JPH07114686B2 - 回流式培養装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞、藻類
等の微生物細胞を大量に培養し、しかも高密度で長時間
にわたって保持できる培養装置に関する。また分泌物質
生産並びに細胞物質生産用の培養装置、物質代謝用バイ
オリアクター、並びに体外用の人工臓器等として使用で
きる細胞培養並びに細胞保持装置に関する。

〔従来技術〕

ヒト細胞を含む動物細胞が生産する各種インターフェロ
ン、各種モノクローナル抗体、各種増殖因子、プラスミ
ノーゲン活性化因子等のほか、ウイルス感染細胞が産生
するウイルス抗原蛋白質などの有用物質は産業上きわめ
て価値の高いものであり、医薬品及び試薬として広く利
用されていることは、よく知られているところである。

また、皮膚ケラチノサイト、血管内皮細胞、肝細胞、膵
臓ランゲルハンス細胞を培養して、皮膚移植、ハイブリ
ッド型人工血管、人工臓器、並びに移植に使用すること
が実験段階では成功している。中でも人工肝臓は、大量
の肝細胞を培養した体外培養装置を人工血管を通じて生
体と結合させ、急性期の肝機能障害を克服しようとする
ものである。

このようなヒト細胞を含む動物細胞等の微生物細胞の培
養においては、該微生物細胞を大量に培養することが必
要であり、しかも高密度で長時間にわたって細胞を保持
しなければならない。

そこで、物質生産を対象とする動物細胞の培養に例をと
って、その従来技術をみると以下のようなものがある。

（１） 静置単層培養法 この方法は、壁付着性のある細胞をガラス、プラスチッ
ク等の平坦な基質の表面に付着させた状態で静置培養す
る技術であって、中でもプラスチック培養瓶は用途が広
い。そして、この方法によって大量の細胞を培養する技
術としては、多層のプラスチック平板を直方体内にモジ
ュール化して広い表面を付与した培養容器が代表的技術
である（Weiss,R.S.＆ Schleicher,J.B.,Biotech.Bioen
g.10:601−616（1968））。この方法は、培養液の一
部、或いは全部をある一定期間ごとに交換し、必要に応
じて培養細胞も回収或いは更新する培養方法、即ち回分
培養法によって操作するのが普通である。付着性細胞培
養の最も基本的な形であるが、培養装置容積当たりの細
胞数が少なく、培養液の交換に多大の人力を要するな
ど、大規模な培養には限界があると共に、ディスポーザ
ブルな装置であるためにコストが高い。

（２） 可動式単層培養法 静置単層培養法の限界となる培養液の供給特性、ガス交
換特性、細胞付着面積についての問題を一部解決したの
がこの方法であって、細胞が付着している薄板を様々な
動的な手段で培養液や気相に接触させる工夫がなされ
た。円筒状の培養瓶（ローラーボトル）の内部側面に細
胞を付着させて回転させつつ培養する技術（ローラーボ
トル培養法）はその代表的な例である。更にローラーボ
トルの内部に波状のプラスチック薄板と平面のプラスチ
ック薄板を交互に巻き込んだタイプ（Sterilin,Bulk Cu
lture Vessel,Sterilin Ltd.,Teddington,Middlesex）
など、基質表面積を増大させる工夫が様々になされてき
た。可動式単層培養法は、培養装置自体、或いは培養基
質を回転させることによって、細胞と培養液並びに気相
との接触を図る装置であって、基質を固定した状態で培
養液を流動させる培養法に関する本発明に関連するもの
ではない。

（３） 微粒子担体培養法 この方法は、細胞付着性のある浮遊性の微粒子を培養液
内に分散し、機内力によってこの微粒子を懸垂状態とし
て、これに細胞を付着あるいは捕捉して増殖せしめる培
養法であって、これに使用される多種の微粒子担子が開
発され、また付着性の弱い細胞を付着させ、あるいは捕
捉する微粒子担体も開発されている（Van Wezel,A.L.,N
ature,216:64−65（1967）,Van Wezel,A.L.in Animal C
ell Biotechnology,ed.by spier,R.E.＆ Griffith,J.
B.,Academic Press,London,Vol.1,265−282（198
5））。この方法は前記の単層培養法と比較して、培養
容器の容積あたり高い細胞付着表面積を得ることが可能
であるため、付着性細胞に対する標準的な大量細胞培養
技術である。そして、微粒子を懸垂状態に維持するため
に、インペラー、回転子、気泡などが用いられている。
微粒子担体培養法は細胞に与える損傷や撹拌技術などに
一部困難があるにも拘らず、付着性細胞について汎用さ
れている大量培養技術の一つであるが、本発明に関連す
るものではない。即ち、微粒子担体培養においては基質
そのものを浮遊撹拌せしめるが、本発明ではそのような
微粒子基質を利用することもできるが、培養液のみを流
動させるものである。

（４） 中空糸型細胞培養法 この方法は、透析に使用する人工腎臓に類似した装置を
使用する培養法であって、中空糸を多数束ねた管の間隙
に細胞を閉じ込め、中空糸内には培養液を還流させて、
細胞に栄養分を供給し、またガス交換を図りつつ増殖さ
せるもので、これによって生体に近い細胞密度を達成す
ることができるものである（Knazek,R.A.,Gullino,P.M.
Kohler,P.O.＆ Science,178:65−66（1972）,Tyo,M.A.,
Bulbulian B.J.,Menken B.Z.,Murphy,T.,J.Animal Cell
Biotech.3:357−371 Academic Press,London（198
8））。また、中空糸に付着しない細胞についても中空
糸の束の間に捕捉することによって培養が可能である。
本培養方法も多用される培養技術の一つであるが、本発
明と関連するものではない。即ち、中空糸培養法は細胞
が存在する側と培養液を供給する側とが半透性を有する
膜面によって隔てられ、そのような膜面が細管状の中空
糸をなすことを特徴とする培養法であって、本発明にお
いてはそのような中空糸を利用することもできるが、中
空糸の半透性に拘りなく、他の基質も利用することが可
能である。

本発明においては、中空糸の有無に拘らず培養容器内に
培養液を回流させる装置を導入することによって培養環
境を均一に保つことが可能であり、中空糸培養法とは関
連しないものである。

（５） 不動化細胞培養法 この方法は、通水性及び細胞付着性或いは細胞不動化さ
せる性質のある基質に細胞を付着、不動化させ、ここに
培養液を通液して、栄養を与えると共にガス交換並びに
老廃物の除去を図る培養法であって、マトリックスとし
て、ガラス繊維、セラミックモジュール等が使用され、
付着性の弱い細胞も捕捉することから応用範囲が広いも
のである。この培養技術に属するもののうち、有孔セラ
ミックモジュールを内装するジャケットにポンプを用い
て培養液を流通させ、流通した培養液を更にガス交換
器、新鮮培養液供給装置、使用する培養回収装置等を回
路に接続した潅流培養装置（Opticell培養装置）が汎用
されている（Lyder−sen,B.K.,Pugh,G.G.,Paris,M.S.,S
harma,B.P.,＆ Noll,L.A.P Biotechnology 3:63−67（1
985））。

また、細胞固定化基質、ガス交換チューブ、培養液交換
用の半透性の充填した閉鎖容器内に細胞を静止状態で培
養する不動化細胞培養装置（Static Maintenance React
or）が開発されている（Toblert,W.R.,Stigley,W.R.,Pr
ior,C.P.,in Animal Cell Biotechnology,edited by Sp
ier,R.E.＆ Griffith,J.B.,Academic Press,London,Vo
l.3,373−393）。さらにまた、顆粒状の細胞固定化基質
を円筒内に柱状に充填し、充填した顆粒を貫通して多孔
性の管を配置し、それらの管を通じて培養液及びガスを
供給並びに排出する培養装置（ラジアルフロー式充填型
バイオリアクター）が開発されている（特開平２−1099
66号公報）。

本発明は不動化細胞培養法の範疇に属するものである
が、前記のOpticell培養法、Static Maintenance React
or、ラジアルフロー式充填型バイオリアクターを始めと
する従来技術と関連するものではない。即ち、本発明で
は有孔セラミックモジュール、ガラス繊維を始めとする
あらゆる素材を通水性及び細胞を不動化し得る形態に加
工した素材を基質として内包し得る培養装置並びに培養
方法に関するものであって、基質を特定する装置とは関
連しないものである。また、本発明では培養容器内に細
胞の環境を均一に保ち、栄養及びガスの交換を迅速に行
わせるための回流装置を備えており、半透性の管あるい
は有孔管を含むチューブを介して外部の培養液貯留槽と
培養容器との間に培養液を循環させることによって、培
養液あるいはガスの交換を図る装置とは関連しないもの
である。

（６） 浮遊培養法 この方法は、付着性の少ない細胞を培養液内に浮遊させ
た状態で培養する方法であって、原理的には微生物細胞
の懸濁培養法と同じである。そして、動物細胞では培養
液を撹拌するとき剪断力を受け細胞が障害を受けるた
め、さまざまな工夫がされている。本培養法も現代的な
大量培養における汎用技術であるが、本発明は不動化細
胞培養に関するものであり、浮遊培養法とは関連しない
ものである。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のような従来の細胞培養法には、下記のような問題
点がある。すなわち、 （１） 細胞の損傷 細胞を浮遊状態に維持する目的で外部から負荷する機械
力によって、細胞が受ける機械的損傷がある。細胞壁を
持たない動物細胞を浮遊培養、あるいは微粒子担体培養
する場合に特に問題となる点であって、細胞密度を高め
たり、また培養装置のスケールアップを妨げる重要な要
因の一つとなっている。

（２） 培養の長期維持 培養容器、基質、機械要素の疲労細胞の増殖と死、並び
に物質生産に伴う培養環境の変化によって培養の長期維
持が困難となる。単層培養にあっては細胞層の剥離、浮
遊培養にあっては細胞分離装置やガス交換装置の目詰ま
り、微粒子担体培養にあっては微粒子の団塊化や細胞の
剥離、中空糸培養や不動化培養などの潅流培養にあって
はポンプへの負荷の増大などが問題となる。

（３） 培養方法の一般性 細胞の付着性のあるなし、あるいは強弱により、従来の
培養方法はそれぞれ限られた細胞種にしか適用できない
場合が多い。例えば微粒子担体培養法、多層式培養法の
場合では付着性の強い細胞種でないと培養が困難であ
る。逆に浮遊培養では付着性細胞を培養することは困難
である。

（４） ガス交換 細胞の代謝に伴って消費される酸素を供給し、産生され
る炭酸ガスを除去する効率は細胞培養の密度を高める上
で、一つの重要な制限因子である。

静置単層培養法においては、表面通気の効率が低いこと
が細胞増殖の大きな制限因子である。

気泡を培養液にスパージングする方法は、能率の高いガ
ス交換法であるが、動物細胞の培養については、いくつ
かの問題点がある。すなわち、培養液に生ずる泡の処
理、気泡によって生じる培養液中のタンパク質の界面変
性、或いは細胞障害である。

これらの問題点は、ガス透過性のチューブを培養液内に
配置して、ガス供給する方法によって、一部解決され、
このチューブ法によってきわめて効率の高いガス交換が
可能となった。しかし、このチューブ法では、培養容器
内でのチューブ表面の目づまりによるガス交換効率の変
化があり、長期間の連続培養では問題となる。

（５） 細胞と培養液の分離及び培養液供給 浮遊細胞培養法、微粒子担体培養法における細胞分離に
は、自然沈降、遠心分離あるいは膜分離が行われる。ま
た大量培養法においては沈澱管を装置し、細胞、あるい
は細胞の付着した微粒子と培養液の密度差を利用して、
細胞、あるいは細胞の付着した微粒子を回収しつつ、使
用済み培養液を除去する方法もしばしば使用されてい
る。

平面単層培養法あるいはマトリックスに細胞を付着させ
た状態での培養法では、この点あまり問題とならない
が、浮遊細胞培養法あるいは微粒子担体培養法では分離
装置の目詰まり或いは分離能力が重要な問題となる。ま
た、培養システムが高密度の細胞培養に進むにつれて、
細胞と培養液の分離、さらには培養液の供給能力におい
て問題が生じており、これら分離装置に高い処理能力と
耐用能力が求められている。

（６） 精製工程への影響 細胞の生産物が培養液中に放出されるタイプの培養では
培養液が生産物以外にどのような物質を含むかによって
精製工程の負担が大きく異なってくる。例えば細胞損傷
の大きな培養法では損傷細胞から細胞蛋白質やDNAが多
量に培養液中に放出されこれらが精製の負担を増大させ
る。

（７） 装置の信頼性 細胞培養装置の高性能化に伴い、装置の運転のためにさ
まざまなパーツが必要となってきている。培養容器と培
養基質以外の主要なものを挙げても、機械的なものとし
て、回転子、インペラーあるいはバイブレーター、ポン
プとそれらの駆動部分、コック類、チューブ、脱着装置
があり、モニター装置として、酸素電極、pH電極、炭酸
ガス電極、圧力センサー、温度センサーがある。その
他、ガスの供給装置、排出ガスのコンデンサーとフィル
ター、定温水供給装置、培養液供給装置があり、さらに
はシステムの滅菌装置、及び全体をつなぐシステムの自
動制御装置がある。これらの制御装置の複雑化はやむを
えないことであるが、その結果、装置のコスト高、機械
的信頼性の低下、長期運転への不安及び汚染の問題等が
生じている。そして、新規な技術開発にあたっても、結
果として装置の信頼性を増すものであるかどうかが決定
的な役割を果す。

（８） 培養の経済性 物質生産を目的とする細胞培養を例にとってみると、培
養の経済性には培養装置の信頼性とコスト、培養の規模
が重要な因子である。しかし、やはり達成できる細胞密
度は一つの重要な技術的課題であることは確かである。
ちなみに、達成できる細胞密度は、通常の浮遊培養、あ
るいは単層培養ではｎ×10⁶個/cm³の水準であり、微粒
子担体培養ではｎ×10⁷個/cm³の水準であり、また中空
糸培養の培養では10⁸個/cm³が達成されている。ハイブ
リドーマ細胞の培養のように、動物の腹腔内に移植して
モノクローナル抗体を産生する場合と比較して考えれば
10⁸個/cm³に近い高密度を達成することが一つの目標と
なる。

〔本発明の目的〕

この発明の目的は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細
胞、藻類等の微生物細胞を培養する際に該細胞の機械的
損傷を防ぎ、培養を長期安定に維持でき、広範な微生物
細胞に適用でき、微生物細胞と培養液間の栄養物及び老
廃物の交換、並びにガス交換を容易にしかも高効率で行
うことができ、混入物の少ない培養上清あるいは瀘液を
得ることができ、さらには培養容器の容積当りの微生物
細胞の培養密度を高めることができ、長期運転でも信頼
性のある培養装置を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

この発明の回流式培養装置は次のように構成されてい
る。

脱着可能な蓋を上面に有する培養容器と、該培養容器内
の所定場所に適宜な基質支持体により設置された、微生
物細胞が付着状態あるいは不動化状態で増殖するための
空間を有する基質と、基質に培養液を回流するための回
転手段を収納する回流誘導室を基本部分とし、必要によ
り前記基質の外周を覆うように形成された回流誘導筒
と、基質上面に設置された気流誘導板を設置し、その他
必要に応じて公知の或いは本発明のために工夫された内
圧維持装置、排出ガスフィルター乾燥装置、培養液供給
装置、回転手段の駆動装置、ガス供給装置、定温水供給
装置、各種モニター・センサー装置並びに培養システム
の自動制御装置等とから構成されている。

培養容器の形状は培養液の回流を効率よくするために、
高さに比して直径を大きく（例えば1:2程度）かつ培養
容器の底面と円筒状の側壁との接続面は緩やかな曲線を
描くように形成されることが好ましく、蓋の形状は平板
状でも円弧状でもよく、該蓋にはガスの供給口や排出
口、培養液供給口などの他、のぞき窓、酸素電極や温度
センサーの取付口等適宜設けてよい。培養容器の材質
は、ステンレスや内部を透視できるガラス、ポリカーボ
ネート等の耐熱性のプラスチックが使用できる。

前記基質は、通水性の多数の小さな空間を有する基質実
体部分と、該基質実体部分を上下方向に貫通する培養液
の流下孔よりなる円柱状或いは多角柱形状の構造体であ
る。本発明の基質の素材は、微生物細胞を付着あるいは
不動化し得る表面を有しある程度の機械的強度を有する
ものであればよく、織布や通水性多孔体よりなる素材、
不織布状の繊維、多孔質素材、細管の束、或いは蜂の巣
状のもの等が使用でき、例えばガラス繊維、動植物繊
維、合成繊維等の繊維や、ガラス、プラスチック等の多
孔質素材や、フィルムあるいはハニカムセラミックモジ
ュールが使用できる。必要に応じて素材表面を処理して
微生物細胞の付着性あるいは不動化性を高めてもよい。

基質素材に応じて基質の形状のバリエーションが考えら
れるが後述するように回流装置との連携で、培養液が、
基質内の空間に付着増殖している微生物細胞に接触しつ
つ基質内を上方に向って均一にしかも高速に移動できる
ような形状に作成する事が肝要で、このことから次に述
べる培養液の回流装置との組合せで当業者なら考えつく
であろう基質の形状のバリエーションは本発明に妥当に
包含されてよいことは明らかである。基質の上面は培養
容器内の上部に設けられた気流誘導板の下に位置するよ
うに、基質の下面は前記培養液の流下孔が培養容器の底
部に設置した回転手段を収納する回流誘導室の上部開口
部と接続するように、基質の外周側壁は培養容器内周側
壁に近接して配置するように、基質支持体によって培養
容器内に保持される。

基質を前記のように培養容器内に支持固定する基質支持
体は、基質を構成する素材によって適宜選択可能であり
限定されない。

基質素材に織布を用いた場合、該織布を帯状に裁断し、
その基端部を中空円筒状の筒体或いはスペーサー（後
述）に固定したのち、中空円筒状の外周を織布と織布の
間を所定間隔に保ちながら渦巻き状に巻いていき、最終
的には培養容器の内周側壁に近接するまで巻いていって
基質を形成する。この時織布と織布の渦巻き間隔を一定
に保持するために、例えば中空円筒状の筒体の外周壁の
上端部および下端部に放射状に一定間隔に複数個のアー
ムを配設し、このアームに設けられたスペーサー挿入孔
にスペーサーを挿入し、挿入されたスペーサーの上から
織布を巻きつけ、一巻きしたところで次のスペーサーを
挿入し織布を巻きつけ、順次スペーサーを挿入しながら
織布を巻いていく方法をとることができる。この場合渦
巻き状に巻かれた織布と織布の間隙や織布の織目が前記
基質の小さな多数の空間に相当し、中空円筒状の筒体が
前記培養液の流下孔に相当する。培養容器の内周側壁と
基質外周側壁との間に生じた空隙には後述する筒状回流
誘導筒を設けてもよい。巻き込んだ織布を緊張させるた
めにスペーサーをアームの上で外周方向に引き寄せるた
めの螺子を設けてもよい。

基質素材に通水性多孔体よりなる素材例えばハニカム状
のセラミックモジュールを使用する場合は、ハニカムを
構成する小空間が上下方向に通じるように円柱状に基質
を形成し、基質の水平断面の形状は培養容器の内壁側壁
に若干の空間を有するように形成するのが好ましいが接
していてもよい。基質の一部には培養液流下用の筒状の
空間が設けられる。或いはセラミックスをそれぞれ径の
異なる中空筒体に形成し、最も径の大きな中空筒体に順
次径の小さいものを挿入していって同心円状の基質とし
てもよい。培養容器の内周側壁と基質外周側壁との間に
生じた空隙には後述する筒状回流誘導筒を設けることが
望ましいが、空隙がない場合は省略してもよい。基質支
持体は前記セラミックモジュールを培養容器内、回転誘
導室上に固定するための構造体だけでもよい。

基質は適当な基質支持体により培養容器内に前記のよう
に収納固定されるが、回流誘導室も前記培養液流下孔の
下端に一体的に接続して形成してもよい。

培養液下孔の下端と接続した回流誘導室はその下端が培
養容器の底面に密着或いは近接して設置されており、回
転手段を収容する小室の役割を果たしている。回流誘導
室の形状は室内の液が高速の回転に適したものが用いら
れる。例えば、水平断面が円形で全体として円錐台形、
椀を倒立させた形状或いはロートを倒立させた形状など
をとり得る。回流誘導室には培養液流出用の孔が複数箇
所所定間隔で設けられている。この回流誘導室の材質は
ステンレス、ポリカーボネートその他の耐熱性のプラス
チック等である。そしてこの中には回転手段が水平方向
に回転自在に収納されており、培養容器の外部の対応位
置に設置した駆動部に接続して直接的に或いはマグネッ
トにより間接的に回転させられる。回転手段の形状は羽
根型のインペラー、棒状回転子、先細棒状回転子、円盤
状回転子など多用の形状のものが使用できる。回転子が
培養器底面に接触する場合にはガラスあるいはステンレ
スなどの薄板を挿入して培養器底面を保護することがで
きる。

培養容器の内側壁と基質外周との間の空隙に回流誘導筒
を設ける。該回流誘導筒は基質外周側壁を覆い、その上
端部は、培養容器の内側壁と該回流誘導筒の間に形成さ
れる培養液面が前記上端部から運転時基質上に形成され
る培養液面にオーバーフローして流入しない程度の高さ
に位置し、その下端が培養容器の基質の少なくとも底部
近くに位置するような大きさとする。回流誘導筒の上部
には培養液の液面に対応する位置に複数個の孔が設けら
れている。

培養液面と培養容器の蓋との間の気相空間にはガスの導
通孔を有する気流誘導板が配置され、該気流誘導板は培
養液面をある間隔をおいて覆う。その垂直断面は前記気
相空間の垂直断面形状に対応したバリエーションを取り
得る。小型の培養容器にあっては気流誘導板を省略する
ことも可能である。

以上の他、排気ガスから水分を回収するコンデンサー、
或いは逆に排気ガス並びに排気ガスフィルターを保温す
ることによって水蒸気の凝縮を防ぐ保温ジャケット、培
養液を供給・排出するチューブ並びにポンプ、培養容器
内に時として発生する泡を除去するためのチューブ並び
にポンプ、微生物細胞を供給するチューブ並びにポン
プ、サンプルを取得するチューブ並びにパンプ、酸素電
極、pH電極、表面通気だけでなく膜通気で酸素ガスを供
給すべく培養容器内の底部或いは外部に設置した通気性
チューブ、或いは通気性チューブを装備するガス交換
器、培養容器に必要に応じ取付する保温ジャケットとそ
れへの温水等の供給装置、加圧した酸素ガス、炭酸ガス
および空気供給源と供給を調節する電磁弁並びにそれら
を接続するチューブ、容器内圧センサー並びに圧力超過
防止装置、新培養液のタンク、使用済み培養液のタン
ク、以上のものを結合する各種チューブ類、コネクター
類、スイッチ類、更にはそれらを総合的に制御する自動
制御装置等が培養目的や規模等に応じて本発明の培養装
置に適宜取付けできる。また、透明な容器でない場合に
培養容器内を観察できる小窓や必要に応じて培養容器内
でのガスの回流を助ける目的でエアポンプ或いは外部駆
動式のファンを設置することができる。本培養装置の付
属装置の一つとして培養細胞サンプリング装置を設置す
ることができる。例として基質と同質の素材の小片をガ
ラス、プラスチック、セラミック或いは金属の棒の一端
に付着または挟み込んで基質内部に挿入し、他の一端を
培養器に取り付けたフックに懸架し、細胞を付着させて
培養すると共に、適当な時期にフックから外して無菌的
に培養器外に取り出すことができる。

〔作 用〕

回流誘導室の中に収納されている回転手段は培養容器の
外部の駆動力により回転する。この時、回流誘導室が回
転手段の周辺の培養液の回転速度を効率的に高め培養液
に遠心力を付与する。このようにして高速になった回流
誘導室内の培養液は回流誘導室に設けられた多数の孔を
通過して基質下面から高速かつ均一に基質内に流入して
上昇し培養液の回流を促進することとなる。

更に、回流誘導筒の上端が、本培養装置の運転時形成さ
れる培養液面よりも高く形成してあるのでこの回流誘導
筒と培養容器内側壁との空隙にある培養液面は、基質上
の培養液面より高く回流誘導筒の上部孔より通過した培
養液のみが回流に参加する。これは培養液が前記空隙に
滞留することにより培養容器内の諸条件が不均一となる
のを避けるためである。従って、殆どの空隙内の培養液
は基質内に流入することとなり培養液の効率的な回流が
行われることとなる。

基質の外周側壁が培養容器の内側壁に密着している場合
は回流誘導室から高速で流出した培養液は、基質下面の
全面に均一に導かれる。

以上のようにして基質内の空間に流入した培養液は該空
間を形成する基質に付着或いは巻き込まれて不動化した
微生物細胞に栄養物を供給し、微生物細胞によって産生
された有用物質や老廃物を運びだしつつ基質内の空間を
上昇し基質の上面に達し基質上にある高さの培養液面が
形成される。次いで基質内の一部に設けられた培養液流
下孔に流入し流下孔を下降して再び回流誘導室内に流入
し前記のことを繰り返しながら基質内を一定方向に回流
する。その結果基質の多数の空間に付着あるいは不動化
した微生物細胞は培養されることとなる。基質に形成さ
れた多数の空間により微生物細胞の大量培養が可能とな
り、又微生物細胞にかかる剪断力が小さくなることによ
り微生物細胞の損傷が減少する。また細胞は常に一定方
向の液流中にある基質の表面或いは凹凸面に付着或いは
不動化させられているから、培養液中に細胞の断片や死
骸更にはそれらの構成成分など、培養上清からの有用物
質の抽出の妨げとなるような物質が培養上清に浮遊して
混入する機会が減少する。本培養装置では繊維或いは表
面に多数の凹凸面のある素材を基質として使用すること
により、これらの基質素材に一旦付着或いは不動化した
細胞は剥離する機会が少なくなる。これらの特性は培養
の長期維持を可能とさせるものである。また、付着性の
弱い細胞も容易に基質内にとどまることが可能となる。

基質に多数の連通する空間があり、細胞が基質に付着或
いは不動化している本培養装置では、培養液を連続的に
交換することは勿論、短時間のうちに使用済み培養液を
回収し、新しい培養液に更新する回分培養も可能とな
る。

気流誘導板の作用は次の通りである。

本発明においては培養容器の底部或いは外部に通気性の
チューブ（例えば、シリコンチューブや有孔テフロンチ
ューブ等）或いは通気性チューブを内装したガス交換モ
ジュールを配設して培養液のガス交換を行ってもよい
が、気流誘導板をそのガス導通孔と基質内の培養液流下
孔とが対応するように設置することにより上面通気のみ
でも相当ガス交換が可能であり、小型の培養装置にあっ
てはこれら付属ガス交換装置を必要としないほどの能力
を持たせることができる。すなわち培養容器の蓋に設け
られたガス供給口より培養容器内に流入したガスは培養
液の表面に当たり気流誘導板と培養液の液面との間を培
養液とガス交換しながら培養液の流れに沿って流れ、気
流誘導板に設けられた孔に達し、この孔から抜けたガス
は蓋に当り、周辺に拡散して一部が蓋に設けた排出口に
より排出され、残りは培養容器上部内面と気流誘導板と
の間を外周方向に流れ培養容器内側面にぶつかり再び気
流誘導板と培養液の液面との間をガス交換してから気流
誘導板の孔に向って流れる。このようにガスは気流誘導
板をはさんで回流することとなり、ガス交換が能率的に
行われる。エアポンプ或いは駆動式のファンを使用して
強制的にガスの回流を加速した場合には液面の流れとガ
スの流れに流れの差が生じ更にガス交換の効率が高めら
れる。

本発明の培養装置はその機械的な信頼性において従来技
術を超える作用を行うことができる。装置の基本となる
機能要素、すなわち培養液の供給、排出、細胞と培養液
の分離、ガス交換、培養液の循環を、補助的に外部付属
装置を使用して行うことももちろんできるが、すべて一
個の容器を中心として行うことが可能である。また、可
動部分すなわち液送ポンプや回転子の駆動体にそれぞれ
フレキシブルなチューブやマグネットを介して行うタイ
プのものを採用することができ、完全な閉鎖系として汚
染の機会を排除することができる。さらに、本培養装置
においてはその細胞と培養液の分離やガス交換にしばし
ば信頼性に欠けるフィルターを類を使用しないことが可
能である。採用している表面ガス交換法や培養液回流法
はフィルターに比較するとはるかにその信頼性並びに耐
用性が大きい。また、本培養装置にあっては培養液の輸
送、ガスの輸送あるいは細胞の供給にわたるチューブ／
ポンプシステムの全般にわたって高圧負荷を避けること
が可能であり、チューブ／ポンプシステムの全般にわた
って高い耐久性を付与することができる。以上に要約し
たように、本発明による培養装置にあっては装置の細部
から全般にわたるあらゆる部分で高い機械的な信頼性を
期待することができる。

本発明の培養装置はその経済性において従来技術を超え
る作用を行うことができる。経済性にかかわる信頼性に
ついてはすでに述べた。細胞密度についての試算を行う
と以下のようである。

本発明による培養装置で、基質にガラス繊維を使用する
場合を例にとり、基質内で繊維の間隔を2mmに保つとす
ると、1cm³当りの表面積は繊維の面が平滑面であると仮
定したときに10cm²である。比較例として多層型の静置
単層培養装置の一例であるセルファクトリーでは、培
養器１基の容積が12、その表面積が6,000cm²である。
本発明によって同容積の基質で培養する場合には12あ
たり120,000cm²、すなわち培養容積換算でセルファクト
リーの20個分の能力を有する。本発明による培養装置
では基質を収納するための容器や付属装置があるため
に、実際の装置の容積は基質容積より大きくなる。一方
で前記の試算では繊維面を平滑としているが実際の繊維
はさらに数倍の表面積を有している。結局、本培養装置
が容積当り高い付着面積を提供するものであることが明
らかである。本発明による培養装置では消耗する部分が
ガラス繊維等きわめて安価な素材であり、セルファクト
リーがディスポーザブルであることと比較すると繊維
コストはきわめて安い。回流式培養装置を無菌的な閉鎖
系から解放系にまで拡大して藻類細胞等を培養する場合
を想定すると数万立方メートルにまで拡大することにな
んら原理的な困難はない。以上のように本発明による培
養装置はその経済性にかかわるさまざまな要素について
従来技術を超える作用を示すものである。

〔実施例〕

〇回流式培養装置の作製の実施例 以下、回流式培養装置作製の実施例１〜４について述べ
る。実施例１及び４（800ml培養装置）では、容器の内
径が10.5cm、内容積、1,000mlのステンレス製上蓋付き
ガラス容器を培養容器とした。実施例２（10培養装
置）では、内径30cm、内容積10のステンレス製上蓋付
きポリカーボネートプラスチック容器を培養容器とし
た。実施例３（50培養装置）では内径60cm、内容積50
のステンレス製上蓋付きステンレス製容器を培養容器
とした。

実施例１〜４を図面に基づいて詳述する。４実施例とも
基本的な構造はほぼ同じであるのでまとめて述べること
とする。第１図において、１は、培養容器であり、上部
に蓋２を取付することにより密閉容器となっている。こ
の培養容器１の形状は、培養液３を効率よく回流させる
都合上、高さに比して直径が大きく、略1:2程度の円筒
状のもので、底面外周辺と円筒状の側壁とは緩やかな曲
線を描いたものとし、培養液の回流をスムーズにしてい
る。蓋２には図示するガス供給口19及びガス排出口20が
設けられている。培養容器１の外周部に必要に応じジャ
ケット（図示していない）を取付して培養容器１を保温
できるものとする。

実施例1,2及び３ではガラス繊維の織布を基質素材とし
た。ガラス繊維は厚み0.13mm、30本の単繊維をまとめた
繊維束を1mm間隔に平織りとした織布であって、重量75g
/m²のものを使用した。

培養容器１内には、織布９が第３図（１）に示すように
基質支持体10に渦巻き状に多層に巻付けられ基質を形成
している。この基質支持体10は、第２図（１），（２）
に示すように、中央部の円筒状の筒体５の外側上端部及
び下端部外周の対応位置に放射方向に伸びるアーム6,
6′が一定間隔で取付けられており、前記下端のアーム
６′末端には、リング８が取付けられている。上、下の
アーム6,6′には第４図に示すようなスペーサ７が挿入
可能なガイド孔が穿設されている。筒体５、上、下のア
ーム6,6′、スペーサ７およびリング８にて構成された
ものを基質支持体10という。基質支持体10を培養容器１
内の所定位置に安定に保持し、かつ、基質支持体10の下
端（リング８の位置）と培養容器１の底面との間に一定
間隔（後述する、円錐状回流誘導室13と回転子15を設け
ることができる間隔）を確保するためにリング８の下端
と適合する支脚11を設ける。

本実施例では、織布は第３図（１）に示すような基質支
持体10に次のように取付されている。対応する上下のア
ーム6,6′の間隔とほぼ同じ幅を有するシート状の織布
９をまず、筒体５にその一端を固定して巻き付け、次に
対応する上、下アーム6,6′の孔に第４図に示すような
構造のスペーサー７を差し込み、巻き付けた織布９上に
位置させた後、織布９をこの差し込んだスペーサー７を
巻き込むようにして巻く。これを繰り返すことによって
第３図（１）に示すように、基質支持体10にはスペーサ
ー７によって一定間隔に保たれた渦巻き状の多層の織布
９よりなる基質４が形成される。織布９を第３図（２）
に示すように同心円状に巻いても良い。

基質支持体10の筒体５の下部には、この筒体５の直径と
同じ直径の開口部を上部に有する円錐状の回流誘導室13
が取付されている。この回流誘導室13には、その側壁に
数個の孔14が等間隔に設けられ、回転子15を覆うように
して培養容器１の底部にその下端が接するように設けら
れている。回流誘導室13内の回転子15は外部のマグネチ
ックスターラー（図示せず）によって駆動回転させられ
る。基質４の外周には基質４を覆う回流誘導筒12が設け
られその上端は培養液３の液面より突出し、かつ、その
下端は、基質４の底部近くまでの長さを有するように形
成されている。回流誘導筒12の上部円周には培養液３の
液面に対応する位置に複数個の孔16が穿設されている。

培養液３と培養容器の蓋２の間の気相空間には培養液上
面に気相を能率よく接触させるべく、これらの間に、中
央部に孔18を有する円盤状の気流誘導板17が配置されて
いる。

実施例４では基質４の素材としてハニカム状セラミック
を用いた（第５図）。使用したハニカム状セラミックは
組成がMgO:Al₂O₃:SiO₂＝2:2:5のものである。断面が１
辺2mmの正四角型をなすハニカムが高さ5cmの円柱状の素
材内を密に並行して上下方向に貫通した構造で、円柱の
中心線を軸とする直径4.0cmの円柱状の穴を穿った形状
のものを使用した。この基質４の前記穴に直径3.8cm、
高さ5.5cmのステンレス製の筒体５を挿入する（第２図
（３））。筒体５の下部に水平方向に長さ3.2cmの８本
のステンレス製の支持棒（６″）をそれぞれ円周を８等
分する間隔で張りださせ、さらに支持棒の先端に高さ2c
mのステンレス製の支柱を設けた基質支持体10を設け
た。筒体５の下部に円錐状回流誘導質13を実施例１と同
様に取り付けた。

実施例１から４にわたって、その大きさには大小あるも
のの、それぞれに以下のような付属装置を取り付けた。
即ちポーラログラフィータイプの酸素電極各１基、酸素
分圧の数値をコンピューターに送るインターフェイス各
１基、酸素分圧の数値によってコンピューターで開閉を
制御する電磁弁ならびに電磁弁に接続する酸素ガス供給
用マニュアルフローメーターと無菌フィルター、５％CO
₂を含む空気の流量を調節可能として供給するためのマ
ニュアルフローメーター並びにフローメーターに接続す
るチューブと無菌フィルター、マグネチックスターラ
ー、細胞浮遊液供給チューブならびにペリスタルティッ
クポンプ、培養液供給チューブならびにペリスタルテッ
ィクポンプ、培養液排出チューブならびにペリスタルテ
ッィクポンプ、排気ガス排出チューブならびにフィルタ
ー、排気チューブと排気フィルターを併せて保温し乾燥
状態に保つ温風供給器、培養容器をジャケットに通水す
ることによって保温するための恒温水槽と水流ポンプで
ある。また、チューブの無菌的着脱を行うためのステン
レス製コネクターを必要箇所に配置した。その他の条件
については培養実施例にも一部記載している。

以上のようにこの発明の実施例は構成されているので、
実施例１〜４を通じて共通して、次のように作用する。
すなわち、回転子15の回転により、培養容器１の底部の
培養液３は回転し遠心力が与えられる。そして、円錐状
回流誘導室13が、回転子15を覆うようにして設けられて
いるため、回転子15の周辺で培養液３の回転速度を効率
的に高めることができ、このようにして高速になった培
養液３は、この円錐状回流誘導室13の側壁にある多数の
孔14より矢印イ方向に流出することによって、基質４内
へ均一に流入することになる。

そして、基質内へ流入した培養液３は、基質４に付着し
た細胞への栄養物供給と細胞の老廃物排出を行いつつ、
基質４内を上昇し、基質４の上面に達し、オーバーフロ
ーして筒体５内へ矢印ロのごとく流入し、筒体５内を下
降して、円錐状回流誘導室13内へ戻り、再び回転子15に
作用されて、前記のことを繰り返しながら、基質４内を
回流する。ところで、回流誘導筒12の上端は、運転時、
培養液３が達する高さより更に上部に出る高さに形成さ
れているため、運転時この回流誘導筒12と培養容器１の
間隙にある培養液面は基質上の培養液面より高く押し上
げられるが回流誘導筒12にもうけられた孔16より通過し
たもののみが回流に参加するようになっている。この一
部回流に参加するようにしたのは、前記間隙の培養液３
が滞留することによって培養容器１内の諸条件が不均一
となるのを避けるためである。

次に、気流誘導板17の作用について説明する。ガス供給
口19より培養容器１内へ流入したガスは、培養液３の表
面に当たり中央方向に流れながら培養液３とガス交換を
行っていく。そして中央部へきたガスは、気流誘導板17
の中央部に設けられた孔18をぬけ蓋２に当たり、周辺に
放散して矢印ニの方向へ流れ、一部はガス排出口20より
排出される。この矢印ニの方向へ流れたガスは、気流誘
導板17の端部へ来ると、ガス供給口19よりのガスの流れ
及び培養容器１の内側部に当たることによって中心に向
けて矢印ハのごとく流れることとなり、ガスは気流誘導
板17をはさんで、回流することとなる。その際ガスの培
養液３の表面上の流れは、培養液３上面の流れと同じに
なる。このようにガスに回流を与えて培養液３上面とガ
スとは能率よく接触し、ガス交換の能率が高められる。
ポンプを使用して強制的にガスの回流を加速した場合に
は、更にガス交換の効率が高められる。

次に、具体的に細胞培養の実験例について述べる。

以下の培養実施例において装置作製実施例１〜４をそれ
ぞれ１型培養装置〜４型培養装置と記した。また、培養
装置は組み立た状態でオートクレブ滅菌して使用した。

〇 培養実施例１−−ガラス繊維織布を用いた１型培養
装置による各種細胞の培養 培養容器１は、内径10.5cm、深さ10.5cmのジャケット付
き、ステンレス蓋付きのものである。基質支持体10は、
直径2mmのステンレス線を加工したラック状のもので、
アーム６、６は上下８本ずつ放射状に配置したものであ
り、筒体５もステンレスとし、筒体５の下端と培養容器
１の底面とは3.5cmの間隙を設けている。基質４は幅47m
mのガラス繊維織布９を2mm間隙で８角型に巻き込んであ
り、その長さは3mで、表面積は塗布の面積に換算して28
20cm²となるが、実効表面積はこれより大である。円錐
状回流誘導室13及び回流誘導筒12は、ポリカーボネート
のフィルムを使用した。気流誘導板17は直径8cmで、孔1
8の大きさを直径3cmとしたポリカーボネート円盤とし
た。また、回転子15は毎分800回転程度の速度で回転す
る。また、培養容器１の蓋２を通じてガス供給チュー
ブ、ガス排出チューブのほか、培養液供給チューブ、培
養液排出チューブ、細胞浮遊液供給兼サンプル培養液採
取チューブの合計５本のステンレスチューブを配してお
り、pH電極、酸素電極も配備されている。

そして、huH−１培養ヒト肝癌細胞の一系統（Huh,N.＆
Utakoji,T.,Gann,72,178−179（1981））を、DM160培養
液に牛胎児血清（FBS）５％添加した増殖培養液中、プ
ラスチックディッシュで単層培養し、トリプシン処理し
て、1.5×10⁸個の種細胞を得、この細胞を前記培養容器
１に800mlの増殖培養液を満たした中に入れ、回転子15
を回転させて培養液３を回流させ、基質４に細胞を付着
させた。最初の２日間は培養液を更新せず、以降は全培
養期間20日間のうちに、半量ずつ培養液を随時交換し、
グルコースレベルを300mg/以上、乳酸レベルを500mg/
以下に維持した。この間、５％炭酸ガス含有空気を５
〜10ml/分間通気し、加えて酸素を随時補給した。培養
期間中、実体顕微鏡によって培養容器１の外から細胞が
基質４に付着しつつ増殖していることを確認した。培養
後は、織布９を基質支持体10から剥離し、その各所を切
り取って、クエン酸クリスタルバイオレット法で裸核を
計数した。細胞数は、織布９片面あたりに換算して1.05
×10⁶/cm²であった。面積当たりの細胞数はセルファク
トリー（Nulgen社製）による単層培養の場合の約２倍
である。基質４の容積当たりの細胞密度に換算すると、
1.05×10⁷/cm³である。

ガラス繊維基質装置の１型培養装置で、前記ヒト肝癌細
胞系統のほかに、壁付着性の細胞系統であるC127Iマウ
ス乳ガン細胞（Lowy,D.R.,Renal,E.,Scolnick,E.M.:J.V
irol.26,291−298（1978））の１系統、浮遊培養に適す
る細胞系統であるが、若干の壁付着性を有するKYM−Ｉ
ヒト横紋筋肉腫細胞（Sekiguchi,M.,Shiroko,Y.,Susuk
i,T.,Imada,M.,Miyahara,M.,Fujii,G.:Biomed,Pharamac
other.,39,372（1985））の１系統、ならびに壁付着性
の殆どないマウスハイブリドーマ細胞の一系統（X63−A
g8−6.5.3.株マウスミエローマを母細胞とするハイブリ
ドーマ、M.Miyahara,unpublished）の培養を行った。培
養装置の組立て、細胞の播種法、細胞数の測定法は前記
のhuH−１細胞に準じた。

C127I細胞の１系統はガラス繊維の表面片面当りに換算
して1.1×10⁴個/cm²をダルベッコ変法イーグル培養液
（DEM）に牛胎児血清５％添加した増殖培養液中で培養
した。この間培養液の交換率を徐々に増加させて、10日
以降は毎日全量交換した。グルコースの消費速度は培養
14日まで増加し、培養装置あたり60mg/時に達し、以降
安定に推移した。培養23日で、ガラス繊維の表面片面当
りに換算して5.7×10⁵個/cm²の細胞密度を得た。

KYM−Ｉヒト肉腫細胞の１系統はガラス繊維の片面表面
を平面と見なして1.6×10⁵個/cm²の細胞密度で播種し、
RPMI−1640を基礎培養液とし、微量成分ならびに0.1ウ
シ血清アルブミンを添加した無血清培養液を増殖培養液
として培養した。この細胞は付着性のきわめて弱い細胞
で、浮遊培養で継代維持してきた系統であるが、培養開
始後17時間での測定では浮遊細胞率から換算して、この
時点で約45％の細胞が基質内に不動化したものと推算さ
れた。培養中、培養液の交換率を徐々に増加させて、17
日以降は毎日1000ml交換し、グルコース濃度を600mg/
水準に維持した。30日間培養後、織布表面積換算で5.9
×10⁵/cm²の細胞収量を得た。

マウスハイブリドーマは培養装置あたり2.2×10⁴個（ガ
ラス繊維片面換算で細胞密度（7.3×10⁸/cm²に相当）を
播種した。RPMI−1640培養液に10％FBSを添加した培養
液中で33日間連続培養した。この間、培養液を培養11日
まで0.59容／日、以降は0.89容／日交換して、グルコー
ス濃度を1.1ないし1.5g/に維持した。グルコースの消
費量からみて、この培養は11日以降はほぼ定常の状態を
維持した。この間排出される培養液に含まれる浮遊細胞
の密度は５×10⁵/ml前後であった。培養終了時に測定し
た細胞密度は基質部分の容積あたり6.3×10⁶/ml（ガラ
ス繊維片面換算で細胞密度6.3×10⁵/cm²）であり、浮遊
している細胞密度の約10倍の密度の細胞が基質内に滞留
していることが示された。走査電子顕微鏡による観察で
は、ハイブリドーマ細胞はガラス繊維の表面に付着し、
あるいははさまれた状態で不動化して存在しており、繊
維の広範な部分に比較的均等に分布していた。

前記の結果はガラス繊維を基質の素材に採用した本発明
の回流式培養装置（１型装置）は付着性の強い細胞から
付着性の殆どない細胞にまで広い範囲で細胞を不動化
し、細胞を増殖させ、また細胞培養を維持することが可
能であることを示している。

〇 培養実施例２−−セラミック基質を用いた４型培養
装置による培養実施例 マウスハイブリドーマの系統ならびに培養液条件は１型
培養装置での実施例と同様である。本実施例で使用した
セラミック基質はその容積400ml、単位容積あたりの表
面積はセラミックの１面を平面と換算して20cm²/mlであ
り、この表面密度は１−３型装置で使用しているガラス
繊維での換算表面密度の２倍である。本装置に対して2.
2×10⁸個のハイブリドーマ繊維（セラミック表面を平面
と換算して3.7×10⁴/cm²に相当する）を播種した。RPMI
−1640培養液に10％FBSを添加した培養液中で34日間連
続培養した。この間、培養液の交換量を培養10日まで徐
々に上昇させ、10日以降は3.5容／日交換して、グルコ
ース濃度を1.1ないし1.5g/に維持した。グルコースの
消費量からみて、この培養は11日以降はほぼ定常の状態
を維持した。この間排出される培養液に含まれる浮遊細
胞の密度は５×10⁵/ml前後であった。本実施例について
は培養終了時の細胞密度の正確な数値を得ていないが、
そのモノクローナル抗体の生産量からみて、１型培養装
置による実施例の約４倍の細胞密度を得ているものと推
定した。以上の結果は本発明による培養装置の基質とし
てハニカム状のセラミックは基質として使用でき、しか
もハイブリドーマのような壁付着性のきわめて弱い細胞
も不動化しうることを示している。

〇 培養実施例３−−ガラス基質を用いた2,3型培養装
置によるスケールアップ ヒト肝癌細胞huH−１の一系ならびにヒト横紋筋肉腫細
胞KYM−Ｉの一系を用いて、２型培養装置（10スケー
ル）ならびに３型培養装置（50スケール）への拡大試
験を以下のように行った。２型培養装置は基本的には前
記の１型培養装置と同様のパーツ構成よりなり、培養容
器１は内径30cm、深さ17cmのポリカーボネート製であ
り、外側にポリカーボネート製の保温ジャケットを設け
ており、蓋２はステンレス製の円盤で１型培養装置と同
様に７個の開口部が設けられ、これらの開口部に接続す
るステンレスチューブ、各電極は、前記のものと同様で
ある。基質支持体10はステンレス製で高さは10cm、中心
部の筒体５の内径は7cmであり、筒体５の上、下部に８
本のアーム８が放射状に配置されている。基質４は、前
記のものと同様に基質支持体10に巻き込んで取付けられ
ており、8.5cm×30mのガラス繊維織布９を2mm間隔で巻
き込み、表面積は布の両面をそれぞれ平面とみなしたと
き面積に換算して51,000cm²である。円錐状回流誘導室1
3は、ステンレス製とした。なお、回転子15の配置は前
記１型培養装置の例と同様である。また、通気性テフロ
ンチューブ19mをコイル状に巻いたガス交換ユニットを
基質支持体10の底面に張り付け、これによって培養液３
のガス交換ができるようにした。

huH−１細胞を用いた試験では、細胞、増殖培養液等の
条件は、前記１型培養装置の場合と同様にして細胞培養
を行った。但し種細胞の培養にはマイクロキャリアー培
養を採用し、2.0×10⁹個の種細胞を得た。この細胞を、
10の培養液を満たした培養容器１に播種して、以降28
日間、500乃至800r.p.m.で撹拌しつつ培養液を回流させ
て培養した。この間、５％炭酸ガス含有空気を通気し、
加えて、酸素を前記１型の培養装置の要領で補給した。
最初の４日間は培養液を更新せず本実施例においては、
以降は全培養期間27日間のうちに、全量の培養液を随時
交換し、グルコースレベルを400mg/以上、乳酸レベル
を800mg/以下に維持した。細胞の収量は面積あたり、
3.64×10⁵/cm²であった。この値はセルファクトリー
での数値にほぼ匹敵するものである。

３型培養装置（50培養装置）では幅10cm、長さ180mの
ガラス繊維を、2mm間隔に中央に円筒型の空間を設けた
直径60cmの12角形ステンレス支柱に巻き込んだ基質を使
用した。培養容器は直径60cm、蓋を除いた容器の深さ20
cm、内容積は50、基質部分の容積は25である。１、
２型装置（800mlならびに10装置）の基質支持体では
並行した２本のステンレス棒よりなるアームとその間に
ははさむようにして並べるピン型のスペイサーの組合せ
を採用したが、３型装置では１本のステンレス棒よりな
るアームに幅5mm、厚さ2mm、長さ11cmのステンレス角材
の両端近くにそれぞれ１個ずつの穴を設けたスペーサー
を、ガラス繊維を巻き進むごとに挿入して基質を作成し
た。さらに、織布をすべて巻き込んだ後、巻き込んだ織
布を緊張させるために、スペイサーを外縁にむけて固定
する補助的な締め具を付属させた。ガラス繊維の表面積
は片面を平面とみなして、360,000cm²である。

本実施例ではヒト横紋筋肉腫細胞（KYM−Ｉ）を用い、
浮遊培養した細胞３×10¹⁰個を播種した。24時間培養後
算定した浮遊細胞数は4.7×10⁷個であり、98％以上の細
胞が基質に付着したものと推定された。さきに述べた無
血清増殖培養液を使用して16日間連続的に培養液を交換
しながら培養を続けた。この間、グルコースのレベルを
500〜1000mg/に維持し、720の培養液を供給した。
培養終了時の細胞の総数は1.87×10¹¹個である。この数
値はガラス繊維の片面あたりに換算して5.2×10⁵/cm²で
あり、単層培養における細胞密度と匹敵する。培養終了
時に培養液に浮遊していた細胞は細胞総数の0.2％以下
であった。本実施例において詳細には触れていないが、
KYM−Ｉ細胞は有用物質を培養上清に分泌生産してい
る。細胞DNAは有用物質の分離精製の段階で負担のかか
る混入物質であるが、本培養装置で生産した培養上清に
は浮遊培養から細胞を分離して得た培養上清に含まれる
DNA含量の1/10以下しか細胞DNAが含まれていなかった。
このことは、本装置において細胞に与える損傷が少ない
こと、ならびに細胞物質が培養上清に混入する機会が少
ないことを示すものである。

なお、ヒト肝癌細胞huH−１細胞についての実施例は次
項にある長期培養によって行い成功している。

以上の実施例にあるように、本発明にある培養装置は50
まで容易に拡張することが可能であった。

〇 培養実施例４−−長期培養試験 細胞、増殖培養液等の条件は、前記800ml培養装置での
細胞培養の場合と同様で、huH−１細胞の一系統の種培
養はプラスティックディッシュで単層培養し、トリプシ
ン処理して、3.0×10⁸個の種細胞を得、これを800mlの
増殖培養液を満たした培養容器１に播種し、回転子15を
回転させて培養液３を回流させて細胞を基質４に付着さ
せた。最初の２日間は培養液を更新せず、以降は増殖期
19日間のうちに、650ml/日から1,950ml/日までの量で連
続的に培養液を更新した。19日目以降はウイリアムＥ培
養液を主成分とする無血清培養液に変更し、６ヶ月間維
持培養した。この間、５％炭酸ガス含有空気を90〜95ml
/分の割合で通気し、加えて、酸素を随時補給した。培
養期間中、実体顕微鏡によって培養容器１の外から細胞
が基質４に密に付着しつつ増殖していることを確認し
た。

６ヶ月の培養期間中、細胞の生育状態の安定性が確認さ
れた。培養終了後、測定した細胞数を基質４の部分の容
積あたりの細胞密度に換算すると、4.4×10⁷/cm³以上の
細胞密度に達していた。また、基質４に使用した布の両
面の面積から布の単位面積当りの細胞密度を計算する
と、5.8×10⁶/cm³の細胞密度となり、この値はセルファ
クトリーを用いた場合に達成される細胞密度の10倍で
ある。このことは本発明の培養装置が物質生産システム
として極めて有用であることを示している。

ヒト肝癌huH−１細胞を用い、３型培養装置（50）に
スケールアップして長期培養試験を行った。３型培養装
置の仕様は前述のものと同様であるが、さらにガス交換
の効率を固める目的で直径2cm長さ26cmのシリコン中空
糸よりなるカラム２基を直列につないだガス交換筒を外
装し、ペリスタルティックポンプを用いて培養液の一部
がガス交換筒を循環するように接続した。シリコン中空
糸には100％酸素を供給できるように装置した。この外
装ガス交換装置は培養の初期には使用せず、細胞数が増
殖して培養液の酸素分圧が低下した後に使用を開始し
た。本実施例では5.9×10⁹個の細胞を接種し、209日間
培養を継続した。最初の26日間は５％牛胎児血清を含む
DM160培養液を使用して細胞を増殖させ、その後はWilli
am E培養液を主成分とする無血清培養液に変更したこと
は１型培養装置での実施例と同様である。総計209日
間、培養装置には何等故障を認めなかった。回収した細
胞は2.2×10¹¹個であった。この密度は基質容積あたり
に換算すると９×10⁶/cm³である。またガラス繊維片面
あたりに換算すると９×10⁵個/cm²の密度である。この
数値は１型装置での達成密度より低いがセルファクトリ
ーでの達成密度の1.8倍である。本実施例では詳細に
ついて触れてないが、使用している細胞系統は有用物質
を生産している。その生産性をセルファクトリーでの
値と比較すると、本培養装置１基は培養表面積6000c
m²、培養液１を搭載できるセルファクトリー130台
ないし140台分に相当する能力を示した。

〇 液表面におけるガス交換能の測定 ３型培養装置（50）を使用して液表面における酸素の
透過能力を実測した。50培養装置にガラス繊維基質を
装填し、蒸留水を充してスターラーで循環させた。測定
の直前に亜硫酸ソーダを添加し、酸素分圧を０として、
装置に蓋をし、以降、空気、あるいは空気と酸素ガスの
混合ガスを液の上面に通気しながら酸素分圧の上昇を酸
素電極を用いて測定した。本測定においては、表面通気
をファン等を用いてとくに積極的に回流させることは行
わなかったが、100％酸素ガスを通気した状態に外捜し
た見かけ上の酸素吸収の最大効率は１時間あたり約800m
gであた。この数値から、通常の細胞の酸素消費速度を
２μg/10⁶細胞／時間と仮定すると、とくに加速しない
条件で表面通気を行った場合の培養装置あたりの最大細
胞数は４×10¹¹個、基質体積あたりで1.6×10⁷/cm³、ガ
ラス繊維表面を平面とみなした場合の面積あたりで1.6
×10⁶/cm²の細胞密度が期待できる最大密度となる。ガ
ス交換の補助装置をもうけない場合の本体培養装置にお
ける最大細胞密度の一つの目安を与えるものである。２
型装置ならびに１型装置では相対的に回流の速度が早い
のでさらに高い細胞密度が期待できる。

なお、実施例において詳細に説明していないが、ガラス
繊維に付着増殖させた細胞を無菌的に回収することは可
能である。ヒト肝癌細胞huH−１での例では、トリプシ
ン処理後に培養容器の外から繊維基質に機械的にショッ
クを数回与えることによって、96％の細胞を浮遊液に回
収している。

〔発明の効果〕

この発明の回流式培養装置は、（１）従来の微粒子担体
培養法、浮遊培養におけるように細胞に機械的損傷を与
えることがなく培養できる、（２）単層培養法や微粒子
担体培養法におけるように細胞の剥離や移動、あるいは
不均化をもたらすことがなく、長期安定に維持すること
ができる。（３）細胞の付着性の強弱に関わらず、さま
ざまな細胞を培養できる、（４）微粒子担体培養法、浮
遊培養法、中空糸培養法に必要であるような酸素の供給
装置を付設することを前提とせずに培養できる、（５）
浮遊培養法、微粒子担体培養法に必要であるような細胞
と培養液の分離装置を付設せずに培養できる、（６）浮
遊培養法や微粒子担体培養法で問題となるような培養上
清中の混入細胞物質が少ない、（７）中空糸培養法にお
けるようなポンプへの大きな負担、あるいは微粒子担体
培養法や浮遊培養法におけるようなガス交換装置や細胞
分離装置の信頼性への心配がなく、また、微粒子担体培
養装置、浮遊培養装置、中空糸培養装置において必要で
あるような培養培養装置外の培養液循環システム構築せ
ずとも一体的な装置として機能させることができるた
め、生物学的封じ込めの信頼性が高く、結局全体として
培養装置の信頼性が高い、（８）付着性細胞の培養につ
いてしばしば問題となる細胞数あたりの培養装置の容積
がコンパクトで制御しやすく、装置の信頼性が高く、ま
た装置の耐久性が高いことによって培養装置としての経
済性が高い、等の多くの特徴点を有することが示され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明による回流式培養装置の一実施例の
概略断面図、第２図（１），（２），（３）は、基質支
持体の一実施例の概略図、第３図（１），（２）は、基
質を取付した基質支持体の一実施例の概略平面図、第４
図は、基質素材を一定間隔を保持するスペーサーの一実
施例の側面図及び第５図は、基質の他の実施例を示す斜
視図である。 １……培養容器 ２……培養容器の蓋 ３……培養液 ４……基質 ５……筒体 ６……アーム ７……スペーサー ８……リング ９……織布 10……基質支持体 11……支脚 12……回流誘導筒 13……円錐状回流誘導室 14……孔 15……回転子 16……孔 17……気流誘導板 18……孔 19……ガス供給口 20……ガス排出口

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】着脱可能な蓋を上面に有する培養容器と、
   該容器内に微生物細胞が付着あるいは不動化し得る基質
   と、培養液を回流するための回流手段、とを有する回流
   式培養装置であって、 前記基質は、複数の第１の空間と第２の空間とを有して
   おり、該回流手段の作用により培養液が第１と第２の空
   間との間で回流するようになっていることを特徴とす
   る、回流式培養装置。
2. 【請求項２】該容器の蓋と該基質の上面との間に気相空
   間が形成されていることを特徴とする、請求の範囲１記
   載の回流式培養装置。
3. 【請求項３】該気相空間内には、中央部に孔を有する気
   流誘導板が配置されていることを特徴とする、請求の範
   囲２記載の回流式培養装置。
4. 【請求項４】該回流手段は、該培養容器の底部と基質の
   下面との間に形成されていることを特徴とする、請求の
   範囲１ないし３記載の回流式培養装置。
5. 【請求項５】該回転手段は、該培養容器の底部と基質の
   下面との間に位置する複数の開孔を持つ隔壁により区画
   された回流誘導室内に位置していることを特徴とする、
   請求の範囲４記載の回流式培養装置。
6. 【請求項６】該基質は、その素材が繊維物質、セラミッ
   ク、又は多孔性樹脂体であることを特徴とする、請求の
   範囲１ないし５いずれか記載の回流式培養装置。
7. 【請求項７】該基質は、微生物細胞を付着あるいは不動
   化する表面を構成する帯状の素材を保って渦巻き状に巻
   き込んだものであり、巻き込まれたものの中央部分が該
   第２の空間を形成しており、該小間隙が該複数の第１の
   空間を形成ししていることを特徴とする、請求の範囲１
   ないし５いずれか記載の回流式培養装置。
8. 【請求項８】着脱可能な蓋を上面に有する培養容器と、
   該容器内に微生物細胞が付着あるいは不動化し得る基質
   と、培養液を回流するための回流手段、とを有する回流
   式培養装置であって、 前記基質は、複数の第１の空間と第２の空間とを有して
   おり、該第１の空間は培養液が上昇することおよび該第
   ２の空間は培養液が下降することで培養液の回流が可能
   に形成され、該容器の蓋と該基質の間にはさらに気相空
   間が形成され、 該回転手段は、該基質の第２の空間下方部に位置してい
   て、その回転により溶液に回転遠心力を付与するように
   作用し、かつ、 該気相空間内において、培養液が該気相空間内のガスと
   ガス交換しながら回流するようになっていることを特徴
   とする、回流式培養装置。
9. 【請求項９】該気相空間内には、中央部に孔を有する気
   流誘導板が配置されていることを特徴とする、請求の範
   囲８記載の回流式培養装置。
10. 【請求項１０】該基質は、その素材が繊維物質、セラミ
    ック、又は多孔性樹脂体であることを特徴とする、請求
    の範囲８記載の回流式培養装置。
11. 【請求項１１】該基質は、微生物細胞を付着あるいは不
    動化する表面を構成する帯状の素材を保って渦巻き状に
    巻き込んだものであり、巻き込まれたものの中央部分が
    該第２の空間を形成しており、該小間隙が該複数の第１
    の空間を形成ししていることを特徴とする、請求の範囲
    ８ないし10記載の回流式培養装置。
12. 【請求項１２】該回転手段は、該培養容器の底部と基質
    の下面との間に位置する複数の開孔を持つ隔壁により区
    画された回流誘導室内に位置していることを特徴とす
    る、請求の範囲８ないし11いずれか記載の回流式培養装
    置。