよびＬ特異的−Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｉｅｓ）でコートした後、形質転換体による馴化培地を加えてインキュベート した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的−Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ ｅｓ）を西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したものを用いてヒト抗体を検出し た。最大量の抗体を生産しているクローンをさらにＭＴＸの濃度を次第に高めた （０６１μＨから１μｈ、順化後さらに５＃Ｍから終濃度１０μＭＭＴＸ）培地 中で培養した。１０μ）ＩＭＴＸ下で数世（慣代したのち、限界希釈法によりモ ノクローナルな細胞系を得た。

３、蛋白質の精製 インククトなｃｈ１４．１Ｂ抗体はプロティンＡセファロース（Ｒｅｐｌｉｇｅ ｎ）への結合および溶出により精製した。ΔＣＨ２変異抗体は抗ヒトにモノクロ ーナル抗体−セファロースカラムへの免疫親和性クロマトグラフィーにより精製 した。５ＤＳ−ＰＡＧＥまたはＨＰＬＣで解析した結果、両蛋白質はともに９０ ％以上純粋であった。

４、抗原結合アッセイ 抗原への直接的結合アッセイおよび競合結合アッセイは、ジシアロガングリオシ ドＧ、！抗原（１４，１８抗体）または顎下腺ムチン（Ｓｉｇｍａ）（８７２， ３抗体）でコートしたマイクロタイタープレートを用いてＧ１１ｌｉｅｓ　ｅｔ 　ａｌ、（１９９０同上）の方法により行った０両者の場合ともに二次（検出） 抗体としてヤギ抗ヒ）ＩｇＧ、Ｆｃ特異的ポリクローナル抗血清（Ｊａｃｋｓｏ ｎ　１ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ） でラベルして用い１こ、簡単に述べるとＧｏｔでコートしたプレートをまず５％ ウシ直情アルブミン（ＢＳＡ）と５％ヤギ血清を含む［’ＢＳで３７℃、２時間 ブロックした。ラベルプレートをカバーし、４°Ｃで一晩インキュベートした後 、ＰＢＳで６回洗浄し、〇−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）を基質として発色さ せた。

５．１１胞障害！１ア７セイ ＡＤＣＣアフセイは、標的細胞として”ＣｒでラベルしたＭ２１ヒトメラノーマ ナーからの末梢血管系白臼球）を５０μｌとしたものとを、希釈したキメラ抗体 １０μｍとメ匡のマイクロタイタープレート中で混合した。３７°Ｃ４時間のイ ンキュベートの後、プレートを遠心分離して１ｏｏｔＩ＋を採取し、ＬＫＢモデ ル１２７２ガンマカウンターでカウントを計測した。

ラベルしたＭ２１メラノーマの補体による溶解は、５０ｕｌの細胞（２ＸｌＯＳ 細胞／ｍ　ｌ　）と等量の希釈した各抗体を混合することにより行った。３７° Ｃ１５分間のインキュベートの後、１００μｌのヒト補体（新鮮ヒト血清で４倍 希釈したもの）を各ウェルに加えた。プレートをさらに３７°Ｃで１時間インキ ュベートした後、遠心分離して上清１ＯＯＫ！■を用いて放出された”Ｃｒのカ ウントを計測した。ＫＪ胞傷害性の百分率は。

により決定した。

６、生体内分布と血液中からの消失の検討８〜ｌＯｓ令のメス？！！胸腺マウス （ｎｕ／ｎｕ）（Ｌｈｅ　ＮａＬｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ＬｉＬｕＬｅ 、ヘセスダ、ＮイＤ）に２Ｘ１０’のｈ４ｚｔ！１ｌｆｆｌ細胞を皮下注射した 。腫瘍は１０日以内に５０−１５０ｍｇの大きさに生長した。この時点でマウス の尾静脈に２５μｇ、３〜４μＣ１の＋２１−ラベルした抗体を静脈性！１した 。注射後指定された時点で３匹ずつのグループとしたマウスにハロセンで麻酔し 、血液試料を後Ｕ１窩出血法により採取した。放射性ラベルした抗体の生体内分 布を調べるため、３匹ずつのグループをｔ主側後のい（っがの時点で殺害した。

腫瘍および主要な器官（心臓、皮膚、筋肉、骨、肺、肝臓、牌臓、甲状腺、腎臓 、１Ｌｉｉ）を取り出し、重量を測った。すべての組織試料について１！＄１活 性をガンマカウンターによりアッセイした。結果は組織１ｇあたりの注射された 濃度に対する％および局在比率（ｃｐｍ／ｇ腫瘍：ｃｐｍ／ｇ組織）として算出 した。

７、放射性ラベリング ヒ目ｇＧのｃｈ１４．１Ｂ、ｃｈ１４．１Ｂ−ΔＣＨ２、Ｆ（ａｂ’）、断片を ＵＳｒでラベルした。簡単に述べると、ｌ　ＯＯｔｌｇの１ｏｄｏ−Ｇｅｎ試薬 （Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｏｙクフォード、ＩＬ）でコート したポリスチレンチューブ中で、５００　ｕｚの抗体を０．５ｍＣ１の”ＳＴ　 （１００ｍｃｉまたは３．７５ＧＢｑ／ｍ１．Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ、、 アーリントンハイツ、　ＩＬ）とともに氷上２５分間インキュベートした。取り 込まれなかった１１Ｓ■はＰＤＩＯカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ、　ピスヵタウェイ。

ＮＪ）を用いたゲル濾過により除いた。比活性はｎＩＪに体あたり１．　５〜０ ．５ｎＣｉが典型的な値であった。

本発明は、その主旨もしくは本質から離れることなく、他の特定の態様で実施す ることも可能である。したがってここに記載した態様は全ての面において、限定 的例ではなく例示的なものと理解されるべきであり、よって、本発明の範囲は明 細書の記載ではなく請求の範囲により定まり、また請求の範囲の記載と均等範囲 内で生じ得る全ての変化は本発明の範囲に含まれる。

ｈ’ｌ／１１　ｎが１ １ρ ９１イちζｌ「ノノン、５外％ ”　！Ｊｌｌｌｔ／　Ｇ　’　１　％ ３猜１昏／　’Ｇ　’＋　％ ｉｌ　ＦｊｌΦＩｆ／１’：′ＸＹ’：！！　％補ｉ［書の翻訳文提出書 （特５′［法第１８４条の８） 平成　４年　９１１２日 特ｒ「庁長官　麻　生　渡　殿　ｐ匍 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１００６３３ ２、発明の名称 結合親ｔｏ性を高めた抗体構築物 ３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１３９．ケンブリッジ。

ワン・ケントール・スクエア、ビルディング　７００名　称　レブリケン・コー ポレーション４、代理人 住　所　東京都千代ＩＪＪ区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話　３２７０−６６４１〜６６４６ 氏名（２７７０）弁理士湯浅恭三「ヲ ”二′・二 ５、補ＩＬ書の提出口 請求の範囲全文の差替え 請求の範囲 １、抗原上のエピトープに対して特異的な抗体構築物であって、＜ａ）上記エピ トープに特異的な天然抗体の超可変６■域とホモロガスな超可表領域からなり、 予め決定された特異性をもフ免疫グロブリン結合領域；及び＜ｂ）実質的にＣＩ （１ドメイン、ヒンジ及びＣＨ３ドメインからなり、天然抗体に通常存在するＣ Ｈ２ドメインを欠失した免疫グロブリンの定常領域を含んでなり、 上記定１ｇ領域が上記抗体構築物の結合能）Ｊを上記天然抗体の抗原結合能力と 比較して少なくとも２倍増大させることを特徴とする、上記抗体構築物。

２、結合領域が非ヒト免疫グロブリン分子の結合領域を含む、請求項１記載の構 築物。

３、該結合領域がネズミ免疫グロブリン分子の結合領域を含む、請求項２記載の 構築物。

４、該結合領域がムチンに対する特異性をもつ、請求項１記載の構築物。

５、該結合領域がＧＤ２ガングリオシドに対する特異性をもつ、請求項１記載の 構築物。

６、該結合領域がメラノーマー特異的プロテオグリカンに対する特異性をもつ、 請求項１記載の構築物。

７、該定常領域がヒト免疫グロブリンの定常領域を含む、請求項１記載の構築物 。

８、免疫グロブリン軽鎖にジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎮を含む、請 求項１記載の構築物。

９、該定常領域のカルボキシ末端に共有結合した、腫瘍殺傷活性をもつ蛋白質を さらに含む、請求項１記載の構築物。

１０、ｉ蛋白質が、エンドペプチダーゼで開裂可能なアミノ酸配列を介して、３ ｉＣＩ＋３ドメインのカルボキシ末端にペプチド結合している、請求項９記載の 構築物。

ｉ＋、ｉ蛋白質がリジン残基を介して１ｃＨ３ドメインのカルボキシ末端にペプ チド結合している、請求項１０記載の抗体構築物。

１２、該蛋白質が、リンホトキシン及びその活性なｍｕ体からなる群から選択さ れるＩ蜂殺傷蛋白質を含む、請求項９記載の構築物。

１３、該蛋白質が、インターロイキン−２及びその活性な類縁体からなる群から 選択されるＩＩ瘍殺傷蛋白質を含む、請求項９記載の構築物。

＋４．該蛋白質が、上皮生長因子、ｌｆ！瘍壊欠壊死因子シン、ジフテリア毒素 、シュウトモナス外毒素及びそれらの活性な類縁体からなる群から選択される腫 瘍殺傷蛋白質を含む、請求項９記載の構築物。

１５、放射活性標識も含む、請求項１記載の構築物。

１６、　該Ｗ白質が、リンホトキシンまたはリンホトキシン類縁体の活性フラグ メントであるＩＩ瘍殺滅蛋白質を含む、請求項９記載の構築物。

１７、該蛋白質が、インターロイキン−２またはインターライキン−２類縁体の 活性フラグメントである腫瘍殺滅蛋白質を含む、請求項９記載の構築物。

１８、該蛋白質が、上皮生長因子、腫瘍壊死因子、リシン、ジフテリア毒素、ツ ユウドモナス外毒素及びそれらの活性な類縁体からなる群から選択される蛋白質 の活性フラグメントであるｌ［Ｉ瘍殺傷蛋白質を含む、請求項９記載の構築物。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９ ５　Ｖ　９２８４−４ＣＹ　９２８４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１４１５２ １６／４６　８３１８−４Ｈ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０９ （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） ８３１４−４Ｃ ９０５１−４Ｃ ９２８１−４Ｂ Ｉ Ａ６１Ｋ　３７／２４ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ある抗原上のエピトープに特異的な抗体構築物：即ち、（ａ）あるエピトー プに特異的なネイティブな抗体の超可変部と相同な超可変部を含み、予め快定さ れた特異性を持つ免疫グロブリン結合領域；および（ｂ）木質的にＣＨ１ドメイ ン、ヒンジ部およびＣＨ３ドメインからなり、ネイティブな抗体においては通常 存在するＣＨ２ドメインが除かれた免疫グロブリン定常部 （該定常部は上記の抗体構築物の結合活性を、上記のネイティブな抗体の結合活 性と比較して少なくとも２倍は高める）からなる該構築物。
2. ２．上記結合領域が非ヒト免疫グロブリン分子の結合領域を含んでいる請求項１ の構築物。
3. ３．上記結合領域がマウス免疫グロブリン分子の結合領域を含んでいる請求項２ の構築物。
4. ４．上記結合領域がムチンに対する特異性を持つ請求項１の構築物。
5. ５．上記結合領域がＧＤ２ガングリオシドに対する特異性を持つ請求項１の構築 物。
6. ６．上記結合領域がメラノーマ特異的プロテオグリカンに対する特異性を持つ請 求項１の構築物。
7. ７．上記定常部がヒト免疫グロブリン定常ドメインを含んでいる請求項１の構築 物。
8. ８．免疫グロブリン軽鎖にジスルフィド結合により架橋された免疫グロブリン重 鎖を含んでいる請求項１の構築物。
9. ９．上記定常部のカルボキシ未端に付加された形で、腫瘍を破壊する活性を持つ タンパク質をさらに含んでいる請求項１の構築物。
10. １０．上記タンパク質がエンドペプチダーゼにより切断可能なアミノ酸配列を通 じて、上記ＣＨ３ドメインのカルボキシ未端に緊げられたペプチドである、請求 項９の構築物。
11. １１．上記タンパク質がリジン残基を通じて上記ＣＨ３ドメインのカルボキシ末 端に緊げられたペプチドである、請求項１０の抗体構築物。
12. １２．上記タンパク質が、リンホトキシン、その類似活性物質およびその活性断 片からなるグループから選択される、腫瘍を破壊するタンパク質を含んでいる請 求項９の構築物。
13. １３．上記タンパク質が、インターロイキン２、その類似活性物質およびその活 性断片からなるグループから選択される、腫瘍を破壊するタンパク質を含んでい る請求項９の構築物。
14. １４．上記タンパク質が、表皮成長因子、腫瘍壊死因子、リシン、ジフテリア毒 素Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ外毒素、その類似活性物質およびその活性断片からなる グループから選択される、腫瘍を破壊するタンパク質を含んでいる請求項９の抗 体構築物。
15. １５．さらに放射性ラベルを含んでいる請求項１の構築物。