JPH07102150B2

JPH07102150B2 - ポリペプチドの調製方法

Info

Publication number: JPH07102150B2
Application number: JP6106595A
Authority: JP
Inventors: ミッチェル・スチュアート・グロス; ジェイムズ・フランシス・ヤング
Original assignee: スミスクライン・ベックマン・コーポレイション
Priority date: 1985-02-07
Filing date: 1994-05-20
Publication date: 1995-11-08
Anticipated expiration: 2010-11-08
Also published as: JPH07170995A; YU18186A; DK62486A; DK62486D0; PT81967B; JPS61181387A; AU603054B2; ZA86797B; ES8704975A1; PT81967A; CN86100979A; MY102249A; EP0191748B1; ES551656A0; AP8600020A0; AU5293686A; DE3687071T2; AP17A; NZ215034A; OA08199A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、哺乳動物をマラリアか
ら防御するワクチン用のポリペプチドの調製方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】マラリアは、長年鋭意研究が重ねられて
きたにもかかわらず、ワクチンが開発されていない、重
く、かつ広範囲にわたる病気である。例えば、サイエン
ス(Ｓcience)、第２２６巻、６７９頁(１９８４年１１
月９日)参照。実験的に、ヒトを含めた哺乳類は、照射
したスポロゾイトを接種することにより、マラリアの病
原体、プラスモジウム(Ｐlasmodium)による感染に対し
て防御される。クライドら、アメリカン・ジャーナル・
オブ・トロピカル・メジシン・アンド・ハイジーン(Ｃl
yde et al．,Ａm．Ｊ．Ｔrop．Ｍed、Ｈyg．)、第２
４巻、３９７頁(１９７５)およびリークマンら、ブリテ
ィン、ダブリュー・エイチ・オー(Ｒieckmanet al．,
Ｂull．ＷＨＯ)、第５７巻(補遺１)、２６１頁(１９７
９)参照。ヨシダら、サイエンス(Ｙoshida et al．,
Ｓcience)、第２０７巻、７１頁(１９８０)の報告によ
れば、かかる防御は、少なくとも、スポロゾイトの表面
上のタンパク質、サーカムスポロゾイト(ＣＳ)タンパク
質に対する抗体により部分的に媒介され、ＣＳタンパク
質に対して生じたモノクローナル抗体は、in vitroで
感染を中和し、in vivoで動物を防御する。ＣＳタンパ
ク質は、種内で高度に進化的に保存されるが、種間では
かなり異なる。プラスモジウムの４つの種は、ヒトを感
染させることが公知である。これらは、熱帯熱マラリア
原虫(Ｐ．falciparum)、三日熱マラリア原虫(Ｐ．viva
x)、卵形マラリア原虫(Ｐ．ovale)および四日熱原虫
(Ｐ．malariae)であって、後の２つは頻度が少ない。科
学的に興味深い他の種は、囓歯類住血胞子虫(Ｐ．bergh
ei)および猿マラリア原虫(Ｐ．knowlesi)であり、これ
らの種の宿主は、各々、囓歯類動物およびサルである。

【０００３】猿マラリア原虫のＣＳタンパク質は、１２
のアミノ酸配列の１２のタンデム重複からなる。ザバラ
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン
(Ｚavala et al．,Ｊ．Ｅxp．Ｍed．)、第１５７巻、
１９４７頁(１９８３)は、該重複単位に対するモノクロ
ーナル抗体が、抗スポロゾイト抗血清の可溶化スポロゾ
イトタンパク質に対する接触をブロックするという実験
に基づいて、該重複単位が、猿マラリア原虫ＣＳタンパ
ク質の主な免疫原であることを報告している。ジシン
ら、ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン
(Ｇysin et al．,Ｊ．Ｅxp．Ｍed．)、第１６０巻、
９３５頁(１９８４)は、猿マラリア原虫ＣＳタンパク質
のタンデム重複単位を表す合成の２４のペプチド残基
は、サルにおける病原性スポロゾイトの感染性を中和す
ることを報告している。コルマンら(Ｃolman et a
l)、国際特許公開ＷＯ８４−２９２２−Ａ号(１９８４
年８月２日公開)は、猿マラリア原虫ＣＳタンパク質重
複単位のコーディング領域のタンパク質のクローニン
グ、およびイー・コリ(Ｅ．coli)におけるそのβ−ラク
タマーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ融合株の発現を報
告している。ヌッセンバイクら(Ｎussenzweig et a
l．)、米国特許第４４６６９１７号は、Ｐ４４タンパク
質と称するスポロゾイトタンパク質、およびイー・コリ
におけるそのクローニングおよび発現を開示している。
エネアら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エイ(Ｅn
ea et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ)、
第８１巻、７５２０頁(１９８４)は、シノモルギマラリ
ア原虫(Ｐ．cynomologi)のＣＳタンパク質内の類似した
重複単位構造を報告している。ケンプら(Ｋemp et a
l)、国際特許公開ＷＯ８４−０２９１７−Ａ号は、イー
・コリにおける熱帯熱マラリア原虫cＤＮＡのクローニ
ングおよび発現を開示している。デイムら、サイエンス
(Ｄame et al．,Ｓcience)、第２２５巻、５９３頁
(１９８４)は、イー・コリにおける熱帯熱マラリア原虫
のＣＳタンパク質のクローニングおよび発現を報告して
いる。該タンパク質は、分子量約４４０００の約４１２
のアミノ酸からなると記載されている。これは、テトラ
ペプチドの４１タンデム重複からなる。モノクローナル
抗体に結合した重複領域由来の合成の７−、１１−およ
び１５−ペプチド残基は、ＣＳタンパク質に対して発生
する。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、熱帯熱マラ
リア原虫(Ｐlasmodium falciparum)ＣＳタンパク質の
重複単位の全部または一部に対するコーディング配列を
有するイー・コリ(Ｅ．coli)発現ベクターで形質転換さ
れたイー・コリ培養株から熱帯熱マラリア原虫ＣＳタン
パク質の４以上のタンデム重複単位を有するポリペプチ
ドを精製、調製する方法を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明のポリペプチド
は、イー・コリ(Ｅ．coli)において産生される４つ以上
のタンデムＣＳタンパク質重複単位からなる。該ポリペ
プチドは、ＣＳタンパク質ではないが、重複単位以外の
ＣＳタンパク質の部分を含んでもよい。熱帯熱マラリア
原虫(Ｐ．falciparum)重複単位は、次に示す配列を有す
るテトラペプチドである: アスパラギン(Ａsn)−アラニン(Ａla)−アスパラギン
（Ａsn）−プロリン(Ｐro)−

【０００６】本発明のポリペプチド内で、種々のテトラ
ペプチドが存在し、かかるペプチドは、熱帯熱マラリア
原虫ＣＳタンパク質に関して、その抗体の反応性に著し
く悪い影響を及ぼさない。例えば、デイムら、サイエン
ス(Ｄame et al．,Ｓcience)、第２２５巻、５９３頁
(１９８４)に開示されている如く、天然に存在する熱帯
熱マラリア原虫における４１テトラペプチド重複の３７
は、Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐroであり、４はＡsn−バリン
(Ｖal)−アスパラギン酸(Ａsp)−Ｐroである。好ましく
は、本発明のポリペプチドにおけるテトラペプチド重複
単位の半分以上は、いわゆる共通塩基配列、Ａsn−Ａla
−Ａsn−Ｐroである。好ましくは、本発明のポリペプチ
ドは、約８重複(即ち３２アミノ酸)〜約１４８重複から
なる。さらに好ましくは、ポリペプチドは、約１６〜約
１１２の重複からなる。

【０００７】本発明のポリペプチドは、ハイブリッド、
即ち、非ＣＳタンパク質重複単位配列を有する融合ポリ
ペプチドである。かかる非ＣＳタンパク質重複配列は、
免疫原性を高めるか、または組換微生物におけるクロー
ニングおよび発現を促進する担体分子として機能し得
る。あるいは、かかる追加的配列は、他のスポロゾイト
免疫原、他のプラスモジウム免疫原および／または他の
非プラスモジウム免疫原に対する１以上のエピトープを
担うことができる。特に、イー・コリにおいて実施可能
な量で安定に発現されず、熱帯熱マラリア原虫に対する
免疫化に関して必要でないことが判明しているＣＳタン
パク質は、本発明から除外される。

【０００８】本明細書において例示する本発明のポリペ
プチドの種類の具体例は、次のとおりである。重複のＣ
末端と融合したpＢＲ３２２におけるテトラサイクリン
耐性(tetＲ)遺伝子由来の約３２のＮ−末端アミノ酸を
有する少なくとも４つの重複からなるＲtet₃₂ポリペプ
チド:重複のＣ末端と融合したtetＲ遺伝子を有する少な
くとも４つの重複からなるＲtet₈₆ポリペプチド；重複
のＣ末端と融合したＮＳ１の２２７のアミノ酸を有する
少なくとも４つの重複からなるＲＮＳ１ポリペプチド；
重複のＮ末端と融合したＮＳ１の８１のＮ末端アミノ酸
を有する少なくとも４つの重複からなるＮＳ１Ｒポリペ
プチド;重複のＣ末端で−グリシン残基が続いている少
なくとも４つの重複からなるＲＧポリペプチド;重複の
Ｃ末端で−ロイシン−アルギニン残基につながっている
少なくとも４つの重複からなるＲＬＡポリペプチド;お
よび重複のＣ末端で−Ａsn−Ｔhr−Ｖal−Ｓer−Ｓerに
つながっている少なくとも４つの重複からなるＲＮポリ
ペプチド。

【０００９】ＣＳタンパク質重複単位に関する遺伝子コ
ーディング配列は、公知の技術により得ることができ
る。該技術には、合成、好ましくは、例えば、エリス
ら、ネイチャー(Ｅllis et al．,Ｎature)、第３０２
巻、５３６頁(１９８３)に開示されている様なメッセン
ジャーＲＮＡの逆転写により、熱帯熱マラリア原虫から
得られるものによるか、または、前記デイムら(Ｄame
et al)により開示されている様な、熱帯熱マラリア原
虫ゲノムＤＮＡから得られる完全な遺伝子の直接的クロ
ーニングによるものが挙げられる。図面に、ＣＳタンパ
ク質コーディング領域を示す。熱帯熱マラリア原虫およ
びそのスポロゾイトは、感染したヒトおよび蚊より得る
ことができる。ＣＳタンパク質の全部または一部に対す
るコーディング配列をクローンし、重複単位の全部また
は一部をコードするそのサブフラグメントを、公知の技
術により調製することができる。図１に、ＣＳタンパク
質遺伝子内の選択された有用な制限サイトを示す。好ま
しいサイトはＸhoＩＩサイトである。ＸhoＩＩで切断す
ると、次に示す１６重複のコーディング配列が得られ
る: Ｎ−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａsn−Ｖ
al−Ａsp−Ｐro)₁]nＣ[式中、nは１である] 適当な配列の多重タンデムＸhoＩＩフラグメントを用い
ることにより、さらに長い重複、即ち、nが１以上であ
る重複が得られる。

【００１０】合成技術は公知であり、かつ、商業的に入
手可能なＤＮＡ合成装置を用いて達成することができ
る。実質的に同じアミノ酸に関するコドンを有し、同じ
ＸhoＩＩ末端または末端に異なる開裂サイトを有する合
成オリゴヌクレオチドを合成することができる。かかる
合成オリゴヌクレオチドは、天然の６４コドンと異なっ
てもよく、同じアミノ酸、または少数の、好ましくは約
８末端の異なるアミノ酸をコードし得る。ただし、これ
らはポリペプチドの免疫防御性に著しく悪影響を及ぼさ
ないものとする。典型的な合成コーディング配列は、完
全に、共通塩基配列、(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)n(式
中、nは少なくとも４である)をコードする。

【００１１】ポリペプチドのコーディング配列は、いか
なるイー・コリ発現ベクターにも挿入することができ、
その多くは公知であり、かつ入手可能である。イー・コ
リにおける本発明のポリペプチドの高レベルの発現は、
生成物の異常なアミノ酸組成(アスパラギン(Ａsn)約５
０％、アラニン(Ａla)２５％、プロリン(Ｐro)２５％)
の観点から、驚異的である。さらに以下に記載する様
に、プラスミドpＡＳ１に含まれる様な、λ−ＰＬプロ
モーターおよびλ−cＩＩリボソーム結合サイトからな
る調節エレメントを用いて、コーディング配列がよく発
現されることが判明している[ローゼンベルクら、メソ
ッズ・オブ・エンザイモロジー(Ｒosenberget al．,Ｍ
eth．Ｅnzym．)、第１０１巻、１２３頁(１９８３)およ
びシャッツマンら、エクスペリメンタル・マニピュレイ
ション・オブ・ジーン・エクスプレッション、エム・イ
ノウエ編、アカデミックプレス、ニューヨーク(Ｓhatzm
anet al．,in Ｅxperimental Ｍanipulation of g
ene Ｅxpression,edit．by Ｍ．Ｉnouye．Ａcaremic
Ｐress,Ｎew Ｙork)(１９８２)参照]。pＡＳ１は、p
ＢＲ３２２複製開始点、アンピシリン耐性マーカーおよ
びＰＬ、Ｎ抗停止機能認識サイト(ＮutＬおよびＮut
Ｒ)、ρ−依存性転写停止シグナル(tＲ１)およびＧ残基
が直接ＢamＨＩ開裂サイトにつながっているcＩＩ翻訳
開始サイトを含むcＩＩリボソーム結合サイトを含むλ
由来の一連のフラグメントを担う。pＡＳ１は、pＫＣ３
０cＩＩから、pＫＣ３０cＩＩのcＩＩ−pＢＲ３２２結
合のＢamＨＩサイトおよびcＩＩＡＴＧ間のヌクレオチ
ドを切除し、該分子を再結紮して、ＡＴＧのすぐ下流に
ＢamＨＩサイトを再生することにより得ることができ
る。

【００１２】pＫＣ３０cＩＩは、pＫＣ３０のＨpaＩサ
イトに、cＩＩ遺伝子を担うλ由来の１．３kb ＨaeＩ
ＩＩフラグメントを挿入することにより組立てることが
できる(前記シャッツマンら(Ｓhatzman et al．)およ
び前記ローゼンベルクら(Ｒosenberg et al．)参
照)。pＫＣ３０は、シミタケら、ネイチャー(Ｓhimitak
e et al．,Ｎature)、第２９２巻、１２８頁(１９８
１)により記載されている。これは、pＢＲ３２２のtet
Ｒ遺伝子のＨindＩＩＩおよびＢamＨＩサイト間に挿入
されたλの２．４kb ＨindＩＩＩ−ＢamＨＩフラグメ
ントを有するpＢＲ３２２誘導体である。pＡＳ１に類似
した構造は、コートニーら、ネイチャー(Ｃourtney et
al．,Ｎature)、第３１３巻、１４９頁(１９８５)に
記載されている。pＡＳ１は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション(Ａmerican Ｔype Ｃulture
Ｃollection,Ｒockville,Ｍaryland)に、ブダペスト条
約に従って寄託されている。コーディング配列は、有効
に、即ち、適当な配列で、適当な解読フレーム中に、イ
ー・コリ発現ベクターの調節エレメントに、標準的技術
により結合され、本発明の発現ベクターを形成する。

【００１３】この様に発現されたポリペプチドを、公知
の標準的タンパク質単離技術により、増殖培養株から単
離精製する。典型的な、有用な一連の精製反応は、１)
細胞の破壊、２)細胞片の清澄化、３)本発明のポリペプ
チドの、清澄化細胞抽出物中に存在する他のポリペプチ
ドからの分離、４)残存ポリペプチド、炭水化物、核酸
および／またはリポポリサッカライドを含む残存する汚
染物質を除去するための最終精製からなる。第１工程
は、例えば、リソゾームまたは他の溶解または浸透化剤
を添加するか、あるいは機械的または超音波破壊により
達成することができる。抽出物を清澄化するための遠心
操作または濾過の前に、界面活性剤を添加して、本発明
のポリペプチドを溶液状態に保つ。

【００１４】本発明の一態様としては、本発明のある種
のポリペプチドは、清澄化した抽出物を、タンパク質の
溶解性を維持するために界面活性剤を添加した後、約８
０℃に加熱することにより、他のポリペプチドから非常
に効率よく分離できることが判明した。少なくとも約４
分間８０℃に加熱することにより、実質的に重複または
他の非熱変性配列と融合した重複からなるポリペプチド
を変性させることなく殆ど全ての細菌性ポリペプチドを
沈澱させられることが判明した。変性した細菌性ポリペ
プチドは、遠心操作によりペレット化し、除去すること
ができる。この操作は、Ｒtet₃₂、ＲＧ、ＲＬＡおよび
Ｒtet₈₆ポリペプチドを精製するのに用いられる。特
に、この操作は、以下の実施例に記載の如く、Ｒ１６te
t₃₂、Ｒ３２tet₃₂、Ｒ４８tet₃₂、Ｒ６４tet₃₂、Ｒ４８
Ｇ、Ｒ３２ＬＡおよびＲ１６tet₈₆をうまく精製するの
に用いられるが、Ｒ１６ＮＳ１およびＲ３２ＮＳ１を加
熱すると、これらのポリペプチドは沈澱する。例えば、
選択的沈澱剤を添加し、次いでイオン交換クロマトグラ
フィーまたは逆相ＨＰＬＣ等の仕上クロマトグラフィー
工程により、本発明のポリペプチドをさらに精製するこ
とができる。

【００１５】本発明で得られたポリペプチドを使用する
ワクチンにおいて、好ましくは生理的pＨに緩衝された
本発明のポリペプチドの水性溶液を直接用いることがで
きる。あるいは、通常の凍結乾燥を施したか、またはし
ていないポリペプチドを、いかなる各種公知のアジュバ
ントと混合あるいは吸着させることができる。かかるア
ジュジントとしては、とりわけ水酸化アルミニウム、ム
ラミルジペプチドおよびＱuil Ａ等のサポニンが挙げ
られる。別の変法例として、ポリペプチドをリポソーム
等の微粒子中に封入することができる。さらに別法例と
して、死菌百日咳(Ｂordetella)または破傷風トキソイ
ド等の免疫刺激性高分子に接合することができる。ワク
チンの調製は、一般的に、「ワクチンにおける新傾向お
よび発展」ポーラーら編、ユニバシティー・パーク・プ
レス(Ｎew Ｔrends and Ｄevelopementsin Ｖaccin
es,edited by Ｖoller et al．,Ｕniversity Ｐar
k Ｐress.Baltimore,Ｍaryland．Ｕ．Ｓ．Ａ)、(１９
７８)に記載されている。リポソーム中への封入は、例
えば、フュラートン(Ｆullerton)、米国特許第４２３５
８７７号に記載されている。タンパク質の高分子への接
合は、例えばリクハイト(Ｌikhite)、米国特許第４３７
２９４５号およびアーモーら(armor et al．)、米国
特許第４４７４７５７号により開示されている。Ｑuil
Ａの使用は、例えばダルスガードら、アクタ・ベテリ
ナリア・スカンジナビカ(Ｄalsgaard et al．,Ａct
a．Ｖet．Ｓcand．)、第１８巻、３４９頁、(１９７７)
に開示されている。

【００１６】各ワクチン投与量中に存在するポリペプチ
ドの量は、典型的なワクチンにおける著しく有害な副作
用なしに免疫防御応答を惹起する量として選択される。
かかる量は、どのポリペプチドを用いるか、およびワク
チンにアジュバントが添加されているか否かによって異
なる。一般に、各投与量はポリペプチドを１〜１０００
μg、好ましくは、１０〜２００μg含有する。特定のワ
クチンに対する最適量は、抗体力価および患者における
他の応答の観察を含めた標準的考察により確かめること
ができる。第１回接種の後、患者は好ましくは約４週間
後に追加抗原投与を受け、その後、感染の危険性が存在
するかぎり、６カ月毎に追加抗原投与を繰返し受ける。

【００１７】

【実施例】以下の実施例で本発明を説明するが、これに
限定されるものではない。ＣＳタンパク質コーディング
配列は、ジェームズ・ウェーバー、ウォルター・リード
・アーミー・インスティチュート・フォア・リサーチ
(Ｊames Ｗeber,ＷalterＲeed Ａrmy Ｉnstitute f
or Ｒesearch)により、pＵＣ８(標準的なイー・コリク
ローニングベクター(例えば、ベゼスダ・リサーチ・ラ
ボラトリーズ・インコーポレイテッド(Ｂethesda Ｒes
earch Ｌaboratories,Ｉnc．Ｇaithersburg,ＭＤ)より
入手可能)のＥcoＲＩサイトにおけるλmＰＦ１(前記デ
イムら(Ｄame et al．)参照)の２３３７bp ＥcoＲＩ
フラグメント(図１参照)として得た。得られたpＵＣ８
誘導体は、pＵＣ８クローン１と称する。

【００１８】実施例１ＣＳタンパク質誘導体精製したpＵＣ８クローン１プラスミドＤＮＡ４０μgを
培地緩衝液(５０mＭトリス、pＨ７．５５０mＭＮa
Ｃl、１mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)、１０mＭＭg
Ｃl₂)４００μl中制限エンドヌクレアーゼＳtuＩおよび
ＲsaＩ(各酵素、それぞれ１００単位)で３７℃にて１．
５時間消化する。ＣＳタンパク質のはじめの１８アミノ
酸以外をコードする得られた１２１６塩基対フラグメン
トを、５％ポリアクリルアミドゲル(ＰＡＧＥ)上での電
気泳動により単離する。発現ベクターpＡＳ１１０μg
を、培地緩衝液２００μl中制限エンドヌクレアーゼＢa
mＨＩ２５単位で、３７℃にて１．５時間消化する。切
断されたプラスミドを、次いでＤＮＡポリメラーゼ大フ
ラグメントで処理し(クレノウ５単位;２０mＭトリス−
ＨＣl、pＨ７．５、７mＭＭgＣl₂、６０mＭＮaＣ
l、５mＭ２−メルカプトエタノールおよび各０．２５m
Ｍの４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート;２
５℃、１５分)、ＢamＨＩサイトの末端をうめる。ＣＳ
遺伝子フラグメント１μgを次いで３０μlリガーゼバッ
ファー(５０mＭトリス、pＨ７．５、１mＭＤＴＴ、１０
mＭＭgＣl₂、１００μＭ rＡＴＰ)中、１単位のＴ４
−ＤＮＡリガーゼで４℃にて１６時間、このベクター１
００ngに結紮する。該結紮混合物をイー・コリＭＭ２９
４ＣＩ＋株に形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを
得、ＣＳ遺伝子フラグメントのpＡＳ１中への挿入に関
してスクリーンする。適正な構造を有するプラスミド(p
ＣＳＰ)を同定し、イー・コリＮ５１５１株(cＩts８５
７)に形質転換し、完全なＣＳタンパク質の発現に関し
てテストする。(タンパク質のアミノ末端での１８アミ
ノ酸の欠失は、真正ＣＳタンパク質の開裂シグナルペプ
チドに対応する。)細胞を、ルリア・ベルタニ・ブロス
(ＬＢ)中で３２℃にて６５０nmでの吸収(Ａ₆₅₀)が０．
６となる様に増殖させ、２時間４２℃で発現プラスミド
のＰＬプロモーターの転写およびその結果ＣＳタンパク
質誘導体の翻訳が起こる。細胞の１mlをサンプルにと
り、ペレット化し、溶解緩衝液(１０mＭトリス−ＨＣ
l、pＨ７．８、２５％(v／v)グリセロール、２％２−メ
ルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム(Ｓ
ＤＳ)、０．１％ブロモフェニルブルー)中に再懸濁し、
１０５℃加熱ブロック中で５分間インキュベートする。
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１３％アクリルアミド
３０:０．８アクリルアミド:ビスアクリルアミド比)に
より分離する。タンパク質をニトロセルロースに移し、
イー・コリにおいて産生されたＣＳタンパク質を、熱帯
熱マラリア原虫ＣＳタンパク質のテトラペプチド重複領
域と反応性の５つのモノクローナル抗体のプールを用い
て、ウエスタンプロット分析により検出する(前記デイ
ムら(Ｄameet al．)参照)。

【００１９】実施例２Ｒ１６tet₈₆ 精製したpＵＣ８クローン１プラスミド１００μgを培地
緩衝液４００μl中、制限エンドヌクレアーゼＸhoＩＩ
４０単位で３７℃にて、１６時間消化する。ＣＳタンパ
ク質の１６テトラペプチド重複をコードづける１９２塩
基対フラグメントを次いでＰＡＧＥにより単離する。発
現ベクターpＡＳ１を実施例１に記載したのと同様にし
て制限エンドヌクレアーゼＢamＨＩで開裂させる。実施
例１に記載したのと同様にして、１９２塩基対のＸhoＩ
Ｉフラグメント１μgをpＡＳ１１００ngのＢamＨＩサイ
トに結紮する。結紮ミックスをイー・コリＭＭ２９４Ｃ
Ｉ＋株に形質転換する。クローンは、該プラスミドのＢ
amＨＩ−ＨindＩＩフラグメントのポリアクリルアミド
ゲル電気泳動分析によりpＡＳ１のＢamＨＩサイトで適
正な配列である１９２塩基対のＸhoＩＩフラグメントを
含有し、ＨindＩＩサイトがtetＲ遺伝子の下流であり、
ＢamＨＩサイトがcＩＩＡＴＧおよび適正な配列のプラ
スミドの挿入部の結合点にあるものと同定される。この
プラスミドpＲ１６tet₈₆は、次の様に表される:

【００２０】 pＲＢ３２２ＰＬ重複 tetＲ pＢＲ３２２・・・・・・ＢＨＢＢ

【００２１】(図中、ＢＨはＢamＨＩサイトを意味し、
ＢはＢanＨＩＩサイト、Ｓは終止コドンを意味する)。p
Ｒ１６tet₈₆は、イー・コリＮ５１５１株(cＩts８５７)
を形質転換するのに用いられ、ウエスタン・ブロック分
析によりＣＳタンパク質のテトラペプチド重複の産生に
関して調べる。この様にして産生されたタンパク質は、
次の様な配列を有する: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａs
n−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁Ｔ８６−Ｃ (式中、Ｔ８６はpＡＳ１上に存在するテトラサイクリン
耐性遺伝子由来の８６アミノ酸である)。Ｎ−末端メチ
オニン(Ｍet)残基も、ベクター、より詳しくは、cＩＩ
タンパク質開始コドン由来である。

【００２２】実施例２ＡＲ３２tet₈₆およびＲ４８tet₈₆ 精製したpＲ１６tet₈₆プラスミドＤＮＡ１０μgを培地
緩衝液２００μl中ＢamＨＩ２５単位で３７℃にて２時
間、消化する。このＤＮＡ１００ngを次いで前記と同様
にして、１９２塩基対のＸhoＩＩフラグメント１μgと
結紮する。次のポリペプチドをコードするプラスミド発
現ベクター、pＲ３２tet₈₆およびpＲ４８tet₈₆を調製
し、イー・コリにおいて発現させる: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｔ８６−Ｃ (式中、nは２(Ｒ３２tet₈₆)またはnは３(Ｒ４８tet₈₆)
である。)nが２または３であるpＡＳ１クローンは、前
記と同様にして、各々nが２または３以外であるクロー
ンから選択される。調べた全てのクローンは、適正な配
列の挿入部を有していた。Ｒ３２tet₈₆およびＲ４８tet
₈₆は両方とも、イムノブロッティングにより評価される
如く、Ｒ１６tet₈₆とほぼ同じレベルで発現される。数
種のＲtet₈₆タンパク質のイムノブロット分析により、
クーマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５０染色によ
り見られない不均一な生成物があることが示される。こ
れらのタンパク質は、以下に記載の如くＲtet₃₂ポリペ
プチドのおよそ半量まで蓄積されると考えられる。最小
の分解生成物の大きさは、クローン中のテトラペプチド
重複の数に比例する。これらのタンパク質の不安定性
は、不均質ＣＯＯＨ末端の低下による。

【００２３】実施例３Ｒ１６tet₃₂ 精製したpＲ１６tet₈₆ＤＮＡ１０μgを培地緩衝液２０
０μl中制限エンドヌクレアーゼＢanＩＩ２５単位で、
３７℃にて２時間で切断する。切断したＤＮＡ１００ng
を次いで結紮する。この操作により１４塩基対のＢanＩ
Ｉフラグメントが欠失し、残存するＢanＩＩサイトのす
ぐ下流に終止コドンが生じる。得られたプラスミドpＲ
１６tet₃₂を用いてイー・コリＮ５１５１株においてＲ
１６tet₃₂を発展させ、Ｒ１６tet₃₂をこれから精製す
る。Ｒ１６tet₃₂を含有するイー・コリ３０g(湿潤重量)
を緩衝液Ａ(５０mＭトリスＨＣl、pＨ８．０、２mＭエ
チレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、０．１mＭジチオト
レイトール、５％(v／v)グリセロール)２００ml中に再
懸濁させる。リツゾイムを添加して最終濃度を０．２mg
／mlにし、該混合物を氷上で３０分間インキュベート
し、細胞を溶解させる。該混合物を次いでワーリングブ
レンダー中、最高値にセットして３分間処理し、次いで
ブランソン３５０超音波装置で１分間超音波処理するこ
とにより、微生物ＤＮＡを除去する。デオキシコール酸
ナトリウムを添加して最終濃度を０．１％(w／v)にし、
この混合物を４℃にて３０分間撹拌する。該懸濁液を次
いで１２０００×gで３０分間遠心操作に付し、細胞片
を除去する。上清をフラスコ中に集め、沸騰水浴中で１
０分間インキュベートし、１２０００×gで３０分間遠
心分離する。殆ど全てのイー・コリタンパク質が、加熱
工程中に沈澱し、遠心操作中にペレット化され、一方、
Ｒ１６tet₃₂タンパク質は溶解性で、上清中に含まれ
る。上清を集め、次いで硫酸アルミニウムをゆっくり添
加して、最終濃度を飽和状態の２０％とする。これによ
り、Ｒ１６tet₃₂タンパク質が選択的に沈澱し、これを
遠心操作(１２０００×gで３０分間)により集める。こ
の時点で、Ｒ１６tet₃₂は、他の汚染バクテリアタンパ
ク質に関して約９５％純粋である。最終クロマトグラフ
ィー工程(例えば、イオン交換、逆相高速液体クロマト
グラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィ
ー、サイズ・セパレーション等)を行い、タンパク質、
炭水化物、核酸またはリポポリサッカライド等の他の物
質による残存する汚染物質を除去する。Ｒ１６tet₃₂を
発現させ、イー・コリタンパク質全体の５％にほぼ等し
いレベル、即ち、フーマシーブルー染色により示される
様な、約３６〜６０mg／リットルで精製する。

【００２４】Ｒ１６tet₃₂は次に示す配列を有する: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]nＴ３２−Ｃ (式中、nは１、Ｔ３２はテトラサイクリン耐性遺伝子由
来の３２アミノ酸である。)さらに詳しくは、Ｔ３２
は、次の様に配列: −Ｌeu−Ａrg−Ａrg−Ｔhr−Ｈis−Ａrg−Ｇly−Ａrg−
Ｈis−Ｈis−Ａrg−Ａrg−Ｈis−Ａrg−Ｃys−Ｇly−Ｃ
ys−Ｔrp−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ａrg−Ａrg−Ｈis−Ｈis
−Ａrg−Ｔrp−Ｇly−Ａrg−Ｓer−Ｇly−Ｓer−Ｃを有し、残存するＢanＩＩサイトは、３０および３１残
基の間にある。

【００２５】実施例３ＡＲ３２tet₃₂、Ｒ４８tet₃₂ 前記実施例３と実質的に同様にして、Ｒ３２tet₃₂およ
びＲ４８tet₃₂(各々、Ｒ１６tet₃₂においてnが２および
３である)をイー・コリにおいて発現させ、Ｒ１６tet₃₂
と同じレベルおよび程度の純度に単離する。出発ベクタ
ーは、各々、pＲ３２tet₈₆およびpＲ４８tet₈₆である。

【００２６】実施例３ＢＲ６４tet₃₂、Ｒ８０tet₃₂ 精製したpＲ４８tet₃₂プラスミドＤＮＡ１０μgを培地
緩衝液２００μl中ＢamＨＩ２５単位で、３７℃にて２
時間消化する。このＤＮＡ１００ngを次いで前記と同様
にして、１９２塩基対のＸhoＩＩフラグメント１μgと
結紮する。次に示すポリペプチドをコードするプラスミ
ド発現ベクターを調製し、イー・コリにおいて発現させ
る。Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｔ３２−Ｃ (式中、nは４(Ｒ６４tet₃₂)またはnは５(Ｒ８０tet₃₂)
である)。nが４または５であるpＡＳ１クローンを、前
記と同様にして、各々、nが４または５以外であるクロ
ーンから選択する。Ｒ６４tet₃₂およびＲ８０tet₃₂は両
方ともＲ４８tet₃₂とほぼ同じレベルで発現する。Ｒ６
４tet₃₂を、前記Ｒ１６tet₃₂、Ｒ３２tet₃₂およびＲ４
８tet₃₂と実質的に同じ方法で精製する。

【００２７】実施例３ＣＲ９６tet₃₂およびＲ１１２tet₃₂ 前記実施例３Ｂに記載したのと実質的に同様にして、Ｒ
９６tet₃₂およびＲ１１２tet₃₂(各々、nは６および７で
ある)をＲ４８tet₃₂とほぼ同じレベルでイー・コリにお
いて発現させる。出発ベクターはpＲ８０tet₃₂である。
イムノブロット分析により、精製したＲtet₃₂ポリペプ
チドにおいて、いくぶん不均一性がみられるが、バンド
に対応する主要な反応性種がタンパク質染色により見ら
れる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって得られる分子量は、予
想値の約２倍であるが、各タンパク質の移動は、各構造
中のテトラペプチドの数に比例する。数種のＲtet₃₂ポ
リペプチドに関するアミノ酸組成決定は、予想通りの値
を示す。

【００２８】実施例４Ｒ１６Ｇ pＴermは、配列: ５'−ＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡ
−３' ３'− ＧＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＴ
ＡＧ −５' を有する合成リンカーを、pＡＳ１のＢamＨＩサイトに
挿入することにより調製される。pＡＳ１１０μgを２
５単位のＢamＨＩで消化する。１００ngのＢamＨＩ切断
pＡＳ１を２０ngの合成リンカーと結紮し、プラスミドp
ＴermをpＡＳ１のＢamＨＩサイトに挿入されたリンカー
で同定する。このベクターはＢamＨＩサイトを有し、全
ての３種の解読フレーム中にcＩＩタンパク質のＡＴＧ
開始コドンの下流にＴＧＡ終止コドンが挿入される。p
Ｇ１６Ｇは、pＵＣ８クローン１由来の１９２塩基対の
ＸhoＩＩフラグメントをpＴermのＢamＨＩサイトに挿入
することにより調製し、適正な配列の１つのＸhoＩＩ挿
入部を有するクローンを、実質的に前記と同様にして選
択する。実質的に前記と同様にして、pＲ１６Ｇをクロ
ーン化し、イー・コリＮ５１５１株において発現させ
る。Ｒ１６Ｇは、次に示す配列を有する: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−gly−Ｃ (式中、nは１である)。このタンパク質は芳香族残基を
含有していないので、発現レベルを定量化するクーマシ
ーブリリアントブルーＲ−２５０染色法によって視覚化
することができない。ＣＳタンパク質に関して特異的な
５種のモノクローナル抗体を用いたイムノブロット分析
(前記デイムら(Ｄame et al．)参照)により、クーマ
シーブリリアントブルーＲ−２５０染色が可能なＲ１６
tet₃₂と比較して評価したレヘルは、全細胞タンパク質
の約１％である。

【００２９】実施例４ＡＲ３２Ｇ、Ｒ４８Ｇ、Ｒ６４Ｇ、Ｒ８０ＧおよびＲ１１
２Ｇ前記実施例４と同様にして、Ｒ３２Ｇ、Ｒ４８Ｇ、Ｒ６
４Ｇ、Ｒ８０ＧおよびＲ１１２Ｇ(Ｒ１６Ｇにおいて各
々、nが２、３、４、５または７である)をイー・コリＮ
５１５１株において発現させる。これらのポリペプチド
は、Ｒ１６Ｇとほぼ同じレベルで発現される。実質的に
実施例３に記載したのと同様にして、Ｒ４８Ｇを精製す
る。

【００３０】実施例５Ｒ１６ＬＡおよびＲ３２ＬＡ実質的に実施例４に記載したのと同様にして、配列: ５'−ＧＡＴＣＣＧＣＴＧＣＧＴＴ −３' ３'− ＧＣＧＡＣＧＣＡＡＣＴＡＧ−５’ を有する合成リンカーをｐＡＳ１のＢamＨＩサイトに挿
入することによりpＴerm２を調製する。pＴerm２はＢam
ＨＩサイトを有する。pＵＣ８クローン１由来の１９２
塩基対のＸhoＩＩフラグメントを前記と同様にして挿入
する。各々、適正な配列の１種または２種のＸhoＩＩ挿
入部を有するクローンであるpＲ１６ＬＡおよびpＲ３２
ＬＡを、実質的に前記と同様にして選択する。実質的に
実施例３に記載したのと同様にして、Ｒ３２ＬＡを精製
する。実質的に前記と同様にして、pＲ１６ＬＡおよびp
Ｒ３２ＬＡをクローン化し、イー・コリＮ５１５１株に
おいて発現させる。Ｒ１６ＬＡおよびＲ３２ＬＡは次の
配列を有する: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｌeu−Ａrg−Ｃ (式中、nは、各々、１および２である)。Ｃ末端のロイ
シンおよびアルギニンは、pＴerm２の合成リンカー由来
のものである。Ｒ１６ＬＡは全イー・コリタンパク質の
約１％で発現され、一方、Ｒ３２ＬＡは、全細胞タンパ
ク質の約５％で発現される。

【００３１】実施例６Ｒ１６ＮＳ１ pＡＳ１デルタＥＨは、pＡＳ１起源のpＢＲ３２２の必
須でないＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩ領域の切除により調製
される。実質的に前記と同様にして、１０μgのpＡＳ１
を、培地緩衝液２００μl中ＥcoＲＩおよびＨindＩＩＩ
(各々、２０単位)で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ(クレ
ノウ)で処理し、結紮し、イー・コリ中に形質転換す
る。２９塩基対のＥcoＲＩ−ＨindＩＩＩフラグメント
が欠失したクローンを同定する。８６１塩基対のビール
ス原および３７５塩基対のpＢＲ３２２原中にインフル
エンザビールス(Ａ／ＰＲ／８／３４)ＮＳ１コーディン
グ領域を含有するpＡＰＲ８０１の１２３６塩基対のＢa
mＨＩフラグメント(ヤングら、プロシーディングズ・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユ
ー・エス・エイ(Ｙoung et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．Ｕ．Ｓ．Ａ)、第８０巻、６１０５頁(１９８
３)参照)を、pＡＳ１デルタＥＨのＢamＨＩサイトに挿
入する。得られたプラスミド、pＡＳ１デルタＥＨ／８
０１は真正のＮＳ１(２３０アミノ酸)を発現する。この
プラスミドは、cＩＩ翻訳開始サイトおよびＮＳ１コー
ディング配列間にＢamＨＩサイトを有する。実質的に前
記と同様にして、pＡＳ１デルタＥＨ／８０１１０μg
を、ハイ・バッファー(５０mＭトリス・ＨＣl、pＨ７．
５、１mＭＤＴＴ、１０mＭＭgＣl₂、１００mＭＮ
aＣl)２００μl中ＥcoＲＩ２０単位およびＳalＩ２０単
位で、３７℃にて２時間で切断し、ＤＮＡポリメラーゼ
大フラグメント(クレノウ)で処理し、結紮する。６５０
塩基対のＥcoＲＩ−ＳalＩ領域が欠失したクローンを単
離する。このプラスミド、pＮＳ１デルタＥＳは真正の
ＮＳ１を発現する。pＵＣ８クローン１由来の１９２塩
基対のＸhoＩＩフラグメントをpＮＳ１デルタＥＳ中の
ＢamＨＩサイト中に挿入することによりpＲ１６ＮＳ１
を調製し、実質的に前記と同様にして、適正な配列の１
つのＸhoＩＩ挿入部を有するクローンを選択する。煮沸
工程を除いて、実質的に前記と同様にして、pＲ１６Ｎ
Ｓ１をクローンし、イー・コリにおいて発現し、Ｒ１６
ＮＳ１を精製する。Ｒ１６ＮＳ１は、次の配列を有す
る: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｎ２２７ (式中、n−１、Ｎ２２７は、ＮＳ１起源の２２７アミノ
酸である)。Ｒ１６ＮＳ１調製におけるＲ１６ＮＳ１
は、煮沸またはイオン交換工程なしで、タンパク質の８
０％以上と評価された。特に著しく高い比率を示すＲ１
６ＮＳ１は、総細胞タンパク質の約２５％である。

【００３２】実施例６ＡＲ３２ＮＳ１、Ｒ４８ＮＳ１およびＲ６４ＮＳ１煮沸工程を除いて、実質的に実施例３に記載したのと同
様にして、Ｒ３２ＮＳ１(Ｒ１６ＮＳ１においてnが２で
ある)をイー・コリにおいて発現し、イー・コリから精
製する。Ｒ３２ＮＳ１はＲ１６ＮＳ１とほぼ同じレベル
で発現され、同じ程度まで精製する。実質的に前記と同
様にして、Ｒ４８ＮＳ１(Ｒ１６ＮＳ１においてnが３で
ある)およびＲ６４ＮＳ１(Ｒ１６ＮＳ１においてnが４
である)をイー・コリにおいて発現させる。Ｒ４８ＮＳ
１およびＲ６４ＮＳ１は、各々、総イー・コリタンパク
質の約１０％および約５％で発現する。

【００３３】実施例７ＮＳ１Ｒ４８実質的に前記と同様にして、pＲ４８tet₈₆をＢamＨＩで
開裂させ、ＤＮＡポリメラーゼ(クレノウ)で末端をうめ
る。プラスミドを次いで前記の如くＢanＩＩで開裂さ
せ、３つのＸhoＩＩフラグメントを担う６７２塩基対の
フラグメントおよびテトラサイクリン耐性遺伝子由来の
９６塩基対を得る。実質的に前記と同様にして、１０μ
gのpＡＳ１デルタＥＨ／８０１をハイバッファー２００
μl中ＮcoＩ２０単位で３７℃にて２時間で切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ大フラグメント(クレノウ)で末端をう
める。ＮcoＩサイトは、ＮＳ１中の８１残基に関するコ
ドン中にある。プラスミドを次いで前記の如くＢanＩＩ
切断して残存するＮＳ１コドンおよびテトラサイクリン
耐性遺伝子の一部を切除し、pＡＳ１デルタＥＨ／８０
１−１を得る。６７２塩基対のＢamＨＩ(末端をうめた
もの)−ＢanＩＩフラグメントをpＡＳ１デルタＥＨ／８
０１−１に挿入してpＮＳ１Ｒ４８を調製する。このプ
ラスミドを実質的に前記と同様にして、イー・コリにお
いて発現させる。ＮＳ１Ｒ４８は、次の配列を有する: Ｎ−８１Ｎ−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)
₁₅(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｔ３２−Ｃ (式中、８１ＮはＮＳ１の８１Ｎ末端アミノ酸、nは３、
Ｔ３２は前記のとおりである)。ＮＳ１Ｒ４８は総細胞
タンパク質の約５％で発現される。

【００３４】実施例８Ｒ３２Ｎ実質的に前記と同様にして、１０μgのpＲ３２ＮＳ１を
培地緩衝液２００μｌ中ＨｉｎｄＩＩＩ２５単位で３７
℃にて２時間で切断し、pＲ３２ＮＳ１−１を得る。Ｈi
ndＩＩＩサイトはＮＳ１コーディング領域中の残基５に
関するコドン中にある。pＲ３２ＮＳ１−１１００ng
を次いで実質的に前記と同様にして結紮する。得られた
プラスミド、pＲ３２Ｎは、ＮＳ１コーディング配列に
おいて、５番目のコドンの後にＴＡＡ終止コドンを含有
する。pＲ３２Ｎは、実質的に前記と同様にしてイー・
コリにおいてＲ３２Ｎを発現するのに用いる。Ｒ３２Ｎ
は、次の配列を有する: Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｎ５−Ｃ (式中、nは２、Ｎ５はＮＳ１遺伝子由来の５つのアミノ
酸である)。さらに詳しくは、Ｎ５は、次の配列を有す
る: −Ａsn−Ｔhr−Ｖal−Ｓer−Ｓer−ＣＲ３２Ｎは総イー・コリタンパク質の約５％で発現され
る。

【００３５】実施例９抗体応答−ＥＬＩＳＡ組換タンパク質Ｒ１６tet₃₂、Ｒ３２tet₃₂およびＲ４８
tet₃₂を実質的に前記と同様にして精製し、０．０１Ｍ
リン酸緩衝生理食塩水pＨ７．０(ＰＢＳ)に対して透析
し、アリコートをとり、−８０℃にて貯蔵する。構築物
を、ＰＢＳ、水酸化アルミニウム(明バン)または完全フ
ロインドアジュバント(ＣＦＡ)のいずれかと混合して、
５０μgのタンパク質を含有する０．５mlの投与量を得
る。ＰＢＳ中ＣＦＡ(ＧＩＢＣＯ、Ｇrand Ｉsland、Ｎ
ewＹork)＋抗原を１:１の比で、機械的撹拌機で３０分
間撹拌することにより乳濁化させる。明バンをＰＢＳ中
に希釈した水酸化アルミニウムゲル(ＵＳＰ)から調製す
る。４℃にて１２時間回転式混合機で、抗原は明バンに
吸着される。該懸濁液をさらに１２時間静置し、上清を
廃棄して、１投与量につきＡl０．８０mgおよび組換タ
ンパク質５０μgを得る。６〜８週令のＣ５７Ｂ１／６
マウスを総量５０μgのタンパク質を皮下投与および腹
腔内投与により免疫化する(１群につき５匹)。被験動物
に、第一回注射と同じ方法に従って、初期免疫化の４週
間後に追加抗原投与をする。ただし、ＣＦＡ中免疫原を
受けた群には、不完全フロインドアジュバント(ＩＦＡ)
中乳濁化したタンパク質で追加抗原投与を行う。１週間
後、尾から採取した血を全部ため、一夜４℃にて凝固さ
せ、遠心操作に付して血清を分離する。この血清を必要
になるまで−８０℃にて保存する。

【００３６】固相酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)を用い
て、熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク質(Ａsn−Ａla−
Ａsn−Ｐro)₄の４つの重複からなる１６アミノ酸合成ペ
プチドとの反応性に関して、全ての血清をテストする
(デイムら、サイエンス(Ｄameet al．,Ｓcience)、第
２２５巻、５９３頁(１９８４)参照)。合成ペプチド抗
原を牛血清アルブミン(ＢＳＡ)と結合させ、これをマイ
クロタイタープレートの孔に塗布する。０．０１Ｍリン
酸緩衝生理食塩水pＨ７．４(ＰＢＳ)で希釈したスクリ
ーニング抗原５０μl(０．１μg)をポリスチレンマイク
ロタイタープレート(イムンロン２ダイナテク・ラボ
ラトリーズ(Ｉmmunlon２Ｄynatech Ｌaboratories,
Ａlexandria,ＶＡ)のくぼみにピペットで添加し、一夜
室温(約２２℃)(ＲＴ)に保つ。孔内容物を次いで、吸引
し、ブロッキングバッファー(ＢＢ＝ＰＢＳ中１．０％
ＢＳＡ、０．５％カゼイン、０．００５％チメルソール
および０．０００５％フェノールレッド)を充填し、１
時間室温に保つ。マウスの血清を連続してＢＢ中に希釈
し、５０μlを各孔に添加する。室温にて２時間インキ
ュベートした後、孔を吸引し、ＰＢＳ−０．０５％ツィ
ーン２０(ＰＢＳ−ＴＷ２０)で３回洗浄し、１０％ＰＢ
Ｓ中熱不活化ヒト血清で１／５００に希釈したヤギ抗マ
ウスＩgＧ(Ｈ＋Ｌ)(バイオラドラボラトリーズ(Ｂio−
Ｒad Ｌaboratories,Ｒichmond,ＣＡ)と結合したホー
スラディッシュパーオキシダーゼ５０μlを各孔に添加
する。１時間後、孔内容物を吸引し、ＰＢＳ−ＴＷ２０
で３回洗浄し、次いで基質(１mg２,２'−アジノ−ジ−
(３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸−６)／０．１
Ｍクエン酸リン酸緩衝液、pＨ４．０ml、使用直前に
０．００５％過酸化水素を添加)を各孔に添加する。４
１４nmにおける吸収を１時間後にＥＬＩＳＡプレートリ
ーダー(ティターテク・マルチスキャン、フロー、ラボ
ラトリーズ・インコーポレイテッド(Ｔitertek Ｍulti
skan．Ｆlowlaboratories,Ｉnc．,ＭcＬean,ＶＡ))で測
定する。Ｒ１６tet₃₂、Ｒ３２tet₃₂およびＲ４８tet₃₂
構築物は、全てＥＬＩＳＡにおいて反応する抗体を産生
する。Ｒ１６tet₃₂は、単独で投与した場合、Ｒ３２tet
₃₂およびＲ４８tet₃₂に比べて免疫原性が劣る。明バン
およびＣＦＡは両方とも３種のタンパク質全部の免疫原
性を高め、抗体は、少なくとも１領域で滴定により１０
２０００検出される。

【００３７】実施例１０抗体応答−ＩＦＡ実施例９で得た抗血清は、間接免疫蛍光抗体分析(ＩＦ
Ａ)でテストし、真正熱帯熱マラリア原虫ＣＳタンパク
質と強く反応することが示された。猿マラリア原虫、シ
ノモルギマラリア原虫(Ｐ．cynomolgi)、三日熱マラリ
ア原虫(Ｐ．viva)、およびガリナケウムマラリア原虫
(Ｐ．gallinaceum)に対する抗血清の反応性は、若干、
囓歯類住血胞子虫(Ｐ．berghei)に関してみられた。こ
の結果は、ホックマイヤーら、プロシーデンクズ・サー
ド・インターナショナル・シンポジウム・オブ・イムノ
バイオロジー、プロティンズペプタイズ、アタッシ、エ
ム・ゼット編、プレナム(Ｈockmeyer et al．,in Ｐ
roc．３d Ｉnt'１．Ｓymp．Ｉmmunobiol．Ｐroteins
Ｐeptides, ed．by Ａtassi,Ｍ．Ｚ．,Ｐlenum Ｎew
Ｙork(inpress)による、熱帯熱マラリア原虫に対するあ
る種のＭabは、ＩＦＡにより、囓歯類住血胞子虫スポロ
ゾイトと反応することを示すデータと一致する。実質的
にボスワース、ジャーナル・オブ・パラシトロジィ(Ｂo
sworth、Ｊ．Ｐarasitol．)、第６１巻、７６９頁(１９
７５)に記載されているのと同様にして、スポロゾイト
を感染した蚊の唾液腺から摘出し、食塩水または０．５
％ＢＳＡを含有するＭedium１９９(ＧＩＢＣＯ)中に希
釈し、血球計算盤で計測し、２０００〜５０００スポロ
ゾイト／１０μlに希釈する。１０μlのアリコートを、
マルチウェルプリンテッドＩＦＡスライドの各孔に入
れ、室温で乾燥し、−８０℃にて保存する。

【００３８】ＩＦＡは、まず、ＢＢで１／１００に希釈
した血清２０μl容を、乾燥したスポロゾイトを入れた
ＩＦＡスライドの孔に入れることにより開始する。湿潤
室内で室温にて２０分間インキュベートした後、該血清
溶液を吸引し、スポットを２滴のＰＢＳで洗浄する。Ｂ
Ｂで１:４０に希釈したフルオレセインイソチオシアネ
ート(キルケガード・アンド・ペリー(Ｋirkegord and
Ｐery,Ｇaithersburg,ＭＤ)と接合したヤギ抗マウス抗
体２０μlを次いで各スポットに添加する。再び室温に
て２０分間インキュベートした後、該スポットを再び２
滴のＰＢＳで洗浄し、グリセロールに添加し、５００倍
のＵＶ光の下で蛍光に関して調べる。

【００３９】実施例１１ＣＳＰ反応Ｒ１６tet₃₂、Ｒ３２tet₃₂およびＲ４８tet₃₂で免疫化
したマウス由来の血清は、強いＣＳＰ陽性反応を示す
(表１参照)。アジュバントなしで投与した場合、Ｒ１６
tet₃₂だけが、陽性のＣＳＰ反応を示す抗体を産生せ
ず、一方、ＣＦＡまたは明バンとともに投与した場合、
３つの構築物は全て強いＣＳＰ反応を示す抗体を産生し
た。

【００４０】

【表１】Ｒ１６tet₃₂、Ｒ３２tet₃₂およびＲ４８tet₃₂に対する血清のＣＳＰ反応アジュバント抗血清Ｒ１６tet₃₂ Ｒ３２tet₃₂ Ｒ４８tet₃₂ なし０／２５１７／２５２１／２５（−）（２＋）（４＋）ＣＦＡ２３／２５２１／２５２１／２５（４＋）（４＋）（４＋）明バン２５／２５２５／２５１６／２７（４＋）（４＋）（２＋〜４＋）

【００４１】ＣＳＰ反応は、基本的にファンデルベルク
ら、(Ｖanderberg et al．Ｍil．Ｍed．)、第１３４
巻(補遺１)、１１８３頁(１９６９)により記載されてい
るのと同様にして行う。Ｍedium１９９中に再懸濁させ
た熱帯熱マラリア原虫５００〜１０００を含有する蚊唾
液腺スポロゾイトを、顕微鏡スライド上で血清５μlと
混合し、カバーガラスをかけ、ペトロリウムゼリーをふ
ちにつけて密封し、３７℃にて１時間インキュベートす
る。位相差顕微鏡で４００倍で反応を評価する。２５の
ランダムスポロゾイトを、各血清サンプルに関して調
べ、ＣＳＰ陽性生体の数を表に示す。前記ファンデルベ
ルクら(Ｖanderberg et al．)により記載されている
ＣＳＰ反応度を書き加えてある。(−)は、ＣＳＰ反応性
が検出されないことを示す;(２＋)は、スポロゾイトの
表面上に粒状の沈澱が見られることを示す;(４＋)は、
スポロゾイトの一端に、長い糸状フィラメントが見られ
ることを示す。正常マウス血清、およびＣＦＡのみで免
疫化したマウスから得た血清は、同様の分析で検出可能
なＣＳＰ活性を示さなかった。

【００４２】実施例１２肝臓細胞ブロッキング前記実施例９で得た血清を、in vitroでの侵入阻害分
析で調べた(表２)。これらのデータにより、Ｒ３２tet
₃₂およびＲ４８tet₃₂タンパク質はアジュバントの非存
在下でも抗体に強いブロッキング活性を惹起することが
わかる。Ｒ１６tet₃₂は、適用され明バンに吸収され
る場合は、強いブロッキング抗体の惹起にあまり有効で
ない。これは、Ｒ１６tet₃₂タンパク質に生じる抗血清
について見られる弱いＣＳＰ反応性および低いＥＬＩＳ
Ａ滴定値と一致する。

【００４３】

【表２】 in vitroの熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト侵入ＨepＧ２−Ａ１６ヘパトーム細胞の阻害アジュバント抗血清Ｒ１６Ｒ３２Ｒ４８なし４６９５９２ＣＦＡ７６９２９４明バン１００１００９６

【００４４】培養細胞のスポロゾイト侵入の阻害は、ホ
リングデイルら、ジャーナル・オブ・イムノロジイ(Ｈo
llingdale et al．,Ｊ．Ｉmmunol．)第３２巻、９０
９頁(１９８４)により記載されているのと実質的に同様
にして行なわれる。Ｒ１６tet₃₂、Ｒ３２tet₃₂およびＲ
４８tet₃₂構築物で免疫化されたマウスから得た血清
を、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトによる培養細胞の
侵入の阻害性に関してテストした。血清を培養液中に希
釈し、ＨepＧ２−Ａ１６細胞培養物に添加して、最終希
釈度を１:２０(v／v)にする。次いで１２０００〜４０
０００の蚊唾液腺熱帯熱マラリア原虫スポロゾイトを適
用した培養物を、３７℃にて５％ＣＯ₂雰囲気下で３時
間インキュベートし、Ｄulbeccoのリン酸緩衝生理食塩
水(ＰＢＳ)ですすぎ、メタノール中で凝固させて、ＰＢ
Ｓで２回洗浄する。細胞中にはいったスポロゾイトは、
免疫パーオキシダーゼ分析(ＩＰＡ)により視覚化できる
(前記ホリングデイル(Ｈollingdale et al．参照)。
ＩＰＡは、まず、固定化培養物を熱帯熱マラリア原虫に
対するＭab(２Ｆ１．１、前記デイムら(Ｄame et a
l．参照)で処理し、次いで、ホースラディッシュパーオ
キシダーゼと接合したウサギ抗マウスイムノグロブリン
とともにインキュベートし、３,３−ジアミノベンジジ
ンで染色することにより行う。培養細胞中に侵入したス
ポロゾイトの数を、ライツ(Ｌeitz)の顕微鏡で、２５０
倍で、暗青色フィルターを用いて、全調製物中に存在す
る細胞内寄生体の計測により測定する。実験は、２回ま
たは３回ずつ行い、同一の実験においては、各細胞培養
物に同数のスポロゾイトを添加する。、阻害は、正常マ
ウス血清対照例と比較した抗構築免疫血清によるスポロ
ゾイト侵入の減少率(％)であり、ＣＳ反応性Ｍab２Ｆ
１．１により、希釈度１／２０で１００％のスポロゾイ
ト侵入阻害が得られた。

【００４５】実質的に前記と同様にして調製した組換タ
ンパク質、ＲＬＡ、Ｒ１６ＮＳ１およびＲ３２ＮＳ１
を、同様にＥＬＩＳＡおよびＩＦＡ分析でテストし、同
様に、１６合成ペプチド残基と反応する抗体を惹起し、
陽性のＣＳＰ反応を示すことが判明した。Ｒ３２tet₃₂
およびＲ３２ＬＡは、その反応の均一性、発現レベルお
よび調製の容易性のために好ましい。合成的に製造した
ワクチンの第一の問題は、合成免疫原性に対して産生さ
れた抗体が真正分子を認識するかどうか、および該抗体
が防御を付与するのに十分な生物学的性質を有するかど
うかである。免疫蛍光分析およびＣＳＰ反応の両方を示
す実施例により、イー・コリ構築物に対して産生された
抗体は、スポロゾイトの表面と反応し、従って、真正Ｃ
Ｓタンパク質を認識することがわかる。ＣＳＰ抗体は動
物およびヒトにおいて存在し、防御免疫と重要な関連が
あることが判明している。抗構築抗体がin vitroでヒ
トヘプトーマのスポロゾイト侵入を阻害することは明ら
かである。前記ホリングデイルら(Ｈollingdale et a
l．)は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫
に対するＭabは両方とも、これらのマラリア種に対する
ヒト免疫由来のポリクローナル血清と同様に、スポロゾ
イト侵入をブロックすることを示している。in vitro
でのスポロゾイト侵入のブロッキングは、従って防御抗
体に関する評価として考慮される。従って、該データは
全体として、侵入のワクチンは、熱帯熱マラリア原虫ス
ポロゾイトによる感染からヒトを防御するのに用いるこ
とができることがわかった。ＥＬＩＳＡ滴定により評価
されるこれらの組換タンパク質、表面反応性(ＩＦＡお
よびＣＳＰにより示される)およびスポロゾイト侵入の
ブロッキングに対する免疫応答は、完全フロインドアジ
ュバントまたは明バンのいずれかを用いることにより高
められる。完全フロインドアジュバントは、発熱させ、
肉芽腫を生じさせ、その結果、ツベルクリン過感作とな
るので、ヒトにおいて用いることができない。明バン
は、現在、ジフテリアおよび破傷風トキソイド等の確立
されたワクチン、ならびに最新ワクチンの一種、Ｂ型肝
炎において、アジュバントとして用いられている。これ
は、有効で、ヒトにおいて長期間安全に使用できること
が実証されている。

【００４６】実施例１３ワクチン調製物一例として、ワクチンを以下の様にして調製する。３％
水酸化アルミニウムの緩衝水性溶液(１０mＭリン酸ナト
リウム、１５０mＭＮaＣl、pＨ６．８;濾過により滅菌
化)に、同様の緩衝液中本発明のポリペプチド溶液を撹
拌しながら添加し、ポリペプチドの最終濃度を１００μ
g／ml、アルミニウム(Ａl³＋)の最終濃度を１．０mg／m
lにする。pＨを６．６に保つ。該混合物を約０℃にて一
夜静置する。チメンソールを添加し、最終濃度を０．０
０５％にする。pＨをチェックし、要すれば、６．８に
調節する。

【００４７】

【発明の効果】以上のごとく、本発明によれば、哺乳動
物をマラリアから防御するワクチンに有用なポリペプチ
ドが提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＳタンパク質のコーディング配列を担う熱
帯熱マラリア原虫(Ｐlasmoduim falciparum)ゲノムＤ
ＮＡの領域の部分的制限エンドヌクレアーゼ開裂地図で
ある。

【図２】 pＡＳ１の部分的制限エンドヌクレアーゼの
開裂地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ジェイムズ・フランシス・ヤングアメリカ合衆国ペンシルベニア州19083、ハバータウン、ホールブルック・ロード10 番 (56)参考文献ＳＣＩＥＮＣＥ，1984〜225！Ｐ．593

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】熱帯熱マラリア原虫(Ｐlasmodium falc
iparum)のＣＳタンパク質のタンデム重複単位の４つ以
上と、非ＣＳタンパク質とからなるポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含み、該非ＣＳタンパク質が、Ｇl
y、Ｌeu−Ａrg、インフルエンザ・ウイルス非構造タン
パク質(ＮＳ１)、ＮＳ１の８１のＮ末端アミノ酸、Ａsn
−Ｔhr−Ｖal−Ｓer−Ｓer、テトラサイクリン耐性遺伝
子製品の８６Ｎ−末端アミノ酸(tet₈₆)およびテトラサ
イクリン耐性遺伝子製品の３２Ｎ−末端アミノ酸(te
t₃₂)のいずれかから選択され、該タンデム重複単位が、
式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n (ここにn≧１) で示され、該ＤＮＡ配列が調節エレメントに作動可能に
結合しているイー・コリ(Ｅ．coli)発現ベクターで形質
転換されたイー・コリを培養してポリペプチドを産生さ
せ、精製することからなる該ポリペプチドの調製方法。
【請求項２】ポリペプチドが、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−tet₃₂−Ｃ (ここにn≧１) で示される請求項１項記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項３】ポリペプチドが、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁]n−
tet₃₂−Ｃ(ここにn≧１) で示される請求項１記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項４】 tet₃₂が、式Ｌeu−Ａrg−Ａrg−Ｔhr−
Ｈis−Ａrg−Ｇly−Ａrg−Ｈis−Ｈis−Ａrg−Ａrg−Ｈ
is−Ａrg−Ｃys−Ｇly−Ｃys−Ｔrp−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr
−Ａrg−Ａrg−Ｈis−Ｈis−Ａrg−Ｔrp−Ｇly−Ａrg−
Ｓer−Ｇly−Ｓer−Ｃで示されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペ
プチドの調製方法。
【請求項５】ポリペプチドが、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｇly−Ｃ (ここにn≧
１) で示される請求項１記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項６】ポリペプチドが、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ｌeu−Ａrg−Ｃ (ここ
にn≧１) で示されるされる請求項１記載のポリペプチドの調製方
法。
【請求項７】ポリペプチドが、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−ＮＳ１−Ｃ (ここにn
≧１) で示される請求項１記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項８】ポリペプチドが、式Ｎ−ＮＳ１₈₁−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)
₁₅−(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−tet₃₂−Ｃ (ここ
にn≧１) で示される請求項１記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項９】ポリペプチドが、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅−
(Ａsn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n−Ａsn−Ｔhr−Ｖal−Ｓe
r−Ｓer−Ｃ (ここにn≧１) で示される請求項１記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項１０】調節エレメントがＰＬプロモーター
と、cII翻訳開始サイトを含めたcIIリボソーム結合サイ
トを含む請求項１記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項１１】 pＡＳ１調節エレメントを有する請求
項３記載のポリペプチドの調製方法。
【請求項１２】細胞抽出物に界面活性剤を添加し、次
いで該抽出物を加熱して細菌性タンパク質を沈澱させ、
さらにポリペプチドを上清から精製することからなる、
熱帯熱マラリア原虫(Ｐlasmodium falciparum)のＣＳ
タンパク質のタンデム重複単位の４つ以上と、非ＣＳタ
ンパク質とからなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配
列を含み、該非ＣＳタンパク質が、Ｇly、Ｌeu−Ａrg、
インフルエンザ・ウイルス非構造タンパク質(ＮＳ１)、
ＮＳ１の８１のＮ末端アミノ酸、Ａsn−Ｔhr−Ｖal−Ｓ
er−Ｓer、テトラサイクリン耐性遺伝子製品の８６Ｎ−
末端アミノ酸(tet₈₆)およびテトラサイクリン耐性遺伝
子製品の３２Ｎ−末端アミノ酸(tet₃₂)のいずれかから
選択され、該タンデム重複単位が、式Ｎ−Ｍet−Ａsp−Ｐro[(Ａsn−Ａla−Ａsn−Ｐro)₁₅(Ａ
sn−Ｖal−Ａsp−Ｐro)₁]n (ここにn≧１) で示され、該ＤＮＡ配列が調節エレメントに作動可能に
結合しているイー・コリ(Ｅ．coli)発現ベクターで形質
転換されたイー・コリの清澄化細胞抽出物から該ベクタ
ーによりコードされたポリペプチドを精製する方法。