JPH07112968B2 - リポソ−ム類における抗腫瘍剤類の被包 - Google Patents
リポソ−ム類における抗腫瘍剤類の被包Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背系 1.発明の分野 本発明は、イオン化可能な生物活性剤類、例えばイオン
化可能な抗腫瘍剤類（antineoplastic agents）、特
に、リポソーム類におけるこれらの剤の被包（encapsul
ation）に関するものである。
化可能な抗腫瘍剤類（antineoplastic agents）、特
に、リポソーム類におけるこれらの剤の被包（encapsul
ation）に関するものである。
2.先行技術の記載 種々の研究者により確立されているように、抗腫瘍剤類
の使用による癌の治療は、多くの場合、抗腫瘍剤類を人
体に直接投与するよりもリポソーム類に該抗腫瘍剤類を
被包することにより大いに改善され得る［例えばフォル
セン等（Forssen et al）（1983），キャンサー レス
（Cancer Res.），43:546;ギャビゾンら（Gabizon et a
l）（1982），（Cancer Res.），42:4734;およびオルソ
ンら（Olson et al）（1982），ユーロピアン ジャー
ナル オブ キャンサー クリニカル オンコル（Eur.
J.Cancer Clin.Oncol.），18:167参照、アブラら（Abra
et al）（1983），キャンサー ケミテル ファーマコ
ル（Cancer Chemother.Pharmacol.），11:98参照のこ
と］。このような抗腫瘍剤類をリポソーム類へ配合する
と、その抗腫瘍活性、クリアランス率、組織分布および
毒性が、直接投与に比して変化する［例えばラーマンら
（Rahman et al）（1982），キャンサー レス（Cancer
Res.），42:1817;ローザら（Rosa et al）（1982）ト
ランスポート イン バイオメンブレンズ（Transport
in Biomembranes）における「モデル システムズ ア
ンド リコンスティテューション（Modrl Systems and
Reconstition），アール アントリーニら（A.Antolini
et al）編、ラベン プレス（Raven Press）、ニュー
ヨーク、234−256;ローザら（Rosa et al）（1983），
ファーマコロジー（Pharmacology），26:221;上記フォ
ルセンら（Forssen et al）；上記ギャビソンら（Gabiz
on et al）；および上記オルソンら（Olson et al）参
照のこと］。例えば、アントラサイクリン抗生物質ダウ
ノルビシン（daunorubicin）およびドキソルビシン（do
xorubicin）（アドリアマイシン）（adriamycin）およ
びその医薬的に受容し得る誘導体およびその塩の心臓毒
性が著しく減少することは公知である［例えば上記フォ
ルセンら；上記オルソンら（Olson et al）；および上
記ラーマンら（Rahman et al）参照のこと］。また極め
て毒性の高い抗腫瘍剤類をリポソーム中に導入すること
によって、その投入される人を抗体のような抗腫瘍剤類
にさらす危険は減少できる。
の使用による癌の治療は、多くの場合、抗腫瘍剤類を人
体に直接投与するよりもリポソーム類に該抗腫瘍剤類を
被包することにより大いに改善され得る［例えばフォル
セン等（Forssen et al）（1983），キャンサー レス
（Cancer Res.），43:546;ギャビゾンら（Gabizon et a
l）（1982），（Cancer Res.），42:4734;およびオルソ
ンら（Olson et al）（1982），ユーロピアン ジャー
ナル オブ キャンサー クリニカル オンコル（Eur.
J.Cancer Clin.Oncol.），18:167参照、アブラら（Abra
et al）（1983），キャンサー ケミテル ファーマコ
ル（Cancer Chemother.Pharmacol.），11:98参照のこ
と］。このような抗腫瘍剤類をリポソーム類へ配合する
と、その抗腫瘍活性、クリアランス率、組織分布および
毒性が、直接投与に比して変化する［例えばラーマンら
（Rahman et al）（1982），キャンサー レス（Cancer
Res.），42:1817;ローザら（Rosa et al）（1982）ト
ランスポート イン バイオメンブレンズ（Transport
in Biomembranes）における「モデル システムズ ア
ンド リコンスティテューション（Modrl Systems and
Reconstition），アール アントリーニら（A.Antolini
et al）編、ラベン プレス（Raven Press）、ニュー
ヨーク、234−256;ローザら（Rosa et al）（1983），
ファーマコロジー（Pharmacology），26:221;上記フォ
ルセンら（Forssen et al）；上記ギャビソンら（Gabiz
on et al）；および上記オルソンら（Olson et al）参
照のこと］。例えば、アントラサイクリン抗生物質ダウ
ノルビシン（daunorubicin）およびドキソルビシン（do
xorubicin）（アドリアマイシン）（adriamycin）およ
びその医薬的に受容し得る誘導体およびその塩の心臓毒
性が著しく減少することは公知である［例えば上記フォ
ルセンら；上記オルソンら（Olson et al）；および上
記ラーマンら（Rahman et al）参照のこと］。また極め
て毒性の高い抗腫瘍剤類をリポソーム中に導入すること
によって、その投入される人を抗体のような抗腫瘍剤類
にさらす危険は減少できる。
リポソーム類を使用して抗腫瘍剤類を投与する際には、
医薬被包および治療中の医薬放出の両方に関して問題が
生ずる。被包に関しては、治療中に患者に与える脂質装
填を最小にするように、トラップ効果を増加する必要性
が引続いてあった。さらに、高いトラップ効果によっ
て、癌の治療において現在使用されている高価な医薬を
処理する際の重要な点である少量の医薬しか損失しない
という利点が得られるのである。
医薬被包および治療中の医薬放出の両方に関して問題が
生ずる。被包に関しては、治療中に患者に与える脂質装
填を最小にするように、トラップ効果を増加する必要性
が引続いてあった。さらに、高いトラップ効果によっ
て、癌の治療において現在使用されている高価な医薬を
処理する際の重要な点である少量の医薬しか損失しない
という利点が得られるのである。
医薬の放出に関しては、アドリアマイシンのような多く
の抗腫瘍剤類が被包類が被包後にリポソーム類から急速
に放出されることが見出されていた。このような急速な
放出は、リポソーム被包の有用な効果を減少させるため
一般に望ましくないことである。したがって、リポソー
ム類からの抗腫瘍剤類およびその他の医薬の放出速度を
減少させる方法を見出す努力が当業者により引続いて行
なわれてきた。
の抗腫瘍剤類が被包類が被包後にリポソーム類から急速
に放出されることが見出されていた。このような急速な
放出は、リポソーム被包の有用な効果を減少させるため
一般に望ましくないことである。したがって、リポソー
ム類からの抗腫瘍剤類およびその他の医薬の放出速度を
減少させる方法を見出す努力が当業者により引続いて行
なわれてきた。
これらの被包および放出の問題の他に、臨床医に抗腫瘍
剤類含有リポソーム類を提供するための商業的に許容し
得る方法を見出すという無視すべからざる問題がある。
必要とされる基準にしたがって、リポソーム類の生産お
よび装填は実験室的には行えるものの、一般に、臨床的
には不満足なものである。したがって、被包された医薬
を有するあるいは有さないリポソーム類を出荷、貯蔵、
かつ従来の商業的な販売ルートを通じて損害を与えず搬
送する方法は、強くかつ継続的な需要がある。
剤類含有リポソーム類を提供するための商業的に許容し
得る方法を見出すという無視すべからざる問題がある。
必要とされる基準にしたがって、リポソーム類の生産お
よび装填は実験室的には行えるものの、一般に、臨床的
には不満足なものである。したがって、被包された医薬
を有するあるいは有さないリポソーム類を出荷、貯蔵、
かつ従来の商業的な販売ルートを通じて損害を与えず搬
送する方法は、強くかつ継続的な需要がある。
発明の要約 上記のごとき技術の状態から、本発明の目的は、リポソ
ーム類に抗腫瘍剤類（antineoplastic agents）を被包
し、リポソーム類からの抗腫瘍剤類またはその他の生物
学的に活性な薬剤の放出速度を減少させる方法を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、リポソーム
類が実質的な損耗なしに貯蔵され、出荷されかつ商業的
に頒布され得るように抗腫瘍剤類の装填前または装填後
にリポソーム類を脱水する方法を提供することにある。
ーム類に抗腫瘍剤類（antineoplastic agents）を被包
し、リポソーム類からの抗腫瘍剤類またはその他の生物
学的に活性な薬剤の放出速度を減少させる方法を提供す
ることにある。本発明のさらに他の目的は、リポソーム
類が実質的な損耗なしに貯蔵され、出荷されかつ商業的
に頒布され得るように抗腫瘍剤類の装填前または装填後
にリポソーム類を脱水する方法を提供することにある。
これらおよびその他の諸目的を達成するために、その見
解の一つによれば、本発明は、膜貫通ポテンシャル（tr
ansmembrane potential）がリポソームの壁部を横切っ
て形成されかつ抗腫瘍剤類が該膜貫通ポテンシャルによ
りリポソーム類内に装填されるイオン化可能な抗腫瘍剤
でリポソーム類を装填する方法を提供するものである。
解の一つによれば、本発明は、膜貫通ポテンシャル（tr
ansmembrane potential）がリポソームの壁部を横切っ
て形成されかつ抗腫瘍剤類が該膜貫通ポテンシャルによ
りリポソーム類内に装填されるイオン化可能な抗腫瘍剤
でリポソーム類を装填する方法を提供するものである。
この方法は、水性媒体中に溶解したときに帯電状態（ch
arged state）で存在し得る本質的にいかなる抗腫瘍剤
（例えばプロトン化し得るアミノ基を有する有機化合
物）も使用できる。好ましくは、該薬剤は、リポソーム
膜内に分割されるように比較的親油性でなければならな
い。複数の抗腫瘍剤類は、この方法を用いて同時にある
いは順次装填させることができる。また、イオン化可能
な抗腫瘍剤が装填されるリポソーム類は、従来の被包技
術（例えば、リポソーム類が作られる緩衝液中に医薬を
配合すること）により他の抗腫瘍剤類または他の医薬で
予め装填することができる。
arged state）で存在し得る本質的にいかなる抗腫瘍剤
（例えばプロトン化し得るアミノ基を有する有機化合
物）も使用できる。好ましくは、該薬剤は、リポソーム
膜内に分割されるように比較的親油性でなければならな
い。複数の抗腫瘍剤類は、この方法を用いて同時にある
いは順次装填させることができる。また、イオン化可能
な抗腫瘍剤が装填されるリポソーム類は、従来の被包技
術（例えば、リポソーム類が作られる緩衝液中に医薬を
配合すること）により他の抗腫瘍剤類または他の医薬で
予め装填することができる。
本発明によれば、リポソーム類に薬剤を保持するために
配向した膜貫通ポテンシャルがリポソーム類を横切って
発生しているリポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍
剤類または他の生物学的に活性な薬剤の放出速度を減少
させる方法が提供される。下記に詳述するように、リポ
ソーム類からのアドリアマイシンのようなイオン化可能
な薬剤の放出速度を、このような膜貫通ポテンシャルが
10倍も減少させ得ることは驚くべきことである。この方
法はリポソーム中に被包できるイオン化し得る物質のい
ずれにも用いることできる。この膜貫通ポテンシャル
は、被包後に発生させることもできるし、あるいは上記
被包技術にしたがってリポソーム類に装填するために用
いられた膜貫通ポテンシャルと同一であり得る。
配向した膜貫通ポテンシャルがリポソーム類を横切って
発生しているリポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍
剤類または他の生物学的に活性な薬剤の放出速度を減少
させる方法が提供される。下記に詳述するように、リポ
ソーム類からのアドリアマイシンのようなイオン化可能
な薬剤の放出速度を、このような膜貫通ポテンシャルが
10倍も減少させ得ることは驚くべきことである。この方
法はリポソーム中に被包できるイオン化し得る物質のい
ずれにも用いることできる。この膜貫通ポテンシャル
は、被包後に発生させることもできるし、あるいは上記
被包技術にしたがってリポソーム類に装填するために用
いられた膜貫通ポテンシャルと同一であり得る。
本発明の更なる特徴としては、本発明は臨床での抗腫瘍
剤類の投与に都合がよいようなリポソーム類の種々の脱
水プロトコールを提供するものである。これらのプロト
コールの或る種のものによれば、抗腫瘍剤類をリポソー
ム類中に装填し、その結果得られる製剤を脱水して、抗
腫瘍剤類がリポソーム類から実質的に漏出することな
く、貯蔵され、出荷され、また他の処理も行えるように
するものである。
剤類の投与に都合がよいようなリポソーム類の種々の脱
水プロトコールを提供するものである。これらのプロト
コールの或る種のものによれば、抗腫瘍剤類をリポソー
ム類中に装填し、その結果得られる製剤を脱水して、抗
腫瘍剤類がリポソーム類から実質的に漏出することな
く、貯蔵され、出荷され、また他の処理も行えるように
するものである。
このプロトコールのある実施態様によれば、脱水は１種
またはそれ以上の保護糖類の存在下に行なわれる。この
場合、脱水はさきに凍結することなく行なわねばなら
ず、抗腫瘍剤類の被包に使用されるリポソーム類は、多
分子脂質層を有するタイプのものでなければならず、ま
たリポソーム製剤は完全に脱水できないが、むしろ製剤
内に約２〜約５％の元からの水分を脱水工程の最後まで
残しておかなければならない。脂質当りの水の点から考
えると、これは１モルの脂質当り約12〜35モルの水が脱
水製剤中に存在しなければならないということである。
またはそれ以上の保護糖類の存在下に行なわれる。この
場合、脱水はさきに凍結することなく行なわねばなら
ず、抗腫瘍剤類の被包に使用されるリポソーム類は、多
分子脂質層を有するタイプのものでなければならず、ま
たリポソーム製剤は完全に脱水できないが、むしろ製剤
内に約２〜約５％の元からの水分を脱水工程の最後まで
残しておかなければならない。脂質当りの水の点から考
えると、これは１モルの脂質当り約12〜35モルの水が脱
水製剤中に存在しなければならないということである。
本発明の他の脱水プロトコールによれば、抗腫瘍剤類
は、出荷、貯蔵等用に予め脱水されているリポソーム類
に装填され、ついで再水和される。脱水は、上記方法に
より行なわれ、抗腫瘍剤類の装填は上記膜貫通ポテンシ
ャル法を用いて達成される。膜貫通ポテンシャルは、必
要により脱水工程前または後に発生させる。
は、出荷、貯蔵等用に予め脱水されているリポソーム類
に装填され、ついで再水和される。脱水は、上記方法に
より行なわれ、抗腫瘍剤類の装填は上記膜貫通ポテンシ
ャル法を用いて達成される。膜貫通ポテンシャルは、必
要により脱水工程前または後に発生させる。
上記方法の他に、本発明は、つぎの方法により製造され
る生成物をも提供するものである。すなわち、（１）膜
貫通ポテンシャルによりリポソーム類中に装填される抗
腫瘍剤類を含む医薬製剤、（２）リポソーム類からの薬
剤の放出速度を減少させるようにその膜を横切って膜貫
通ポテンシャルを有するリポソーム類に被包されたイオ
ン化可能な生物学的に活性な薬剤を含む安定化された医
薬製剤、（３）リポソーム類に被包された抗腫瘍剤類を
含む医薬製剤、および（４）膜貫通ポテンシャルにより
予め脱水されたリポソーム類内に装填された抗腫瘍剤類
よりなる医薬製剤である。
る生成物をも提供するものである。すなわち、（１）膜
貫通ポテンシャルによりリポソーム類中に装填される抗
腫瘍剤類を含む医薬製剤、（２）リポソーム類からの薬
剤の放出速度を減少させるようにその膜を横切って膜貫
通ポテンシャルを有するリポソーム類に被包されたイオ
ン化可能な生物学的に活性な薬剤を含む安定化された医
薬製剤、（３）リポソーム類に被包された抗腫瘍剤類を
含む医薬製剤、および（４）膜貫通ポテンシャルにより
予め脱水されたリポソーム類内に装填された抗腫瘍剤類
よりなる医薬製剤である。
本発明の前記および他の目的および利点の達成は、本発
明の好ましい実施態様の記載に関連して記載されてい
る。
明の好ましい実施態様の記載に関連して記載されてい
る。
本明細書で使用されているように、「医薬製剤」、「イ
オン化可能な抗腫瘍剤（ionizable antineoplastic age
nt）」および「イオン化可能な生物学的に活性な薬剤
（ionizable biologically−active agent）」の用語
は、次ぎの意味を有している。すなわち、ヒトまたは動
物への投与に好適でかつ生物学的に活性な物質および適
当な緩衝剤、希釈剤、担体等よりなる組成物を意味し、
イオン化可能な抗腫瘍剤は水性媒体に溶解したときに帯
電した状態で存在し得る抗腫瘍剤を意味し、また、イオ
ン化可能な生物学的に活性な薬剤は水性媒体に溶解した
ときに帯電した状態で存在し得る生物学的に活性な薬剤
を意味する。
オン化可能な抗腫瘍剤（ionizable antineoplastic age
nt）」および「イオン化可能な生物学的に活性な薬剤
（ionizable biologically−active agent）」の用語
は、次ぎの意味を有している。すなわち、ヒトまたは動
物への投与に好適でかつ生物学的に活性な物質および適
当な緩衝剤、希釈剤、担体等よりなる組成物を意味し、
イオン化可能な抗腫瘍剤は水性媒体に溶解したときに帯
電した状態で存在し得る抗腫瘍剤を意味し、また、イオ
ン化可能な生物学的に活性な薬剤は水性媒体に溶解した
ときに帯電した状態で存在し得る生物学的に活性な薬剤
を意味する。
図面の簡単な説明 第１図はNa+/K+拡散ポテンシャルの存在下又は不存在下
に大きなユニラメラベシクル類（LUV類）へのアドリア
マイシン（ADM）の吸収を示す。卵−PC LUV類（１μmol
リン脂質/ml）が0.2mMのアドリアマイシンの存在下に20
℃でインキュベートされた。薬剤の吸収は、前記の「材
料及び方法」で評価された。実験条件は、つぎのとおり
であった。すなわち白抜三角印は、内部及び外部両媒体
中に20mMのヘペス（Hepes）（pH7.5）、169mMのグルタ
ミン酸カリウムを有するベシクル類。白抜丸印は、内部
媒体中に169mMのグルタミン酸カリウムおよび20mMのヘ
ペス（pH7.5）を有し、外部媒体には更にワリノマイシ
ン（valinomycin）を有するベシクル類。白抜四角印は
内部媒体中に20mMのヘペス（pH7.5）、169mMのグルタミ
ン酸カリウムを有し、外部媒体中に20mMのヘペス（pH7.
5）及び150mMのNaClを有するベシクル類。黒丸印は、内
部媒体中に20mMのヘペス（pH7.5）および169mMのグルタ
ミン酸カリウムを有し、外部媒体中に150mMのNaCl、20m
Mのヘペス（pH7.5）およびワリノマイシンを有するベシ
クル類を表す。
に大きなユニラメラベシクル類（LUV類）へのアドリア
マイシン（ADM）の吸収を示す。卵−PC LUV類（１μmol
リン脂質/ml）が0.2mMのアドリアマイシンの存在下に20
℃でインキュベートされた。薬剤の吸収は、前記の「材
料及び方法」で評価された。実験条件は、つぎのとおり
であった。すなわち白抜三角印は、内部及び外部両媒体
中に20mMのヘペス（Hepes）（pH7.5）、169mMのグルタ
ミン酸カリウムを有するベシクル類。白抜丸印は、内部
媒体中に169mMのグルタミン酸カリウムおよび20mMのヘ
ペス（pH7.5）を有し、外部媒体には更にワリノマイシ
ン（valinomycin）を有するベシクル類。白抜四角印は
内部媒体中に20mMのヘペス（pH7.5）、169mMのグルタミ
ン酸カリウムを有し、外部媒体中に20mMのヘペス（pH7.
5）及び150mMのNaClを有するベシクル類。黒丸印は、内
部媒体中に20mMのヘペス（pH7.5）および169mMのグルタ
ミン酸カリウムを有し、外部媒体中に150mMのNaCl、20m
Mのヘペス（pH7.5）およびワリノマイシンを有するベシ
クル類を表す。
第２図はNa+/K+拡散ポテンシャルの存在下または不存在
下での、大きなユニラメラベシクル類へのビンブラスチ
ン（vinblastine）（VINB）の吸収を示す。卵−PC LUV
類（１μmolリン脂質/ml）が0.2mMのビンブラスチンの
存在下に20℃でつぎの条件下でインキュベートされた。
白抜三角印は、内部及び外部緩衝液としての20mMのヘペ
ス（pH7.5）、169mMのグルタミン酸カリウムを有するベ
シクル類、白抜丸印は、内部緩衝液として169mMのグル
タミン酸カリウムおよび20mMのヘペスを有し、外部緩衝
液としてこのものに更にワリノマイシンが加えられたも
のを有するベシクル類、白抜四角印は、外部媒体中に15
0mM NaCl、20mMヘペス（pH7.5）を、ベシクル内部には1
69mMのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類を示
す。黒丸印は外部媒体中に150mM NaCl、20mMヘペス（pH
7.5）を内部媒体にはこのものに更にワリノマイシンを
加えたベシクル類を示す。
下での、大きなユニラメラベシクル類へのビンブラスチ
ン（vinblastine）（VINB）の吸収を示す。卵−PC LUV
類（１μmolリン脂質/ml）が0.2mMのビンブラスチンの
存在下に20℃でつぎの条件下でインキュベートされた。
白抜三角印は、内部及び外部緩衝液としての20mMのヘペ
ス（pH7.5）、169mMのグルタミン酸カリウムを有するベ
シクル類、白抜丸印は、内部緩衝液として169mMのグル
タミン酸カリウムおよび20mMのヘペスを有し、外部緩衝
液としてこのものに更にワリノマイシンが加えられたも
のを有するベシクル類、白抜四角印は、外部媒体中に15
0mM NaCl、20mMヘペス（pH7.5）を、ベシクル内部には1
69mMのグルタミン酸カリウムを有するベシクル類を示
す。黒丸印は外部媒体中に150mM NaCl、20mMヘペス（pH
7.5）を内部媒体にはこのものに更にワリノマイシンを
加えたベシクル類を示す。
第３図は最初の遊離のアドリアマイシン濃度（黒丸）の
関数としての膜を横切ってのNa+/K+勾配を有する卵−PC
LUV類へのアドリアマイシン（ACM）の捕捉を示す。白
抜丸印は蓄積した使用可能な全薬剤のパーセントを示
す。このベシクル類（1mMリン脂質）は、ワリノマイシ
ンの存在下に２時間にわたって示された濃度のアドリア
マイシンと共に20℃でインキュベートした。
関数としての膜を横切ってのNa+/K+勾配を有する卵−PC
LUV類へのアドリアマイシン（ACM）の捕捉を示す。白
抜丸印は蓄積した使用可能な全薬剤のパーセントを示
す。このベシクル類（1mMリン脂質）は、ワリノマイシ
ンの存在下に２時間にわたって示された濃度のアドリア
マイシンと共に20℃でインキュベートした。
第４図は（Ａ）20℃および（Ｂ）37℃での、Na+/K+膜貫
通化学勾配およびワリノマイシンの存在下に卵−PCコレ
ステロールLUV系へのワドリアマイシン（ADM）の捕捉を
示す。このベシクル類（１μmolの全脂質/ml）は、0.2m
Mのアドリアマイシンの存在下に20℃または37℃で２時
間インキュベートされた。使用したコレステロールに対
する卵−PCのモル比は、つぎのとおりである。すなわ
ち、黒丸は1:0、白丸は9:1、黒角は3:1であり、また白
角は1:1である。
通化学勾配およびワリノマイシンの存在下に卵−PCコレ
ステロールLUV系へのワドリアマイシン（ADM）の捕捉を
示す。このベシクル類（１μmolの全脂質/ml）は、0.2m
Mのアドリアマイシンの存在下に20℃または37℃で２時
間インキュベートされた。使用したコレステロールに対
する卵−PCのモル比は、つぎのとおりである。すなわ
ち、黒丸は1:0、白丸は9:1、黒角は3:1であり、また白
角は1:1である。
第５図は種々の温度において0.2mMのアドリアマイシン
の存在下に培養したのちのNa+/K+膜貫通化学勾配の存在
下でのDPPC−コレステロール（1:1）LUV類（1mM脂質）
へのアドリアマイシン（ADM）の捕捉を示す。白抜丸印
はワリノマイシンの存在下で20℃、黒四角印はワリノマ
イシンの存在下で37℃、黒丸印はワリノマイシンの不存
在下で37℃、白抜四角印はワリノマイシンの存在下で60
℃、下向黒三角印（solid downward facing triangle）
はワリノマイシンの不存在下で60℃、上向黒三角印（so
lid upward facing triangle）はワリノマイシンの不存
在下での37℃における卵−PC LUV類（1mM）、下向白抜
三角印（open downward facing triangle）はワノマイ
シンの不存在下での60℃における卵−PC LUV類を示す。
の存在下に培養したのちのNa+/K+膜貫通化学勾配の存在
下でのDPPC−コレステロール（1:1）LUV類（1mM脂質）
へのアドリアマイシン（ADM）の捕捉を示す。白抜丸印
はワリノマイシンの存在下で20℃、黒四角印はワリノマ
イシンの存在下で37℃、黒丸印はワリノマイシンの不存
在下で37℃、白抜四角印はワリノマイシンの存在下で60
℃、下向黒三角印（solid downward facing triangle）
はワリノマイシンの不存在下で60℃、上向黒三角印（so
lid upward facing triangle）はワリノマイシンの不存
在下での37℃における卵−PC LUV類（1mM）、下向白抜
三角印（open downward facing triangle）はワノマイ
シンの不存在下での60℃における卵−PC LUV類を示す。
第６図は0.2mMのアドリアマイシンの存在下での20℃に
おける培養後のNa+/K+化学勾配の存在下での卵−PC/卵
−PS LUV類へのアドリアマイシン（ADM）の捕捉を示
す。白抜三角印はワリノマイシンの存在下での卵−PC/
卵−PS（4:1）、黒三角印はワリノマイシンの不存在下
での卵−PC/卵−PS（4:1）、白抜四角印はワリノマイシ
ンの不存在下での卵−PC/卵−PS（9:1）、黒四角印はワ
リノマイシン不存在下での卵−PC/卵−PS（20:1）、白
抜丸印はワリノマイシンの不存在下での卵−PC/卵−PS
（50:1）、黒丸印はNa+/K+勾配（内側および外側のK+緩
衝液）の不存在下での卵−PC/卵−PS（4:1）への捕捉を
示す。
おける培養後のNa+/K+化学勾配の存在下での卵−PC/卵
−PS LUV類へのアドリアマイシン（ADM）の捕捉を示
す。白抜三角印はワリノマイシンの存在下での卵−PC/
卵−PS（4:1）、黒三角印はワリノマイシンの不存在下
での卵−PC/卵−PS（4:1）、白抜四角印はワリノマイシ
ンの不存在下での卵−PC/卵−PS（9:1）、黒四角印はワ
リノマイシン不存在下での卵−PC/卵−PS（20:1）、白
抜丸印はワリノマイシンの不存在下での卵−PC/卵−PS
（50:1）、黒丸印はNa+/K+勾配（内側および外側のK+緩
衝液）の不存在下での卵−PC/卵−PS（4:1）への捕捉を
示す。
第７図は（Ａ）20℃および（Ｂ）37℃における、膜貫通
のpH勾配を示すLUV類へのアドリアマイシンの捕捉を示
す。実験条件は、つぎのとおりであった。すなわち、プ
ロトンイオン通過担体CCCP（10μＭ）の不存在下（黒
印）および存在下（白抜印）での0.2mMアドリアマイシ
ン、2mMの脂質。内部緩衝液の組成は150mMのKOH、175mM
のグルタミン酸（pH4.6）であり、一方外部緩衝液の組
成は150mMのKOH、125mMのグルタミン酸および30mMのNaC
l（pH7.5）よりなっていた。脂質の組成はEPC（丸印）
および1:1のモル比のEPC/コレステロール（1:1）であっ
た。
のpH勾配を示すLUV類へのアドリアマイシンの捕捉を示
す。実験条件は、つぎのとおりであった。すなわち、プ
ロトンイオン通過担体CCCP（10μＭ）の不存在下（黒
印）および存在下（白抜印）での0.2mMアドリアマイシ
ン、2mMの脂質。内部緩衝液の組成は150mMのKOH、175mM
のグルタミン酸（pH4.6）であり、一方外部緩衝液の組
成は150mMのKOH、125mMのグルタミン酸および30mMのNaC
l（pH7.5）よりなっていた。脂質の組成はEPC（丸印）
および1:1のモル比のEPC/コレステロール（1:1）であっ
た。
第８図は37℃におけるEPC（黒丸印、白抜丸印）およびE
PC/コレステロール（1:1モル比）（黒四角印、白抜四角
印）LUV類からのアドリアマイシンの放出を示す。アド
リアマイシンは、それぞれ5.0および0.5mMの脂質ならび
に薬剤濃度でpH勾配に応じてベシクル類へ捕捉される。
遊離のアドリアマイシンは、150mMのK+（黒色）または1
80mMのNa+（白抜印）を含有しpHを4.6（図8A）またはpH
を7.5（図8B）に調整された緩衝液で並衡にしたゲルフ
ィルトレーションクロマトグラフィカラムによりベシク
ルに会合した薬剤から分離される。
PC/コレステロール（1:1モル比）（黒四角印、白抜四角
印）LUV類からのアドリアマイシンの放出を示す。アド
リアマイシンは、それぞれ5.0および0.5mMの脂質ならび
に薬剤濃度でpH勾配に応じてベシクル類へ捕捉される。
遊離のアドリアマイシンは、150mMのK+（黒色）または1
80mMのNa+（白抜印）を含有しpHを4.6（図8A）またはpH
を7.5（図8B）に調整された緩衝液で並衡にしたゲルフ
ィルトレーションクロマトグラフィカラムによりベシク
ルに会合した薬剤から分離される。
第９図は比較のためのベシクル類（四角形）および脱水
／再水和ベシクル類（円形）に対してpH勾配によって生
ずる膜貫通ポテンシャルを示す。予め存在するプロトン
勾配を有するベシクル類は、４℃で24時間保持される
（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に250mMのト
レハロースの存在下に脱水された。再水和によるベシク
ル類に見られるポテンシャルは、CCCPの不存在下（白抜
丸および白抜四角印）または20μＭのCCCPの存在下（黒
丸および黒四角印）に3H−テトラフェニルホスホニウム
ブロマイドをプローブとして使用して測定された。CCCP
の存在下または不存在下にpH勾配なしにベシクル類にみ
られる膜貫通ポテンシャルは、それぞれ黒三角印および
白抜三角印で示されている。
／再水和ベシクル類（円形）に対してpH勾配によって生
ずる膜貫通ポテンシャルを示す。予め存在するプロトン
勾配を有するベシクル類は、４℃で24時間保持される
（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に250mMのト
レハロースの存在下に脱水された。再水和によるベシク
ル類に見られるポテンシャルは、CCCPの不存在下（白抜
丸および白抜四角印）または20μＭのCCCPの存在下（黒
丸および黒四角印）に3H−テトラフェニルホスホニウム
ブロマイドをプローブとして使用して測定された。CCCP
の存在下または不存在下にpH勾配なしにベシクル類にみ
られる膜貫通ポテンシャルは、それぞれ黒三角印および
白抜三角印で示されている。
第10図は比較のためのベシクル類（四角印）および脱水
／再水和ベシクル類（丸印）に対してNa+/K+化学勾配に
より発生する膜貫通ポテンシャルを示す。予め存在する
Na+/K+勾配を有するベシクル類は、４℃で24時間保持さ
れる（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に250mM
のトレハロースの存在下に脱水された。再水和によるベ
シクル類にみられるポテンシャルは、CCCPの不存在下
（白抜丸および白抜四角印）または20μＭのCCCPの存在
下（黒丸および黒四角印）に3H−テトラフェニルホスホ
ニウムブロマイドをプローブとして使用して測定され
た。ワリノマイシンの存在下または不存在下に膜の両側
にグルタミン酸カリウムを有するベシクル類にみられる
膜貫通ポテンシャルは、それぞれ白抜三角印および黒三
角印で示されている。
／再水和ベシクル類（丸印）に対してNa+/K+化学勾配に
より発生する膜貫通ポテンシャルを示す。予め存在する
Na+/K+勾配を有するベシクル類は、４℃で24時間保持さ
れる（比較例）か、あるいは同一時間高真空下に250mM
のトレハロースの存在下に脱水された。再水和によるベ
シクル類にみられるポテンシャルは、CCCPの不存在下
（白抜丸および白抜四角印）または20μＭのCCCPの存在
下（黒丸および黒四角印）に3H−テトラフェニルホスホ
ニウムブロマイドをプローブとして使用して測定され
た。ワリノマイシンの存在下または不存在下に膜の両側
にグルタミン酸カリウムを有するベシクル類にみられる
膜貫通ポテンシャルは、それぞれ白抜三角印および黒三
角印で示されている。
第11図は予め乾燥したベシクル類にアドリアマイシンを
負荷するための膜貫通ポテンシャルの使用を示す。予め
存在するNa+/K+勾配を有するベシクル類は、250mMのト
レハロースの存在下に24時間脱水される。再水和化に続
いてワリノマイシン（0.5μg/リン脂質μmol）の存在下
（白抜丸印）または不存在下（黒丸印）にアドリアマイ
シンを蓄積させるベシクル類の能力が測定された。同一
時間４℃に保持された比較のためのベシクル類も、ワリ
ノマイシンの存在下（白抜四角印）または不存在下（黒
四角印）に試験された。
負荷するための膜貫通ポテンシャルの使用を示す。予め
存在するNa+/K+勾配を有するベシクル類は、250mMのト
レハロースの存在下に24時間脱水される。再水和化に続
いてワリノマイシン（0.5μg/リン脂質μmol）の存在下
（白抜丸印）または不存在下（黒丸印）にアドリアマイ
シンを蓄積させるベシクル類の能力が測定された。同一
時間４℃に保持された比較のためのベシクル類も、ワリ
ノマイシンの存在下（白抜四角印）または不存在下（黒
四角印）に試験された。
好ましい実施態様の説明 上記のように、本発明はリポソーム類への抗腫瘍剤の被
包に関するものである。
包に関するものである。
抗腫瘍剤類が被包されるリポソーム類は、種種の組成お
よび内部含有物を有しており、かつ現在知られているあ
るいは将来開発されるマルチラメラ、ユニラメラまたは
他のタイプのリポソーム類あるいは一般に脂質含有粒子
は、米国特許出願第476,496号（米国特許第4,522,803
号）、同第521,176号（米国特許第4,588,578号）、同第
591,576号（米国特許4,610,868号）および同第599,691
号（米国特許第4,721,612号）に開示されているタイプ
のステロイドリポソーム類、安定なプルリラメラリポソ
ーム類（SPLV類、）単相ベシクル類（MPV類）または脂
質マトリックス担体（LMC類）の形であり得、その関連
個所は参考のために本明細書に記載されて入れられてい
る。
よび内部含有物を有しており、かつ現在知られているあ
るいは将来開発されるマルチラメラ、ユニラメラまたは
他のタイプのリポソーム類あるいは一般に脂質含有粒子
は、米国特許出願第476,496号（米国特許第4,522,803
号）、同第521,176号（米国特許第4,588,578号）、同第
591,576号（米国特許4,610,868号）および同第599,691
号（米国特許第4,721,612号）に開示されているタイプ
のステロイドリポソーム類、安定なプルリラメラリポソ
ーム類（SPLV類、）単相ベシクル類（MPV類）または脂
質マトリックス担体（LMC類）の形であり得、その関連
個所は参考のために本明細書に記載されて入れられてい
る。
リポソーム類は、リポソーム類の製造法として現在知ら
れているかあるいは将来開発されるいかなる方法によっ
ても製造できる。例えば、マルチメラリポソーム類（ML
V類）製造用の従来の技術により該リポソーム類は形成
できる。すなわち、クロロホルム中に脂質類を溶解する
ことにより適当な容器の内壁に１種またはそれ以上の選
ばれた脂質類を堆積させ、ついでクロロホルムを蒸発さ
せ、被包させるべき水溶液を容器に加え、該水溶液で脂
質類を水和し、かつ得られる懸濁液を旋回させることに
より目的とするリポソーム類が製造される。
れているかあるいは将来開発されるいかなる方法によっ
ても製造できる。例えば、マルチメラリポソーム類（ML
V類）製造用の従来の技術により該リポソーム類は形成
できる。すなわち、クロロホルム中に脂質類を溶解する
ことにより適当な容器の内壁に１種またはそれ以上の選
ばれた脂質類を堆積させ、ついでクロロホルムを蒸発さ
せ、被包させるべき水溶液を容器に加え、該水溶液で脂
質類を水和し、かつ得られる懸濁液を旋回させることに
より目的とするリポソーム類が製造される。
別法としては、逆相蒸発法、注入法および洗浄剤希釈法
のごとき大型ユニラメラリポソーム類（LUV類）の製造
に用いられる技術がリポソーム類の製造に使用できる。
リポソーム類製造のためのこれらおよびその他の方法の
総説は、マーク ジェイ オストロ（Marc j.Ostro）編
「リポソーム類（Liposomes）」マーテルテッカー…構
成している」なる記載を「「リポソーム類（Liposome
s）」ルセル デッカー インコーポレーテッド（Marce
l Dekker Inc.）ニューヨーク1983年発行の第１章に見
出すことができ、その関連部分を参照されたい。スゾカ
ジュニアら（Szoka,jr.,et al）（1980）アン レブ
バイオフィズ バイオエジニヤ（Ann.Rev.Biophys.Bi
oengr.）,9:467も参照のこと。LUV類製造の特に好まし
い方法は、1984年６月20日に出願された米国特許出願第
622,690号「ユニラメラベシクル類製造用押出技術」に
記載され、その関連部分も参照されたい。
のごとき大型ユニラメラリポソーム類（LUV類）の製造
に用いられる技術がリポソーム類の製造に使用できる。
リポソーム類製造のためのこれらおよびその他の方法の
総説は、マーク ジェイ オストロ（Marc j.Ostro）編
「リポソーム類（Liposomes）」マーテルテッカー…構
成している」なる記載を「「リポソーム類（Liposome
s）」ルセル デッカー インコーポレーテッド（Marce
l Dekker Inc.）ニューヨーク1983年発行の第１章に見
出すことができ、その関連部分を参照されたい。スゾカ
ジュニアら（Szoka,jr.,et al）（1980）アン レブ
バイオフィズ バイオエジニヤ（Ann.Rev.Biophys.Bi
oengr.）,9:467も参照のこと。LUV類製造の特に好まし
い方法は、1984年６月20日に出願された米国特許出願第
622,690号「ユニラメラベシクル類製造用押出技術」に
記載され、その関連部分も参照されたい。
他の別法としては、上記米国特許第4,522,803号、同第
4,588,578号および同第4,721,612号に記載の方法により
製造できる。また、リポソーム類自体を使用するより
も、上記米国特許第4,610,868号に記載されているよう
な他の脂質含有粒子が、本発明の実施に当って使用でき
る。さらに、また、必要により、抗腫瘍剤類の担持によ
り使用されるリポソーム類または脂質含有粒子が「決め
られた粒径分布を有するリポソーム類」という名称の19
84年６月20日に出願された米国特許第622,502号（継続
出願が米国特許第5,008,050号として許可されている）
に記載されている方法によりさらに均一な粒径分布を与
える抗体とができ、その関連部分も参照されたい。
4,588,578号および同第4,721,612号に記載の方法により
製造できる。また、リポソーム類自体を使用するより
も、上記米国特許第4,610,868号に記載されているよう
な他の脂質含有粒子が、本発明の実施に当って使用でき
る。さらに、また、必要により、抗腫瘍剤類の担持によ
り使用されるリポソーム類または脂質含有粒子が「決め
られた粒径分布を有するリポソーム類」という名称の19
84年６月20日に出願された米国特許第622,502号（継続
出願が米国特許第5,008,050号として許可されている）
に記載されている方法によりさらに均一な粒径分布を与
える抗体とができ、その関連部分も参照されたい。
上記のように、その特徴の一つによれば、本発明は、膜
貫通ポテンシャルがリポソーム類の壁を横切って生じか
つ抗腫瘍剤類が該膜貫通ポテンシャルによりリポソーム
類内に装填されるイオン化可能な抗腫瘍剤類でリポソー
ム類を装填する方法を提供する。膜貫通ポテンシャル
は、リポソーム類をはさんで１種またはそれ以上の帯電
した種（charged species）（例えばNa+,K+および／ま
たはH+）に対応する濃度勾配をつくることにより発生す
る。この濃度勾配は、異なる内部および外部媒体、すな
わち１種またはそれ以上の帯電された種を有する内部お
よび外部媒体を有するリポソーム類を製造することによ
りつくり出される。
貫通ポテンシャルがリポソーム類の壁を横切って生じか
つ抗腫瘍剤類が該膜貫通ポテンシャルによりリポソーム
類内に装填されるイオン化可能な抗腫瘍剤類でリポソー
ム類を装填する方法を提供する。膜貫通ポテンシャル
は、リポソーム類をはさんで１種またはそれ以上の帯電
した種（charged species）（例えばNa+,K+および／ま
たはH+）に対応する濃度勾配をつくることにより発生す
る。この濃度勾配は、異なる内部および外部媒体、すな
わち１種またはそれ以上の帯電された種を有する内部お
よび外部媒体を有するリポソーム類を製造することによ
りつくり出される。
具体的には、１種またはそれ以上の帯電された種の第１
の濃度を有する第１の媒体を被包するリポソーム類が製
造される。代表的なリポソーム製造技術によれば（先に
述べている従来法を参考されたい）、この第１の媒体は
リポソーム類が製造されている間にリポソーム類を包囲
し、その結果リポソーム類の元来の外部媒体は該第１の
媒体と同一組成を有することになる。濃度勾配をつくり
だすには、元の外部媒体は異なる濃度の１種またはそれ
以上の帯電された種を有する新たな外部媒体で置換され
る。この外部媒体の置換は、新たな媒体で平衡化された
ゲルフィルトレーションカラム、例えばセファデックス
（Sephadex）カラムにリポソーム製剤を通すことによ
り、または遠心分離、透析または関連する技術等、種々
の技術により達成できる。
の濃度を有する第１の媒体を被包するリポソーム類が製
造される。代表的なリポソーム製造技術によれば（先に
述べている従来法を参考されたい）、この第１の媒体は
リポソーム類が製造されている間にリポソーム類を包囲
し、その結果リポソーム類の元来の外部媒体は該第１の
媒体と同一組成を有することになる。濃度勾配をつくり
だすには、元の外部媒体は異なる濃度の１種またはそれ
以上の帯電された種を有する新たな外部媒体で置換され
る。この外部媒体の置換は、新たな媒体で平衡化された
ゲルフィルトレーションカラム、例えばセファデックス
（Sephadex）カラムにリポソーム製剤を通すことによ
り、または遠心分離、透析または関連する技術等、種々
の技術により達成できる。
リポソーム類の透過性に応じて濃度勾配に相当する全膜
貫通ポテンシャルを同時に形成するかあるいは透過性増
強剤、例えばワリノマイシンのようなイオン透過担体が
浴媒体に添加されなければならない（必要により、透過
性増強剤は、クロマトグラフィまたは他の技術を用いて
装填を完了したのち、該製剤から除去できることに注目
されたし。）。いずれの場合も、ネルンスト式により決
定されるマグニチュードを有する膜貫通ポテンシャルは
リポソーム類の膜を横切って発現する。
貫通ポテンシャルを同時に形成するかあるいは透過性増
強剤、例えばワリノマイシンのようなイオン透過担体が
浴媒体に添加されなければならない（必要により、透過
性増強剤は、クロマトグラフィまたは他の技術を用いて
装填を完了したのち、該製剤から除去できることに注目
されたし。）。いずれの場合も、ネルンスト式により決
定されるマグニチュードを有する膜貫通ポテンシャルは
リポソーム類の膜を横切って発現する。
本発明によれば、この膜貫通ポテンシャルは、イオン化
可能な抗体腫瘍剤類をリポソーム類に装填するために使
用できる。特に、濃度勾配を有しかつこのために適当な
配向の膜貫通ポテンシャルを持つリポソーム類がいった
ん作られると、該リポソーム類への抗腫瘍剤類の装填方
法は、該薬剤を外部媒体へ添加する極めて簡単な工程に
縮小される。いったん添加すると、膜貫通ポテシャルは
自動的にリポソーム類へ該薬剤を装填する。さらに、下
記例１に記載したように、この装填は簡単であるだけで
なく極めて効果的である。この例に記載したように、95
％以上の抗腫瘍剤類捕捉効果が、この膜貫通ポテンシャ
ル装填技術により達成できることが見出された。
可能な抗体腫瘍剤類をリポソーム類に装填するために使
用できる。特に、濃度勾配を有しかつこのために適当な
配向の膜貫通ポテンシャルを持つリポソーム類がいった
ん作られると、該リポソーム類への抗腫瘍剤類の装填方
法は、該薬剤を外部媒体へ添加する極めて簡単な工程に
縮小される。いったん添加すると、膜貫通ポテシャルは
自動的にリポソーム類へ該薬剤を装填する。さらに、下
記例１に記載したように、この装填は簡単であるだけで
なく極めて効果的である。この例に記載したように、95
％以上の抗腫瘍剤類捕捉効果が、この膜貫通ポテンシャ
ル装填技術により達成できることが見出された。
膜貫通ポテンシャル装填方法は、適当な水性媒体に溶解
したときに帯電状態で存在するものであればいかなる抗
腫瘍剤でも実質的に使用できる（例えばプロトン化し得
るアミノ基を有する有機化合物）。好ましくは、薬剤が
リポソーム複数の膜に分画されるように、比較的に親油
性でなければならない。この方法でリポソーム類内へ装
填できる抗腫瘍剤類の例としては、ドキソルビシン（do
xorubicin）、マイトマイシン（mitomycin）、ブレオマ
イシン（bleomycin）、ダウノルビシン（daunorubici
n）、ストレプトゾシン（streptozocin）、ビンブラス
チン（binblastine）、ビンクリスチン（vincristin
e）、メクロレタミンハイドロクロライド（mechloretha
mine hydrochloride）、メルファラン（melphalan）、
シクロホスファミド、トリエチレンチオホスフォルアミ
ド、カルムスチン（carmustine）、ロスムチン（lomust
ine）、セムスチン（semustine）、フルオロウラシル、
ヒドロキシウレア、チオグアニン、チタラビン（cytara
bine）、フロクスリジン（floxuridine）、デカルバジ
ン（decarbazine）、シスプラチン（cisplastin）およ
びプロカルバジン（procarbazine）等が挙げられる。
したときに帯電状態で存在するものであればいかなる抗
腫瘍剤でも実質的に使用できる（例えばプロトン化し得
るアミノ基を有する有機化合物）。好ましくは、薬剤が
リポソーム複数の膜に分画されるように、比較的に親油
性でなければならない。この方法でリポソーム類内へ装
填できる抗腫瘍剤類の例としては、ドキソルビシン（do
xorubicin）、マイトマイシン（mitomycin）、ブレオマ
イシン（bleomycin）、ダウノルビシン（daunorubici
n）、ストレプトゾシン（streptozocin）、ビンブラス
チン（binblastine）、ビンクリスチン（vincristin
e）、メクロレタミンハイドロクロライド（mechloretha
mine hydrochloride）、メルファラン（melphalan）、
シクロホスファミド、トリエチレンチオホスフォルアミ
ド、カルムスチン（carmustine）、ロスムチン（lomust
ine）、セムスチン（semustine）、フルオロウラシル、
ヒドロキシウレア、チオグアニン、チタラビン（cytara
bine）、フロクスリジン（floxuridine）、デカルバジ
ン（decarbazine）、シスプラチン（cisplastin）およ
びプロカルバジン（procarbazine）等が挙げられる。
１種の抗腫瘍剤の装填の他に、この方法は複数の抗腫瘍
剤を同時あるいは順次装填するのに使用される。また、
イオン化可能な抗腫瘍剤類が装填されるリポソーム類
は、従来の被包技術（例えばリポソーム類が作られる緩
衝液中に医薬を配合することにより）を用いて他の抗腫
瘍剤または他の医薬を予め装填しておくこともできる。
従来の装填物質はイオン化可能である必要はないので、
このような方法は、癌治療におけるリポソーム被包の
「医薬カクテル」の製造に大きな幅を与える。事実、実
質的にすべてのタイプの抗癌医薬は、リポソーム類の脂
質または水性部分のいずれかで少なくともある程度予め
装填できる。もちろん、必要により上掲のイオン化可能
な医薬の１種またはそれ以上は予め装填でき、かつ膜貫
通ポテンシャル法を用いてリポソーム類に同一または異
種の医薬が添加される。
剤を同時あるいは順次装填するのに使用される。また、
イオン化可能な抗腫瘍剤類が装填されるリポソーム類
は、従来の被包技術（例えばリポソーム類が作られる緩
衝液中に医薬を配合することにより）を用いて他の抗腫
瘍剤または他の医薬を予め装填しておくこともできる。
従来の装填物質はイオン化可能である必要はないので、
このような方法は、癌治療におけるリポソーム被包の
「医薬カクテル」の製造に大きな幅を与える。事実、実
質的にすべてのタイプの抗癌医薬は、リポソーム類の脂
質または水性部分のいずれかで少なくともある程度予め
装填できる。もちろん、必要により上掲のイオン化可能
な医薬の１種またはそれ以上は予め装填でき、かつ膜貫
通ポテンシャル法を用いてリポソーム類に同一または異
種の医薬が添加される。
リポソーム類からのイオン化可能な抗腫瘍剤または他の
イオン化可能な抗腫瘍剤または他のイオン化可能な生物
学的に活性な薬剤の放出速度の低減に関する本発明の方
法については、驚くべきことには、リポソーム類に該薬
剤を保持するために配向しているリポソーム類を横切っ
て膜貫通ポテンシャルを形成することによって、放出速
度が著しく低減されることが見出された。すなわち、イ
オン化したときに正に帯電する薬剤用には、外部ポテン
シャルに比較して負である内部ポテンシャルを有するリ
ポソーム類を横切った膜貫通ポテンシャルがつくり出さ
れるが、負に帯電している薬剤用には、反対の配向が使
用される。
イオン化可能な抗腫瘍剤または他のイオン化可能な生物
学的に活性な薬剤の放出速度の低減に関する本発明の方
法については、驚くべきことには、リポソーム類に該薬
剤を保持するために配向しているリポソーム類を横切っ
て膜貫通ポテンシャルを形成することによって、放出速
度が著しく低減されることが見出された。すなわち、イ
オン化したときに正に帯電する薬剤用には、外部ポテン
シャルに比較して負である内部ポテンシャルを有するリ
ポソーム類を横切った膜貫通ポテンシャルがつくり出さ
れるが、負に帯電している薬剤用には、反対の配向が使
用される。
本発明の膜貫通装填の面に関しては、薬剤放出の速度を
低減するために使用される膜貫ポテンシャルは、Na+,K+
および／またはH+のような帯電した種のリポソーム類の
内部および外部の濃度を調整することによりつくり出さ
れる。事実、このような濃度勾配により生成する膜貫通
ポテンシャルによりリポソーム類が装填されるならば、
元の濃度勾配を保つ外部媒体内にリポソーム類を保つこ
とだけで放出速度の所望の低減を生ずるであろう。別法
としては、膜貫通ポテンシャルがリポソーム類を横切っ
てつくり出されていない場合、例えばリポソーム類が従
来の技術を用いて装填されている場合には、所望の膜貫
通ポテンシャルは、上記交換技術を用いて外部媒体の組
成を変えることにより直ちにつくり出すことができる。
低減するために使用される膜貫ポテンシャルは、Na+,K+
および／またはH+のような帯電した種のリポソーム類の
内部および外部の濃度を調整することによりつくり出さ
れる。事実、このような濃度勾配により生成する膜貫通
ポテンシャルによりリポソーム類が装填されるならば、
元の濃度勾配を保つ外部媒体内にリポソーム類を保つこ
とだけで放出速度の所望の低減を生ずるであろう。別法
としては、膜貫通ポテンシャルがリポソーム類を横切っ
てつくり出されていない場合、例えばリポソーム類が従
来の技術を用いて装填されている場合には、所望の膜貫
通ポテンシャルは、上記交換技術を用いて外部媒体の組
成を変えることにより直ちにつくり出すことができる。
本発明の低減された放出速度は、リポソーム類内に被包
され得る実質的にイオン化可能な生物学的に活性な薬剤
のいずれも使用できる。特に、この技術は、上記のイオ
ン化可能な抗腫瘍剤類および局部麻酔剤、例えばジブカ
インおよびクロルプロナジン、β−アドレナリンしゃ断
薬、例えばプロパノール、チモロールおよびラベトロー
ル、抗高血圧薬、例えばクロニジンおよびヒドララジ
ン、抗うつ剤、例えばイミプラミン、アミプリプチリン
およびドキセピム、鎮痙薬、例えばフェニトイン、制吐
薬、例えばプロカインアミドおよびプロクロルペラジ
ン、抗ヒスタミン剤、例えばジフェニルヒドラミン、ク
ロルフェニラミンおよびプロメタジン、抗不整脈剤、例
えばキシジンおよびジソピラミド、抗マラリア剤、例え
ばクロロキニーネ、および鎮痛剤、例えばコカインを含
む他の種々のイオン化可能な医薬とともに使用できる。
一般に、放出速度の最大の低減は、その通常放出速度が
非親油性物質に比べて高い親油性物質に見られる。
され得る実質的にイオン化可能な生物学的に活性な薬剤
のいずれも使用できる。特に、この技術は、上記のイオ
ン化可能な抗腫瘍剤類および局部麻酔剤、例えばジブカ
インおよびクロルプロナジン、β−アドレナリンしゃ断
薬、例えばプロパノール、チモロールおよびラベトロー
ル、抗高血圧薬、例えばクロニジンおよびヒドララジ
ン、抗うつ剤、例えばイミプラミン、アミプリプチリン
およびドキセピム、鎮痙薬、例えばフェニトイン、制吐
薬、例えばプロカインアミドおよびプロクロルペラジ
ン、抗ヒスタミン剤、例えばジフェニルヒドラミン、ク
ロルフェニラミンおよびプロメタジン、抗不整脈剤、例
えばキシジンおよびジソピラミド、抗マラリア剤、例え
ばクロロキニーネ、および鎮痛剤、例えばコカインを含
む他の種々のイオン化可能な医薬とともに使用できる。
一般に、放出速度の最大の低減は、その通常放出速度が
非親油性物質に比べて高い親油性物質に見られる。
脱水プロコトールに関する本発明方法は、、二つの基本
適な方法が提供される。すなわち、（１）リポソーム類
は、（例えば従来技術または上記の膜貫通ポテンシャル
を用いて）抗腫瘍剤により装填され、貯蔵、出荷等のた
めに脱水され、ついで使用時に再水和されるか、あるい
は（２）予備成形されたリポソーム類は、貯蔵等のため
に脱水され、ついで使用時またはその付近に再水和しか
つ上記膜貫通装填技術を用いてイオン化可能な抗腫瘍剤
で装填する。
適な方法が提供される。すなわち、（１）リポソーム類
は、（例えば従来技術または上記の膜貫通ポテンシャル
を用いて）抗腫瘍剤により装填され、貯蔵、出荷等のた
めに脱水され、ついで使用時に再水和されるか、あるい
は（２）予備成形されたリポソーム類は、貯蔵等のため
に脱水され、ついで使用時またはその付近に再水和しか
つ上記膜貫通装填技術を用いてイオン化可能な抗腫瘍剤
で装填する。
いずれの場合も、リポソーム類は、好ましくは標準の凍
結乾燥装置または同様な装置を用いて脱水される。すな
わち、好ましくは減圧下に脱水される。必要により、リ
ポソーム類およびその周囲の媒体は、脱水前に液体窒素
中で凍結される。別法としては、リポソーム類は凍結前
に単に減圧下に置くことにより脱水できる。予め凍結し
ない脱水は、凍結を予め行なう場合に比べて長く時間が
かかるが、凍結しない場合の方が全工程にわたり条件が
緩やかで、このため一般にリポソーム類に対する損傷が
小さく、かつリポソーム類の内部成分の損失も小さい。
予め凍結することなく室温でかつ1mmHgのオーダーの減
圧状態にできる真空ポンプを使用して減圧下に脱水する
と、約24〜36時間を要するが、予め凍結して同一条件で
脱水すると約12〜24時間である。
結乾燥装置または同様な装置を用いて脱水される。すな
わち、好ましくは減圧下に脱水される。必要により、リ
ポソーム類およびその周囲の媒体は、脱水前に液体窒素
中で凍結される。別法としては、リポソーム類は凍結前
に単に減圧下に置くことにより脱水できる。予め凍結し
ない脱水は、凍結を予め行なう場合に比べて長く時間が
かかるが、凍結しない場合の方が全工程にわたり条件が
緩やかで、このため一般にリポソーム類に対する損傷が
小さく、かつリポソーム類の内部成分の損失も小さい。
予め凍結することなく室温でかつ1mmHgのオーダーの減
圧状態にできる真空ポンプを使用して減圧下に脱水する
と、約24〜36時間を要するが、予め凍結して同一条件で
脱水すると約12〜24時間である。
その内部成分の実質的部分を失うことなく脱水方法が行
なわれるように、系内の水が除去されるとき、リポソー
ム膜と相互作用し、かつリポソーム膜を完全に保つため
に、１種またはそれ以上の糖類を使用することが重要で
ある。使用される種々の種類としては、トレハロース、
シュクロース、グルコール、ラクトースおよびデキスト
ランがある。一般に二糖類は、単糖類よりもすぐれてお
り、またトレハロースおよびシュクロースのごとき二糖
類が最も有効であることが見出された。例えばストレプ
トマイシンおよびジヒドロスロレプトマイシンを含むア
ミノグルコシド類が脱水中にリポソーム類を保護するこ
とが見出された。
なわれるように、系内の水が除去されるとき、リポソー
ム膜と相互作用し、かつリポソーム膜を完全に保つため
に、１種またはそれ以上の糖類を使用することが重要で
ある。使用される種々の種類としては、トレハロース、
シュクロース、グルコール、ラクトースおよびデキスト
ランがある。一般に二糖類は、単糖類よりもすぐれてお
り、またトレハロースおよびシュクロースのごとき二糖
類が最も有効であることが見出された。例えばストレプ
トマイシンおよびジヒドロスロレプトマイシンを含むア
ミノグルコシド類が脱水中にリポソーム類を保護するこ
とが見出された。
リポソーム類の内部および外部媒体のいずれかの部分と
して１種またはそれ以上の糖が含まれる。最も好ましく
は、リポソーム類の膜の内部および外部表面の両方と相
互作用するように、糖類は内部および外部媒体の両方に
含まれるものであり、内部媒体への含有は、リポソーム
形成工程中にリポソーム類に被包されることになる緩衝
液に糖類を添加することにより行なわれる。たいていの
場合、この緩衝液は最終のリポソーム類用の浴媒体も形
成するので、該緩衝液中に糖類を含有させることによっ
て糖を外部媒体に含ませることになる。もちろん、元の
緩衝液以外の外部媒体が、例えば膜貫通ポテンシャル
（上記参照）をつくり出すのに使用される場合、新たな
外部媒体も又１種またはそれ以上の保護糖類を含まなけ
ればならない。
して１種またはそれ以上の糖が含まれる。最も好ましく
は、リポソーム類の膜の内部および外部表面の両方と相
互作用するように、糖類は内部および外部媒体の両方に
含まれるものであり、内部媒体への含有は、リポソーム
形成工程中にリポソーム類に被包されることになる緩衝
液に糖類を添加することにより行なわれる。たいていの
場合、この緩衝液は最終のリポソーム類用の浴媒体も形
成するので、該緩衝液中に糖類を含有させることによっ
て糖を外部媒体に含ませることになる。もちろん、元の
緩衝液以外の外部媒体が、例えば膜貫通ポテンシャル
（上記参照）をつくり出すのに使用される場合、新たな
外部媒体も又１種またはそれ以上の保護糖類を含まなけ
ればならない。
使用されるべき糖の量は、使用される糖の種類および保
護されるべきリポソーム類の性質に左右される。上記の
ように、「脱水リポソーム類」の名称で1984年８月８日
に出願された米国特許第638,809号（米国特許第4,850,6
35号参照）の関連部分を参照されたいが、同特許出願か
ら当業者であれば特別なリポソーム製剤用に最適の組合
せを決定する濃度および種々の糖の種類を直ちに試験で
きる。一般に、100mM以上のオーダーの糖濃度が、最高
のレベルの保護を達成するのに必要なことが見出され
た。膜リン脂質のモル数の観点よりすると、100mMのオ
ーダーに対するミリモルのレベルは１モルのリン脂質当
り約５モルの糖に相当する。
護されるべきリポソーム類の性質に左右される。上記の
ように、「脱水リポソーム類」の名称で1984年８月８日
に出願された米国特許第638,809号（米国特許第4,850,6
35号参照）の関連部分を参照されたいが、同特許出願か
ら当業者であれば特別なリポソーム製剤用に最適の組合
せを決定する濃度および種々の糖の種類を直ちに試験で
きる。一般に、100mM以上のオーダーの糖濃度が、最高
のレベルの保護を達成するのに必要なことが見出され
た。膜リン脂質のモル数の観点よりすると、100mMのオ
ーダーに対するミリモルのレベルは１モルのリン脂質当
り約５モルの糖に相当する。
予め凍結せずに脱水を行なう場合、脱水されるリポソー
ム類が多脂質層（multiple lipid layers）を有するタ
イプであり、そして脱水が製剤中の元の水に対して約２
〜５％が製剤中に残る終点まで行なわれる場合、１種ま
たはそれ以上の保護糖類の使用が省略できる。
ム類が多脂質層（multiple lipid layers）を有するタ
イプであり、そして脱水が製剤中の元の水に対して約２
〜５％が製剤中に残る終点まで行なわれる場合、１種ま
たはそれ以上の保護糖類の使用が省略できる。
いったんリポソーム類が脱水されると、これらが使用さ
れるまで長期間貯蔵できる。貯蔵に適当な温度はリポソ
ーム類の構成に、またいかなる物質がリポソーム類中に
被包されたにせよその温度感度に左右される。例えば、
当業界で知られているように、種々の抗腫瘍剤は熱に不
安定であり、このためにこのような製剤を含有する脱水
リポソーム類は、該薬剤の能力が失なわれないように冷
凍状態で貯蔵しなければならない。また、このような薬
剤には、脱水方法は室温よりもむしろ低温で行なうこと
が望ましい。
れるまで長期間貯蔵できる。貯蔵に適当な温度はリポソ
ーム類の構成に、またいかなる物質がリポソーム類中に
被包されたにせよその温度感度に左右される。例えば、
当業界で知られているように、種々の抗腫瘍剤は熱に不
安定であり、このためにこのような製剤を含有する脱水
リポソーム類は、該薬剤の能力が失なわれないように冷
凍状態で貯蔵しなければならない。また、このような薬
剤には、脱水方法は室温よりもむしろ低温で行なうこと
が望ましい。
脱水リポソーム類を使用する場合には、再水和は、水溶
液、例えば蒸留水または適当な緩衝液をリポソーム類に
単に添加し、これらに再水和させることにより行なわれ
る。該リポソーム類は溶液を静かに渦巻かせることによ
り水溶液中に再懸濁できる。再水和はリポソーム類組成
およびその内部成分に適当な室温またはその多の温度で
行なわれる。
液、例えば蒸留水または適当な緩衝液をリポソーム類に
単に添加し、これらに再水和させることにより行なわれ
る。該リポソーム類は溶液を静かに渦巻かせることによ
り水溶液中に再懸濁できる。再水和はリポソーム類組成
およびその内部成分に適当な室温またはその多の温度で
行なわれる。
投与されるべき抗腫瘍剤が脱水前にリポソーム類へ配合
され、かつ更なる組成変化が望まれない場合には、再水
和されたリポソーム類はリポソームで被包された薬剤の
投与に関する公知の方法で癌治療に直接使用できる。
され、かつ更なる組成変化が望まれない場合には、再水
和されたリポソーム類はリポソームで被包された薬剤の
投与に関する公知の方法で癌治療に直接使用できる。
別法としては、上記膜貫通ポテンシャル法を用いて、イ
オン化可能な抗腫瘍剤類は投与直前に再水和化リポソー
ム類へ配合できる。この方法に関連して、膜貫通ポテン
シャルを発生する濃度勾配は、上記外部媒体交換技術を
用いて脱水前または再水和後のいずれかにつくり出され
る。
オン化可能な抗腫瘍剤類は投与直前に再水和化リポソー
ム類へ配合できる。この方法に関連して、膜貫通ポテン
シャルを発生する濃度勾配は、上記外部媒体交換技術を
用いて脱水前または再水和後のいずれかにつくり出され
る。
例えば、同一の内部および外部媒体を有する、すなわち
膜貫通ポテンシャルのないリポソーム類が製造され、脱
水され、貯蔵され、再水和化され、ついで外部媒体が膜
貫通ポテンシャルを発生する組成を有する新たな媒体で
置換され、かつ該膜貫通ポテンシャルはリポソーム類を
装填するのに使用される。別法として、膜貫通ポテンシ
ャルを生じる内部および外部媒体を有するリポソーム類
が調製され、脱水され、貯蔵され、再水和化され、つい
で膜貫通ポテンシャルを用いて装填が行われる。
膜貫通ポテンシャルのないリポソーム類が製造され、脱
水され、貯蔵され、再水和化され、ついで外部媒体が膜
貫通ポテンシャルを発生する組成を有する新たな媒体で
置換され、かつ該膜貫通ポテンシャルはリポソーム類を
装填するのに使用される。別法として、膜貫通ポテンシ
ャルを生じる内部および外部媒体を有するリポソーム類
が調製され、脱水され、貯蔵され、再水和化され、つい
で膜貫通ポテンシャルを用いて装填が行われる。
本発明を以下の例によりさらに詳細に説明するが、これ
らは本発明を限定するためものではない。種々の例にお
いて共通な材料および方法は、つぎの通りである。
らは本発明を限定するためものではない。種々の例にお
いて共通な材料および方法は、つぎの通りである。
材料および方法 材料 卵ホスファチジルコリン（卵−PCまたはEPC）を、標準
方法［例えば、シングルトンら（Singleton et al）（1
965）ジャーナル オブ ジ アメリカン オイル ケ
ミカル ソサエティ（Journal of the American Oil Ch
emcal Society）,42:53］により分離し、このものはTLC
で測定して99％以上の純度であった。卵−PSを、ホープ
ら（Hope et al）（1985），ビオヒム ビオフィズ ア
クタ（Biochim.Biophys.Acta）812:55］に記載の方法に
より卵−PCから調製した。
方法［例えば、シングルトンら（Singleton et al）（1
965）ジャーナル オブ ジ アメリカン オイル ケ
ミカル ソサエティ（Journal of the American Oil Ch
emcal Society）,42:53］により分離し、このものはTLC
で測定して99％以上の純度であった。卵−PSを、ホープ
ら（Hope et al）（1985），ビオヒム ビオフィズ ア
クタ（Biochim.Biophys.Acta）812:55］に記載の方法に
より卵−PCから調製した。
コレステロール、ワリノマイシン、ビンブラスチン、ヘ
ペス、ジパルミトイルホスファチジルコン（DPPC）、ト
レハロース、CCCPおよび塩類は、シグマ ケミカル カ
ンパニー（Sigma Chemical Company）（ミズリー州セン
トルイス）から入手した。
ペス、ジパルミトイルホスファチジルコン（DPPC）、ト
レハロース、CCCPおよび塩類は、シグマ ケミカル カ
ンパニー（Sigma Chemical Company）（ミズリー州セン
トルイス）から入手した。
アドリアマイシンはアドリア ラボラトリー（Adria La
oratory）（オンタリオ州ミッシソらが）またはキャン
サー リサーチ センター（Cancer Research Center）
（ブリテッシュコロンバア州バンクーバー）のいずれか
から入手した。メトトレキセイト（methotrexate）およ
びチトシンアラビノシド（cytosine arabinoside）もキ
ャンサー リサーチ センターから入手した。
oratory）（オンタリオ州ミッシソらが）またはキャン
サー リサーチ センター（Cancer Research Center）
（ブリテッシュコロンバア州バンクーバー）のいずれか
から入手した。メトトレキセイト（methotrexate）およ
びチトシンアラビノシド（cytosine arabinoside）もキ
ャンサー リサーチ センターから入手した。
トリテイエイテッドメトトレキセート（tritiated meth
otrexate）、DPPCおよびメチルトリフェニルホスフォニ
ウム、また同様に22Na+、3H−イヌリン、14C−イヌリ
ン、3H−テトラフェニルホスフォニウジュブロマイドお
よび3H−H2Oはニューイングラド ニュークレア（New
England Nuclear）（ケベック州ラシーヌ）から入手し
た。トリテイエイテッドチトシンアラビノシド（tritia
tedcytosine arabinosade）はアメルシャム（Amersha
m）（オンタリオ州オークビル）から入手した。
otrexate）、DPPCおよびメチルトリフェニルホスフォニ
ウム、また同様に22Na+、3H−イヌリン、14C−イヌリ
ン、3H−テトラフェニルホスフォニウジュブロマイドお
よび3H−H2Oはニューイングラド ニュークレア（New
England Nuclear）（ケベック州ラシーヌ）から入手し
た。トリテイエイテッドチトシンアラビノシド（tritia
tedcytosine arabinosade）はアメルシャム（Amersha
m）（オンタリオ州オークビル）から入手した。
試薬 グルタミン酸カリウム、KClおよびNaCl緩衝液はNaOHでp
Hを7.5に調整した20mMのヘペス緩衝液中で調製した。こ
の溶液は、それぞれ150、150および169mMのKCl、NaClお
よびグルタミン酸カリウムの濃度に相当する通常の310m
osm/kgの浸透性（osmotarity）に調整された。
Hを7.5に調整した20mMのヘペス緩衝液中で調製した。こ
の溶液は、それぞれ150、150および169mMのKCl、NaClお
よびグルタミン酸カリウムの濃度に相当する通常の310m
osm/kgの浸透性（osmotarity）に調整された。
ベシクル製剤 ベシクル類は、上記米国特許出願第622,690号（関連米
国特許第5,008,050号）および同第622,502号に記載の押
出技術を用いて調製した。これらの技術については、上
記出願および特許を参照されたい。この技術はまた、ホ
ープら（Hope et al）（1985），ビオヒム ビオフィズ
アクタ（Biochim.Biophys.Acta）812:55−65］にも記
載されている。これらの技術で製造されたベシクル類
は、本明細書中においてETV類、すなわち押出技術ベシ
クル類（Ｅxtrusion Ｔechnique Ｖesicles）またはLUV
類、すなわち大きなユニラメラリポソーム類（Ｌarge
Ｕnilamellar Ｌiposomes）として言及されている。
国特許第5,008,050号）および同第622,502号に記載の押
出技術を用いて調製した。これらの技術については、上
記出願および特許を参照されたい。この技術はまた、ホ
ープら（Hope et al）（1985），ビオヒム ビオフィズ
アクタ（Biochim.Biophys.Acta）812:55−65］にも記
載されている。これらの技術で製造されたベシクル類
は、本明細書中においてETV類、すなわち押出技術ベシ
クル類（Ｅxtrusion Ｔechnique Ｖesicles）またはLUV
類、すなわち大きなユニラメラリポソーム類（Ｌarge
Ｕnilamellar Ｌiposomes）として言及されている。
簡単にいえば、乾燥脂質フィルムは25〜100μmolのリン
脂質/mlの濃度範囲で大きなマルチラメラベシクル類を
製造するために適当な緩衝液で水和される。使用時には
水和前に22Na+（５μCi）または3H−イヌリン（５μC
i）が乾燥脂質に添加される。
脂質/mlの濃度範囲で大きなマルチラメラベシクル類を
製造するために適当な緩衝液で水和される。使用時には
水和前に22Na+（５μCi）または3H−イヌリン（５μC
i）が乾燥脂質に添加される。
混合物を渦回により分散させ、ついで例えば250psiの圧
力を用いて100nmの孔径の２枚の積重ねたポリカーボネ
ートフィルタ［ヌクレポア，インコーポレーテッド（Nu
clepore,Inc.），カルフォルニア州プレザントン］を10
回通過させた。例1Bおよび2Bの実験には、分散液は液体
窒素中で凍結され、かつポリカーボネートフィルタへの
押出前に５回融凍を行なった。得られるベシクル類は10
3nmの平均粒径を有し、かつ約1.5μl/μmolリン脂質の
捕捉容積を有していた。例１および２の残りの実験用に
は、液体窒素中で２回の凍結−融凍のサイクルにより最
初の押出を行ない、その後、５回以上フィルタを通過さ
せた。この場合、ベシクル類は90nmの平均粒径を有し、
かつ再び約1.5μl/μmolリン脂質の捕捉容積を有してい
た。
力を用いて100nmの孔径の２枚の積重ねたポリカーボネ
ートフィルタ［ヌクレポア，インコーポレーテッド（Nu
clepore,Inc.），カルフォルニア州プレザントン］を10
回通過させた。例1Bおよび2Bの実験には、分散液は液体
窒素中で凍結され、かつポリカーボネートフィルタへの
押出前に５回融凍を行なった。得られるベシクル類は10
3nmの平均粒径を有し、かつ約1.5μl/μmolリン脂質の
捕捉容積を有していた。例１および２の残りの実験用に
は、液体窒素中で２回の凍結−融凍のサイクルにより最
初の押出を行ない、その後、５回以上フィルタを通過さ
せた。この場合、ベシクル類は90nmの平均粒径を有し、
かつ再び約1.5μl/μmolリン脂質の捕捉容積を有してい
た。
被包されなかった22Na2,3H−イヌリンの除去に当って
は、22Na+の除去用にはセファデックス（Sephadex）Ｇ
−50の、また3H−イヌリン除去用にはウルトラゲル（
Ultragel）AcA34のカラム（1.4×10cm）にベシクル類を
通過させて除去を行なった。この方法では、一般に試料
のリン脂質顔料を約50％まで希釈した。
は、22Na+の除去用にはセファデックス（Sephadex）Ｇ
−50の、また3H−イヌリン除去用にはウルトラゲル（
Ultragel）AcA34のカラム（1.4×10cm）にベシクル類を
通過させて除去を行なった。この方法では、一般に試料
のリン脂質顔料を約50％まで希釈した。
脱水 試料（1ml）をバーチスフリーズドライヤー（Virtis Fr
eeze Drier）（ニューヨーク州ガーディナー）を用い高
真空下に室温で10mlのキメックス管（Kimex tube）内で
乾燥した。いくつかの場合、試料を脱水前に液体窒素中
で凍結させた。それぞれの場合、減圧脱水法を約24時間
行なった。
eeze Drier）（ニューヨーク州ガーディナー）を用い高
真空下に室温で10mlのキメックス管（Kimex tube）内で
乾燥した。いくつかの場合、試料を脱水前に液体窒素中
で凍結させた。それぞれの場合、減圧脱水法を約24時間
行なった。
再水和 １〜７日間脱水および貯蔵を行なった後、試料を蒸留水
（900μｌ）で再水和化し、ベシクル類をゆるく渦回さ
せて分散させた。
（900μｌ）で再水和化し、ベシクル類をゆるく渦回さ
せて分散させた。
測定 リン脂質はチェンら（chen et al），（1956）アナリテ
ィカルケミストリー（Anal.chem.）28:1756の記載によ
り無機リンの測定により定量した。同様にボッチャーら
（Bottcher et al），（1961）アナル シマ アクタ
（Anal.Chima Acta）24:203を参照。別法としては、あ
る場合には液体シンチレーションカウンティングにより
［3H］DPPC（0.05μCi/μmol脂質）を定量した。
ィカルケミストリー（Anal.chem.）28:1756の記載によ
り無機リンの測定により定量した。同様にボッチャーら
（Bottcher et al），（1961）アナル シマ アクタ
（Anal.Chima Acta）24:203を参照。別法としては、あ
る場合には液体シンチレーションカウンティングにより
［3H］DPPC（0.05μCi/μmol脂質）を定量した。
アドリマイシンは、ベシクル懸濁液の一定量を0.5％の
トライトン（Triton）Ｘ−100（これはベシクル類を分
断しかつ捕捉されている薬剤を放出する）と混合し、パ
イ ユニカム（Pye Umicam）SP8−200分光光度計を用い
て480nmにおける吸収を測定した。ビンブラスチンは、9
4％エタノール中に溶解した懸濁液の265nmにおける吸収
を測定することにより測定した。
トライトン（Triton）Ｘ−100（これはベシクル類を分
断しかつ捕捉されている薬剤を放出する）と混合し、パ
イ ユニカム（Pye Umicam）SP8−200分光光度計を用い
て480nmにおける吸収を測定した。ビンブラスチンは、9
4％エタノール中に溶解した懸濁液の265nmにおける吸収
を測定することにより測定した。
種々のトリムウム標識化合物（tritiated compound）お
よび14C−イヌリンはフィリップス（phillips）PW4700
液体シンチレーションカウンターにより定量し、22Na+
はベックマンガンマ800（Beckman Gamma800）でガンマ
カウンティングで定量した。
よび14C−イヌリンはフィリップス（phillips）PW4700
液体シンチレーションカウンターにより定量し、22Na+
はベックマンガンマ800（Beckman Gamma800）でガンマ
カウンティングで定量した。
例１ 膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム類内へのイオ
ン化し得る抗腫瘍剤の装填 本例は、膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム内へ
のイオン化可能な抗腫瘍剤の活性装填を説明するもので
ある。
ン化し得る抗腫瘍剤の装填 本例は、膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム内へ
のイオン化可能な抗腫瘍剤の活性装填を説明するもので
ある。
例のＡ部は、膜貫通ポテンシャルを発生するためにNa+/
K+勾配を利用したリポソーム類中に抗癌剤であるアドリ
アマイシンおよびビンビラスチンの装填を説明し、Ｂ部
はpH勾配を利用したアドリアマイシンの装填を説明し、
またＣ部はメトトレキセイトまたはチトシンアラビノシ
ドのいずれかにより予め受動的に装填されたリポソーム
類へアドリアマイシンを装填させるための膜貫通ポテン
シャルの利用を説明する。
K+勾配を利用したリポソーム類中に抗癌剤であるアドリ
アマイシンおよびビンビラスチンの装填を説明し、Ｂ部
はpH勾配を利用したアドリアマイシンの装填を説明し、
またＣ部はメトトレキセイトまたはチトシンアラビノシ
ドのいずれかにより予め受動的に装填されたリポソーム
類へアドリアマイシンを装填させるための膜貫通ポテン
シャルの利用を説明する。
Ａ部 Na+/K+勾配を利用した活性装填 膜ポテンシャルは、グルタミン酸カリウム緩衝液（上
記）中で卵−PC LUV類を形成し、ついでセファデックス
Ｇ−50脱塩カラムを用いてNaCl緩衝液（上記）用の未捕
捉緩衝液を交換することにより発生させた。この時、カ
リウムイオン透過担体、ワリノマイシン（1mg/mlエタノ
ール）を0.5μg/μmolリン脂質の濃度になるように添加
した。膜ポテンシャルは、膜ポテンシャルのプローブで
あるメチルトリフェニルホスフォニウムを用いて測定さ
れた［バリーら（Bally et al），（1985），ビオフィ
ム ビオフィズ アクタ（Biochim.Biophys.Acta），81
2:66を参照。また下記例４を参照。ここではプローブは
メチルトリフェニルホスホニウムが使用されてい
る。］。
記）中で卵−PC LUV類を形成し、ついでセファデックス
Ｇ−50脱塩カラムを用いてNaCl緩衝液（上記）用の未捕
捉緩衝液を交換することにより発生させた。この時、カ
リウムイオン透過担体、ワリノマイシン（1mg/mlエタノ
ール）を0.5μg/μmolリン脂質の濃度になるように添加
した。膜ポテンシャルは、膜ポテンシャルのプローブで
あるメチルトリフェニルホスフォニウムを用いて測定さ
れた［バリーら（Bally et al），（1985），ビオフィ
ム ビオフィズ アクタ（Biochim.Biophys.Acta），81
2:66を参照。また下記例４を参照。ここではプローブは
メチルトリフェニルホスホニウムが使用されてい
る。］。
アドリアマイシン（0.2mMの最終濃度）およびビンブラ
スチン（0.2mMの最終濃度）をNa+/K+イオン勾配のある
またはないLUV分散液にワリノマイシンとともにおよび
なしに添加した。種々の時間において、隔離されていな
い医薬を、該溶液の一定量ずつを1mlのセファデックス
Ｇ−50カラムに通すことにより除去した。次いで脂質お
よび医薬濃度を上記の方法を用いて測定した。その結果
は、第１図および第２図に示されている。
スチン（0.2mMの最終濃度）をNa+/K+イオン勾配のある
またはないLUV分散液にワリノマイシンとともにおよび
なしに添加した。種々の時間において、隔離されていな
い医薬を、該溶液の一定量ずつを1mlのセファデックス
Ｇ−50カラムに通すことにより除去した。次いで脂質お
よび医薬濃度を上記の方法を用いて測定した。その結果
は、第１図および第２図に示されている。
第１図に示すように、Na+/K+勾配およびワリノマイシン
の両方がない場合、低いLUV会合アドリアマイシンのレ
ベル（6nmolアドリアマイシン／μmolリン脂質以下）が
２時間の培養で観察された。しかしながら、ワリノマイ
シンおよびNa+/K+勾配が存在すると、ベシクル会合アド
リアマイシンの量の著しい増加が観察される。この吸収
は20分以内で75％以上完成し、190nmolアドリアマイシ
ン／μmolリン脂質の平衡レベルに達する。これは、溶
液中に最初含有されていた95％の薬剤がベシクル類によ
って吸収され、95％の捕捉率に相当する。濃度の点か
ら、この吸収は約127mMの内部アドリアマイシン濃度に
相当する。
の両方がない場合、低いLUV会合アドリアマイシンのレ
ベル（6nmolアドリアマイシン／μmolリン脂質以下）が
２時間の培養で観察された。しかしながら、ワリノマイ
シンおよびNa+/K+勾配が存在すると、ベシクル会合アド
リアマイシンの量の著しい増加が観察される。この吸収
は20分以内で75％以上完成し、190nmolアドリアマイシ
ン／μmolリン脂質の平衡レベルに達する。これは、溶
液中に最初含有されていた95％の薬剤がベシクル類によ
って吸収され、95％の捕捉率に相当する。濃度の点か
ら、この吸収は約127mMの内部アドリアマイシン濃度に
相当する。
第２図に示すように、ビンブラスチンも膜ポテンシャル
に応じてLUV系内に蓄積できる。ワリノマイシンおよびN
a+/K+勾配が存在する場合には、40nmolビンヒブラスチ
ン／μmolリン脂質が、Na+/K+勾配がない場合のほとん
どゼロに近い捕捉と比較して２時間以内に蓄積される。
また、ワリノマイシンがなくてもNa+/K+勾配の存在によ
りかなり捕捉することができる。
に応じてLUV系内に蓄積できる。ワリノマイシンおよびN
a+/K+勾配が存在する場合には、40nmolビンヒブラスチ
ン／μmolリン脂質が、Na+/K+勾配がない場合のほとん
どゼロに近い捕捉と比較して２時間以内に蓄積される。
また、ワリノマイシンがなくてもNa+/K+勾配の存在によ
りかなり捕捉することができる。
要約すれば、第１図および第２図の結果は、膜貫通ポテ
ンシャルに応じてアドリアマイシンおよびビンブラスチ
ンを隔離するLUV系の著しい能力を明らかにしている。
使用する条件下では、捕捉レベルは、それぞれビンブラ
スチンおよびアドリアマイシンの２×102および２×104
の最終貫通膜医薬濃度勾配に応じて達成される。更に、
これらの勾配は20℃で40時間以上安定であることが見出
された。
ンシャルに応じてアドリアマイシンおよびビンブラスチ
ンを隔離するLUV系の著しい能力を明らかにしている。
使用する条件下では、捕捉レベルは、それぞれビンブラ
スチンおよびアドリアマイシンの２×102および２×104
の最終貫通膜医薬濃度勾配に応じて達成される。更に、
これらの勾配は20℃で40時間以上安定であることが見出
された。
操作について特別な理論に結び付けることを望むもので
はないが、Na+/K+勾配に応じてアドリアマイシン、ビン
ブラスチンおよび他のイオン化可能な抗腫瘍剤に見られ
る捕捉に関係する機構は、H+イオンに対するリポソーム
膜の透過性に基づくNa+/K+勾配に応じて自動的に発生す
るpH勾配を含むものと思われる。この機構によれば、イ
オン化可能な抗腫瘍剤は、内部および外部H+イオン濃度
の関数であるその内部および外部濃度によって非荷電状
態で膜を通過し、その薬剤の内部濃度はその内部H+濃度
が高い場合に高く、その逆もまた同様である。
はないが、Na+/K+勾配に応じてアドリアマイシン、ビン
ブラスチンおよび他のイオン化可能な抗腫瘍剤に見られ
る捕捉に関係する機構は、H+イオンに対するリポソーム
膜の透過性に基づくNa+/K+勾配に応じて自動的に発生す
るpH勾配を含むものと思われる。この機構によれば、イ
オン化可能な抗腫瘍剤は、内部および外部H+イオン濃度
の関数であるその内部および外部濃度によって非荷電状
態で膜を通過し、その薬剤の内部濃度はその内部H+濃度
が高い場合に高く、その逆もまた同様である。
膜貫通ポテンシャルの装填方法は、さらに使用される医
薬の量を変えることによってさらに特徴づけられるもの
である。第３図に示すように、所定のベシクル濃度（1m
Mリン脂質）を保ちながら、０から10mMへと初期アドリ
アマイシン濃度を増加することによって、膜貫通ポテン
シャルによって作動するアドリアマイシン捕捉工程が約
400nmol/μmolリン脂質で飽和になることを示した。０
から0.2mMのアドリアマイシンで、その捕捉は最初の遊
離濃度に比例しかつほぼ定量的（95％以上の捕捉効率）
である。0.2mM以上のアドリアマイシンでは、捕捉効率
は捕捉工程の飽和により減少した。しかしながら、これ
らの高い医薬濃度での高い補足効果は、ベシクル濃度増
加という簡単な方策により直ちに達成できる。例えば、
50mMのリン脂質濃度に相当するLUV類の存在下に10mMの
アドリアマイシンを培養すると、98％の捕捉率に相当す
る196nmolアドリアマイシン／μmolリン脂質のレベルの
捕捉が生じたのである。
薬の量を変えることによってさらに特徴づけられるもの
である。第３図に示すように、所定のベシクル濃度（1m
Mリン脂質）を保ちながら、０から10mMへと初期アドリ
アマイシン濃度を増加することによって、膜貫通ポテン
シャルによって作動するアドリアマイシン捕捉工程が約
400nmol/μmolリン脂質で飽和になることを示した。０
から0.2mMのアドリアマイシンで、その捕捉は最初の遊
離濃度に比例しかつほぼ定量的（95％以上の捕捉効率）
である。0.2mM以上のアドリアマイシンでは、捕捉効率
は捕捉工程の飽和により減少した。しかしながら、これ
らの高い医薬濃度での高い補足効果は、ベシクル濃度増
加という簡単な方策により直ちに達成できる。例えば、
50mMのリン脂質濃度に相当するLUV類の存在下に10mMの
アドリアマイシンを培養すると、98％の捕捉率に相当す
る196nmolアドリアマイシン／μmolリン脂質のレベルの
捕捉が生じたのである。
ビンブラスチンを使用した同様な研究により、40nmol瞳
ビンブラスチン／μmolリン脂質で捕捉レベルが飽和に
達することが明らかとなった。100％に近い捕捉率は、5
mMのリン脂質に相当するLUV類の濃度で0.2mMのビンブラ
スチンの培養を行なうことにより達成される。
ビンブラスチン／μmolリン脂質で捕捉レベルが飽和に
達することが明らかとなった。100％に近い捕捉率は、5
mMのリン脂質に相当するLUV類の濃度で0.2mMのビンブラ
スチンの培養を行なうことにより達成される。
リポソーム系医薬搬送システムは、血清成分により誘発
される捕捉される物質の漏出を減少させるために当モル
レベルのコレステロールおよびさらに飽和されたリン脂
質を通常含むので［例えば、ギャビゾンら（Gabison et
al）（1982）キャンサー レス（Cancer Res.），42:4
734メイヒューら（Mayhew et al）（1979）キャンサー
トリート レポート（Cancer Terat.Rep.）,63:192
3、およびパパハジョプーロスら（Papahadjopoulos et
al）（1980），リポソームス アンド イムノロジー
（Lipoxomes and Immunolohgy）（Tom and Six,eds）
（Elsevier,New York）参照のこと］、研究は卵PC LUV
系へのアドリアマイシンの活性補足に関するコレステロ
ール影響を測定して行なった。第４図Ａに示すように、
20℃で当モルの卵−PC/コレステロールレベルを達成す
るためのコレステロール含量の段階的増加は、アドリア
マイシン蓄積速度の相当する減少をもたらす。しかしな
がら、急速な捕捉は単に高速でベシクル−医薬系を培養
することによってもなお達成できる。第４図Ｂに示すよ
うに、平衡捕捉レベルは、37℃で30分以内に達成でき
る。この効果は、卵−PC/コレステロール（1:1）系で最
も著しいものであった。この系では20℃から37℃へと温
度を上げることによって30分間培養したのち42nmol/μm
ol脂質から153nmol/μmol脂質へとベシクル−会合アド
リアマイシンの増加が生じた。これらの結果、ベシクル
内部への医薬の効果的な輸送にはむしろ「流体」二重層
を有することが重要であることを示している。
される捕捉される物質の漏出を減少させるために当モル
レベルのコレステロールおよびさらに飽和されたリン脂
質を通常含むので［例えば、ギャビゾンら（Gabison et
al）（1982）キャンサー レス（Cancer Res.），42:4
734メイヒューら（Mayhew et al）（1979）キャンサー
トリート レポート（Cancer Terat.Rep.）,63:192
3、およびパパハジョプーロスら（Papahadjopoulos et
al）（1980），リポソームス アンド イムノロジー
（Lipoxomes and Immunolohgy）（Tom and Six,eds）
（Elsevier,New York）参照のこと］、研究は卵PC LUV
系へのアドリアマイシンの活性補足に関するコレステロ
ール影響を測定して行なった。第４図Ａに示すように、
20℃で当モルの卵−PC/コレステロールレベルを達成す
るためのコレステロール含量の段階的増加は、アドリア
マイシン蓄積速度の相当する減少をもたらす。しかしな
がら、急速な捕捉は単に高速でベシクル−医薬系を培養
することによってもなお達成できる。第４図Ｂに示すよ
うに、平衡捕捉レベルは、37℃で30分以内に達成でき
る。この効果は、卵−PC/コレステロール（1:1）系で最
も著しいものであった。この系では20℃から37℃へと温
度を上げることによって30分間培養したのち42nmol/μm
ol脂質から153nmol/μmol脂質へとベシクル−会合アド
リアマイシンの増加が生じた。これらの結果、ベシクル
内部への医薬の効果的な輸送にはむしろ「流体」二重層
を有することが重要であることを示している。
アドリアマイシンの膜貫通ポテンシャル装填に関するリ
ン脂質アシル鎖の増大した飽和度の効果は、DDPC−コレ
ステロール（1:1）LUV類への捕捉をチェックすることに
より試験された。第５図に示すように、20℃で４時間以
上経ってもアドリアマイシンの捕捉は見られなかった。
しかしながら、60℃での培養は、２時間で150nmol医薬
／μmol脂質の隔離されたアドリアマイシンレベルを生
じる。また、かなりの捕捉（約60nmol/μmol脂質まで）
がワリノマイシンの不存在下に培養したこれらの系で観
察された。同様に、卵−PC LUV類には、それぞれ37℃お
よび60℃で60および100nmol/μmol脂質のアドリアマイ
シン捕捉レベルが達成された（第５図）。
ン脂質アシル鎖の増大した飽和度の効果は、DDPC−コレ
ステロール（1:1）LUV類への捕捉をチェックすることに
より試験された。第５図に示すように、20℃で４時間以
上経ってもアドリアマイシンの捕捉は見られなかった。
しかしながら、60℃での培養は、２時間で150nmol医薬
／μmol脂質の隔離されたアドリアマイシンレベルを生
じる。また、かなりの捕捉（約60nmol/μmol脂質まで）
がワリノマイシンの不存在下に培養したこれらの系で観
察された。同様に、卵−PC LUV類には、それぞれ37℃お
よび60℃で60および100nmol/μmol脂質のアドリアマイ
シン捕捉レベルが達成された（第５図）。
アシル鎖組成およびコレステロール含量の変動の他に、
生体内分布および捕捉工程に影響する帯電した脂質種も
リポソーム系分配系に配合された［フレーリーら（Fral
ey et al）（1981）バイオケミストリー（Biochemistr
y），20:6978、ヨナら（Jonah et al）（1975）ビオヒ
ム ビオフィズ アクタ（Biochim.Biophys.Acta）,40
1:336およびモークら（Mauk et al）（1979），プロク
ナットル アガド サイエンス ユーエスケイ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）,76:765参照］。膜貫通ポテンシ
ャル装填に関して酸性（負に帯電）リン脂質、卵−PSの
効果を測定した。第６図に示すように、20モル％の卵−
PSを含有する系はワリノマイシンの存在下に、卵−PSの
不存在下（第１図）に観察されたのと実質的に同一な医
薬捕捉の挙動を示した。しかしながら、純粋な卵−PC系
とは対照的に、ワリノマイシンの不存在下においてLUV
類含有卵−PSではかなりの捕捉が観察された。卵−PS含
量の２モル％から20モル％への増加は、このような捕捉
（２時間の培養）を30から78nmolアドリアマイシン／μ
molリン脂質に増加させた。
生体内分布および捕捉工程に影響する帯電した脂質種も
リポソーム系分配系に配合された［フレーリーら（Fral
ey et al）（1981）バイオケミストリー（Biochemistr
y），20:6978、ヨナら（Jonah et al）（1975）ビオヒ
ム ビオフィズ アクタ（Biochim.Biophys.Acta）,40
1:336およびモークら（Mauk et al）（1979），プロク
ナットル アガド サイエンス ユーエスケイ（Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA）,76:765参照］。膜貫通ポテンシ
ャル装填に関して酸性（負に帯電）リン脂質、卵−PSの
効果を測定した。第６図に示すように、20モル％の卵−
PSを含有する系はワリノマイシンの存在下に、卵−PSの
不存在下（第１図）に観察されたのと実質的に同一な医
薬捕捉の挙動を示した。しかしながら、純粋な卵−PC系
とは対照的に、ワリノマイシンの不存在下においてLUV
類含有卵−PSではかなりの捕捉が観察された。卵−PS含
量の２モル％から20モル％への増加は、このような捕捉
（２時間の培養）を30から78nmolアドリアマイシン／μ
molリン脂質に増加させた。
Ｂ部 pH勾配を利用した活性装填 150mMのKOHおよび175mMのグルタミン酸（pH4.6）でLUV
類を形成させついでセファデックスＧ−50脱塩カラムを
用いて150mMのKOH、125mMのグルタミン酸および30mMのN
aClの未捕捉緩衝液で交換することにより、膜貫通pH勾
配を発生させた。［ホープら（Hope et al），（198
5），ビオヒム ビオフィズ アクタ（（Biochim.Bioph
ys.Acta），812:55］。このとき、プロトンイオン透過
担体（エタノール中の10mM）を添加して10μＭの濃度と
した。
類を形成させついでセファデックスＧ−50脱塩カラムを
用いて150mMのKOH、125mMのグルタミン酸および30mMのN
aClの未捕捉緩衝液で交換することにより、膜貫通pH勾
配を発生させた。［ホープら（Hope et al），（198
5），ビオヒム ビオフィズ アクタ（（Biochim.Bioph
ys.Acta），812:55］。このとき、プロトンイオン透過
担体（エタノール中の10mM）を添加して10μＭの濃度と
した。
アドリアマイシン（0.2mMの最終濃度）を該LUV分散液に
添加した。種々の時間において、隔離されていない医薬
を1mlのセファデックスＧ−50カラムに該溶液を一定量
づつ通過されることにより除去した。ついで、脂質およ
び医薬濃度を測定した。
添加した。種々の時間において、隔離されていない医薬
を1mlのセファデックスＧ−50カラムに該溶液を一定量
づつ通過されることにより除去した。ついで、脂質およ
び医薬濃度を測定した。
第７図は、膜貫通pH勾配を示すEPCおよびEPC/コレステ
ロールより構成されるLUVが、プロトンイオン透過担体C
CCPの不存在下にアドリアマイシンを蓄積することを示
す。20℃で、50％の最大捕捉がEPC/コレステロールおよ
びEPC LUVで各々15分間および５分以下で観察された
（第７図Ａ）。これらの結果は、二つの膜系の相対的プ
ロトン透過性と一致する。EPCおよびEPC/コレステロー
ルベシクル類に観察される捕捉率パーセントはそれぞれ
98および72％であり、Na+/K+勾配に関して報告された値
に匹敵するものである。コレステロール含有LUV類の場
合に得られる僅かに低い量の捕捉は、これらのベシクル
類がEPCベシクルよりも僅かに低い捕捉容積を有すると
いう事実に基づく。
ロールより構成されるLUVが、プロトンイオン透過担体C
CCPの不存在下にアドリアマイシンを蓄積することを示
す。20℃で、50％の最大捕捉がEPC/コレステロールおよ
びEPC LUVで各々15分間および５分以下で観察された
（第７図Ａ）。これらの結果は、二つの膜系の相対的プ
ロトン透過性と一致する。EPCおよびEPC/コレステロー
ルベシクル類に観察される捕捉率パーセントはそれぞれ
98および72％であり、Na+/K+勾配に関して報告された値
に匹敵するものである。コレステロール含有LUV類の場
合に得られる僅かに低い量の捕捉は、これらのベシクル
類がEPCベシクルよりも僅かに低い捕捉容積を有すると
いう事実に基づく。
培養混合物にCCCPを含有させると一時的にアドリアマイ
シンの高いレベルでの蓄積があり、つづいてベシクル内
部から徐々に放出された。LUV系が明らかにプロトンを
充分透過してCCCPの不存在下にアドリアマイシンを蓄積
するので、イオン透過担体の添加は、pH勾配を損ない、
この結果、非常に大きな膜貫通医薬濃度勾配を保つエネ
ルギー力が減少せしめるようである。
シンの高いレベルでの蓄積があり、つづいてベシクル内
部から徐々に放出された。LUV系が明らかにプロトンを
充分透過してCCCPの不存在下にアドリアマイシンを蓄積
するので、イオン透過担体の添加は、pH勾配を損ない、
この結果、非常に大きな膜貫通医薬濃度勾配を保つエネ
ルギー力が減少せしめるようである。
培養温度を37℃に増加させると、EPC/コレステロールLU
V類の捕捉速度（第７図Ｂ）が20℃で平衡にした系（第
７図Ａ）と比較して増大した。CCCPの不存在下で昇温し
たEPCベシクル類では20分後にアドリアマイシンのゆる
い放出があったが、イオン透過担体が存在する場合には
急速な放出が起こった。これらの結果は、種々のLUV系
に対する相対プロトン透過性に相当する。
V類の捕捉速度（第７図Ｂ）が20℃で平衡にした系（第
７図Ａ）と比較して増大した。CCCPの不存在下で昇温し
たEPCベシクル類では20分後にアドリアマイシンのゆる
い放出があったが、イオン透過担体が存在する場合には
急速な放出が起こった。これらの結果は、種々のLUV系
に対する相対プロトン透過性に相当する。
Ｃ部 能動的／受動的装填−「医薬カクテル」 親油性またはカチオン性を示さない水溶性抗癌剤である
メトトレキセートおよびチトシンアラビノシドを、最初
のベシクル形成工程中にLUV類に受動的に被包させた。
メトトレキセートおよびチトシンアラビノシドを、最初
のベシクル形成工程中にLUV類に受動的に被包させた。
簡単に述べると、卵−PC LUV類（187μmolリン脂質/m
l）を、20mg/mlのチトシンアラビノシド（２μCi/ml［3
H］チトシンアラビノシド）または10mg/mlメトトレキセ
ート（２μCi/ml［3H］メトトレキセート）が添加され
た上記グルタミン酸カリウム緩衝液中で製造した。この
ベシクル類を、ついで、上記NaCl緩衝液で予め平衡にし
たゲルフィルトレリーションカラムに通し、未捕捉の医
薬を除去し、Na+/K+化学勾配を確立した。この方法で調
製されたLUV類の分析の結果、33％の有効なチトシンア
ラビノシドまたはメトトレキセートが被包されているこ
とが判明した（第１表参照）。
l）を、20mg/mlのチトシンアラビノシド（２μCi/ml［3
H］チトシンアラビノシド）または10mg/mlメトトレキセ
ート（２μCi/ml［3H］メトトレキセート）が添加され
た上記グルタミン酸カリウム緩衝液中で製造した。この
ベシクル類を、ついで、上記NaCl緩衝液で予め平衡にし
たゲルフィルトレリーションカラムに通し、未捕捉の医
薬を除去し、Na+/K+化学勾配を確立した。この方法で調
製されたLUV類の分析の結果、33％の有効なチトシンア
ラビノシドまたはメトトレキセートが被包されているこ
とが判明した（第１表参照）。
メトトレキセートおよびチトシンアラビノシドの受動的
捕捉につづいて、Na+/K+勾配およびワリノマイシンを用
いてアドリアマイシンをベシクル類に能動的に装填させ
た。特に第１表に示すように、0.2mMのアドリアマイシ
ンの存在下にベシクル類（1.0mMのリン脂質）の一定量
を培養すると、98％の有効なアドリアマイシンの吸収が
生じた。アドリアマイシンに見られる捕捉効率と吸収レ
ベルは、受動的に捕捉された医薬の不存在下にみられた
それらとほとんど同一であった（第１表と第１図および
第２図を比較されたい。） 例２ 膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム類からの荷電
された医薬の放出速度の低減 この例は、イオン化可能な医薬がリポソーム類から放出
される速度を低減する膜貫通ポテンシャルの能力を説明
するものである。本例のＡ類およびＢ類は、それぞれ必
要な膜貫通ポテンシャルを発生させるためのNa+/K+勾配
およびpH勾配の利用を説明するものである。
捕捉につづいて、Na+/K+勾配およびワリノマイシンを用
いてアドリアマイシンをベシクル類に能動的に装填させ
た。特に第１表に示すように、0.2mMのアドリアマイシ
ンの存在下にベシクル類（1.0mMのリン脂質）の一定量
を培養すると、98％の有効なアドリアマイシンの吸収が
生じた。アドリアマイシンに見られる捕捉効率と吸収レ
ベルは、受動的に捕捉された医薬の不存在下にみられた
それらとほとんど同一であった（第１表と第１図および
第２図を比較されたい。） 例２ 膜貫通ポテンシャルを利用したリポソーム類からの荷電
された医薬の放出速度の低減 この例は、イオン化可能な医薬がリポソーム類から放出
される速度を低減する膜貫通ポテンシャルの能力を説明
するものである。本例のＡ類およびＢ類は、それぞれ必
要な膜貫通ポテンシャルを発生させるためのNa+/K+勾配
およびpH勾配の利用を説明するものである。
Ａ部 医薬放出速度低減のためのNa+/K+勾配の使用 例1Aに続いて行なわれた活性捕捉に引き続いてLUV類か
らのアドリアマイシンの放出は、つぎのようにして測定
された。アドリアマイシンを含有するベシクル類（10mM
リン脂質）は、最初遊離の医薬を除去するために上記の
NaClまたはKCl緩衝液で平衡にした15mlのゲルフィルト
レーションカラムを通した。ついで、37℃で平衡にした
流動透析装置中に溶質をおいた。流通速度は、試料区分
容量（50ml）の全交換が20分間以下で起こるように調製
した。一定量（100μｌ）の検体が種々の時間において
取り出され、未捕捉の物質は1mlのゲルフィルトレーシ
ョンカラムを用いて分離した。ついで、試料についてア
ドリアマイシンおよびリン脂質を測定した。
らのアドリアマイシンの放出は、つぎのようにして測定
された。アドリアマイシンを含有するベシクル類（10mM
リン脂質）は、最初遊離の医薬を除去するために上記の
NaClまたはKCl緩衝液で平衡にした15mlのゲルフィルト
レーションカラムを通した。ついで、37℃で平衡にした
流動透析装置中に溶質をおいた。流通速度は、試料区分
容量（50ml）の全交換が20分間以下で起こるように調製
した。一定量（100μｌ）の検体が種々の時間において
取り出され、未捕捉の物質は1mlのゲルフィルトレーシ
ョンカラムを用いて分離した。ついで、試料についてア
ドリアマイシンおよびリン脂質を測定した。
これらの実験の結果は、第２表に示されている。この表
から明らかなように、Na+/K+膜貫通勾配が存在すると、
卵−PC、卵−PC/卵−PS（8:2）および卵PC/コレステロ
ール（1:1）ベシクル類の医薬保持時間が非常に長くな
る。同様な試験をDPPC/コレステロール（1:1）ベシクル
類についても行なった。この場合、複雑な医薬放出の動
力学が観察され、T50を決定することは困難である。し
かしながら、一般にNa+/K+勾配は、この組成のベシクル
類で保持時間を著しく増加させないことが判った。測定
されたデータは、24時間で約44％の医薬が放出され、膜
貫通Na+/K+勾配が使用されるか否かには関係ないことを
示している。
から明らかなように、Na+/K+膜貫通勾配が存在すると、
卵−PC、卵−PC/卵−PS（8:2）および卵PC/コレステロ
ール（1:1）ベシクル類の医薬保持時間が非常に長くな
る。同様な試験をDPPC/コレステロール（1:1）ベシクル
類についても行なった。この場合、複雑な医薬放出の動
力学が観察され、T50を決定することは困難である。し
かしながら、一般にNa+/K+勾配は、この組成のベシクル
類で保持時間を著しく増加させないことが判った。測定
されたデータは、24時間で約44％の医薬が放出され、膜
貫通Na+/K+勾配が使用されるか否かには関係ないことを
示している。
Ｂ部 医薬放出速度を低減させるためのpH勾配の使用 例1Bの方法を用いて活性装填を行なったのち、LUV類か
らのアドリアマイシンの放出を、つぎのようにして測定
した。すなわちアドリアマイシンを含有するベシクル類
（5mMのリン脂質）を最初適当な緩衝液で平衡にした15m
lのゲルフィルトレーションカラムを通して遊離に医薬
を除去した。ベシクルを含有する画分を37℃で平衡にし
た流動透析装置においた。流通速度を試料の画分容量
（50ml）の全交換が10分でできるように調整した。一定
量（0.15ml）の試料を数回にわたって除去し、かつ未捕
捉の物質を1mlのゲルフィルトレーションカラムを用い
て分離した。ついで、試料についてアドリアマイシンお
よびリン脂質を測定した。pH勾配の存在下（パネルＢ）
および不存在下（パネルＡ）でのEPC LUV類（丸印）お
よびEPC/コレステロールLUV類（四角印）についての放
出性を図８に示す。黒印はNa+/K+勾配の不存在下での放
出性を示し、白抜き印はこのような勾配の存在下での放
出性を示す。特に、図8Aでは、アドリアマイシン含有ベ
シクル類を内部pHと同じにpH4.6に調製された緩衝液で
脱塩カラムを通し、図8Bでは、ベシクル会合医薬の分離
中に外部pHを7.5に保持した。
らのアドリアマイシンの放出を、つぎのようにして測定
した。すなわちアドリアマイシンを含有するベシクル類
（5mMのリン脂質）を最初適当な緩衝液で平衡にした15m
lのゲルフィルトレーションカラムを通して遊離に医薬
を除去した。ベシクルを含有する画分を37℃で平衡にし
た流動透析装置においた。流通速度を試料の画分容量
（50ml）の全交換が10分でできるように調整した。一定
量（0.15ml）の試料を数回にわたって除去し、かつ未捕
捉の物質を1mlのゲルフィルトレーションカラムを用い
て分離した。ついで、試料についてアドリアマイシンお
よびリン脂質を測定した。pH勾配の存在下（パネルＢ）
および不存在下（パネルＡ）でのEPC LUV類（丸印）お
よびEPC/コレステロールLUV類（四角印）についての放
出性を図８に示す。黒印はNa+/K+勾配の不存在下での放
出性を示し、白抜き印はこのような勾配の存在下での放
出性を示す。特に、図8Aでは、アドリアマイシン含有ベ
シクル類を内部pHと同じにpH4.6に調製された緩衝液で
脱塩カラムを通し、図8Bでは、ベシクル会合医薬の分離
中に外部pHを7.5に保持した。
図８に示すように、すべての場合、膜貫通pH勾配を除去
すると、アドリアマイシンの流出速度が著しく増大す
る。Na+/K+勾配の不存在下（黒印）にpHを7.5から4.6に
減少させると、EPC/コレステロールLUV類（四角印）で
は捕捉薬剤の50％放出時間が24時間から４時間に、また
EPC/コレステロールLUV類（四角印）では３時間から１
時間未満に減少した。放出の動力学に対する影響は、pH
勾配およびNa+/K+勾配勾配の両者がpH勾配のみの代わり
に使用される場合にはEPC/コレステロールベシクル類に
はみられなかった（黒印と白抜印とを比較されたし）。
しかしながら、卵−PC系では、pH勾配とNa+/K+勾配との
組合せは、pH勾配のみで達成する場合より保持時間が長
くなる［黒丸印（pHのみ）と白抜丸印（pH＋Na+/K+）と
を比較されたし］。この効果は、膜貫通pH勾配（パネル
Ｂ）の存在下では、EPC LUV類には最も著しく、Na+/K+
勾配がpH勾配に加わった場合にアドリアマイシンの50％
放出時間が３時間から16時間に増大する。16時間T50値
がNa+/K+勾配のみを使用したEPCベシクル類でも得られ
ることに注目されたい（第２表参照）。
すると、アドリアマイシンの流出速度が著しく増大す
る。Na+/K+勾配の不存在下（黒印）にpHを7.5から4.6に
減少させると、EPC/コレステロールLUV類（四角印）で
は捕捉薬剤の50％放出時間が24時間から４時間に、また
EPC/コレステロールLUV類（四角印）では３時間から１
時間未満に減少した。放出の動力学に対する影響は、pH
勾配およびNa+/K+勾配勾配の両者がpH勾配のみの代わり
に使用される場合にはEPC/コレステロールベシクル類に
はみられなかった（黒印と白抜印とを比較されたし）。
しかしながら、卵−PC系では、pH勾配とNa+/K+勾配との
組合せは、pH勾配のみで達成する場合より保持時間が長
くなる［黒丸印（pHのみ）と白抜丸印（pH＋Na+/K+）と
を比較されたし］。この効果は、膜貫通pH勾配（パネル
Ｂ）の存在下では、EPC LUV類には最も著しく、Na+/K+
勾配がpH勾配に加わった場合にアドリアマイシンの50％
放出時間が３時間から16時間に増大する。16時間T50値
がNa+/K+勾配のみを使用したEPCベシクル類でも得られ
ることに注目されたい（第２表参照）。
例３ 抗腫瘍剤を含有するリポソーム類の脱水 この例は、抗腫瘍剤であるアドリアマイシンを含有する
リポソーム類の脱水およびその後の再水和を説明するも
のである。
リポソーム類の脱水およびその後の再水和を説明するも
のである。
卵ホスファチジルコリンETV類を250mMのトレハロースを
含有する溶質溶液［169mMのグルタミン酸カリウム、20m
Mのヘペス（pH7.4）、40μmol脂質/ml］を使用して上記
のようにして調製した。ついで、外部カリウム緩衝液を
ナトリウム緩衝液［150mMのNaCl、20mMのヘペス（pH7.
4）、250mMトレハロース］と交換した。アドリアマイシ
ン（200nmol/μmol脂質）を、ワリノマイシン（0.5μg/
μmol脂質）とともに加えて膜ポテンシャルを発生させ
た。２時間培養したのち、上記のトレハロース含有ナト
リウム緩衝液で平衡にしたセファデックスＧ−50のカラ
ムにベシクル類を通して未被包アドリアマイシンを除去
した。ETV類は、予め凍結することなく24時間で脱水
し、ついで上記のようにして再水和化した。脱水／再水
和前および後の両方においてベシクル類内の捕捉された
アドリアマイシンの量ならびにベシクル類からの医薬漏
出の速度は、セファデックスＧ−50のカラム（1ml）に
ベシクル懸濁液の100μｌの部分を通しての未捕捉物質
を除去したのち、上記測定方法（「測定」の項参照）を
用いて測定した（さらに詳細には米国特許第622,690号
参照のこと）。このカラムは使用されるリポソーム類の
少量パーセントが捕捉されるので、脱水／再水和工程後
に保持される被包物質の量について測定された値は、本
発明の方法で実際に達成されるレベルよりも幾分低い。
含有する溶質溶液［169mMのグルタミン酸カリウム、20m
Mのヘペス（pH7.4）、40μmol脂質/ml］を使用して上記
のようにして調製した。ついで、外部カリウム緩衝液を
ナトリウム緩衝液［150mMのNaCl、20mMのヘペス（pH7.
4）、250mMトレハロース］と交換した。アドリアマイシ
ン（200nmol/μmol脂質）を、ワリノマイシン（0.5μg/
μmol脂質）とともに加えて膜ポテンシャルを発生させ
た。２時間培養したのち、上記のトレハロース含有ナト
リウム緩衝液で平衡にしたセファデックスＧ−50のカラ
ムにベシクル類を通して未被包アドリアマイシンを除去
した。ETV類は、予め凍結することなく24時間で脱水
し、ついで上記のようにして再水和化した。脱水／再水
和前および後の両方においてベシクル類内の捕捉された
アドリアマイシンの量ならびにベシクル類からの医薬漏
出の速度は、セファデックスＧ−50のカラム（1ml）に
ベシクル懸濁液の100μｌの部分を通しての未捕捉物質
を除去したのち、上記測定方法（「測定」の項参照）を
用いて測定した（さらに詳細には米国特許第622,690号
参照のこと）。このカラムは使用されるリポソーム類の
少量パーセントが捕捉されるので、脱水／再水和工程後
に保持される被包物質の量について測定された値は、本
発明の方法で実際に達成されるレベルよりも幾分低い。
これらの実験の結果は、第３表に示されている。ここに
示すように、90％を越える医薬が脱水および再水和後に
保持される。さらに、アドリアマイシンの再水和ベシク
ル類からの漏出速度は、脱水されなかったベシクル類で
みられる速度に匹敵する（データは示さず）。
示すように、90％を越える医薬が脱水および再水和後に
保持される。さらに、アドリアマイシンの再水和ベシク
ル類からの漏出速度は、脱水されなかったベシクル類で
みられる速度に匹敵する（データは示さず）。
例４ 膜貫通ポテンシャルを利用した再水和リポソーム類への
イオン化可能な抗腫瘍剤の装填 この例は、（１）膜を越えての濃度勾配を有するリポソ
ーム類が、保護糖の存在下に脱水され、かつ濃度勾配の
損失なしに再水和されること、および（２）再水和後
に、濃度勾配がイオン化可能な抗腫瘍剤（アドリアマイ
シン）をリポソーム類へ装填するのに使用し得ることを
説明するものである。
イオン化可能な抗腫瘍剤の装填 この例は、（１）膜を越えての濃度勾配を有するリポソ
ーム類が、保護糖の存在下に脱水され、かつ濃度勾配の
損失なしに再水和されること、および（２）再水和後
に、濃度勾配がイオン化可能な抗腫瘍剤（アドリアマイ
シン）をリポソーム類へ装填するのに使用し得ることを
説明するものである。
グルタミン酸カリウム緩衝液（169mMのグルタミン酸カ
リウム、250mMのトレハロース、20mMのヘペスpH7.4）中
でETV類（40μmol脂質/ml）を形成し、ついでNaCl溶液
で予め平衡にしたセファデックスＧ−50カラム（1.4×1
0cm）に該ベシクル類を通してNaCl緩衝液（150mMのNaC
l、250mMのトレハロース、20mMのヘペス、pH7.4）で外
部緩衝液を置換することにより膜を横切ってのNa+/K+化
学勾配を有するベシクル類を調製した。このときワリノ
マイシン（ミズリー州セントルイスのシグマ社製）を0.
5μg/μmolリン脂質の濃度になるように添加した。
リウム、250mMのトレハロース、20mMのヘペスpH7.4）中
でETV類（40μmol脂質/ml）を形成し、ついでNaCl溶液
で予め平衡にしたセファデックスＧ−50カラム（1.4×1
0cm）に該ベシクル類を通してNaCl緩衝液（150mMのNaC
l、250mMのトレハロース、20mMのヘペス、pH7.4）で外
部緩衝液を置換することにより膜を横切ってのNa+/K+化
学勾配を有するベシクル類を調製した。このときワリノ
マイシン（ミズリー州セントルイスのシグマ社製）を0.
5μg/μmolリン脂質の濃度になるように添加した。
同様に、膜貫通pH勾配（内部酸）を、低いpH（135mMの
グルタミン酸、250mMのトレハロース、水酸カリウムを
添加してpHを5.5にした）を有する緩衝液中でリポソー
ム類を調製し、ついで高いpH（125mMのグルタミン酸、3
0mMのNaCl、250mMのトレハロース、水酸化カリウムを添
加してpHを7.5にした）を有する緩衝液を用いてセファ
デックスＧ−20上で交換した。このとき、プロトンイオ
ン透過担体CCCPを最終濃度20μＭになるよう添加した。
グルタミン酸、250mMのトレハロース、水酸カリウムを
添加してpHを5.5にした）を有する緩衝液中でリポソー
ム類を調製し、ついで高いpH（125mMのグルタミン酸、3
0mMのNaCl、250mMのトレハロース、水酸化カリウムを添
加してpHを7.5にした）を有する緩衝液を用いてセファ
デックスＧ−20上で交換した。このとき、プロトンイオ
ン透過担体CCCPを最終濃度20μＭになるよう添加した。
膜貫通ポテンシャルは、親油性カチオン3H−テトラフェ
ニルホスフォニウムブロマイド（3H−TPPB、カナダ国NE
N）の分布を決定することにより測定した。具体的には
１μｌのエタノール中の１μCiの3H−TPPBをETV分散液
の１〜2mlの試料に添加し、かつその混合物を20℃で20
分間培養した。一定量（100μｌ）の試料を取り出し未
捕捉の3H−TPP+を1mlの使い捨て可能なシリシンジに充
填したセファデックスにその一定量試料を装填すること
により除去し、ついでこのカラムを500gで３分間遠心し
てベシクル類を溶出させた。捕捉された3H−TPP+は液体
シンチレーションカウンティングにより測定し、かつリ
ン脂質はホスフェートアッセイにより測定した。
ニルホスフォニウムブロマイド（3H−TPPB、カナダ国NE
N）の分布を決定することにより測定した。具体的には
１μｌのエタノール中の１μCiの3H−TPPBをETV分散液
の１〜2mlの試料に添加し、かつその混合物を20℃で20
分間培養した。一定量（100μｌ）の試料を取り出し未
捕捉の3H−TPP+を1mlの使い捨て可能なシリシンジに充
填したセファデックスにその一定量試料を装填すること
により除去し、ついでこのカラムを500gで３分間遠心し
てベシクル類を溶出させた。捕捉された3H−TPP+は液体
シンチレーションカウンティングにより測定し、かつリ
ン脂質はホスフェートアッセイにより測定した。
ETV法によりETV類内に捕捉された22Na、3H−イヌリンま
たは14C−イヌリンの量を測定することにより決定され
たETV類用の捕捉容量値（μl/μmolのリン脂質）を使用
して、ベシクル類の3H−TPP+（内側［3H−TPP+］ｉおよ
び外側［3H−TPP+］ｏの濃度を計算し、これから、膜貫
通ポテンシャル（Vm）をネルンスト式を用いて計算し
た。
たは14C−イヌリンの量を測定することにより決定され
たETV類用の捕捉容量値（μl/μmolのリン脂質）を使用
して、ベシクル類の3H−TPP+（内側［3H−TPP+］ｉおよ
び外側［3H−TPP+］ｏの濃度を計算し、これから、膜貫
通ポテンシャル（Vm）をネルンスト式を用いて計算し
た。
Vm＝−59log［3H−TPP+］i/［3H−TPP+］ｏ） Na+/K+およびpH勾配ベシクル類の両者は、高真空下に24
時間脱水し、ついで再水和した。比較のためのベシクル
類は４℃で24時間保持した。乾燥しかつ再水和したの
ち、イオン透過担体の存在下または不存在下にこれらの
ベシクル類により示される膜貫通ポテンシャルは、同様
にイオン透過担体の存在下または不存在下に比較例のも
のにより発生した膜貫通ポテンシャルに匹敵した。その
結果は、第９図（pH）および第10図（Na+/K+）に示すと
おりである。
時間脱水し、ついで再水和した。比較のためのベシクル
類は４℃で24時間保持した。乾燥しかつ再水和したの
ち、イオン透過担体の存在下または不存在下にこれらの
ベシクル類により示される膜貫通ポテンシャルは、同様
にイオン透過担体の存在下または不存在下に比較例のも
のにより発生した膜貫通ポテンシャルに匹敵した。その
結果は、第９図（pH）および第10図（Na+/K+）に示すと
おりである。
これらの図面に示されるように、脱水されかつ再水和さ
れたベシクル類により示される膜貫通ポテンシャルは、
比較例のものにより示されるものと実質的に同一であ
る。唯一の明白な差異は、pH勾配ベシクルの場合、脱水
／再水和ベシクル類の膜貫通ポテンシャルが、比較例の
ベシクル類の膜貫通ポテンシャルより幾分低いというこ
とである。
れたベシクル類により示される膜貫通ポテンシャルは、
比較例のものにより示されるものと実質的に同一であ
る。唯一の明白な差異は、pH勾配ベシクルの場合、脱水
／再水和ベシクル類の膜貫通ポテンシャルが、比較例の
ベシクル類の膜貫通ポテンシャルより幾分低いというこ
とである。
脱水および再水和後にアドリアマイシンを蓄積するNa+/
K+ベシクル類の能力を、イオン透過担体の存在下または
不存在下に試験し、比較例のベシクル類、すなわち24時
間脱水することなく４℃で24時間保持されたベシクル類
により示される蓄積と比較した。充分なアドリアマイシ
ンをベシクル類の外部媒体に添加して0.2モル−アドリ
アマイシン/1モル−リン脂質の最終濃度にした。
K+ベシクル類の能力を、イオン透過担体の存在下または
不存在下に試験し、比較例のベシクル類、すなわち24時
間脱水することなく４℃で24時間保持されたベシクル類
により示される蓄積と比較した。充分なアドリアマイシ
ンをベシクル類の外部媒体に添加して0.2モル−アドリ
アマイシン/1モル−リン脂質の最終濃度にした。
これらの試験結果を第11図に示す。ここにみられるよう
に、脱水／再水和ベシクル類は、比較例のベシクル類と
実質的に同一の速度および同一程度でアドリアマイシン
を蓄積する。したがって、この例は、ベシクル類の後か
らの装填が濃度勾配と脱水／再水和工程との組合せによ
り達成され得ることを示すものである。
に、脱水／再水和ベシクル類は、比較例のベシクル類と
実質的に同一の速度および同一程度でアドリアマイシン
を蓄積する。したがって、この例は、ベシクル類の後か
らの装填が濃度勾配と脱水／再水和工程との組合せによ
り達成され得ることを示すものである。
メトトレキセートを、ベシクル類の製造中（187μmolの
脂質/ml）に、20mMの濃度で受動的に捕捉した。アドリ
アマイシンは、ワリノマイシンの存在下に、1mMのリン
脂質に相当しかつ100μＭで始まるアドリアマイシン濃
度のベシクル濃度で、透過膜Na+/K+勾配を用いて捕捉さ
れた。チトシンアラビノシドは、ベシクル類（187μmol
の脂質/ml）の製造中に25mMの濃度で受動的に捕捉され
た。またビンブラスチンはは、ワリノマイシンの存在下
に5mMのリン脂質に相当しかつ200μＭで始まるビンブラ
スチン濃度のベシクル濃度で膜貫通Na+/K+勾配を用いて
捕捉した。
脂質/ml）に、20mMの濃度で受動的に捕捉した。アドリ
アマイシンは、ワリノマイシンの存在下に、1mMのリン
脂質に相当しかつ100μＭで始まるアドリアマイシン濃
度のベシクル濃度で、透過膜Na+/K+勾配を用いて捕捉さ
れた。チトシンアラビノシドは、ベシクル類（187μmol
の脂質/ml）の製造中に25mMの濃度で受動的に捕捉され
た。またビンブラスチンはは、ワリノマイシンの存在下
に5mMのリン脂質に相当しかつ200μＭで始まるビンブラ
スチン濃度のベシクル濃度で膜貫通Na+/K+勾配を用いて
捕捉した。
医薬を被包したのち、外部緩衝液及び未捕捉の薬剤を、
記載したようにKClまたはNaCl緩衝液で置換した。T
50は、捕捉された薬剤の50％をベシクル類から放出する
ために必要な時間を示す。
記載したようにKClまたはNaCl緩衝液で置換した。T
50は、捕捉された薬剤の50％をベシクル類から放出する
ために必要な時間を示す。
フロントページの続き (72)発明者 キユリス，ピーター，アール カナダ国 ブリテイツシユ コロンビア州 ブイ６ジエイ ３アール２ バンクーバ ー ウオルナツト ストリート 1329 (72)発明者 ホープ，マイケル，ジエイ カナダ国 ブリテイツシユ コロンビア州 ブイ６アール ２ケイ２ バンクーバー ウエスト イレブンス アベニユー 3550 (72)発明者 マツデン，トーマス，デイ カナダ国 ブリテイツシユ コロンビア州 ブイ６ケイ ２エイ５ バンクーバー ウエスト エイス アベニユー 2185 ア パートメント 302 (72)発明者 マイヤー，ローレンス，デイ カナダ国 ブリテイツシユ コロンビア州 ブイ６エヌ ２ピー３ バンクーバー ウエスト サーテイフイフス アベニユー 4084 (56)参考文献 特開 昭54−59314（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−100313（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ，99（16），128259ｃ（1983)
Claims (15)
- 【請求項１】膜を横切って１種またはそれ以上の帯電し
た種の濃度勾配を有するリポソーム類を調製する工程を
包含し、該濃度勾配が、イオン化可能な生物活性剤類を
リポソーム類中に装填せしめることのできる配向を有す
る膜貫通ポテンシャルを発生することができるものであ
る、イオン化可能な生物活性剤類をリポソーム類に装填
する方法。 - 【請求項２】濃度勾配が （ａ）１種またはそれ以上の帯電した種の第１の濃度を
有する第１の媒体をリポソーム類内に被包すること、お
よび （ｂ）該リポソーム類を１種またはそれ以上の帯電した
種の第２の濃度を有する第２の媒体中に懸濁させるこ
と、 により形成されてなる請求の範囲第１項に記載の方法。 - 【請求項３】濃度勾配がNa+/K+濃度勾配である請求の範
囲第１項に記載の方法。 - 【請求項４】濃度勾配がpH勾配である請求の範囲第１項
に記載の方法。 - 【請求項５】生物活性剤類が抗腫瘍剤類である請求の範
囲第１項記載の方法。 - 【請求項６】抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソルビ
シン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る塩
および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求の
範囲第５項に記載の方法。 - 【請求項７】膜を横切って１種またはそれ以上の帯電し
た種の濃度勾配を有するリポソーム類を調製する工程を
包含し、該濃度勾配が、イオン化可能な生物活性剤類を
リポソーム類中に装填せしめることのできる配向を有す
る膜貫通ポテンシャルを発生することができるものであ
る、イオン化可能な生物活性剤類をリポソーム類に装填
する方法により装填されたイオン化可能な生物活性剤類
を含有する医薬製剤。 - 【請求項８】濃度勾配が （ａ）１種またはそれ以上の帯電した種の第１の濃度を
有する第１の媒体をリポソーム類内に被包すること、お
よび （ｂ）該リポソーム類を１種またはそれ以上の帯電した
種の第２の濃度を有する第２の媒体中に懸濁させるこ
と、 により形成されてなる請求の範囲第７項に記載の医薬製
剤。 - 【請求項９】濃度勾配がNa+/K+濃度勾配である請求の範
囲第７項に記載の医薬製剤。 - 【請求項１０】濃度勾配がpH勾配である請求の範囲第７
項に記載の医薬製剤。 - 【請求項１１】生物活性剤類が抗腫瘍剤類である請求の
範囲第７項に記載の医薬製剤。 - 【請求項１２】抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソル
ビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る
塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求
の範囲第７項に記載の医薬製剤。 - 【請求項１３】生物活性剤類が抗腫瘍剤類である請求の
範囲第７項記載の医薬製剤。 - 【請求項１４】抗腫瘍剤類がダウノルビシン、ドキソル
ビシン、ビンブラスチンおよびその医薬的に許容し得る
塩および誘導体よりなる群から選ばれたものである請求
の範囲第13項に記載の医薬製剤。 - 【請求項１５】リポソームが予め脱水されたものであ
る、請求の範囲第７項記載の医薬製剤。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63880984A | 1984-08-08 | 1984-08-08 | |
| US74916185A | 1985-06-26 | 1985-06-26 | |
| US638809 | 1985-06-26 | ||
| US749161 | 1985-06-26 | ||
| PCT/US1985/001501 WO1986001102A1 (en) | 1984-08-08 | 1985-08-07 | Encapsulation of antineoplastic agents in liposomes |
Related Child Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6196978A Division JP2574999B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | 脱水リポソーム医薬製剤 |
| JP6196979A Division JP2572553B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | リポソームへの医薬の装填方法 |
| JP6196980A Division JP2572554B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | リポソームからの薬剤の放出速度低減方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62500101A JPS62500101A (ja) | 1987-01-16 |
| JPH07112968B2 true JPH07112968B2 (ja) | 1995-12-06 |
Family
ID=27093189
Family Applications (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60503627A Expired - Lifetime JPH07112968B2 (ja) | 1984-08-08 | 1985-08-07 | リポソ−ム類における抗腫瘍剤類の被包 |
| JP6196980A Expired - Lifetime JP2572554B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | リポソームからの薬剤の放出速度低減方法 |
| JP6196978A Expired - Lifetime JP2574999B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | 脱水リポソーム医薬製剤 |
| JP6196979A Expired - Lifetime JP2572553B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | リポソームへの医薬の装填方法 |
| JP8193089A Expired - Lifetime JP2847065B2 (ja) | 1984-08-08 | 1996-07-23 | リポソーム中に被包されたイオン化可能な生物学的活性剤を含有する医薬製剤 |
Family Applications After (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6196980A Expired - Lifetime JP2572554B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | リポソームからの薬剤の放出速度低減方法 |
| JP6196978A Expired - Lifetime JP2574999B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | 脱水リポソーム医薬製剤 |
| JP6196979A Expired - Lifetime JP2572553B2 (ja) | 1984-08-08 | 1994-08-22 | リポソームへの医薬の装填方法 |
| JP8193089A Expired - Lifetime JP2847065B2 (ja) | 1984-08-08 | 1996-07-23 | リポソーム中に被包されたイオン化可能な生物学的活性剤を含有する医薬製剤 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0191824B1 (ja) |
| JP (5) | JPH07112968B2 (ja) |
| CA (2) | CA1270198C (ja) |
| DE (1) | DE3587640T2 (ja) |
| HK (1) | HK1007494A1 (ja) |
| WO (1) | WO1986001102A1 (ja) |
Families Citing this family (70)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171578A (en) * | 1985-06-26 | 1992-12-15 | The Liposome Company, Inc. | Composition for targeting, storing and loading of liposomes |
| US5622713A (en) * | 1985-09-17 | 1997-04-22 | The Regents Of The University Of California | Method of detoxifying animal suffering from overdose |
| US5041278A (en) * | 1985-10-15 | 1991-08-20 | The Liposome Company, Inc. | Alpha tocopherol-based vesicles |
| US5384127A (en) * | 1985-10-18 | 1995-01-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Stable liposomal formulations of lipophilic platinum compounds |
| US5117022A (en) * | 1985-10-18 | 1992-05-26 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydrophobic cis-platinum complexes efficiently incorporated into liposomes |
| US5041581A (en) * | 1985-10-18 | 1991-08-20 | The University Of Texas System Board Of Regents | Hydrophobic cis-platinum complexes efficiently incorporated into liposomes |
| US5252263A (en) * | 1986-06-16 | 1993-10-12 | The Liposome Company, Inc. | Induction of asymmetry in vesicles |
| EP0269720B1 (en) * | 1986-06-16 | 1992-02-19 | The Liposome Company, Inc. | Induction of asymmetry in vesicles |
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