JPH0715474B2 - エンドトキシンの測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は、カブトガニの血球成分（Amoebocyte Lysat
e）（以下、ALと略記する。）とエンドトキシン（以
下、ETと略記する。）を反応させることにより行うエン
ドトキシンの測定方法に於いて、AL中に共存するβ−1,
3−グルカン（以下、GLと略記する。）と反応して凝固
反応を惹起する因子（以下、GL感受性因子と略記す
る。）のみを不活化して、ETのみを特異的に測定する方
法に関する。

［発明の背景］ ETは主にグラム陰性菌の細胞表層中に存在するリポ多糖
であり、発熱物質（Pyrogen）の一種としても知られる
物質である。そのため、試料中のET濃度の測定は、医
学、薬学、微生物学の分野に於いて、重要なものの１つ
となっている。

現在のところ、このETの測定法としては、AL抽出液（以
下、AL溶液と略記する。）がETによって活性化されて凝
固する現象を利用した、所謂リムルステストがその簡便
性、費用が安価な点等から広く利用されている。

しかしながら、このAL溶液はETのみならず、カルボキシ
メチル化したGLとも反応して凝固することが見出され
［Kakinuma et al.,Biochem.Biophys.Research Communi
cation,101（２）,434−439（1981）］、その現象は、A
L溶液中に共存するGL感受性因子がGL又はその誘導体と
反応することにより惹起されることが明らかにされた
［岩永ら、日本細菌学雑誌，38（６）,781−803（198
3）］。

そのため、現在市販されているリムルステストの大部分
は、ETのみならずGLとも反応し、この測定法では試料中
に存在しているのがETであるのかGLであるのか或は両者
の混合物であるのかを判定することは難しく、その特異
性が問題となっている。

このような問題点を解決すべく、AL溶液からGL感受性因
子を除去してETに特異的な試薬を調製する方法が報告さ
れている（特開昭58−13516号公報、特開昭59−27828号
公報）。しかしながら、これらに開示された方法は、何
れもAL溶液をゲル濾過法或はヘパリン，デキストラン硫
酸等を結合させた担体を用いたクロマトグラフィ法等に
よって処理し、凝固酵素前駆体の画分、GL感受性因子の
画分及びETと反応して凝固を惹起する因子（以下、ET感
受性因子と略記する。）の画分に分離してGL感受性因子
の除去を行うと言う極めて煩雑な操作を要する方法であ
る。従って、分離操作中にAL溶液或はその画分液がETに
よる汚染を受けるのを防止するためには、この操作を行
うための専用設備等が必要であり、しかも、最終的にET
に特異的な試薬を得るには各画分を改めて適宜混合しな
ければならないという欠点をも有していた。

一方、前記Kakinumaらの文献［Biochem.Biophys.Resear
ch Communication,101（２）,434−439（1981）］に
は、AL溶液はETのみならず、カルボキシメチル化したGL
とも反応して凝固反応を起こすが、カルボキシメチル化
したGLを大量（10μg/ml以上）に添加した場合にはカル
ボキシメチル化したGLによる凝固反応は起こらず、この
溶液に更に大量（10ng/ml）のETを添加した場合には凝
固反応が生じる旨の記載がある。しかしながら、ここで
添加されているETの量（10ng/ml）は、蒸留水等に於け
るETの許容濃度の約200倍と言う大きな値であり［例え
ば、米国薬局方（USP）XX版による試料中のETの基準値
（試料中での許容濃度）は0.25EU/ml（0.05ng/ml）であ
る。］、ETの測定法に於いて通常問題にされている数量
とは著しくかけ離れた数量なので、これをETの測定に利
用するなどということは到底考えられなかった。

［発明の目的］ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、AL
中に共存するGL感受性因子の影響を全く受けずに簡便に
且つ効率良く、ETのみを特異的に且つ定量的に測定する
方法を提供することを目的とする。

［発明の構成］ 上記の目的を達成するために、本発明は下記の構成より
なる。

「カブトガニ血球成分とエンドトキシンを反応させる際
の反応液中に、β−1,3−グルカンを構成成分とする水
溶性の多糖類又は／及びその水溶性の誘導体を100ng/ml
乃至100mg/ml共存させることを特徴とする、試料中の微
量のエンドトキシンの測定法。」 即ち、本発明者らは、AL溶液を原料としたETに特異的な
試薬を簡便に且つ効率良く調製できる方法につき研究の
途上、AL溶液を用いたET測定法に於ける反応液中にGLを
構成成分とする水溶性の多糖類（以下、GLPSと略称す
る。）又は／及びその水溶性の誘導体を、GLによるAL溶
液凝固反応が抑制される程大量に反応液中に共存させて
ETの測定を行うと、GL感受性因子は不活化されてGLによ
るAL溶液の凝固反応は生じないが、ET感受性因子及び凝
固酵素前駆体は何らその影響を受けず、しかも驚くべき
ことに0.01EU/ml（0.002ng/ml）程度の極微量のETであ
っても、これを特異的に且つ感度良く検出し得ることを
見出し、本発明を完成するに至った。

本発明に用いることのできるGLPS及びその水溶性の誘導
体としては、GLをその構成成分として含む多糖類であっ
て、水溶性のものであれば特に限定されることなく用い
ることができるが、例えば各種細菌類（例えば、Alcali
genes属,,Agrobacterium属等）、酵母類（例えば,Sacch
aromyces属等）、キノコ類（例えば、シイタケ，スエヒ
ロタケ，カワラタケ等）等の細胞壁から得られる天然の
多糖、具体的には例えばカードラン，パキマン，スクレ
ロタン，レンチナン，シゾフィラン，コリオラン等、或
は、藻類（例えば、褐藻，ユーグレナ，ケイ藻等）の貯
蔵性多糖、具体的には例えばラミナラン，パラミロン
等、或は又これらを常法、例えば大有機化学第19巻，第
７版,70〜101頁，小竹無二雄監修，昭和42年５月10日，
朝倉書店;A.E.Clarkeら,Phytochemistry,１,175−188
（1967）;T.Sasakiら,Europ.J.Cancer,15,211−215（19
67）等に記載された方法に準じてカルボキシメチル基，
カルボキシエチル基，メチル基，ヒドロキシエチル基，
ヒドロキシプロピル基，スルホプロピル基等を導入して
得られる水溶性の誘導体等が好ましく挙げられ、これら
を単独で或は２種以上適宜組み合わせて用いる等は任意
である。

本発明に於いて使用可能なAL溶液としては、リムルス
（Limulus）属、タキプレウス（Tachypleus）属／或は
カルシノスコルピウス（Carcinoscorpius）属に属する
カブトガニの血球から抽出されたもので、ETとの反応に
より凝固反応が生じるものであれば特に限定されること
なく挙げられる。また、例えばACC（ASSOCIATES OF CAP
E COD）社，ヘマケム社,MAB社，マリンクロット社等よ
り市販されているAL溶液の凍結乾操品をもとに調製した
ものも当然用いることが可能である。

ALとETとの反応液中へGLPS又は／及びその水溶性の誘導
体を共存させる方法としては、例えば、水、緩衝液、或
は希アルカル溶液等にこれらを溶解し、これを用いてAL
の凍結乾燥品を溶解する方法、ALの凍結乾燥品を注射用
蒸留水や緩衝液で溶解して調製したAL溶液に、上記した
如き方法で調製したGLPS又は／及びその水溶性の誘導体
の溶液を添加する方法、GLPS又は／及びその水溶性の誘
導体を試料に添加する方法、予め必要量のGLPS又は／及
びその水溶性の誘導体を添加したAL溶液を凍結乾燥して
得た試薬を注射用蒸留水や緩衝液で溶解して調製する方
法等が挙げられるが、最終的に、ALとETが反応する際の
反応液中に、AL溶液中に共存するGL感受性因子は不活化
するがETとET感受性因子との反応及びその反応により惹
起されるAL溶液の凝固反応は阻害しないような量のGLPS
又は／及びその水溶性の誘導体が共存するような方法で
あればよく、これらに限定されるものではない。

該反応液中のGLPS又は／及びその水溶性の誘導体の濃度
としては、AL溶液の凍結乾燥品或はAL溶液の、例えば製
造ロット、ETに対する検出感度（EU/ml）等によって多
少変動はあるが、通常、反応液中に100ng/ml乃至100mg/
ml、更に好ましくは、10μg/ml乃至10mg/mlの濃度範囲
が挙げられる。また、上記した如き市販のALの凍結乾燥
品をET測定用のAL溶液として調製したものは、0.03〜5E
U/mlのETに対する検出感度を有しており、これらは、GL
を構成成分とする多糖類又は／及びその誘導体を0.1〜1
000ng/ml添加することにより凝固反応を起こす。このよ
うなAL溶液へ、本発明の目的のために添加するGLPS又は
／及びその水溶性の誘導体の濃度としては、GLを構成成
分とする多糖類又は／及びその誘導体により凝固反応を
起こす濃度の1000倍以上はあることが望ましい。

本発明のETの測定法は、ALとETとを反応させる際の反応
液中にGLPS又は／及びその水溶性の誘導体を所定量共存
させておく以外は、AL溶液を用いた自体公知のET測定法
に準じてこれを行えばよく、使用されるその他の試薬等
も自体公知のET測定法に於いて用いられる試薬に準じ
て、適宜選択して用いればよい。AL溶液を用いた自体公
知のET測定法としては、例えばAL溶液と試料を混合した
後、適当な温度で一定時間インキュベートし、凝固によ
るゲル生成の有無を調べるゲル化転倒法、凝固に伴って
生ずる濁度を測定する比濁法、凝固に伴って生ずる濁度
が一定の値に達するまでの時間を測定する比濁時間分析
法、AL溶液の成分とETとの反応に伴って活性化されるプ
ロテアーゼの活性を合成基質を用いて測定する合成基質
法等が挙げられるが、本発明の適用範囲はこれらに限定
されるものではなく、ALとETとの反応を利用した測定方
法であれば、何れにも適用可能である。

本発明の測定方法に於いて、測定時のpHとしては、AL溶
液中のETと反応して凝固反応を起こす因子が失活しない
pHであれば何れにてもよいが、通常６〜８の範囲が好ま
しく用いられる。また、測定時の温度としては、AL溶液
中のETと反応して凝固反応を起こす因子が失活しない温
度であればよいが、通常、０〜40℃、より好ましくは25
〜40℃が用いられる。

以下に参照例及び実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるも
のではない。

［実施例］ 参考例 1.カルボキシメチル化カードランの調製 カードラン（和光純薬工業（株）製）60gにトルエン540
mlとエタノール60mlを加え、これに50％水酸化ナトリウ
ム水溶液61gを滴下した後、50℃に加熱し、１時間撹拌
した。これに、モノクロル酸35gをトルエン：エタノー
ル＝9:1の混合溶媒100mlに溶解したものを加え、更に50
℃で１時間撹拌した。この反応液に更に水酸化ナトリウ
ム水溶液とモノクロル酢酸溶液を加える前記の操作を、
２度繰り返した後、冷却し、一晩放置した。これを、90
％メタノール1l中に流し込み、生じた沈澱を濾取し、乾
燥して142gの粗結晶を得た。得られた粗結晶を1420mlの
蒸留水に溶解し、この溶液のpHを希塩酸を用いて８に調
整した。これに、メタノール12.78lを、撹拌下に滴下
し、生じた沈澱を濾取し、90％メタノール500mlで洗浄
後、乾燥し、目的のカルボキシメチルカードラン（以
下、CMCUと略記する。）を得た。

実施例 1. （試料） 以下に示すカードラン溶液及びET溶液を試料とした。

・カードラン溶液 ETを含まないカードラン（和光純薬工業（株）製）をET
を含まない50mM水酸化ナトリウム水溶液に5mg/mlとなる
ように溶解した後、注射用蒸留水で適宜希釈したものを
使用した。

・ET溶液 大腸菌レファレンスET（和光純薬工業（株）製、E.coli
UKT−Ｂ株由来のリポ多糖、１バイアル当たりFDAレフ
ァレンスET EC−２として500ng相当量を含有、5ml用）
を注射用蒸留水5mlで溶解した後、注射用蒸留水で適宜
希釈したものを使用した。

（CMCU−LAL溶液の調製） リムルス属のカブトガニ由来のAL溶液の凍結乾燥品（以
下、LALと略記する。和光純薬工業（株）販売、凝固感
度:0.5EU/ml、5ml用。）を、参考例１で得たCMCUを0.2m
g/mlとなるように溶解した注射用蒸留水5mlで溶解してC
MCU−LAL溶液とした。

（測定操作法） CMCU−LAL溶液0.1mlに試料0.1mlを加え、良く混合した
後トキシノメーターET−201（和光純薬工業（株）製）
を用いて、37℃で、試料の透過光量が５％減少するまで
の時間（以下、Tgと略称する。）を測定した。

（結果） 横軸の各ET濃度に対して得られたTgの値を縦軸に沿って
プロットした点を結んで得られた検量線を第１図に−〇
−で示す。尚、カードラン溶液を試料として用いた場合
には、いずれのカードラン濃度でも、80分以内に試料の
透過光量が５％の減少を示さなかった。

比較例1. 実施例１に於いて使用したCMCU−LAL溶液の代りに、実
施例１で使用したのと同ロットのLALを注射用蒸留水5ml
で溶解して調製したLAL溶液（以下、未処理LAL溶液と略
記する。）を用いた以外は、実施例１と全く同様にし
て、実施例１と同じ試料につき測定を行った。

（結果） 横軸の各ET濃度に対して得られたTgの値を縦軸に沿って
プロットした点を結んで得られた検量線を第１図に−●
−で示す。また、横軸の各カードラン濃度に対して得ら
れたTgの値を縦軸に沿ってプロットした点を結んで得ら
れた検量線を、第２図に示す。

第１図より明らかな如く、ET溶液を試料とした場合に
は、CMCU−LAL溶液及び未処理LAL溶液の何れを試薬とし
て用いた場合でも、良好な直線性を示す検量線が得られ
た。

また、第２図より明らかな如く、未処理LAL溶液はカー
ドラン溶液とも反応して、良好な直線性を示す検量線が
得られることが判る。

以上の結果から明らかな如く、AL溶液にCMCUを添加する
ことにより、ETに特異的な試薬が得られることが判る。

実施例2. 実施例１で調製したET1.5EU/mlを含む試料（試料−
１）、及びカードラン20ng/mlを含む試料とET3.0EU/ml
を含む試料とを等量混合したもの（試料−２）を試料と
して実施例１と同様の測定操作法により測定を行った結
果を表１に示す。

比較例2. 実施例２に於いて使用したCMCU−LAL溶液の代りに、比
較例１で使用した未処理LAL溶液を用いた以外は、実施
例２と全く同様にして、実施例２と同じ試料につき測定
を行った結果を表１に併せて示す。

表１の結果から明らかな如く、試薬としてCMCU−LAL溶
液を用いた場合には、ET溶液に更にカードランを添加し
た場合でも、TgはET溶液により得られるそれと同等の値
が得られる、即ちCMCU−LAL溶液はカードランとは反応
しないことが判る。また、試薬として未処理LAL溶液を
用いて測定を行った場合には、ET溶液に更にカードラン
を添加することにより、Tgが非常に短縮される、即ち未
処理LAL溶液がカードランとも反応することが判る。

実施例3. （試料） 以下に示すカードラン溶液及びET溶液を試料とした。

・カードラン溶液 ETを含まないカードラン（和光純薬工業（株）製）を50
mM水酸化ナトリウム水溶液（ET未含有。CMCUを0.2mg/ml
含有。）に5mg/mlとなるように溶解した後、CMCUを0.2m
g/ml含む注射用蒸留水で適宜希釈したものを使用した。

・ET溶液 大腸菌レファレンスET（和光純薬工業（株）製、E.coli
UKT−Ｂ株由来のリポ多糖、１バイアル当たりFDAレフ
ァレンスET EC−２として500ng相当量を含有、5ml用）
を、CMCUを0.2mg/ml含む注射用蒸留水5mlで溶解した
後、CMCUを0.2mg/ml含む注射用蒸留水で適宜希釈したも
のを使用した。

（測定操作法） 比較例１で使用した未処理LAL溶液0.1mlに0.1mlの試料
を加え、良く混合した後、37℃で、トキシノメーターET
−201を用いて、Tgを測定した。

（結果） 横軸の各ET濃度に対して得られたTgの値を縦軸に沿って
プロットした点を結んで得られた検量線を第３図に示
す。尚、カードラン溶液を試料として用いた場合には、
いずれのカードラン濃度でも、80分以内に試料の透過光
量が５％の減少を示さなかった。

この結果から明らかな如く、試料中にCMCUを予め添加し
ておけば、未処理LAL溶液はカードランとは反応せず、E
Tとのみ特異的に反応することが判る。

実施例4. 実施例３で調製したET1.5EU/mlを含む試料（CMCU0.2mg/
ml含有。試料−１）、及びカードラン20ng/mlを含む試
料（CMCU0.2mg/ml含有。）とET3.0EU/mlを含む試料（CM
CU0.2mg/ml含有。）とを等量混合したもの（試料−２）
を試料として実施例３と同様の測定操作法により測定を
行った結果を表２に示す。

比較例3. 実施例４に於いて使用した試料の代りに、実施例２で使
用したET1.5EU/mlを含む試料（CMCU未含有。試料−
３）、及びカードラン20ng/mlを含む試料（CMCU未含
有。）とET3.0EU/mlを含む試料（CMCU未含有。）とを等
量混合したもの（試料−４）を試料として用い、比較例
１で使用した未処理LAL溶液を用いて実施例４と同様の
測定操作法により測定を行った。結果を表２に併せて示
す。

表２の結果から明らかな如く、CMCUを含む試料を用いた
場合には、ET溶液に更にカードランを添加した場合で
も、TgはET溶液により得られるそれと同等の値が得られ
る、即ちCMCUを試料中に添加しておくことにより未処理
LAL溶液がカードランとは反応しなくなることが判る。
また、CMCUを含まない試料を用いて測定を行った場合に
は、ET溶液に更にカードランを添加することにより、Tg
が非常に短縮される、即ち未処理LAL溶液がカードラン
とも反応することが判る。

実施例５ （試料） 実施例１と同じ。

（CMCU−LAL溶液） 実施例１と同じ。

（測定試薬） CMCU−LAL溶液1mlに、0.45M N,N−ビス（２−ヒドロキ
シエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（N,N−Bis
（２−hydroxyethyl）−２−aminoethanesulfonic aci
d）緩衝液（pH7.5）1ml及び基質溶液［1.02mM Boc−Val
−Leu−Gly−Arg−［（４−Ｎ−ethyl−Ｎ−２−hydrox
yethyl）aminoaniline］（和光純薬工業（株）製）、2.
25mMジエチルアニリン及び0.12M塩化マグネシウム含
有］1mlを加えて測定試薬とした。

（測定操作法） 測定試薬0.2mlに試料0.1mlを加え、良く混合し、37℃で
30分間反応させた後、0.17％のメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ムと0.25％のラウリル硫酸ナトリウム（SDS）を含む反
応停止液1mlを加えて反応を停止し、反応液の730nmにお
ける吸光度を測定した。

（結果） 横軸の各ET濃度に対して得られた吸光度を縦軸に沿って
プロットした点を結ぶことにより得られた検量線を第４
図に示す。また、横軸の各カードラン濃度に対して得ら
れた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結ぶことに
より得られた検量線を、第５図に示す。

第４図及び第５図より明らかな如く、本発明に係るCMCU
−LAL溶液は、ETとは反応して良好な直線性を有する検
量関係を示したが、カードランとはいずれの濃度でも反
応しなかった。

また、カードラン20ng/mlを含む試料とET1.0EU/mlを含
む試料を等量混合したものを試料として測定を行ったと
ころ、反応液の730nmにおける吸光度は0.490となり、ET
0.5EU/mlのみを含む試料を測定した場合の吸光度（0.48
6）とほぼ同じ値となった。

これらの結果から明らかな如く、CMCU−LAL溶液は、カ
ードランには反応せず、ETによってのみ活性化がおこる
ことが判る。

（発明の効果） 以上述べた如く、本発明は、AL溶液を用いたET測定法に
於いて、ET測定試薬中に含まれるGL感受性因子を、AL溶
液中の成分の分画、再構成等の特殊な操作を行うことな
く容易に、且つ効率良く不活性化し、ETのみを特異的に
測定し得る方法を提供するものであり、斯業に貢献する
ところ大なる発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１及び比較例１に於いて得られたエン
ドトキシン（以下、ETと略記する。）の検量線を示し、
横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られた、透過光量
が５％減少するまでの時間（分）（以下、Tgと略記す
る。）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものであ
る。図中、−〇−は実施例１に於いて得られた結果を、
−●−は比較例１に於いて得られた結果を夫々示す。 第２図は、比較例１に於いて得られたカードランの検量
線を示し、横軸の各カードラン濃度（ng/ml）に対して
得られたTgを縦軸に沿ってプロットした点を結んだもの
である。 第３図は、実施例３に於いて得られたETの検量線を示
し、横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られたTgを縦
軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第４図は、実施例５に於いて得られたETの検量線を示
し、横軸の各ET濃度（EU/ml）に対して得られた吸光度
を縦軸に沿ってプロットした点を結んだものである。 第５図は、実施例５に於いて得られたカードランの検量
線を示し、横軸の各カードラン濃度（ng/ml）に対して
得られた吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カブトガニ血球成分とエンドトキシンを反
   応させる際の反応液中に、β−1,3−グルカンを構成成
   分とする水溶性の多糖類又は／及びその水溶性の誘導体
   を100ng/ml乃至100mg/ml共存させることを特徴とする、
   試料中の微量のエンドトキシンの測定法。