JPH07121871B2

JPH07121871B2 - インフルエンザワクチン凍結乾燥製剤

Info

Publication number: JPH07121871B2
Application number: JP61240542A
Authority: JP
Inventors: 国昭根路銘; 明大谷; 邦夫大隈; 徹也岡; 昭三輪; 英哉柘植
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1986-10-09
Filing date: 1986-10-09
Publication date: 1995-12-25
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: JPS6393727A

Description

【発明の詳細な説明】＜産業上の利用分野＞本発明はインフルエンザワクチン凍結乾燥製剤，更に詳
しくはインフルエンザウイルスに由来するHANA抗原と合
成アジュバントとして知られるムラミルジペプチド誘導
体（以下,MDP誘導体と称す。）との複合体からなるイン
フルエンザウイルス粒子様人工膜ワクチンいわゆるビロ
ソームワクチン（VIROSOME VACCINE）の凍結乾燥製剤に
関する。

＜従来技術＞本出願人等は，現在使用されているインフルエンザワク
チンの安全性及び有効性を改良すべく検討した結果，イ
ンフルエンザHANA抗原とMDP誘導体との複合体からなる
インフルエンザウイルス様人工膜ワクチンを開発し先に
特許出願している（特願昭60−123341号）。

このワクチンは天然のウイルス粒子とほぼ同じ大きさの
MDP誘導体人工膜（直径100〜300nm）の表面にHANA抗原
が結合した形のいわゆるビロソームを形成している。そ
して，ビロソームの高次構造を保持させ，物理化学的安
定性を保つことは，ビロソームワクチンの有効性に対し
て極めて重要である。

このワクチンは，溶液状態においても,MDP誘導体が人工
膜を形成しているためMDP誘導体の加水分解が抑制され
（MDP誘導体は通常の条件下で加水分解を受けやすくそ
の活性が損なわれる），化学的にはかなりの安定性を示
すが，様々な環境条件でのワクチン輸送及び使用を考慮
したとき，いまだ安定性は充分とはいえない。例えば,M
DP誘導体は通常のワクチン保存条件下である５℃におい
て１週間程で約10％もの加水分解を受けその分活性が低
下するのに対し，人工膜を形成させた場合同じ温度で３
週間経過後も約１〜２％程度しか加水分解を受けない。
しかしながら，人工膜を形成させた場合でも，保存条件
が苛酷になった場合，例えば30℃,3週間で約10％，又50
℃,3週間で約40％もの含量の低下が生じている（第１表
参照）。又，人工膜を利用した製剤において，人工膜粒
子の凝集や融合の問題がある。

このような化学的あるいは物理的に不安定な問題は，一
般に凍結貯蔵又は凍結乾燥により安定化が計れる。

例えば，本発明のビロソームと類似の人工膜を利用した
製剤としては，レシチン等のリン脂質を用いたリポソー
ム製剤がある。そしてリポソールの凍結貯蔵あるいは凍
結乾燥において，グルコースやガラクトース等の糖類が
リポソームの人工膜の損傷を防ぐ効果を持つが，復水後
のリポソームの凝集や融合は避けられないことが知られ
ている。

＜発明が解決しようとする問題点＞従って，ビロソームワクチンの凍結貯蔵，凍結乾燥によ
る安定化のみならず，復水後のビロソーム製剤の凝集や
融合を避けうる凍結乾燥製剤を提供することが望まれ
る。

＜発明の構成＞本発明は優れた安定性を有するビロソームワクチンの凍
結乾燥製剤を提供するものである。

本発明の凍結乾燥製剤を製するには，先づビロソールワ
クチンを製する。該ビロソームワクチンを製する方法
は，本発明者等が先に出願した特願昭60−123341号明細
書中に詳述しているが，概要下記の操作により製しう
る。

先づ，インフルエンザHANA抗原とMDP誘導体とを適当な
緩衝液，例えばリン酸緩衝液中で10/1〜1/300（重量
比）の割合で混合し，この混合物に界面活性剤を有効量
（0.1〜10W/v％）を加えて可溶化する。その後，透析に
より界面活性剤を除去し，新規なHANA抗原−MDP誘導体
複合体を得る。この場合，使用する界面活性剤は透析に
より除去可能なものを選択することが重要であり，例え
ばオクチルグルコシド，コール酸ナトリウム等を挙げ得
る。かくして得られたHANA抗原−MDP誘導体の複合体は,
MDP誘導体自体が人工膜をも形成し得，これにHANA抗原
が結合した形のいわゆるビロソームを形成している。

別の態様によれば,MDP誘導体と組合せてコレステロール
及び／又はレシチンとジセチルフォスフェート等の使用
も可能であり，これによってMDP誘導体人工膜形成能を
高揚させ得る。しかも，この態様においては，上述の界
面活性剤の使用及び透析を必ずしも行う必要はなく，例
えば通常のソニケーション（超音波法），マイクロイン
ジェクション法，逆相エバポレーション法等によっても
MDP誘導体人工膜が形成できるという利点がある。

ここで使用するMDP誘導体とは,MDP自体の種々の化学修
飾体であり，本出願人の１人その他により開発されたも
ので，その特許出願明細書中に詳しく記載されている。
例えば特開昭52−46020号，特開昭52−156812号，特開
昭54−73729号，特開昭54−130517号，特開昭55−19236
号，特開昭55−28932号，特開昭55−28933号，特開昭56
−18996号及び特開昭56−49396号記載のMDP誘導体があ
る。好ましいのは，特開昭54−130517号の一般式：（式中,Qは総炭素数20〜60の合成高級脂肪酸残基を意味
し,AはＬ−アラニン,L−セリン又はグリシンを,isoGln
はイソグルタミンを意味する。）で示されるMDP高級脂
肪酸エステル［特に好ましいのはB30−MDPと称される６
−０−（２−テトラデシルヘキサデカノイル）MDPであ
る。］及び特開昭56−18996号記載の一般式：（式中,XはＬ−アラニン,L−セリン,L−バリン，グリシ
ン等のアミノ酸を,Yは−NM−Ａ又はを意味し,R₁は水素原子，低級アルキル基，カルボキサ
ミド基又はカルボキシル基を,nは１〜６の整数を,Aは炭
素数８〜30の分枝を有することもある飽和又は不飽和脂
肪族炭化水素残基を意味する。）で示されるMDP誘導体
［特に好ましいのは,MDP−Lys（L18）と称されるＮ^α−
（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル
タミニル）−Ｎ^ε−ステアロイル−Ｌ−リジンである］
及び特開昭60−78997号公報記載のMDP（MeAla）−Lys
（L18）と称されるＮ^α−（Ｎ−アセチルムラミル−Ｎ
−メチル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル）−Ｎ
^ε−ステアロイル−Ｌ−リジンである。

又，使用するインフルエンザHANA抗原は，インフルエン
ザウイルス感染尿膜腔液から低高速遠心又は化学的処理
によってウイルスを精製し，得られた精製ウイルスを界
面活性剤，例えばトリトンＸ−100,コール酸ナトリウム
等で可溶化するかあるいはエーテルのような有機溶媒に
よってウイルスを分解し，その後，更にショ糖密度勾配
遠心法やアフィニティークロマト法等によって分離精製
することによって取得できる。

上述の如くして製したブロソームワクチンの安定な凍結
乾燥製剤，即ち本発明の凍結乾燥製剤は下記の如くして
製しうる。

即ち，上述した如くして製したビロソームワクチンの溶
液に，単糖類，二糖類又は三糖類の糖類より選ばれる少
くとも一種以上を粉末あるいは水溶液として加え，必要
であれば除菌濾過を行った後，包装単位に従い分注し，
常法に従って凍結乾燥すればよい。

本発明に用いられる安定化剤としての糖類の具体例とし
ては，単糖類として，ガラクトース，キシロース，グル
コース，フルクトース，マンノース又はリボースが挙げ
られる。二糖類は，シュークロース，マルトース，ラク
トース又はセロビオースが挙げられる。三糖類は，マル
トトリオース又はラフィノースが挙げられる。

安定化剤の濃度は，凍結乾燥時の濃度として規定する
と,3〜30（w/v）％の範囲で添加すればよく，望ましく
は,5〜20（w/v）％である。なお，添加する安定化剤を
２種以上混合して使用する場合においても，添加量は総
量として上記幅であれば充分効果を発揮する。

安定化に有用な糖類は，記載例に留まらず，凍結乾燥可
能であり，相対的に水和量が多く，凍結時，氷晶形成を
妨げる糖類であれば効果を発揮する。

一方，通常．凍結乾燥剤の安定化剤として用いられるマ
ンニトール，イノシトール等の糖アルコールは，凍結乾
燥時の氷晶形成が大きく，人工膜の凝集，融合を生じ，
安定化効果に欠け，本発明の目的を達することができな
い。

本発明の凍結乾燥剤に供するビロソームは前述したコレ
ステロールを包含させたものが特に好ましく，かつ又，
ビロソーム人工膜におけるMDP誘導体とコレステロール
の組成比は重量比で1/2以下が望ましく，特に,1/1以下
においては，凍結乾燥前後及び25℃,6カ月保存後も粒子
径の増大をほとんど認めず，極めて安定である。

＜発明の効果＞本ビロソームワクチンは単に凍結乾燥しただけでは，凍
結時の氷晶形成により，人工膜の凝集や融合を起こし，
かつ又，復水後においてビロソール製剤が得られない
が，本発明によって製した凍結乾燥製剤は優れたビロソ
ーム製剤としての物理化学的安定性を維持するのみなら
ず，薬効の維持及び成分MDP誘導体の化学的安定性にも
寄与するものである。

本発明凍結乾燥製剤の優れた効果は，凍結乾燥原液と凍
結乾燥後復水したものとのビロソーム粒子径測定，電子
顕微鏡写真の形状判定，抗体価の測定，更には長期保存
後の同上の判定をすることにより確認した。

その結果，本発明の凍結乾燥製剤は凍結乾燥前後及び長
期保存において，一定の粒子径を保持するという物理化
学的安定性のみでなく,MDP誘導体の化学的安定性にも及
ぶことが明らかになった。

このような安定性の改善により，ビロソームワクチンの
貯法の改善及び有効期間の延長が期待される。又，本凍
結乾燥ワクチンは凍結乾燥粉末であり，投与対象とし
て，非経口のみならず腸溶性カプセルに充填することに
より経口投与も可能である。

尚，安定性評価のための粒子径の測定は光子相関法によ
るレーザー光散乱測定装置によった。又，有効性評価の
ための抗体価の測定は,WHO法に準じてヘマグルチニンイ
ンヒビションテスト（Hemagglutinin Inhibition Tes
t）を行い抗体産生能を判定した。

実施例１精製インフルエンザHANA抗原（A/BANGKOK/1/79（H₃N₂）
株より精製したもの）を含む0.01モルのリン酸塩緩衝食
塩水（PBS,pH7.2）にB30−MDP30mg及びコレステロール
（純度98.0％以上）30mgを混合したのち，界面活性剤の
オクチルグルコシドを６％を割合になるように加え，超
音波発生装置を用い均一に混合した。その混合液を透析
膜に入れ,PBSに対して透析しオクチルグルコシドを除去
した。

得られたサンプルをHANA抗原濃度として10μgN/mlにな
るように調整したのち，濃度20％のマルトース溶液と1:
1に混合し，凍結乾燥原液とした。その1mlをバイアルに
分注した後，常法により凍結乾燥した。

上記で調製した原液とその凍結乾燥品の経時安定生を，
ビロソームの粒子径及びB30−MDPの残存率により評価し
た。サンプルの保存条件は5,30,40,50℃の各温度で３週
間とした。

結果は表１のとおりであり，ビロソームの粒子径及びB3
0−MDPの残存率の両方共，凍結乾燥製剤の安定性が極め
て優れていることを示している。

実施例２ B30−MDPとコレステロースの重量比1/0.4更にオクチグ
ルコシド濃度３％の条件で実施例１と同様の方法によ
り，安定化剤としてマルトースを使用し，サンプルを調
製した。そして，その長期安定性を外観及びビロソーム
粒子径により評価した。

結果は表２及び３のとおりであり，凍結乾燥製剤は25
℃,6カ月の保存において開始時と比較して，外観試験で
のにごり及び粒子径の増大を認めず，極めて安定であっ
た。

実施例３安定化剤として表４に示す各糖類を用いた以外は実施例
１の手順を繰返して各種凍結乾燥製剤を調製した。

各々のサンプルを凍結乾燥後30℃,3週間保存したのち復
水したものについて，ビロソーム粒子径及びB30−MDP残
存率を測定した。結果を表４に示す。

通常，凍結乾燥製剤の安定性として用いられる糖アルコ
ールであるマンニトール（No.10）及びイノシトール（N
o.11）は，凍結乾燥前後の粒子径の増大が大きい。これ
らの糖アルコールは，凍結時の氷晶形成が大きく，人工
膜の凝集，融合を生じさせやすい。

B30−MDPの含量は30℃,3週間保存後原液が約10％，糖無
添加の場合約５％の低下を示したのに対し，糖類を添加
したものはほとんど含量低下を認めなかった。

実施例４実施例３で調製したNo.2、No.3およびNo.4ワクチン即ち
安定化剤としてシュークロース、マルトースおよびラク
トースを用いたものの、それぞれの液状品および凍結乾
燥品についてマウスにおけるHI抗体産生能を測定した。
マウスはDDYマウス（４週令、♀）を用い各群10匹の腹
腔内にそれぞれHANA抗原量で0.1μgN/マウスの投与量で
接種した。その後接種３週間目および２ケ月目の各５匹
について採血を行い、WHO法に準じてヘマグルチニンイ
ンヒビションテストを行いHI抗体価を測定した。結果は
表５に示すとおりであり、免疫３週間では液状品、乾燥
品ともに変りはないが、免疫２ヶ月ではむしろ凍乾品に
抗体価の上昇がみられた。

なお、比較のためHANAのものものおよびホルマリン処理
（0.02％添加）および無処理についても検討した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者大隈邦夫熊本県熊本市清水町大字大窪313−20 (72)発明者岡徹也熊本県熊本市湖東２丁目44番地２号 (72)発明者三輪昭東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社中央研究所内 (72)発明者柘植英哉東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号第一製薬株式会社中央研究所内 (56)参考文献特開昭58−208237（ＪＰ，Ａ) 特開昭58−32827（ＪＰ，Ａ) 特開昭57−118794（ＪＰ，Ａ) 薬学雑誌、103巻、第１号（1983），１ −27

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インフルエンザHANA抗原とMDP誘導体との
複合体であって、該複合体がインフルエンザウイルス粒
子様人工膜を形成しているインフルエンザワクチンに、
単糖類、二糖類又は三糖類の糖類より選ばれる少くとも
一種以上を添加して製したインフルエンザワクチン凍結
乾燥製剤。
【請求項２】インフルエンザウイルス粒子様人工膜がコ
レステロールを含む特許請求の範囲第（１）項記載のイ
ンフルエンザワクチン凍結乾燥製剤。
【請求項３】MDP誘導体が６−０−（２−テトラデシル
ヘキサデカノイル）MDPである特許請求の範囲第（１）
又は（２）項記載のインフルエンザワクチン凍結乾燥製
剤。