JPH07106159B2

JPH07106159B2 - タンパク質抗ガン剤

Info

Publication number: JPH07106159B2
Application number: JP2037126A
Authority: JP
Inventors: オリフアレン; デー．ジヨーンズデボラ; エム．エドワーズグウイネス
Original assignee: メルクエンドカムパニーインコーポレーテツド
Priority date: 1989-02-17
Filing date: 1990-02-17
Publication date: 1995-11-15
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: CY1987A; NZ232564A; HK15597A; ATE133993T1; AU4994690A; JPH02276590A; FI102383B; EP0383599A2; AU617039B2; EP0383599B1; JP2510846B2; CA2010256A1; CA2010256C; IE71934B1; IL93425A; PT93178A; IL93425A0; IE900587L; FI900783A0; DK0383599T3

Description

【発明の詳細な説明】伝統的なガンの化学療法は、薬物がガン患者の腫瘍細胞
を殺す能力に依存している。不幸なことに、これらの同
じ薬物が腫瘍細胞とともに正常な細胞をも殺すことがし
ばしばある。ガン薬が正常細胞を殺さずに腫瘍細胞を殺
す程度は、その化合物の腫瘍細胞に対する選択性の度合
の指標である。ガン薬の腫瘍細胞に対する選択性を高め
る一つの方法は、薬物を腫瘍細胞に重点的に送達し、正
常細胞集団には近づけないことである。化学療法剤を特
定の細胞集団に選択的に送達することを言い表わす言葉
として、「ターゲティング（targeting）」という言葉
もある。腫瘍細胞への薬物のターゲティングはいくつか
の方法によって行うことができる。一つの方法は、腫瘍
細胞の表面に見い出される特定の受容体（receptor）分
子の存在に依存する方法である。「ターゲティング剤」
と称される他の分子がこのような細胞表面の受容体を認
識してそれに結合するのである。これらの「ターゲティ
ング剤」には、たとえば抗体、成長因子（growth facto
r）あるいはホルモンなどがある。特定の細胞表面受容
体を認識してそれに結合する「ターゲティング剤」はそ
のような受容体を有する細胞を標的にするといわれてい
る。たとえば、多くの腫瘍細胞は、その表面に表皮性
（epidermal）成長因子受容体と呼ばれるタンパク質を
有する。表皮性成長因子（EGF）および転換性（transfo
rming）成長因子α（TGF−α）を含むいくつかの成長因
子は、腫瘍細胞上のEGF受容体を認識してこれに結合す
る。それゆえEGFやTGF−αはこれらの腫瘍細胞に対する
「ターゲティング剤」である。

「ターゲティング剤」はそれ自身では腫瘍細胞を殺さな
い。細胞毒あるいは毒素といった他の分子が「ターゲテ
ィング剤」と結合して、腫瘍細胞ターゲティング領域と
細胞毒素領域との両方を有する複合（hybrid）分子を作
ることができるのである。これらの複合分子はその腫瘍
細胞を標的にする能力に基づく腫瘍細胞選択性の毒物と
して機能し、かくしてその毒素成分によりこれらの細胞
を殺す。これらの複合分子を作るのに最もよく用いられ
る細胞毒のうちのいくつかのものは、哺乳動物細胞内に
おけるタンパク質合成を阻害する細菌性毒素である。シ
ュードモナス外毒素（pseudomonas exotoxin）Ａはこの
ような細菌性毒素の一つであり、複合「ターゲティング
−毒素」分子を構成するのに用いられてきた（米国特許
第4,545,985号）。

シュードモナス外毒素Ａは、まず哺乳動物細胞表面に結
合し、次に細胞質内に侵入して、タンパク質合成に必要
な細胞タンパク質である延長因子（elongation facto
r）２を不活性化して細胞を中毒させる。シュードモナ
ス外毒素Ａは、モノクローナル抗体とタンパク質ホルモ
ンを用いて抗ガン複合分子を作るのに用いられている。
しかしながら、このような複合分子にまつわる一つの問
題は、それらが正常細胞に対して毒性を示すことであ
る。シュードモナス外毒素Ａを含む複合分子に係る毒性
の少なくとも一部は、シュードモナス外毒素Ａ自体が多
くの種類の哺乳動物細胞に結合してその中に侵入する能
力を有することによるものである。よれゆえ、シュード
モナス外毒素Ａの特定の「ターゲティング剤」との間に
形成された複合分子は、その「ターゲティング剤」によ
って認識される細胞に加えて、多くの正常細胞にも結合
することができる。この問題に対処するための一つの方
法は、シュードモナス外毒素Ａを改変して、それがもは
や正常細胞には結合できないようにすることである。こ
れはシュードモナス外毒素Ａ分子の細胞結合能力に係わ
る部分を除去することによって達成できる。シュードモ
ナス外毒素Ａ分子の先端を切り取った形のものが作られ
ており、これは延長因子２を不活性化する能力を保持し
ているが、もはや哺乳動物細胞に結合することはできな
い。この改変シュードモナス外毒素Ａ分子はシュードモ
ナス外毒素40あるいはPE₄₀と呼ばれている（Hwang他、C
ell 48:129−136 1987）。

PE₄₀はTGF−αを含むいくつかのターゲティング分子と
結合されている（Chaudhary他、PNAS USA 84:4538−454
2 1987）。TGF−αの場合、PE₄₀領域とTGF−α領域とを
含む複合分子は、EGF受容体を有する腫瘍細胞に特異的
に結合して、タンパク質合成を阻害することによりこれ
らの細胞を中毒させる。この複合分子が効率的にEGF受
容体を結合するためには、それが適当なコンホメーショ
ンを有していなければならないと考えられる。効率的な
受容体との結合はまた、「ターゲティング領域」が適当
に露出していて結合にあやかれるようになっているかど
うかということにも依存する。TGF−αとPE₄₀との複合
分子を組換えDNA法を用いて細菌中において融合タンパ
ク質として産生する場合には、多くの複合分子は弱いEG
F受容体結合活性しか示さない。

なお、本発明に関連する文献としては、以下のものが挙
げられる。

1. 米国特許4,545,985号は、シュードモナス外毒素Ａ
を抗体や表面成長因子に結合させることができることを
教示する。同特許はまた、これらの結合体を用いてヒト
腫瘍細胞を殺すことができることも教示する。

2. 米国特許第4,664,911号は、植物から得られる毒素
であるリシンのＡ鎖またはＢ鎖に抗体を結合することが
できることを教示する。同特許はまた、これらの結合体
を用いてヒト腫瘍細胞を殺すことができることも教示す
る。

3. 米国特許第4,675,382号は、メラニン細胞刺激ホル
モン（MSH）のようなホルモンをペプチド結合によりジ
フテリア毒素タンパク質の一部を結合することができこ
とを教示する。同特許はまた、これらのタンパンク質を
コードする遺伝子を組換えDNA法を用いてつなぎ合わせ
て複合融合タンパク質の合成を合わせることができるこ
とも教示する。この融合タンパク質はMSH受容体を有す
る細胞に結合する能力を有する。

4. Murphy他、PNAS USA 83:8258−8262 1986,Genetic
construction,expression,and melanoma−selective cy
totoxicity of a diphtheria toxin−related alpha−m
elanocyte−stimu−lating hormone fusion protein
（ジフテリア毒素関連αメラニン細胞刺激ホルモン融合
タンパク質の遺伝子構成、発現、および黒色腫選択的細
胞毒性）。この文献は、組換えDNA法を用いて細菌中で
産生され、αメラニン細胞刺激ホルモンに結合したジフ
テリア毒素タンパク質の一部からなる複合融合タンパク
質が、ヒト黒色腫細胞に結合してこれを殺すことを教示
する。

5. Kelley他、PNAS USA 85:3980−3984 1988,Interleu
kin2−diphtheria toxin fusion protein can abolish
cell−mediated immunity in vivo（インターロイキン
２−ジフテリア毒素融合タンパク質は生体の細胞性免
疫を破壊することができる）。この文献は、組換えDNA
法を用いて細菌中で産生され、インターロイキン２に結
合したジフテリア毒素タンパク質の一部からなる複合融
合タンパク質が、ヌードマウス中において細胞性免疫を
抑制する作用を呈することを教示する。

6. Allured他、PNAS USA 83:1320−1324 1986,Structu
re of exotoxin A of Pseudomonas aeruginosa at 3.0
Angstrom（3.0オングストロームでのシュードモナス・
エルギノーサの外毒素Ａの構造）。この文献は、シュー
ドモナス外毒素Ａタンパク質の三次元構造を教示する。

7. Hwang他、Cell 48:129−136 1987,Functional Doma
ins of Pseudomonas Exotoxin Identified by Deletio
n Analysis of the Gene Expressed in E.Coli（大腸菌
中で発現した遺伝子の欠失分析によって同定されたシュ
ードモナス外毒素の作用領域）。この文献は、シュード
モナス外毒素Ａタンパク質が３つの異なる機能領域に分
割することができ、それらはそれぞれ、哺乳動物細胞へ
の結合、リソソーム膜を横切っての上記毒素タンパク質
の移動、および哺乳動物細胞中での延長因子２のリボシ
ル化に関与することを教示する。この文献はまた、これ
らの機能領域がシュードモナス外毒素Ａタンパク質の異
なる領域に対応していることも教示する。

8. 1988年３月30日に公開された欧州特許出願第0 261
671号は、シュードモナス外毒素Ａタンパク質の全体が
有する細胞結合機能は欠いているがシュードモナス外毒
素Ａタンパク質の全体が有する前記移動機能およびADP
リボシル化機能は有するシュードモナス外毒素Ａの一部
分を作ることができることを教示する。このシュードモ
ナス外毒素Ａタンパク質の全体が有する移動機能および
ADPリボシル化機能を保持しているシュードモナス外毒
素Ａタンパク質の一部分は、シュードモナス外毒素40ま
たはPE−40と呼ばれる。PE−40はGray他、PNAS USA 81:
2645−2649 1984において規定されたシュードモナス外
毒素Ａタンパク質全体のアミノ酸残基252−613を構成す
る。この特許出願はまた、組換えDNA法を用いることに
より、PE−40を転換成長因子αに結合して細菌内で産生
される複合融合タンパク質を形成することができること
も教示する。

9. Chandhary他、PNAS USA 84:4538−4542 1987,Activ
ity of a recombinant fusion protein between transf
orming growth factor type alpha and Pesudomonas to
xin（転換成長因子α型とシュードモナス毒素との組換
え融合タンパク質の活性）。この文献は、PE−40と転換
成長因子αとの間で形成され、組換えDNA法を用いて細
菌中で産生される複合融合タンパク質が、表皮性成長因
子受容体を有するヒト腫瘍細胞に結合してこれを殺すこ
とを教示する。

10. Bailon,Biotechnology,1326−1329頁1988年11月,P
urifi−cation and Partial Characterization of an I
nterleukin2−Pseudomonas Exotoxin Fusion Protein
（インターロイキン２−シュードモナス外毒素融合タン
パク質の精製および部分的特徴づけ）。この文献は、PE
−40とインターロイキン２との間で形成され、組換えDN
A法を用いて細胞中で産生される複合融合タンパク質
が、インターロイキン２受容体を有するヒト細胞系に結
合してこれを殺すことを教示する。

標的剤（targeting agent）と改変PE₄₀分子との間に形
成されたハイブリッド分子を標的剤を認識する細胞受容
体に効果的に結合させるPE₄₀の改変体を提供することが
本発明の１つの目的である。標的剤と改変PE₄₀との間で
産生されたハイブリッドたん白を殺菌の融合たん白とし
て回収する方法を提供することが本発明のもう１つの目
的である。本発明の別の目的は細胞受容体結合ドメイン
（すなわち、領域）及びPE₄₀ドメイン（すなわち、領
域）を有するハイブリッド（すなわち、融合）たん白を
提供することである。ここにPE₄₀ドメインは表皮成長因
子受容体へのハイブリッドたん白の結合、又は改変PE₄₀
と結合した標的剤が結合する受容体へのハイブリッドた
ん白の結合を改良するために改変されている。さらに別
の目的は、ずっと容易に精製されるハイブリッドたん白
を提供することである。本発明はこれらの及び他の目的
は以下の記載から明らかになるであろう。

本発明はたん白標的ドメインに結合した改変PE₄₀ドメイ
ンを含むハイブリッド分子を提供する。この改変PE₄₀ド
メインはこのハイブリッド分子の受容体結合活性を改良
する。PE₄₀中のシステイン残基に替えて他のアミノ酸、
例えばアラニンの使用、又はシステイン残基の除去は、
標的ドメインによって認識された受容体へのハイブリッ
ド分子の結合を改良する。本発明のハイブリッド分子は
非改変PE₄₀を有するハイブリッド分子よりもずっと効果
的に、ヒト腫瘍の標的とされる受容体へ結合する。

TGF−αとPE₄₀との間で形成されたハイブリッド分子は
三つの主なアッセイによって特徴付けられる。これらの
アッセイは次のものを含む。

１哺乳類細胞たん白合成を阻害するTGF−α−PE₄₀の
酵素活性を評価する延長因子２のADPリボシル化。

２ TGF−α−PE₄₀のEGF受容体結合活性を評価するA431
からの膜ベシクルのEGF受容体に結合する放射能標識し
たEGFの阻害。

３ TGF−α−PE₄₀への暴露に続いて腫瘍の生存を評価
するために使用されるホルマサンへの３−［4,5−ジメ
チルチアゾール２−イル］−2,5−ジフェニルテトラゾ
リウムブロミド（MTT）の変換によって評価される細胞
の増殖。

これらのアッセイは前記の通り行われる（Dominic et
al.,Infection and Immunity 16:832−841 1977,Cohen
et al.,J.Biol.Chem.257:1523−1531 1982,Riemen et
al.,Peptides ８:877−885 1987,Mosmann J.Immunol.
Methods 65:55−63 1983）。

優れた受容体結合特性を有する新規なTGF−α−PE₄₀ハ
イブリッド分子を造るために、我々はまずTGF−α−PE
₄₀か又はTGF−α−PE₄₀の特異的改変体（specifically
modified versions）かのいずれかをコードする一連の
組換DNA分子を製造した。原又は親TGF−α−PE₄₀遺伝子
は、実施例２に記載されるクローン化DNAの別個のセグ
メントを使用して細胞のTAC発現プラスミドベクター（p
TAC TGF 57−PE₄₀）に分子的にクローン化された。この
pTAC TGF57−PE₄₀DNAクローンを、TGF−α−PE₄₀DNAの
特異的な改変体を構造するための出発試薬として使用し
た。pTAC TGF57−PE₄₀DNAの特異的改変は、pTAC TGF57
−PE₄₀DNAのPE₄₀ドメイン内のシステインコドンの２又
は４を他のアミノ酸のためのコドンで置換するために必
要なDNAコード配列中に部位特異的変異を含んでいる。
また、部位特異的変異をうまく処理して、pTAC TGE57−
PE₄₀のPE₄₀ドメイン内のシステインコドンの２又は４を
除去することができる。pTAC TGF57−PE₄₀DNA中の部位
特異的変異はWinter et al.,Nature 299:756−758 198
2の方法を使用して構造される。変異させられたpTAC TG
F57−PE₄₀DNAの具体例が実施例３に示されている。pTAC
TFG57−PE₄₀DNAによってコードされるハイブッドたん
白のアミノ酸配列が第３図に示されている。親TGF−α
−PE₄₀ハイブリッドたん白のPE₄₀中の４つのシステイン
残基は残基Cys²⁶⁵,Cys²⁸⁷,Cys³⁷²,及びCys³⁷⁹で表わさ
れる（第３図）。アミノ酸残基はGray et al.,PNAS USA
81:2645−2649（1984）において定義されたように番号
が付けられている。特異的に変異させられたpTAC TGF57
−PE₄₀DNAからの改変TGF−α−PE₄₀ハイブリッドたん白
は、残基［Cys²⁶⁵及びCys²⁸⁷］又は［Cys³⁷²及びCy
s³⁷⁹］、又は［Cys²⁶⁵,Cys²⁸⁷,Cys³⁷²,及びCys³⁷⁹］の
置換又は除去を含む。これらの変異pTAC TGF57−PE₄₀DN
Aから産生された改変ハイブリッドたん白を記述するた
めの命名を簡単にするために、我々は位置265及び287の
アミノ酸残基に「Ａ」座を指定しそして位置372及び379
の残基に「Ｂ」座を指定する。システインが親TGF−α
−PE₄₀ハイブリッド分子におけるようにアミノ酸残基26
5及び287に存在する場合、座は大文字（すなわち、
「Ａ」）で表わされる。システインが他アミノ酸、例え
ば、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン又
はイソロイシンで置換されているか又は残基267及び287
から除去されている場合、座は小文字「ａ」によって表
わされる。同様に、位置372及び379のアミノ酸残基がシ
ステインである場合、座は大文字の「Ｂ」によって表わ
されるが、一方、位置372及び379のアミノ酸残基が他の
アミノ酸で置換されているか又は除去されている場合に
は小文字「ｂ」がこの座を表わす。従って、TGF−α−P
E₄₀のPE₄₀ドメインの４つのシステイン残基すべてがア
ラニンで置換されている場合、改変ハイブリッドたん白
はTGF−α−PE₄₀abと表わされる。同様な方法におい
て、アミノ酸残基の位置265,287,372及び379にシステイ
ンを有する親TGF−α−PE₄₀ハイブリッドたん白をTGF−
α−PE₄₀ABと表わすことができる。

TGF−α−PE₄₀ABハイブリッドたん白及び改変TGF−α−
PE₄₀ハイブリッドたん白は、Linemeyer et al.,Bio−T
echnology ５:960−965 1987によって記載されたTAC発
現ベクター系を使用してE.Coliにおいて産生される。こ
れらの細菌において産生された組換ハイブリッドたん白
は収集され、そしてグアニジンヒドロクロリド中で細菌
を溶解させた後、亜硫酸ナトリウム及び四チオン酸ナト
リウムを添加することによって精製される。次に、この
反応混合物を透析しそして尿素を加えて溶液から沈澱し
たたん白を可溶化する。次に、この混合物を遠心して不
溶性たん白を除去し、そしてイオン交換クロマトグラフ
ィー、次にサイズ除去クロマトグラフィー、次に再びイ
オン交換クロマトグラフィーを使用して組換ハイブリッ
ドTGF−α−PE₄₀たん白を分離する。精製されたTGF−α
−PE₄₀雑種たん白を次に、ハイブリッドたん白内に対の
システイン残基の間でジスルフィド結合を形成させるた
めに還元剤、例えばβ−メルカプトエタノールに暴露す
る。最後に、折りたたんだ状態に戻された雑種たん白を
サイズ除外及びイオン交換クロマトグラフィーにかけて
高純度のTGF−α−PE₄₀たん白を単離する。この精製の
概要の詳細は実施例２に記載されている。ひとたび精製
され、折りたたんだ状態に戻されたこれら雑種たん白の
生物学的活性は、前記ADPリボシル化、EGF受容体結合、
及び細胞増殖アッセイを使用して特徴づけるられること
ができる。

TGF−α−PE₄₀の重要な実用性はEGF受容体を所有する細
胞に結合しそして細胞を殺すその能力にある。多くのヒ
ト腫瘍細胞はEGF受容体をもっており、従って、TGF−α
−PE₄₀の細胞を殺す効力に対して感受性が強い。ケラチ
ン生成細胞を含む他の癌にかかっていないヒトの細胞は
EGF受容体をもっていて、やはり、TGF−α−PE₄₀の細胞
を殺す活性に対して感受性が強い。いくつかのヒトの病
気は、乾癬及び疣贅を含むケラチン生成細胞の増殖され
た増殖によって特徴づけられる。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本
発明はそれに限定されない。分子生物学上の取り扱いの
ために必要な酵素反応のすべては、時に断わりのない限
り、Maniatis et al.,（1982）In:Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Pressに記載
されている通りに行なわれた。

実施例１組換えTGF−アルファ−PE₄₀融合蛋白質の製造と単離：融合蛋白質の製造形質転換されたＥ．Coli JM−109細胞を100μg/mlのア
ンピシリンの存在下500ml LB−ブロス（LB−Broth）入
りの１リットル振動フラスコ中で培養した。A600分光光
度吸収値が0.6に達した後で、イソプロピル−Ｂ−Ｄ−
チオーガラクトピラノシドを最終濃度1mMになるまで加
えた。２時間後、細胞を遠心分離して回収した。

融合蛋白質のＳ−スルフォネート化細胞を8Mグアニジン塩酸塩、pH8.0の50mMトリス緩衝
液、1mM EDTA中に室温で、２時間で溶解した。溶解混合
液に固体試薬を加えて、0.4M亜硫酸ナトリウム及び0.1M
四チオン酸ナトリウムとし、そして1M NaOHでpH9.0に調
節した。室温で16時間反応させた。

クロマトグラフィー用の準備蛋白質液を10,000倍過剰容量の1mM EDTAで４℃で透析し
た。混合液を室温で6M尿素、50mM pH8.0トリス緩衝液、
50mM NaClとし、２時間撹拌した。不溶解分は32,000x
g、30分の遠心分離により除去した。

DEAE F.F.セファロースクロマトグラフィー前工程の透明上澄み液を6M尿素、50mM pH8.0トリス緩衝
液、50mM NaClで平衡させた26×40cm DEAE Fast Flow C
olumn（Pharmacia LKB Biotechnology Inc製）に流速1m
l/分でかけた。カラムを平衡緩衝液ですべての不吸着物
がなくなるまで洗浄した。これはカラムを出た平衡緩衝
液のUV280分光光度吸収値が0.1以下になったことで証明
された。吸着された融合蛋白質は1000mlの50〜350mM Na
Clで傾斜溶離され、YM−30膜を付けた撹拌細胞アミコン
（Amicon）濃縮器で濃縮された。

セファクリルＳ−300 濃縮融合蛋白質（8ml）を6M尿素、50mM pH8.0トリス緩
衝液、50mM NaClで平衡させた2.6x100cmセファクリル
（Sephacryl）Ｓ−300 Column（Pharmacia LKB Biotech
nology Inc製）に流速0.25ml/分でかけた。カラムを平
衡緩衝液で溶離し、3mlのフラクションを得た。TGF−ア
ルファーPE₄₀活性を持つフラクションがまとめられた。

Ｑ−セファロースクロマトグラフィーＳ−300カラムからのまとめられたフラクションを6M尿
素、50mM pH8.0トリス緩衝液、50mM NaClで平衡させた
1.6x40cm Q−Sepharose Column（Pharmacia LKB Biotec
hnology Inc製）に流速0.7ml/分でかけた。カラムを平
衡緩衝液で洗浄し、600mlの50〜450mM NaClで傾斜溶離
した。TGF−アルファーPE₄₀活性を持つフラクションが
まとめられ、pH9.0の50mMグリシンで透析し、零下20℃
で貯蔵した。

リホルディング（Refolding）蛋白質サンプルを解かし、pH10.5の50mMグリシン中でUV
A280での分光光度吸収値が0.1になるまで希釈した。ベ
ータ−メルカプトエタノールを蛋白質試料中のＳ−スル
フォネート基の理論値の4:1モル比以上になるまで加え
た。４℃で16時間反応し、10,000倍過剰容量の生理緩衝
食塩水で透析し、零下20℃で貯蔵した。

実施例２ TGF−アルファーPE₄₀DNAを含む組換えクローンの構築： TGF−アルファーDNAセグメントをDefeo−Jones他のMole
cular and Cellular Biology ８:2999−3007.1988記載
の三組の合成オリゴヌクレオチドを使用して構築した。
この合成TGF−アルファー遺伝子をpUC−19にクローン化
した。組換えヒトTGF−アルファーを含むpUC−19クロー
ンからのDNAをSph I及びEco RIで消化した。この消化は
pUC−19とTGF−アルファー５′部分の全てを含む2.8kb
DNAフラグメントを産生した。2.8kbフラグメントを精製
し、ゲル電気泳動法で分離した。Eco RI乃至Sph Iオリ
ゴヌクレオチド・カセットを合成した。この合成カセッ
トは以下に示す配列を有した。

５′−CGGACCTCCTGGCTGCGCATCTAGG−３′ ３′−GTACGCCTGGAGGACCGACGCGTAGTACCTTAA−５′ 便宜上、このオリゴヌクレオチド・カセットを57と名付
けた。カセット57をアニールし、TGF−アルファを含む
2.8kbフラグメントを連結して環化プラスミドを形成し
た。カセットを含んだクローンを放射標識したカセット
57DNAとハイブリダイズさせて同定した。ヒトTGF−アル
ファの存在はDNA配列決定する事で確認された。配列決
定はまたTGF−アルファ配列の３′末端に新しく導入さ
れたFspI部位の存在も確認した。TGF−アルファ57/pUC
−19と命名されたこのプラスミドをFspI及びHindIIIに
よって消化し、TGF−アルファ遺伝子（TGF−アルファ5
7）を含む168bpフラグメントを得た。pUC−19の別の標
品をEcoRI及びHindIIIによって消化し2.68kbのpUC−ベ
クターDNAを作成した。PE₄₀DNAをプラスミドpVC8（Chau
dhary他PNAS USA 84:4538−4542.1987）から分離した。
pVC 8をNde Iを使用して消化した。それから平滑末端を
このDNA上にKlenow反応（Maniatis他、同上p.113）の標
準条件を使用して作った。平滑末端DNAを次いでEco RI
による第２消化に掛け、PE₄₀を含む1.3kb Eco RI乃至Nd
e I（平滑末端）とした。TGF−アルファー57 HinD III
乃至Fsp Iフラグメント（168bp）を2.68kb pUC−19ベク
ターに結紮した。一夜培養の後、1.3kb Eco RI乃至Nde
I（平滑末端）PE₄₀DNAフラグメントを結紮混合物に加え
た。この第２結紮反応は一夜行なわれた。結紮反応生成
物をJM 109細胞を形質転換するために使用した。pUC−1
9中にTGF−アルファー57 PE₄₀を含むクローンを放射性
同位元素でラベルされたTGF−アルファー57 PE₄₀DNAを
ハイブリタイズさせて同定し、このクローンからのDNA
を分離した。TGF−アルファー57 PE₄₀をpUC−19ベクタ
ーから切り出し、Linemeyer他（Bio−Technology ５:96
0−965.1987）に記載のTACベクター系に移した。pUC−1
9中のTGF−アルファー57 PE₄₀をHinD III及びEco RIに
よって消化し、TGF−アルファー57 PE₄₀を含む1.5kbフ
ラグメントを産生した。このDNAフラグメントを上にKle
now反応（Maniatis他、同上）の標準条件を使用して平
滑末端を作った。TACベクターをHinD III及びEco RIで
消化した。平滑末端をKlenow反応（Maniatis他、同上）
の標準条件を使用して消化したTACベクターDNA上に作っ
た。2.7kb平滑末端を持つベクターをゲル電気泳動法で
分離した。平滑末端を持つTGF−アルファー57 PE₄₀フラ
グメントを次で平滑末端TACベクターに結紮した。この
結紮で得たプラスミドをJM 109細胞を形質転換するため
に使用した。TGF−アルファー57 PE₄₀を含む候補クロー
ンを上記ハイブリダイゼーションで同定し配列決定し
た。所期の構成を持つクローンをpTAC TGF−57−PE40と
命名した。これらの操作で得られたプラスミドを図面に
掲げる。pTAC TGF−57−PE40中にコード化されたTGF−
アルファー57PE₄₀のアミノ酸コドンのヌクレオチド酸列
を第２表に掲げる。TGF−57−PE−40遺伝子によってコ
ード化されたアミノ酸配列を第３表に示す。

実施例３ TGF−α−PE₄₀を有する組換えDNAクローンの修飾変換体
の構築：システインに対してアラニン置換 TGF−α−PE₄₀aB クローンpTAC TGF57−PE40はSph IおよびBamHIで消化さ
れ、そして750bp SphI−BamHI断片（TGF−αのＣ末端５
アミノ酸とPE₄₀のＮ末端243アミノ酸を特定する）は単
離された。M13mp19ベクターDNAはSphIおよびBamHIによ
り切断され、ベクターDNAは単離された。750bp Sph I−
BamHI TGF−α−PE₄₀断片は15℃で一晩中M13ベクターに
継ぎ合わされた。バクテリア宿主細胞はこの継ぎ合せ混
合物によって形質転換され、候補クローンは単離され、
そしてそれらのプラスミドDNAはこれクローンが適切な
組換えDNAsを含むことは配列決定して確認した。１本鎖
DNAは突然変異生成のため調製された。

オリゴヌクレオチド（オリゴ＃132）は合成され、突然
変異生成を指示する部位で使用され、そしてHpaI部位を
PE₄₀のアミノ酸位置272でTGF−α−PE₄₀DNAに導入し
た：５′CTGGAGACGTTAACCCGTC3′（オリゴ＃132）この部位特異的突然変異は、結果としてPE₄₀中に272番
目の残基をフェニルアラニンからシステインに転換し
た。この突然変異生成はウインター（Winter）らのNatu
re,第299巻：第756−758頁1982年で記載されるように行
なわれた。

新しく生成されたHpaI部位を有する候補クローンが単
離、配列決定され、突然変異した遺伝子配列が存在する
ことが確認された。次にこのクローンSph IとSal Iによ
り切断される。TGF−αのＣ末端５アミノ酸およびPE₄₀
のＮ末端70アミノ酸を特定し、そして新しく導入された
Hpa I部位を有する210bp断片は単離され、そしてもとの
pTAC TGF57−PE40プラスミドにSph I−Sal I部位でサブ
クローンされた。バクテリア宿主細胞は形質転換され、
候補クローンは単離され、そしてそのプラスミドDNAが
配列決定され、このクローンが適切な組換えDNAを有す
ることが確認された。

便宜上、このクローンをpTAC TGF57−PE40−132と名付
けた。pTAC TGF57−PE40−132はSph IとHpa Iにより消
化され、3.96kb DNA断片が単離された。TGF−αのＣ末
端５アミノ酸およびPE₄₀のＮ末端32アミノ酸をカバー
し、SphIとHpaI用の末端を有する合成オリゴヌクレオチ
ドカセット（オリゴ＃153）は合成され、そして消化さ
れたpTAC TGF57−PE40−132に継ぎ合わされた：このヌクレオチドカセットはTGF−α−PE₄₀DNA中の変
化を組み込んでおり、残基265でシステインを特定して
いたコドンはアラニンを特定する。

便宜上、このプラスミドDNAはpTAC TGF57−PE40−132,1
53と名付けた。バクテリア宿主細胞はpTAC TGF57−PE40
−132,153DNAにより形質転換された。候補クローンはハ
イブリッド形成により確認され、単離され、そしてそれ
らのプラスミドDNAが配列決定され、適切な組換DNAを有
することが確認された。

pTAC TGF57−PE40−132,153DNAはHpa IとSal Iにより消
化され、そして3.95kbベクターDNAは単離された。PE₄₀
のアミノ酸残基272から309をカバーし、HpaIとSalI用の
末端を有する合成オリゴヌクレオチドカセット（オリゴ
＃142）は合成され、そして3.95kb pTAC TGF/PE40−13
2,153 DNAに継ぎ合わされた：このオリゴヌクレオチドカセットは残基287でシステイ
ンを特定するコドンを変化させ、このコドンが今後はア
ラニンを特定した。便宜上、この突然変異したプラスミ
ドDNAはpTAC TGF57−PE40−132,153,142と名付けた。バ
クテリア宿主細胞はこのプラスミドに形質転換され、そ
して候補クローンは交雑形成により確認された。これら
のクローンは単離され、そしてこれらプラスミドDNAは
配列決定され、適切な組換えDNAを有することが確認さ
れた。pTAC TGF57−PE40−132,153,142プラスミドは座
“A"の両方のシステインがアラニンに置換されたTGF−
α−PE₄₀変異体をエンコードした。そのため、前述した
名命法に従うと、TGF−α−PE₄₀のこの修飾変換体はTGF
−α−PE₄₀aBと名付けられた。TGF−α−PE₄₀aB遺伝子
によりエンコードされたアミノ酸配列は表４に示す。

TGF−α−PE₄₀Ab: クローンpTAC TGF57−PE40はSphIとBamHIにより消化さ
れて、そして750bp SphI−BamHI断片（TGF−αのＣ末端
５アミノ酸とPE₄₀のＮ末端252アミノ酸を特定する）は
単離された。M13mp19ベクターはSphIとBamHIにより切断
され、そしてベクターDNAは単離された。750bp SphI−B
amHI TGF−α−PE₄₀断片は15℃で一晩中M13ベクターDNA
へ継き合わされた。バクテリア宿主細胞は連続反応混合
物により形室転換され、候補クローンは単離され、そし
てそれらのプラスミドDNAが配列決定され、これらクロ
ーンが適切な組換えDNAを有することが確認された。一
本鎖DNAは突然変異生成のために調製された。

オリゴヌクレオチド（オリゴ＃133）を合成し、部位特
異的突然変異誘発に使用し、PE₄₀のアミノ酸位置369でT
GF−α−PE₄₀にBsteII部位が導入された：５′GACGTTGTGACCCTGAC3′（オリゴ＃133）この突然変異誘発の結果としてPE40の位置369のセリン
残基がスレオニンに変換された。

新しく生成したBste II部位を有するDNAクローンは確認
され、単離され、そして配列決定され、適切な組換えDN
Aが存在することが確認された。このクローンは次にApa
IとSalIの制限酵素により消化された。新しく生成したB
steII部位を有する120bp挿入DNA断片は単離され、そし
てまたApaIとSalIにより消化されたpTAC TGF57−PE40に
継き合わされた。バクテリア宿主細胞は形質転換され、
候補クローンが単離され配列決定され、適切な組換えDN
Aが存在することが確認された。この新しく生成したプ
ラスミドDNAはpTAC TGF57−PE40−133と名付けられた。
それはBste IIとApsIにより消化され、そして2.65Kbベ
クターDNA断片は単離された。

Bste IIからApaIへのオリゴヌクレオチドカセット（オ
リゴ＃155）は合成され、BsteIIとAsaIの制限酵素によ
り消化されたpTAC TGF57−PE40−133から除去されたTGF
−α−PE₄₀領域をカバーした。このカセットはまたBste
IIとApaI用の末端ヌクレオチド配列を特定した。

このヌクレオチドカセットはPE₄₀の残基372と379でシス
テインに対するコドンをアラニンで特定されるコドンに
変化させた。オリゴヌクレオチドカセット＃155は2.65K
bベクターDNA断片に継き合わされた。バクテリア宿主細
胞は形質転換され、候補クローンが単離され、配列決定
され、適切な組換えDNAが存在することが確認された。
この新しく生成したDNAはpTAC TGF57−PE40−133,155と
名付けられた。それは座“B"の両方のシステインがアラ
ニンに置換されたTGF−α−PE₄₀変異対をエンコードし
た。そのため、前述の名命法に従うとTGF−α−PE₄₀の
この修飾変換体をTGF−α−PE₄₀Abと名付けた。TGF−α
−PE₄₀Ab遺伝子にエンコードされたアミノ酸配列は表５
に示される。

TGF−α−PE₄₀ab: TGF−α−PE₄₀aBをエンコードするpTAC TGF57−PE40−1
32,153,142プラスミドはSal IとApa Iによって消化さ
れ、そしてその結果生じた3.8KbベクターDNA断片は単離
された。TGF−α−PE₄₀AbをエンコードするpTAC−TGF57
−PE40−133,155プラスミドはまたSalIとApaIにより消
化され、そしてPE₄₀のアミノ酸残基372と379がシステイ
ンからアラニンに変わっている140bpDNA断片が単離され
た。これらの２つのDNAは一緒に継ぎ合わされ、そして
バクテリア宿主細胞に形質転換されるのに使用された。
候補クローンはpTAC TGF57−PE40−133,155からの放射
性同位元素を使用して識別された140bp DNAを用いた交
雑形成により確認された。候補クローンからのプラスミ
ドDNAは単離され、そして配列決定され、適切な組換えD
NAの存在が確認された。この新しく生成したDNAクロー
ンはpTAC TGF57−PE40−132,153,142,133,155と名付け
られた。このプラスミドは座“A"と“B"の４個のシステ
イン全部がアラニンに置換されているTGF−α−PE₄₀変
異体をエンコードした。そのため、前述した名命法に従
うと、TGF−α−PE₄₀のこの修飾変換体はTGF−α−PE₄₀
abと名付けられた。TGF−α−PE₄₀ab遺伝子によりエン
コードされたアミノ酸配列を表６に示す。

実施例４組換体TGF−α−PE₄₀の変形体を含むDNAクローンの構
築：システイン残基の選択 TGF−α−PE₄₀aB、TGF−α−PE₄₀Ab、及びTGF−α−PE
₄₀abはまた座“A"及び／又は座“B"におけるシステイン
残基の除法によって構成されることもできる。TGF−α
−PE₄₀のこれらの変形の構築は次のことを除いては実施
例３に述べるられたと全く同じに遂行される。TGF−α
−PE₄₀aBに関してはオリゴヌクレオチドカセット153を
変えて位置265のアラニンコドンが削除され、オリゴヌ
クレオチドカセット142を変えて位置287のアラニンコド
ンが削除される。TGF−α−PE₄₀Abに関してはオリゴヌ
クレオチドカセット155を変えて残基372及び379のアラ
ニンコドンが削除される。TGF−α−PE₄₀abに関しては
この組換え体遺伝子を構成するために使われるDNA断片
がこの実施例に記載されたTGF−α−PE₄₀aBとTGF−α−
PE₄₀Ab遺伝子から取り出される。

実施例５ TGF−α−PE₄₀AB、TGF−α−PE₄₀Ab、TGF−α−PE₄₀aB,
及びTGF−α−PE₄₀ab蛋白質の生物学的活性雑種融合蛋白質TGF−α−PE₄₀AB、TGF−α−PE₄₀Ab、TG
F−α−PE₄₀aB,TGF−α−PE₄₀abは細菌宿主内で発現さ
れ実施例１で述べられたように単離された。そして各蛋
白質はA431細胞膜小胞上の表皮成長因子レセプターへの
放射能ラベルされた表皮成長因子の結合を阻害する能力
及び前述のMTT細胞増殖アッセイにおいて測定されるよ
うなA431細胞を殺す能力について特徴付けられる。次の
表はこれらの蛋白質の生物学的活性を要約している。

実施例６ TGF−α−PE₄₀abのTGF−α領域の表皮成長因子レセプタ
ーへ結合する他の「ターゲット試薬」への置換 TGF−α−PE₄₀の有用性はその表皮成長因子レセプター
を有する細胞へ結合し殺す能力がある。他の「ターゲッ
ト試薬」も、EGFレセプターの結合する本願発明の改質
されたPE₄₀の雑種分子を作るのに用いることができる。
例えば、表皮成長因子又はウロガストロン又はショープ
（Shope）ファイブローマウイルス成長因子、又はバク
シニア（vaccinia）ウイルス成長因子のための遺伝子
は、PE₄₀のための遺伝子に連結され表皮成長因子−P
E₄₀、又はウロガストロン−PE₄₀、又はショープファイ
ブローマウイルス成長因子−PE₄₀、又はバクシニアウイ
ルス成長因子−PE₄₀雑種融合蛋白質の合成を支配するこ
とに用いられることができる。しかしながら、夫々の場
合に於いてここで述べられたPE₄₀への変形の一つ以上
は、表皮成長因子レセプターを有する細胞へのこれらの
他の雑種融合蛋白質の結合を改善する。

実施例７ TGF−α−PE₄₀のTGF−α領域の哺乳類細胞上の他のレセ
プターへ結合する他の「ターゲット試薬」への置換本発明はPE₄₀と哺乳動物細胞の特定のレセプターを認識
する他の「ターゲット試薬」との間の雑種融合蛋白質の
PE₄₀領域の変形に関するものであると理解される。例え
ば、蛋白質と本願発明の変形PE₄₀との間に形成された、
Ｘがインターロイキン２、又はインターロイキン３、又
はインターロイキン４、又はインターロイキン６、又は
成長因子から誘導された血小板、又は特定の哺乳類細胞
レセプターを認識し結合する何か他の蛋白質である一般
式Ｘ−PE₄₀の融合蛋白質はそれらの夫々の細胞のレセプ
ターに対しての改良された結合特性を有する。

実施例８ヒトのケラチノサイトに対するTGF−α−PE₄₀abの生物
学的活性モスマン、ジェー・インミュノル・メソーズ65（Mossma
nn,J.Immunol.Methods65）55−63頁（1983）の細胞増殖
アッセイを用いたところ、TGF−α−PE₄₀abは、そのア
ッセイにおいて用いられるヒトのケラチノサイトを容易
に殺した。ケラチノサイトの50％を殺すのに必要なTGF
−α−PE₄₀abの濃度（ED50）は11nMであった。

【図面の簡単な説明】

図面は、実施例２の操作で得られたプラスミドを示す図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者グウイネスエム．エドワーズアメリカ合衆国，19426 ペンシルヴアニア，カレツジヴイル，グランジアヴエニユー 987 (56)参考文献特開昭59−93093（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／2401（ＷＯ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，Ｎｏ．13，Ｐ. 4538−4542（1987) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81，Ｎｏ．９，Ｐ. 2645−2649（1984)

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも265位と287位の２つのシステイ
ン残基を、ジスルフィド結合を形成しない同じかまたは
異なっていてもよい２つのアミノ酸で置換または除去す
ることにより改変されたPE₄₀領域と、それに結合したタ
ンパク質ターゲティング剤領域とからなり、ターゲティ
ング剤により認識された受容体に結合するハイブリッド
タンパク質（但しPE₄₀は細胞結合領域を欠くシュードモ
ナスエキソトキシンＡの分子量40kDの断片である）。
【請求項２】ターゲティング剤が成長因子、ホルモン、
または抗体である請求項１記載のハイブリッドタンパク
質。
【請求項３】少なくとも265位と287位の２つのシステイ
ン残基が置換されている請求項１記載のハイブリッドタ
ンパク質。
【請求項４】４つのシステイン残基が置換されている請
求項３記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項５】少なくとも１つのシステイン残基がアラニ
ンで置換されている請求項３記載のハイブリッドタンパ
ク質。
【請求項６】少なくとも265位と287位の２つのシステイ
ン残基がアラニンで置換されている請求項３記載のハイ
ブリッドタンパク質。
【請求項７】４つのシステイン残基がアラニンで置換さ
れている請求項４記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項８】少なくとも１つのシステイン残基が、ジス
ルフィド結合を形成しないアラニン以外のアミノ酸で置
換されている請求項３記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項９】少なくとも２つのシステイン残基が、ジス
ルフィド結合を形成しないアラニン以外のアミノ酸で置
換されている請求項３記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１０】４つのシステイン残基が、ジスルフィド
結合を形成しないアラニン以外のアミノ酸で置換されて
いる請求項３記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１１】少なくとも265位と287位の２つのシステ
イン残基が除去されている請求項１記載のハイブリッド
タンパク質。
【請求項１２】４つのシステイン残基が除去されている
請求項11記載のハイブリッドタンパク質。
【請求項１３】２つのシステイン残基が、ジスルフィド
結合を形成しないアミノ酸で置換されており、２つのシ
ステイン残基が除去されている請求項１記載のハイブリ
ッドタンパク質。
【請求項１４】請求項１のハイブリッドタンパク質をコ
ードするDNAを含有し、適切な原核生物または真核生物
宿主にハイブリッドタンパク質を発現させるのに適合し
たプラスミド。
【請求項１５】請求項１のハイブリッドタンパク質をコ
ードするDNAを含有するプラスミドを、適切な原核生物
または真核生物宿主細胞に挿入し、ハイブリッドタンパ
ク質が産生される条件下で宿主細胞を成長させることよ
りなる請求項１のハイブリッドタンパク質を産生する方
法。
【請求項１６】細胞毒有効量の請求項１記載のハイブリ
ッドタンパク質と、生理学的に許容される担体とを含有
する組成物。
【請求項１７】ヒト以外の哺乳動物に請求項１記載のハ
イブリッドタンパク質の細胞毒有効量からなる組成物を
投与することからなる、標的細胞を選択的に殺す方法。
【請求項１８】組成物が生理学的に許容される担体を含
有するものである請求項17記載の方法。
【請求項１９】ケラチン生成細胞の増殖を阻止するのに
効果的な量の請求項１記載のハイブリッドタンパク質で
増殖細胞を処理することよりなる、ケラチン生成細胞の
増殖を処置する方法。
【請求項２０】ターゲティング剤が成長因子、ホルモ
ン、または抗体である請求項19記載の方法。