JPH0731197B2 - 低級アルコールスルフェート洗浄液，試験キットおよび免疫リガンドの測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、例えば、生物学的流体のような流動性検体中
のヒトの絨毛性性腺刺激ホルモン（hCG）の測定に有用
な洗浄液、試験キットおよび方法に関する。

〔従来の技術〕

低濃度で生物学的な流体中に存在する生物学的な物質の
迅速かつ正確な定性的または定量的測定のための診療、
検査および診断方法には、依然として必要性が存在す
る。適切な診断または療法を期すには、例えば血液、
尿、唾液、膣分泌物、精液および他の生物学的流体中の
医薬、麻酔、ホルモン、ステロイド、ポリペプチド、プ
ロスタグランディンまたは感染性生物の存在を正確にか
つ迅速な方法で測定しなければならない。

かかる測定方法を提供する目的で、検出される物（本明
細書では「リガンド」という）およびこの物質と特異的
に反応する化合物（本明細書では「受容体」という）と
の間の特異的バインディング反応を利用する生物学的物
質の単離および同定に関する多様な方法が発明されてき
た。放射性または酵素標識が、得られる反応複合物を検
出するために使用されてきた。

開発されてきた試験の特殊なタイプのものとしては、当
該技術分野でイムノメトリックまたは「サンドイッチ」
アッセイとして知られているものがある。かかるアッセ
イでは、妨害しない態様でかつ種々のエピトープ部位に
おいてリガンドと複合化する２以上の受容体分子（例え
ば、抗体）を用いて該リガンドを「サンドイッチするこ
と」を伴う。かかるアッセイの例は、米国特許出願第4,
486,530号および同4,496,654号明細書および英国特許第
2,074,727号明細書を含む多数の文献に記載されてい
る。

特に興味あるリガンドの１つは、受胎直後の女性におい
て濃度が高まるホルモンであるヒトの絨毛性性腺刺激ホ
ルモン（hCG）が挙げられる。妊娠の早期検出のために
は、適当な濃度のhCGを測定することが望まれる。hCG測
定用の非常に有用なアッセイおよび試験装置は、特開平
１−202663号公報に記載されている。

このアッセイは、アクリルアミドポリマーを使用する試
験装置中に固定化されたhCGに対するビオチン化抗体を
使用する。このアッセイならびに当該技術分野で既知の
他のアッセイでは、複合化されていない物質から複合化
されている物質を分離するために洗浄液が使用されてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、使用されている洗浄液の含有物は、試験
のバックグランドに影響を及ぼす可能性があることが認
められた。望ましくないバックグランド（すなわち、hC
G以外の起源に由来する検出可能な種類のもの）は、低
濃度のhCGの検出を困難にする。換言すれば、アッセイ
感度が減少することである。その上、バックグランドが
一貫して十分に濃度が高い場合には、高い発生率で誤り
をアッセイにもたらすであろう。

この課題は、少なくとも0.01重量％のドデシルスルフェ
ート化合物（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）を含ん
でなる洗浄液を使用することによって解決された。他の
類似の界面活性剤は、前記ドデシル化合物がhCGに対す
るアッセイにおいてバックグランドの減少を示すことと
異っていた。

殆んどの場合に、前述の洗浄液で十分である。しかしな
がら、その洗浄液またはそのものを含有するキットが輸
送または貯蔵を通じて10℃以下の温度にさらされる場
合、そのドデシルスルフェート化合物が結晶化すること
が見い出された。このことを避けるには、利用者は何等
かの方法で温めればよい。しかしながら、このことは、
使用前に望ましくない待ち時間が必要になるかも知れ
ず、そのアッセイを扱い難く、かつ時間のかかるものに
する可能性がある。この点は、迅速な結果が望まれる場
合には、かなりの不利益となる。

従って、当該技術分野においては、比較的低温で結晶に
なり難いだけでなく、濃度の低いアッセイのバックグラ
ンドを維持する洗浄液に対する要求が存在する。

〔課題を解決するための手段〕

前述の課題は、pH5〜９に緩衝化され、そして炭素原子
数６〜10個を有する低級アルコールスルフェート陰イオ
ンおよびアルカリ金属またはアンモニウム陽イオンを含
む化合物を1.5〜４重量％含んでなる水性洗浄液により
解決される。

この洗浄液は、（ａ）免疫リガンドに対する１以上の受
容体であって、その少なくとも１つが検出のために標識
されている前記受容体、ならびに（ｂ）pH5〜９に緩衝
化され、そして炭素原子数６〜10個を有する低級アルコ
ールスルフェート陰イオンおよびアルカリ金属またはア
ンモニウム陽イオンを含む化合物を1.5〜４重量％含ん
でなる水性洗浄液、を包含する免疫リガンドの測定に有
用な試験キットに含めることができる。

本発明は、また、（Ａ）免疫リガンドに対する１以上の
受容体であって、その少なくとも１つが検出のために標
識されている前記受容体を前記リガンドを含有すること
が予想される検体と接触せしめ、前記リガンドと前記１
以上の受容体との間で検出し得る免疫複合物を形成する
工程、（Ｂ）pH5〜９に緩衝化され、そして炭素原子数
６〜10個を有する低級アルコールスルフェート陰イオン
およびアルカリ金属またはアンモニウム陽イオンを含む
化合物を1.5〜４重量％含んでなる水性洗浄液を用いて
洗浄することにより複合化されていない物質から前記検
出し得る複合物を分離する工程、ならびに（Ｃ）検出し
得る複合物または複合化されていない標識受容体のいず
れかの量を検出する工程、を含んでなる免疫リガンドの
測定方法を提供する。

〔態様〕

本発明は、リガンドと受容体との間で、検出し得る免疫
複合物を形成することによる分析方法で使用するため
の、洗浄液、試験キットおよび方法を提供する。前述し
たごとく、免疫リガンドは、検出することに意義のある
生物学的な化合物である。リガンド類の具体例は後述す
る。受容体は、前記リガンドと特異的に複合化する化合
物である。本発明の方法は、医院または家庭でアッセイ
を実施して即座に結果を出すことができるような迅速な
測定方法を提供することができる。このアッセイは、一
価もしくは多価のまたは複数抗原決定基のリガンドの存
否を検出するために使用することができる。好ましく
は、hCGのような複数抗原決定基のリガンドを検出する
ことに使用される。一価のリガンドとは、受容体との複
合化反応に対する単一のエピトープ部位を有するものを
いう。多価のリガンドとは複数の同一の受容体と複合化
するための２以上のエピトープ部位を有するものをい
う。複数抗原決定基のリガンドとは、２種以上の種々の
受容体と複合化するために２以上のエピトープ部位を有
するものをいう。

より具体的には、本発明は、受容体と特異的なバインデ
ィングを生ずる天然物としてまたは合成物として試験検
体中に存在する免疫リガンドの測定方法に使用すること
ができる。この測定方法は、リガンドの存否を単に決定
する場合か、またはリガンドの量を定量的に測定する場
合に使用することができる。就中、本発明は、動物、ヒ
トまたは植物の生物学的流体に使用することができる
が、好ましいのはヒトの生物学的流体への使用である。
限定されるものでないが、このような流体としては、全
血、血漿、血清、リンパ液、胆汁、尿、髄液、精液、涙
液、膣分泌液、喀痰、汗ならびに便通検体などが挙げら
れる。また、ヒトまたは動物の組織、例えば骨格筋、心
臓、腎臓、肺臓、脳または骨髄などの流体調製物であっ
てもよい。

免疫リガンドとは、（１）免疫担当宿主に対して供給さ
れる場合の物質が、その物質とバインディングし得る特
定の抗体産生をもたらす免疫種、または（２）リガンド
が抗原−抗体反応に関与することで抗体が産生するよう
な免疫種のごとく広く定義される。

本発明の洗浄液を使用して検出し得る免疫リガンドの代
表的なものとしては、一級アミン、アミノ酸、ペプチ
ド、ポリペプチド、タンパク質、リポタンパク質力、糖
タンパク質、医薬ハプテン、酵素、ステロイド、脂質、
核酸、ホルモン、ビタミン、多糖類、糖脂質、アルカロ
イド、生物体〔細菌（例えば、連鎖球菌Ａ）、原生動
物、カビ、ウイルス（例えば、HTLV-IもしくはHIV−
Ｉ、または単純ヘルペスウイルスのようなウイルス）ま
たはリケッチア〕およびそれらの成分、血液成分、組織
および器官の抗原、ならびに当業者に既知の他の物質が
挙げられる。

ある場合には、リガンドは、医薬、ホルモン、抗生物質
または抗原性を有する他の化合物に対して向けられる抗
体である。このような例では、目的の抗体と特異的に複
合化する抗原性物質が受容体となる。リガンドが抗原で
ありそして受容体が抗体である場合、モノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれかを使用すること
ができ、そしてそれらは分子全体またはそれらの種々の
フラグメントであってもよい。本発明では、好ましくは
ビオチン化モノクローナル抗体が使用される。他の例で
は、リガンドが抗体でありそして受容体が抗−抗体であ
る。

好ましい態様においては、妊娠の初期指標としてのhCG
の測定のために本発明は有用である。この態様では、hC
Gに対する１以上の種々の抗体がその抗原と反応して免
疫複合物を形成する。抗体の１つは、検出のために適当
に標識される。本発明の洗浄液を使用して複合化されて
いない物質を除去した後、次いで適当な検出出段を施
す。好ましくは、簡便な方式で種々のエピトープ部位で
hCGと複合物を形成するように試薬を供給するため、後
述するように前記抗体が、試験装置に固定化される。最
も好ましくは、これらの抗体の少なくとも１つがビオチ
ン化され、そして他のものが標識される。

本発明の洗浄液は、アッセイにおいて濃度の低いバック
グランドを都合よく持続する水性緩衝液である。このも
のは、免疫複合物から複合化されていない物質の分離を
促進する目的で一般に使用される。

本発明の洗浄液に含まれる化合物は、一般に、界面活性
剤として当該技術分野で知られている水溶性化合物であ
る。この化合物は、炭素原子６〜10個（直鎖または分枝
鎖の、例えばヘキシル、オクチル、デシル、２−メチル
ヘキシルおよび当業者に明らかな他の基）を有する低級
アルコールスルフェート陰イオンを含んでなる。この化
合物は、また、アルカリ金属陽イオンおよびアンモニウ
ム陽イオンから選ばれる陽イオンを含む。特に有用なア
ルカリ金属陽イオンには、リチウム、ナトリウムおよび
カリウムが包含される。代表的なイオン化合物として
は、アンモニウムデシルスルフェート、ナトリウムデシ
ルスルフェート、カリウムデシルスルフェート、ルビジ
ウムデシルスルフェート、ナトリウムオクチルスルフェ
ート、リチウムヘキシルスルフェート、カリウムヘプチ
ルスルフェート、アンモニウムオクチルスルフェートお
よびリチウムデシルスルフェートが挙げられる。ナトリ
ウムデシルスルフェートが最も有用な化合物である。場
合によりこれらの化合物の混合物も使用することができ
る。他のすべての界面活性剤は、本発明の洗浄液中に作
用を発揮する量（すなわち、0.01重量％を越える量）と
しては実質的に存在しない。前記で特定されるスルフェ
ート化合物は、1.5〜４重量％、好ましくは1.8〜４重量
％（総溶液重量に基づく）の濃度で本発明の洗浄液中に
存在する。

前記洗浄液は、１種以上の適当な緩衝剤によりpH5〜
９、好ましくはpH7〜８に緩衝化される。有用な緩衝剤
としては、リン酸ナトリウムＮ−（２−アセタミド）−
２−アミノエタンスルホン酸、N,N−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）グリシン、４−（２−ヒドロキシエチル）
−１−ピペラジンエタンスルホン酸、４−モルホリンエ
タンスルホン酸、４−モルホリンプロパンスルホン酸、
２−〔トリス（ヒドロキシメチル）−メチルアミノ〕−
１−エタンスルホン酸、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル〕グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタンおよび当該技術分野で既知の他のものが挙げ
られる。リン酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。

洗浄液のイオン強度は、少なくとも0.1、より好ましく
は0.1〜0.5であることが好ましい強さである。適するイ
オン強度は、前記液を緩衝化し、ならびに所望のイオン
強度をも供給するのに適する濃度で適当なイオンを有す
る適当な緩衝剤を使用することによって達成することが
できる。他方、緩衝剤が所望のイオン強度を供給しない
場合には、１種以上の水溶性イオン化合物（例えば、界
面活性剤でない一価または二価の塩）を洗浄液に含めて
もよい。一般に、有用な塩は、アルカリ金属、アンモニ
ウムまたはアルカリ土類金属陽イオンと適当な陰イオン
を有する。塩化ナトリウム、塩化リチウムおよび塩化カ
リウムのようなアルカリ金属塩が好ましい。その他の塩
は、当業者にとって自明であろう。

前述したごとく、本発明のキットは、本明細書で開示さ
れる洗浄液ならびにリガンドに対する１以上の受容体
（その１つは検出のために標識されている）を含む。標
識が酵素である場合には、前記キットは、その酵素と反
応して検出し得る種（例えば、染料）を供給する適当な
検出系をも含むことができる。

一般的に、本発明のアッセイは、複合化した物質が検出
される試験装置を使用して実施される。これらの装置
は、キットの一部として、そして場合により試験ストリ
ップ、試験スライド、濾紙、試験管、ペトリ皿および浸
漬ストリップのように極めて簡単なものであることがで
きるが、より一般的には、分析に使用するための１以上
の試験区画またはウェルを有する使い捨て装置である。
かかる装置は、リガンドに対して化学的および免疫学的
に不活性（すなわち、無反応性）である水不溶性の支持
体、アッセイに使用される受容体または他の試薬を含ん
でなる。前記支持体は、平坦であるか、または１以上の
試薬を収容するかもしくは試験検体と数種の態様で接触
することができるように配置するものであることができ
る。アッセイを実施するには、試験検体を、試験管もし
くは微量プレートのような装置に添加するか、または装
置を検体に添加するか、あるいは別の方法で十分な時間
接触をさせればよい。この装置は、使い捨てまたは再生
できるもののいずれであってもよい。

一の態様では、装置をリガンドと受容体を反応させるた
めに使用するが、その後得られる複合物を適当な方法で
リガンドの量が測定される第２の装置に移してもよい。
他方、装置は、複数の実施試験ウェルを有する微量試験
ウェルのごとくアッセイのすべての段階が実施できる装
置であってもよい。いろいろな試験装置が、米国特許第
3,825,410号、同3,888,629号、同3,970,429号および同
4,446,232号明細書を含む従来技術において知られてい
る。特に有用な装置は、特開平１−202663号公報に記載
されている。

より具体的には、本発明の試験装置は、１以上の試験区
画を有する水不溶性の支持体であって、それらの各々に
生物学的検体試料を収容できる前記支持体および適当な
試薬を含んでなる。

この支持体は、いずれかの有用な水不溶性物質、例えば
ガラス、高分子物質、繊維物質、セルロース物質および
当該技術分野で既知の他の物質から作製することができ
る。

好ましい態様では、本発明の試験装置は、試験結果なら
びに正のおよび負の対照を供給するように設計される３
個の試験区画またはウェルを有する。かかる装置は、妊
娠試験キットのような診断キットの一部として医院また
は家庭で特に有用である。有用な試験装置の他の変形物
は、当業者の範囲内にあるであろう。好ましくは、本発
明の装置は、複合化されていない物質および検体液から
免疫複合物を濾過するための水不溶性微孔質濾過膜を各
試験ウェル中に有する。

本発明の装置は、適用な化学的および生物学的試薬を使
用するすべてのアッセイに適合する。好ましい態様とし
ては、尿検体中のhCG測定用として特開平１−202663号
公報に記載されているような装置内に、hCGに対する１
以上の抗体（例えば、ビオチン化または標識化抗体ある
いは両者）が固定化される。

前述したように、本発明のキットは、免疫複合物の形成
を検出する検出系を含めることもできる。この系は、検
出のために適当に標識される、リガンドに対する第２の
受容体のように極めて簡単なものであってもよい。限定
されるものでないが、有用な検出標識としては、放射性
同位体、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合
物、着色ビーズ、染料、染料前駆体および酵素が挙げら
れる。多くの有用な標識は、前記文献に記載されてい
る。これらの標識は、適当な試薬、装置および手段を使
用して検出することができる。

標識としては、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、グル
コースオキシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼまたはグ
ルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）が好ま
しい。

この場合には、酵素基質そして場合により染料形成試薬
を前記検出系が含む。基質と酵素の反応は、検出し得る
種を供給することが可能である。他方、酵素反応は、他
の試薬を含む一連の反応が開始して始めて染料のような
検出し得る種を供給するものであってもよい。

例えば、標識としてペルオキシダーゼが使用される場合
には、過酸化水素および過酸化水素とペルオキシダーゼ
の存在下で染料を供給するテトラメチルベンジジンまた
はロイコ染料（例えば、米国特許第4,089,747号明細書
に記載されるようなトリアリールイミダゾール・ロイコ
染料または同第4,670,385号明細書に記載されるような
トリアリールメタン・ロイコ染料）のごとき、適当な染
料形成試薬をも本発明のキットに含ませることもでき
る。他の有用な酵素に対して使用し得る基質および染料
形成試薬は、当業者の技術水準内に豊富に存在する。

本発明の好ましい態様における試薬キットは、 （ａ）複数の試験ウェルを有し、第１のエピトープ部位
でhCGと反応する抗体を前記試験ウェルの少なくとも１
つに固定化して有し、そして乾燥状態で存在する前述の
試験装置、 （ｂ）第２のエピトープ部位でhCGと反応する第２の抗
体であって、ペルオキシダーゼで標識されている抗体、 （ｃ）ペルオキシダーゼと反応する検出系、ならびに （ｄ）本発明の洗浄液、を含んでなる。

前記試験装置中の抗体は、試験装置の表面、膜、ガラス
またはポリマー粒子あるいは当該技術分野で既知の他の
物質のような水不溶性支持体に固定化することにより不
溶性にすることができる。より好ましくは、特願昭 −
号明細書（前述の対応する米国特許出願第136、2
11号明細書）に記載されるバインダー物質と混合して固
定化される水溶性ビオチン化抗体である。この抗体は、
不溶性相にアビジンまたはその誘導体が結合した相を含
んでなる不溶化試薬を使用して、アビジン−ビオチン反
応を介して不溶化され得る。場合によってこの不溶化試
薬を、前記試験キットに含ませることができる。

このような不溶化試薬は、ガラスビーズ、金属粒子、
膜、ポリマービーズ、ガラスもしくはセルロース繊維お
よび当該技術分野で既知の他のものを有し、これらのア
ビジンまたはその誘導体（例えば、ストレプトアビジ
ン、スクシニル化アビジンおよびモノメリックアビジン
など）が結合されている。代表的な試薬は、以下の実施
例で記載されそして使用される。これらの好ましい試薬
は、不溶性相（例えば、ポリマービーズ）に活性化２−
置換エチルスルホニル基もしくはビニルスルホニル基ま
たは活性化ハロゲン原子を介してアビジンを共有結合す
ることにより調製される。

アビジンまたはその誘導体は、例えば、米国特許第4,29
8,685号、同4,496,654号および同4,582,810号明細書な
らびに国際公開第84/03358号公報（1984年８月30日付で
公開）に記載されるような、当該技術分野で既知の適当
ないずれかの方法により、不溶性相に結合することがで
きる。アビジンは、吸着により結合することもできる
が、好ましくはアビジン分子の反応性部位（例えば、反
応性アミン基）と担体上の適当な反応性基（例えば、カ
ルボキシル基、ハロメチル基、ビニルスルホニル基また
はクロロエチルスルホニル基）とを反応することにより
共有結合する。

本発明のキットは、また、場合によって試薬および装置
（例えば、他の洗浄液、緩衝液、試薬液、ボトル、ピペ
ット、検体を予め濾過するための装置およびキットの使
用に役立つ当該技術分野で既知の他の物質）をも含むこ
とができる。

一般的に、本発明の方法は、リガンドを含むことが予想
される検体とそのリガンドに対する１以上の受容体（こ
の受容体の少なくとも１つは、免疫複合物が検出される
ように標識化されている）を接触せしめて免疫複合物を
検出することにより実施される。次に、本発明の洗浄液
で前記複合物を洗浄することによって複合化されていな
い物質からその複合物が分離される。分離後、複合物ま
たは複合化されていない物質のいずれかが、適当な検出
装置または方法（例えば、光の散乱法、比色法、蛍光分
析法、放射能分析または他の手段）を使用して検出され
る。このアッセイは、一般に室温で実施される。

この方法では、受容体と検体を接触する前後または同時
に前記検体を前述のような試験装置に入れ、そして免疫
複合物を濾過膜上に残したまま、その膜を通して複合化
されていない物質を洗い流すことが好ましい。また、複
合物は、洗浄工程の少し前に不溶化されることも好まし
い。例えば、受容体１つを、最初に不溶性支持体に結合
することもできる。他方そして好ましくは、前述の不溶
性試薬を使用して、アビジン−ビオチン反応による不溶
性化物の形成後、前記複合物を不溶化する。

hCGの検出においては、適当な試験装置によりhCGに対す
る１以上の種々の抗体とhCGを含有することが予想され
る検体（一般に、尿）を接触させることにより本発明の
方法が実施される。この抗体の１つは、検出のために適
当に標識されている。本発明の洗浄液を使用して複合化
されていない物質から複合物を分離し、次いで適当な検
出手段を講ずる。この方法は、、尿試料をアッセイする
ことで、妊婦の早期診断を医院または家庭において実施
することを容易にする。

次の実施例は、本発明実施の代表的なものであるが、本
発明の範囲を限定することを意図するものでない。

物質 抗体−ビオチン接合物は、ホフマン（Hofmann）ら、に
よりJ.A.C.S.100,3585ページ（1978）に記載されている
方法により、イムノ−サーチ・インク（Immuno-Search,
Inc）から入手される抗hCGモノクロナル抗体およびカル
ビオケム−ベーリング・コープ（Calbiochem−Behring
Corp.）から入手されるビオチンを使用して調製され
た。

抗体−ペルオキシダーゼ接合物は、Yoshitakeら、によ
りEur.J.Biochem.101,395（1979）に記載されている方
法により、ケンブリッジ・メディカル・ダイアゴノステ
ィックス（Cambridge Medical Diagnostics）から入手
される抗hCGモノクローナル抗体およびワサビペルオキ
シダーゼを使用して調製された。

ロイコ染料溶液は、２−（４−ヒドロキシ−3,5−ジメ
トキシフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニ
ル）イミダゾールを用いて次のように調製された。

リン酸ナトリウム緩衝液（５ミリモル濃度）中20％のポ
リ（ビニルピロリドン）溶液に固体ロイコ染料（0.1％
の溶液調製量）を溶解した。次に、この溶液を、リン酸
ナトリウム緩衝液中過酸化水素（10ミリモル濃度）、
４′−ヒドロキシアセタニリド電子移動剤（５ミリモル
濃度）およびジエチレントリアミンペンタ酢酸キレート
剤（10マイクロモル濃度）を含有する溶液に添加し、最
終濃度１％のポリ（ビニルピロリドン）および0.005％
のロイコ染料とした。

スクシニル化カゼインは、等重量の琥珀酸無水物とカゼ
インを25℃で４時間反応させた後、生成物を透析するこ
とにより精製して調製した。

実施例1.hCG関する尿のアッセイ 不溶化試薬の調製 下記の３種の溶液をそれぞれ示した速度で、80℃におい
て脱酸素化した水を含む1365mlの容器に連続的に添加し
た。

溶液1:スチレン（739g）、ｍおよびｐ−（２−クロロエ
チルスルホニルメチル）スチレン（82g）および１−ド
デカンチオール（8.2g）分で380分間）。

溶液2:過硫酸アンモニウム（19.7g）および蒸留、脱酸
素水（1152g）（2.14g/分で380分間）． 溶液3:ピロ亜硫酸ナトリウム（9.9g）および蒸留水（11
52g）（2.27g/分で380分間）。

380分後、反応を停止して33.4％の固形分を有するラテ
ックス約1218gを得た。このラテックスを３日間透析
し、27.3％の固形分を有しそしてpH5のラテックスを得
た。このラテックスを13.5％の固形分になるまで希釈し
た。スチレン対第２のモノマーのモル比は、96:4である
ことがNMR分析で確認された。透過型電子顕微鏡で測定
したところ、得られたラテックスは、約0.67μｍの平均
直径を有していた。

前述のラテックス試料（0.75ml）をホウ酸緩衝液（50ミ
リモル濃度、pH8.5）で20mlまで希釈し、次いでアビジ
ン（5mg）を添加した。得られた懸濁液を18時間37℃で
回転させながら攪拌し、次いで遠心した。上澄を廃棄
し、粒子を遠心で緩衝液を用いて１度洗浄し、次いでグ
リシン緩衝液10mlに再懸濁した。ビオチンのバインディ
ング分析（すなわち、トリチウム標識ビオチンを用いる
滴定）は、前記粒子にアビジンが共有結合（0.3％のビ
ーズ懸濁液当たり７×10^-6モルのバインディング部位）
し、本発明の試薬が形成していることを示した。

アッセイ 本明細書で記載されるすべてのアッセイは、室温（通常
20℃〜25℃）で実施された。試験装置は、以下の方法で
尿検体中のhCGを測定するために使用された。各試験装
置は、バックグランドを示しそして試験の対照となる負
対照ウェル、試薬および手順が正確に使用されているこ
とを示す正対照ウェルならびにアッセイ用の試験ウェル
を含んでなる。各試験ウェルは、微孔質ナイロン濾過膜
（Pall Corp.から入手した）からなる濾過膜を含む。

各負対照試験ウェルは、４−モルホリンプロパンスルホ
ン酸緩衝剤（2mg）およびポリ（アクリルアミド）バイ
ンダー（60μｇ）を含む。アッセイ用の試験ウェルは、
ポリ（アクリルアミド）バインダー（60μｇ）で固定さ
れたビオチン化抗hCG抗体の乾燥被覆物（３μｇ）およ
びその試験ウェル中の別の位置に乾燥緩衝剤（2mg）を
含む。正対照ウェルは、ポリ（アクリルアミド）バイン
ダー（60μｇ）で固定されたビオチン化抗hCG抗体（３
μｇ）およびその試験ウェル中の緩衝剤（2mg）から離
れた位置に乾燥hCG（400ml.U）を含む。

不純物を除去するために試料が予め濾過され、この試料
は、hCG約30〜300,000I.U/lを含むことが既知である。
試料を試験装置のすべてのウェルに添加し、次いで各ウ
ェルにペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗hCG抗体
（10^-9モル濃度液40μｌ）を添加した。

２分のインキュベーション期間後、前述の不溶性免疫反
応試薬の懸濁液（0.6％の分散液40μｌ）を加え、次に
各ウェルの膜を通して流体を排出した。リン酸ナトリウ
ム（0.1モル濃度、pH7.2）、チオメルサール防腐剤（0.
01重量％）およびデシル硫酸ナトリウム（100ミリモル
濃度、2.7重量％）から本発明の洗浄液を調製し、そし
てこの洗浄液を各ウェルに添加して複合化していない物
質を洗い流した。次に、前述のロイコ染料溶液（40μ
ｌ）を各ウェルに添加した。２分後、各ウェルの膜上に
生じた色を標準的な測定装置を使用して反射率を測定
し、ウィリアムスークラッパー（Williams−Clapper）
変換を用いて透過率濃度（Dr）に換算した。この色を、
また、カラー・グラージエント・チャート（０〜10の
値、10は最高の色濃度を示す）上の色値との対比により
評価した。試験ウェルおよび正対照ウェル中では暗赤色
が見られ、尿検体中にhCGの存在を示した。前記装置の
負対照ウェルは、カラー・グラージエント・チャートを
使用して第２表に示すようなグレードであった。

前記洗浄液におけるデシル硫酸ナトリウムを各種の既知
の陰イオン界面活性剤に置換する以外は同一の装置同一
の操作で同様な試験を実施した。以下の第１表は、対照
洗浄液により置換された物質の一覧を示す。対照Ｂは全
く界面活性剤を含んでいない。第２表には、バックグラ
ンドデータ（前記装置の負対照のウェルにおいて観察さ
れた）および各洗浄液について観察された低温持続試験
が示され、対照洗浄液を使用するアッセイは、許容し得
ない濃度の高いバックグランドを示すか、または低温に
持続することが許されないことが明らかである。

低温持続試験は、洗浄液を４℃で18〜24時間保存し、次
いでその環境から前記液を取り出した直後に何等かの結
晶化の微候についてその液を観察することにより実施し
た。結果は次のように評価した。すなわち、それぞれＡ
＝持続後全く結晶化の微候がない、Ｕ＝洗浄液における
いくつかのまたは全ての界面活性剤の結晶化のため許容
できない、そしてＭ＝アッセイにそれぞれを使用する上
で害はないが少量の結晶化が生ずるため限界状態にあ
る、ものである。

就中、洗浄液中にドデシル硫酸ナトリウムを使用した対
照Ａは、濃度の低いバックグランドを供給するものの、
その洗浄液は低温持続試験に不合格であった。この洗浄
液を室温に0.5〜４時間静置したが、多くの結晶が残存
し過ぎるのでおそらくアッセイに使用することはできな
い。洗浄を試みた時、その洗浄液の結晶がボトルの口を
ふさいだ。

本発明の洗浄液の使用は、許容し得る水準までバックグ
ランド濃度を驚くほど低下させ、低温持続試験にかけた
場合も結晶化しなかった。

実施例2.ストレプトコッカス（Streptococcus）Ａ抗原
のアッセイ この実施例は、生物学的流体中のストレプトコッカスＡ
抗原の測定に対する本発明の実施を示す ストレプトコッカスＡ抗原は、標準的な亜硝酸抽出を使
用してグループＡのストレップ培養物（strep culture
s）から得た。グループＡ炭水化物抗原は、前記細胞調
製物から精製し、次いでクエン酸（10μｌ、1.2モル濃
度）および亜硝酸ナトリウム溶液（120μｌ、８モル濃
度）を添加した後、４−モルホリノプロパンスルホン酸
緩衝液（120μｌ、１モル濃度pH7.5）で中和した。

FC−134（3M Co.由来のフッ素化合物界面活性剤）で被
覆されたナイロン微孔質膜を、前述したのと同様の使い
捨て装置の３つのウェル中に取り付けた。コポリ〔スチ
レン−ｍおよびｐ−（２−クロエチルスルホニルメチ
ル）スチレン〕ビーズ（５％のポリアクリルアミドを含
有する１％の固体懸濁液２μｌ）を、前記使い捨て装置
のウェルの中心部に付加した。このビーズは、ストレプ
トコッカスＡ抗原に対する共有結合ポリクローナル抗体
を含む。

抗原抽出液200μｌをウェルに添加し、次いで流出させ
た。

ポリクローナル抗ストレップ（Strep）Ａ抗体（ワサビ
ペルオキシダーセに接合）、スクシニル化カゼイン（3m
g/mlの溶液40μｌ）および緩衝液を添加し、次いで流出
させた。その後、前記装置を室温で２分間インキュベー
ションした。

次に、洗浄液を添加して流出させた。対照の洗浄液は、
リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中ドデシル硫酸ナト
リウム（10ミリモル濃度、0.29重量％）を含む。本発明
のアッセイは、洗浄液としてリン酸ナトリウム緩衝液中
デシル硫酸ナトリウム（69ミリモル濃度、1.8重量％ま
たは90ミリモル濃度、2.4重量％）を使用した。

ロイコ染料溶液（実施例１に記載したようなもの、120
μｌ）を添加し、室温で２分インキュベーションした
後、前記装置の試験検体および負対照ウェル中に得られ
た色を測定し、前述のカラー・グラージエント・チャー
トに従って評価した。３重試験の平均値として得られた
データを以下の第３表に示す。このアッセイにおいて両
洗浄液とも許容し得る濃度の低いバックグランドを与え
ることがわかる。しかしながら、ドデシル硫酸ナトリウ
ムを含む対照洗浄液は、実施例１に記載した低温持続試
験にかけると溶液中で結晶化した。

〔発明の効果〕 本発明の洗浄液は、アッセイ（特に、hCGのような免疫
リガンドに対するアッセイ）において非常に濃度の低い
バックグランドを維持する手段を提供する。しかも、ド
デシル硫酸ナトリウムが遭遇する結晶化の問題を心配す
る必要がない。

この洗浄液の臨界的な態様は、低級アルコールスルフェ
ートの陰イオンおよびアルカリ金属またはアンモニウム
陽イオンを含んでなる界面活性剤（また、洗剤もしくは
分散剤としても知られている）が、1.5〜４重量％存在
すれば前記の利点を提供する。前記陰イオンは、炭素原
子を６〜10固有する。特に有用な化合物は、デシル硫酸
ナトリウムである。このことは、類似の化合物が同じ結
果を与えない前記実施例１から明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−36964（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−13460（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，93（４）, Ｐ．313−318（1987) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，257（10）, Ｐ．5589−5593（1982)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】pH5〜９に緩衝化され、そして炭素原子数
   ６〜10個を有する低級アルコールスルフェート陰イオン
   およびアルカリ金属またはアンモニウム陽イオンを含む
   化合物を1.5〜４重量％含んでなる免疫分析用水性洗浄
   液。
2. 【請求項２】（ａ）免疫リガンドに対する１以上の受容
   体であって、その少なくとも１つが検出のために標識さ
   れている前記受容体、ならびに （ｂ）pH5〜９に緩衝化され、そして炭素原子数６〜10
   個を有する低級アルコールスルフェート陰イオンおよび
   アルカリ金属またはアンモニウム陰イオンを含む化合物
   を1.5〜４重量％含んでなる水性洗浄液、を包含する免
   疫リガンドの測定に有用な試験キット。
3. 【請求項３】A.免疫リガンドに対する１以上の受容体で
   あって、その少なくとも１つが検出のために標識されて
   いる前記受容体を前記リガンドを含有することが予想さ
   れる検体と接触せしめ、前記リガンドと前記１以上の受
   容体との間で検出し得る免疫複合物を形成する工程、 B.pH5〜９に緩衝化され、そして炭素原子数６〜10個を
   有する低級アルコールスルフェート陰イオンおよびアル
   カリ金属またはアンモニウム陽イオンを含む化合物を1.
   5〜４重量％含んでなる水性洗浄液を用いて洗浄するこ
   とにより複合化されていない物質から前記検出し得る複
   合物を分離する工程、ならびに C.検出し得る複合物または複合化されていない標識受容
   体のいずれかの量を検出する工程、を含んでなる免疫リ
   ガンドの測定方法。