JPH069697A - バクテリオロドプシン−二重突然変異体 - Google Patents
バクテリオロドプシン−二重突然変異体Info
- Publication number
- JPH069697A JPH069697A JP3304973A JP30497391A JPH069697A JP H069697 A JPH069697 A JP H069697A JP 3304973 A JP3304973 A JP 3304973A JP 30497391 A JP30497391 A JP 30497391A JP H069697 A JPH069697 A JP H069697A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- halobacterium
- gene
- strain
- bacteriorhodopsin
- opsin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/215—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Halobacteriaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 バクテリオロドプシンの二重突然変異体及び
ハロバクテリア中でのその表現 【構成】 ハロバクテリア野生型菌株のオプシンの８５
及び９６位が突然変異されている。 【効果】 突然変異体は、その基底状態及びその長生き
中間体の変えられた吸収極大を有し、プロトンの代わり
にアニオンをポンプする。
ハロバクテリア中でのその表現 【構成】 ハロバクテリア野生型菌株のオプシンの８５
及び９６位が突然変異されている。 【効果】 突然変異体は、その基底状態及びその長生き
中間体の変えられた吸収極大を有し、プロトンの代わり
にアニオンをポンプする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、バクテリオロドプシン
−二重突然変異体に関する。
−二重突然変異体に関する。
【０００２】
【従来の技術】バクテリオロドプシンは、ハロバクテリ
ア、例えばハロバクテリウム ハロビウム中に存在し、
蛋白質分（バクテリオオプシン）およびクロモホ−ル
（レチナ−ル）から成る光で活性化可能なプロトンポン
プ（Protonenpumpe）である（例えば、Oesterheltおよ
びTittor，ＴＩＢＳ １４（１９８９），５７−６１参
照）。ハロバクテリウム ハロビウムの野生型から得ら
れる天然のバクテリオロドプシンは、波長５７０ｎｍで
吸収極大を有する。
ア、例えばハロバクテリウム ハロビウム中に存在し、
蛋白質分（バクテリオオプシン）およびクロモホ−ル
（レチナ−ル）から成る光で活性化可能なプロトンポン
プ（Protonenpumpe）である（例えば、Oesterheltおよ
びTittor，ＴＩＢＳ １４（１９８９），５７−６１参
照）。ハロバクテリウム ハロビウムの野生型から得ら
れる天然のバクテリオロドプシンは、波長５７０ｎｍで
吸収極大を有する。
【０００３】励起された状態の中間体の吸収極大は、４
１２ｎｍの波長を有する。バクテリオロドプシンは、細
胞膜即ち紫膜（Purpurmembran）の二次元の結晶領域内
で組織されている。ハロバクテリウム ハロビウムの細
胞膜の８０％までは、この紫膜から成っていてよい。こ
の紫膜の形のバクテリオロドプシンの単離は、公知の薬
剤を用いて可能である（OesterheltおよびSteckenius,M
etodeｓ Enzymol.31Biomembranes,667-678,1974）。
１２ｎｍの波長を有する。バクテリオロドプシンは、細
胞膜即ち紫膜（Purpurmembran）の二次元の結晶領域内
で組織されている。ハロバクテリウム ハロビウムの細
胞膜の８０％までは、この紫膜から成っていてよい。こ
の紫膜の形のバクテリオロドプシンの単離は、公知の薬
剤を用いて可能である（OesterheltおよびSteckenius,M
etodeｓ Enzymol.31Biomembranes,667-678,1974）。
【０００４】ハロバクテリアは、バクテリオロドプシン
と共にハロロドプシン、光駆動性のクロリド−、ブロミ
ド−、ヨ−ジドポンプを形成する。これは、その構造が
バクテリオロドプシンと非常に類似しているが、細胞膜
の紫膜類似の構造では形成されない。この細胞膜中のハ
ロロドプシンの含量は、そのバクテリオロドプシンの１
０分の１である。このハロロドプシンの単離は、その特
性に基づき極めて経費がかかる。バクテリオロドプシン
と同様に、ハロロドプシンは、基底状態の吸収極大が５
７８ｎｍの波長にある光サイクルを有する。この長生き
中間体は５２０ｎｍの吸収極大を有する。
と共にハロロドプシン、光駆動性のクロリド−、ブロミ
ド−、ヨ−ジドポンプを形成する。これは、その構造が
バクテリオロドプシンと非常に類似しているが、細胞膜
の紫膜類似の構造では形成されない。この細胞膜中のハ
ロロドプシンの含量は、そのバクテリオロドプシンの１
０分の１である。このハロロドプシンの単離は、その特
性に基づき極めて経費がかかる。バクテリオロドプシン
と同様に、ハロロドプシンは、基底状態の吸収極大が５
７８ｎｍの波長にある光サイクルを有する。この長生き
中間体は５２０ｎｍの吸収極大を有する。
【０００５】バクテリオロドプシンおよび他のロドプシ
ンの光化学的特性に基づき、これらの物質をビオコンピ
ュ−タ用に、又は型認識（Mustererkennnung）のために
使用する試みがなされている（Biosystems １９（１９
８６）、２２３−２３６）。この目的のために、バクテ
リオロドプシンおよび光サイクルにおける中間体の吸収
極大を、野生型バクテリオロドプシンの励起のために必
要である、高価な特殊レ−ザ−を価格的に妥当な慣用の
レ−ザ−で換えることができるように長い波長に移すこ
とが望ましい。
ンの光化学的特性に基づき、これらの物質をビオコンピ
ュ−タ用に、又は型認識（Mustererkennnung）のために
使用する試みがなされている（Biosystems １９（１９
８６）、２２３−２３６）。この目的のために、バクテ
リオロドプシンおよび光サイクルにおける中間体の吸収
極大を、野生型バクテリオロドプシンの励起のために必
要である、高価な特殊レ−ザ−を価格的に妥当な慣用の
レ−ザ−で換えることができるように長い波長に移すこ
とが望ましい。
【０００６】光エネエルギ−を用いてクロリドイオンを
ポンプすることができるようにするためには、バクテリ
オロドプシンの特性を、溶液の脱塩のための使用に重要
であろう。従来、ハロロドプシンの取得は、経済的使用
を可能としない程度に高価であった。従って、このハロ
ロドプシンの特性を有する紫膜の形のロドプシンを単離
できるようにすることが望まれている。
ポンプすることができるようにするためには、バクテリ
オロドプシンの特性を、溶液の脱塩のための使用に重要
であろう。従来、ハロロドプシンの取得は、経済的使用
を可能としない程度に高価であった。従って、このハロ
ロドプシンの特性を有する紫膜の形のロドプシンを単離
できるようにすることが望まれている。
【０００７】従来、光サイクルおよび吸収極大への突然
変異の影響を示したバクテリオロドプシンの多くの突然
変異体は公知である。
変異の影響を示したバクテリオロドプシンの多くの突然
変異体は公知である。
【０００８】モギ（Mogi）等（PNAS US 85,4148-4152,1
988）は、８５、９６、１１５および２１２の位置のア
ミノ酸ＡｓｐがＧｌｕおよびＡｓｎに換えられている単
一アミノ酸突然変異体を記載している。他の突然変異体
では、２１２位でＡｓｐがＡｓｎ，Ｇｌｕ又はＡｌａに
換えられている。蛋白質の表現がＥ．コリ−中で起こっ
た。Ｅ．コリ−からこの蛋白質を精製した。界面活性
剤、燐脂質処理及びレチナ−ルの添加によリ、バクテリ
オロドプシン類似のクロモフォ−ルが再生された。プロ
トン移動は、Ａｓｐ−８５のＡｓｎへの、かつ部分的な
（＜１０％）Ａｓｐ−９６のＡｓｎへのかつＡｓｐ−２
１２のＧｌｕへの交換により完全に停止された（aufgeh
oben wurden）ことが明らかであった。Ａｓｐ−８５の
Ａｓｎへの変異は、吸収極大をλｍａｘ＝５９０ｎｍに
移動した。
988）は、８５、９６、１１５および２１２の位置のア
ミノ酸ＡｓｐがＧｌｕおよびＡｓｎに換えられている単
一アミノ酸突然変異体を記載している。他の突然変異体
では、２１２位でＡｓｐがＡｓｎ，Ｇｌｕ又はＡｌａに
換えられている。蛋白質の表現がＥ．コリ−中で起こっ
た。Ｅ．コリ−からこの蛋白質を精製した。界面活性
剤、燐脂質処理及びレチナ−ルの添加によリ、バクテリ
オロドプシン類似のクロモフォ−ルが再生された。プロ
トン移動は、Ａｓｐ−８５のＡｓｎへの、かつ部分的な
（＜１０％）Ａｓｐ−９６のＡｓｎへのかつＡｓｐ−２
１２のＧｌｕへの交換により完全に停止された（aufgeh
oben wurden）ことが明らかであった。Ａｓｐ−８５の
Ａｓｎへの変異は、吸収極大をλｍａｘ＝５９０ｎｍに
移動した。
【０００９】Ｓｏｐｐａ等（ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４，２２，１３０４９−１３０５６，（１９８
９））は、次の単一アミノ酸変異：Ａｓｐ−８５からＧ
ｌｕ；ＡｓｐからＡｓｎ；Ａｓｐ−９６からＧｌｙを有
するバクテリオロドプシン ムテインを記載している。
これらのムテインはレントゲン−又はＵＶ−線照射によ
る統計的突然変異生成により得られ、かつ光合成的に負
の表現型のブロムデオキシウラシル−選択により選択さ
れる。従って、これらは、合目的的には得られなかっ
た。Ｍｏｇｉ等により試験された変性蛋白質とは異な
り、このムテインは、ハロバクテリア中に発現され、こ
れから紫膜類似の構造で単離された。
２６４，２２，１３０４９−１３０５６，（１９８
９））は、次の単一アミノ酸変異：Ａｓｐ−８５からＧ
ｌｕ；ＡｓｐからＡｓｎ；Ａｓｐ−９６からＧｌｙを有
するバクテリオロドプシン ムテインを記載している。
これらのムテインはレントゲン−又はＵＶ−線照射によ
る統計的突然変異生成により得られ、かつ光合成的に負
の表現型のブロムデオキシウラシル−選択により選択さ
れる。従って、これらは、合目的的には得られなかっ
た。Ｍｏｇｉ等により試験された変性蛋白質とは異な
り、このムテインは、ハロバクテリア中に発現され、こ
れから紫膜類似の構造で単離された。
【００１０】Ａｓｐ−９６の変異は、光サイクルの反応
速度を遅らせた。ここでは、バクテリオロドプシンのス
ペクトル特性の変化は現われなかった。アミノ酸Ａｓｐ
−８５のＧｌｕへの交換は、吸収極大を５６８ｎｍから
６１０ｎｍへ移動させる。アミノ酸Ｇｌｕ−８５の脱蛋
白は、この吸収極大を約５３０ｎｍに移行させる。
速度を遅らせた。ここでは、バクテリオロドプシンのス
ペクトル特性の変化は現われなかった。アミノ酸Ａｓｐ
−８５のＧｌｕへの交換は、吸収極大を５６８ｎｍから
６１０ｎｍへ移動させる。アミノ酸Ｇｌｕ−８５の脱蛋
白は、この吸収極大を約５３０ｎｍに移行させる。
【００１１】サブラマニアム等（Subramaniam； Proc.
Natl.Acad.Sci ＵＳＡ，８７，１０１３−１０１７，
１９９０）は、Ａｓｐ−８５位およびＡｒｇ−８２位で
の変異によるバクテリオロドプシンの吸収極大を試験し
ている。Ａｓｐ−８５からＡｓｎへの交換は、青色クロ
モフォ−ル（λｍａｘ＝５８８ｎｍ）を生じる。プロト
ン移動は、もはや認められない。光サイクルの試験は行
われなかった。
Natl.Acad.Sci ＵＳＡ，８７，１０１３−１０１７，
１９９０）は、Ａｓｐ−８５位およびＡｒｇ−８２位で
の変異によるバクテリオロドプシンの吸収極大を試験し
ている。Ａｓｐ−８５からＡｓｎへの交換は、青色クロ
モフォ−ル（λｍａｘ＝５８８ｎｍ）を生じる。プロト
ン移動は、もはや認められない。光サイクルの試験は行
われなかった。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、長波
長の領域に移動する吸収極大並びに吸収極大λ＞５００
ｎｍを有する長生き中間体を有する光サイクルを有する
バクテリオロドプシン変異体を製造することであった。
長の領域に移動する吸収極大並びに吸収極大λ＞５００
ｎｍを有する長生き中間体を有する光サイクルを有する
バクテリオロドプシン変異体を製造することであった。
【００１３】もう一つの本発明の課題は、アニオンをポ
ンプ（ｐｕｍｐ）するバクテリオロドプシンを製造する
ことであった。
ンプ（ｐｕｍｐ）するバクテリオロドプシンを製造する
ことであった。
【００１４】もう一つの課題は、このバクテリオロドプ
シン−ムテインを，有効に生物学的に活性な形で発現さ
せ、二次元的リポイド蛋白質結晶の形で紫膜を単離する
ことができるようにすることであった。
シン−ムテインを，有効に生物学的に活性な形で発現さ
せ、二次元的リポイド蛋白質結晶の形で紫膜を単離する
ことができるようにすることであった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の目的は、バクテ
リオロドプシンの二重変異体であり、これは、ハロバク
テリア野生型のオプシンのアミノ酸位置８５及び９６が
突然変異されていることを特徴とする。
リオロドプシンの二重変異体であり、これは、ハロバク
テリア野生型のオプシンのアミノ酸位置８５及び９６が
突然変異されていることを特徴とする。
【００１６】有利な１実施形では、このオプシンのアミ
ノ酸位置８５および９６がＡｓｐからＡｓｎに変異され
ている（Ｄ８５７９６Ｎ）。
ノ酸位置８５および９６がＡｓｐからＡｓｎに変異され
ている（Ｄ８５７９６Ｎ）。
【００１７】有利な１実施形では、このオプシンは、ハ
ロバクテリウム ハロビウムの野性型から由来する。
ロバクテリウム ハロビウムの野性型から由来する。
【００１８】本発明のもう一つの目的はバクテリオロド
プシンの多重突然変異体であり、これは、光駆動アニオ
ンをポンプする。
プシンの多重突然変異体であり、これは、光駆動アニオ
ンをポンプする。
【００１９】本発明は、更に、バクテリオロドプシンの
多重変異体を包含し、これは、その吸収極大が５７８ｎ
ｍよりも大きいことを特徴としている。
多重変異体を包含し、これは、その吸収極大が５７８ｎ
ｍよりも大きいことを特徴としている。
【００２０】本発明のもう一つ目的物は、バクテリオロ
ドプシンの本発明の突然変異体を産生するハロバクテリ
ア菌株からの紫膜である。
ドプシンの本発明の突然変異体を産生するハロバクテリ
ア菌株からの紫膜である。
【００２１】更に、本発明は、このバクテリオロドプシ
ン多重変異体産生性のハロバクテリア菌株の製法を包含
し、これは、次の工程よりなる： １）オプシン遺伝子に、方向付けされた突然変異生成を
行わせ ２）工程１）で突然変異生成されたオプシン遺伝子に相
当するオプシン遺伝子が不活性であるか又はｂｏｐ遺伝
子および他のレチナ−ル蛋白質遺伝子を欠いている、ハ
ロバクテリウムの菌株の細胞を、工程１）で突然変異さ
れたオプシン遺伝子のコピ−少なくとも１個を有する組
換えハロバクテリア ベクタ−を用いて形質変換させ、
かつ ３）この形質変換されたハロバクテリウム ハロビウム
細胞を再生させ、かつ培養する。
ン多重変異体産生性のハロバクテリア菌株の製法を包含
し、これは、次の工程よりなる： １）オプシン遺伝子に、方向付けされた突然変異生成を
行わせ ２）工程１）で突然変異生成されたオプシン遺伝子に相
当するオプシン遺伝子が不活性であるか又はｂｏｐ遺伝
子および他のレチナ−ル蛋白質遺伝子を欠いている、ハ
ロバクテリウムの菌株の細胞を、工程１）で突然変異さ
れたオプシン遺伝子のコピ−少なくとも１個を有する組
換えハロバクテリア ベクタ−を用いて形質変換させ、
かつ ３）この形質変換されたハロバクテリウム ハロビウム
細胞を再生させ、かつ培養する。
【００２２】本発明の目的物は、ホログラフィ法での光
学的情報−処理のために使用することができる。その例
は、適性時インターフェロメトリー（Echtzeitinterfer
ometrie）、型認識及び可逆的ハログラフィ情報供給で
ある。もう一つの使用可能性は、塩含有溶液の脱塩のた
めの使用である。
学的情報−処理のために使用することができる。その例
は、適性時インターフェロメトリー（Echtzeitinterfer
ometrie）、型認識及び可逆的ハログラフィ情報供給で
ある。もう一つの使用可能性は、塩含有溶液の脱塩のた
めの使用である。
【００２３】本発明によれば、特定のオプシン遺伝子を
目標として突然変異生成される。この目標突然変異生成
は、Ｈ．ハロビウム細胞以外に、分子生物学の分野の当
業者に公知の方法（例えばオリゴヌクレオチド方向突然
変異、化学的ＤＮＡ−合成又はＰＣＲ−反応）により行
った。突然変異生成とは、オプシン遺伝子中での２個以
上のヌクレオチドの交換であり、これは、さらに、生ず
る遺伝子生成物、レチナール蛋白質中のアミノ酸残基の
特異的交換をもたらす。バクテリオロドプシンでは、突
然変異生成は、有利に、イオン通路を形成するアミノ酸
によるか又は有利にレチナール形成に関与し、従って、
色及び光サイクルに影響をおよぼすアミノ酸により行わ
れる。特に、このオプシンの８５位及び９６位に突然変
異を起こすのが有利である。
目標として突然変異生成される。この目標突然変異生成
は、Ｈ．ハロビウム細胞以外に、分子生物学の分野の当
業者に公知の方法（例えばオリゴヌクレオチド方向突然
変異、化学的ＤＮＡ−合成又はＰＣＲ−反応）により行
った。突然変異生成とは、オプシン遺伝子中での２個以
上のヌクレオチドの交換であり、これは、さらに、生ず
る遺伝子生成物、レチナール蛋白質中のアミノ酸残基の
特異的交換をもたらす。バクテリオロドプシンでは、突
然変異生成は、有利に、イオン通路を形成するアミノ酸
によるか又は有利にレチナール形成に関与し、従って、
色及び光サイクルに影響をおよぼすアミノ酸により行わ
れる。特に、このオプシンの８５位及び９６位に突然変
異を起こすのが有利である。
【００２４】ハロバクテリム中のムテインの表現のため
に重要なことは、形質変換のために、その都度の変異さ
れたオプシン遺伝子に相当するオプシン遺伝子が不活性
であるか又はｂｏｐ−遺伝子及び他のレチナ−ル蛋白質
遺伝子を欠いているハロバクテリウム ハロビウム菌株
を使用することである。このオプシン遺伝子の不活性化
は、遺伝子工学的挿入、欠失又はその他の変更によりお
こなうことができ、従って、この細菌菌株は、もはやこ
の細胞中に機能的オプシンを表現することはできない。
しかしながらこの細胞は、形質変換された細胞中で顔料
としてオプシンと結合してそれぞれのレチナ−ル蛋白質
になることのできるレチナ−ルを合成することができる
べきである。好適な細菌菌株は、例えば、バクテリオオ
プシン遺伝子中にＩＳＨＩ−挿入を含有するＨ．ハロビ
ウムＩＶ−８である（Betlach等のAppl.Microbiol．７
（１９８６）、８３−８９）。同様に、バクテリオオプ
シン遺伝子内部にＩＳＨ２−挿入を含有するＨ．ハロビ
ウム菌株Ｌ３３（ＤＳＭ５７３５）（DasSarmaらのPro
c.Nat.Acad.Sci.USA ８１（１９８４），１２５−１２
９）又はＨＮ５（ＢＲ￣ＨＲ￣挿入）（ＤＳＭ６２２
９）は、非常に好適である。Ｈ．ハロビウム菌株Ｌ３３
は、Ｈ．ハロビウムにおける公知の、極めて高い自然突
然変異率にもかかわらず、一般にこの菌株は、従来から
安定であることで優れている。菌株Ｌ３３ におけると
同様に、ＨＮ５中でもバクテリオオプシン遺伝子（ｂｏ
ｐ）は、約１ｋｂの大きさの挿入エレメントにより不活
性化される。この挿入エレメントは、このｂｏｐ−遺伝
子のアミノ末端部またはプロモ−タ−領域内に存在す
る。しかしながら、付加的にＨＮ５中に約１ｋｂの大き
さの挿入エレメントがハロロドプシンの蛋白質部に関し
てコ−ドするｈｏｐ−遺伝子の領域内に存在する。この
挿入により、この菌株ＨＮ５は、表現型バクテリオロド
プシン−及びハロロドプシン−陰性である。
に重要なことは、形質変換のために、その都度の変異さ
れたオプシン遺伝子に相当するオプシン遺伝子が不活性
であるか又はｂｏｐ−遺伝子及び他のレチナ−ル蛋白質
遺伝子を欠いているハロバクテリウム ハロビウム菌株
を使用することである。このオプシン遺伝子の不活性化
は、遺伝子工学的挿入、欠失又はその他の変更によりお
こなうことができ、従って、この細菌菌株は、もはやこ
の細胞中に機能的オプシンを表現することはできない。
しかしながらこの細胞は、形質変換された細胞中で顔料
としてオプシンと結合してそれぞれのレチナ−ル蛋白質
になることのできるレチナ−ルを合成することができる
べきである。好適な細菌菌株は、例えば、バクテリオオ
プシン遺伝子中にＩＳＨＩ−挿入を含有するＨ．ハロビ
ウムＩＶ−８である（Betlach等のAppl.Microbiol．７
（１９８６）、８３−８９）。同様に、バクテリオオプ
シン遺伝子内部にＩＳＨ２−挿入を含有するＨ．ハロビ
ウム菌株Ｌ３３（ＤＳＭ５７３５）（DasSarmaらのPro
c.Nat.Acad.Sci.USA ８１（１９８４），１２５−１２
９）又はＨＮ５（ＢＲ￣ＨＲ￣挿入）（ＤＳＭ６２２
９）は、非常に好適である。Ｈ．ハロビウム菌株Ｌ３３
は、Ｈ．ハロビウムにおける公知の、極めて高い自然突
然変異率にもかかわらず、一般にこの菌株は、従来から
安定であることで優れている。菌株Ｌ３３ におけると
同様に、ＨＮ５中でもバクテリオオプシン遺伝子（ｂｏ
ｐ）は、約１ｋｂの大きさの挿入エレメントにより不活
性化される。この挿入エレメントは、このｂｏｐ−遺伝
子のアミノ末端部またはプロモ−タ−領域内に存在す
る。しかしながら、付加的にＨＮ５中に約１ｋｂの大き
さの挿入エレメントがハロロドプシンの蛋白質部に関し
てコ−ドするｈｏｐ−遺伝子の領域内に存在する。この
挿入により、この菌株ＨＮ５は、表現型バクテリオロド
プシン−及びハロロドプシン−陰性である。
【００２５】ハロバクテリアの形質変換のために、まず
スフェロブラスト（Spheroblast）を製造することが必
要である。これは、クライン等（Cline,J.Bacteriol.17
1(1989),4987-4991）又はニイ等（Ni,Gene90 1990,169-
172）による慣用の方法で行うことができる Ｈ．ハロビウムの形質変換は、バクテリオファ−ジ−Ｄ
ＮＡ，プラスミド−ＤＮＡ及び線状ゲノムＤＮＡを用い
て可能である（Cline 、Can.J.Microbiol.35(1989),148
-152）．従って、原則的に、本発明方法のための組換え
ハロバクテリアベクタ−としてバクテリオファ−ジ、プ
ラスミド又は線状ＤＮＡ分子を使用することができる。
Ｈ．ハロビウム スフェロブラスト中に変異されたオプ
シン遺伝子を導入するために、プラスミドを使用するの
が有利である。Ｈ．ハロビウムの形質変換のために原則
的に好適なプラスミドベクタ−は、例えばハケット及び
ダッサルマにより記載されている（Can.J.Microbiol.35
(1989),86-91）。このようなプラスミド中に、既に変異
されていてよいオプシン遺伝子を常法でクロ−ニング導
入することができる。バクテリオロドプシン−ムテイン
を表現すべき場合には、このベクタ−は、場合によりバ
クテリオオプシン−遺伝子（ｂｏｐ）と並んで付加的に
ハロバクテリウム ハロビウムからのｂｒｐ−遺伝子を
含有することができる。更に、構造遺伝子の周り（例え
ば、プロモ−タ−領域）での遺伝子生成物の表現を高め
るために、変化を導入することができる。本発明の方法
で使用されているハロバクテリアベクタ−は、一個の選
択マ−カ−を含有し、従って形質変換された細胞への良
好な選択が可能である。ハロバクテリアに対して使用可
能な選択マ−カ−は、例えばプラスミドｐＨ４５５上に
存在する（Lam及びDoolittle,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
6 (1989),5478-5482）。プラスミドｐＨ４５５の１５．
８ｋｂＨｉｎｄIII−フラグメントは、Ｈ．ハロビウム
及びＨ．ボルカニイ（ｖｏｌｃａｎｉｉ）中のＨＭＧ−
ＣｏＡ−レダクタ−ゼ−インヒビタ− メビノリン（Me
vinolin;Monakolin K）（３α−Methylcompactin）に対
して抵抗作用をする遺伝子を有する。特に有利に、付加
的な遺伝子エレメントを含有するいわゆるハロバクテリ
ウムＥ．コリ−“シャトルベクタ−”は、Ｅ．コリ−中
の増殖及び選択を可能にする。
スフェロブラスト（Spheroblast）を製造することが必
要である。これは、クライン等（Cline,J.Bacteriol.17
1(1989),4987-4991）又はニイ等（Ni,Gene90 1990,169-
172）による慣用の方法で行うことができる Ｈ．ハロビウムの形質変換は、バクテリオファ−ジ−Ｄ
ＮＡ，プラスミド−ＤＮＡ及び線状ゲノムＤＮＡを用い
て可能である（Cline 、Can.J.Microbiol.35(1989),148
-152）．従って、原則的に、本発明方法のための組換え
ハロバクテリアベクタ−としてバクテリオファ−ジ、プ
ラスミド又は線状ＤＮＡ分子を使用することができる。
Ｈ．ハロビウム スフェロブラスト中に変異されたオプ
シン遺伝子を導入するために、プラスミドを使用するの
が有利である。Ｈ．ハロビウムの形質変換のために原則
的に好適なプラスミドベクタ−は、例えばハケット及び
ダッサルマにより記載されている（Can.J.Microbiol.35
(1989),86-91）。このようなプラスミド中に、既に変異
されていてよいオプシン遺伝子を常法でクロ−ニング導
入することができる。バクテリオロドプシン−ムテイン
を表現すべき場合には、このベクタ−は、場合によりバ
クテリオオプシン−遺伝子（ｂｏｐ）と並んで付加的に
ハロバクテリウム ハロビウムからのｂｒｐ−遺伝子を
含有することができる。更に、構造遺伝子の周り（例え
ば、プロモ−タ−領域）での遺伝子生成物の表現を高め
るために、変化を導入することができる。本発明の方法
で使用されているハロバクテリアベクタ−は、一個の選
択マ−カ−を含有し、従って形質変換された細胞への良
好な選択が可能である。ハロバクテリアに対して使用可
能な選択マ−カ−は、例えばプラスミドｐＨ４５５上に
存在する（Lam及びDoolittle,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8
6 (1989),5478-5482）。プラスミドｐＨ４５５の１５．
８ｋｂＨｉｎｄIII−フラグメントは、Ｈ．ハロビウム
及びＨ．ボルカニイ（ｖｏｌｃａｎｉｉ）中のＨＭＧ−
ＣｏＡ−レダクタ−ゼ−インヒビタ− メビノリン（Me
vinolin;Monakolin K）（３α−Methylcompactin）に対
して抵抗作用をする遺伝子を有する。特に有利に、付加
的な遺伝子エレメントを含有するいわゆるハロバクテリ
ウムＥ．コリ−“シャトルベクタ−”は、Ｅ．コリ−中
の増殖及び選択を可能にする。
【００２６】このベクタ−上のハロバクテリア選択マ−
カ−の存在は有利であるが必ずしも必要ではない。それ
というのも、正の形質変換された細胞上の選択は、レチ
ナ−ル蛋白質の表現により限定される細胞の変色によっ
ても行うことができるからである。
カ−の存在は有利であるが必ずしも必要ではない。それ
というのも、正の形質変換された細胞上の選択は、レチ
ナ−ル蛋白質の表現により限定される細胞の変色によっ
ても行うことができるからである。
【００２７】本発明方法の特に有利な１実施形では、組
換えプラスミドｐ３１９の突然変異誘導体がハロバクテ
リア ベクタ−として働く。ｐ３１９の突然変異誘導体
の構成の詳細は、図面中に示されている。
換えプラスミドｐ３１９の突然変異誘導体がハロバクテ
リア ベクタ−として働く。ｐ３１９の突然変異誘導体
の構成の詳細は、図面中に示されている。
【００２８】プラスミド−ＤＮＡを用いるハロビウムの
形質変換は、原則的には公知である（Ｃｌｉｎｅ等のCa
n.J.Microbil.35(1989),148-152．Ｎｉ等のGene90(199
0),169-172）。
形質変換は、原則的には公知である（Ｃｌｉｎｅ等のCa
n.J.Microbil.35(1989),148-152．Ｎｉ等のGene90(199
0),169-172）。
【００２９】次の配列１中にこの突然変異オリゴヌクレ
オチドＤ８５,９６Ｎのヌクレオチド配列を示す：
オチドＤ８５,９６Ｎのヌクレオチド配列を示す：
【００３０】
【化１】
【００３１】ＲＮＡに対する相補的配列が記載されてい
る。＊は、ＣがＴで換えられた位置を示す。
る。＊は、ＣがＴで換えられた位置を示す。
【００３２】図面中では次の略字を使用する：
【００３３】
【化２】
【００３４】図１は、プラスミドＭｃ５−８／ｂｏｐの
制限地図を示している。
制限地図を示している。
【００３５】図２は、天然ｂｏｐ遺伝子の突然変異生成
を図示している。
を図示している。
【００３６】図３は、ｐＷＴ７８の構成を示している。
【００３７】図４は、ｐ３１９／Ｄ８５,９６Ｎの構成
を示している。
を示している。
【００３８】
【実施例】次の例で、本発明を更に詳説する 例１ ｂｏｐ−遺伝子の生体内突然変異生成、変異されたｂｏ
ｐ−遺伝子を有するベクタ−でのＨ．ハロビウムのｂｏ
ｐ陰性の菌株の形質変換及び変更されたバクテリオロド
プシンの表現の立証 １．突然変異生成 プラスミドｐＭｃ５−８／ｂｏｐ（図１）は、ＳａｌＩ
で切断された突然変異ベクタ−ｐＭｃ５−８（Stanssen
s等のNucleic Acids Research 17,4441-4454,1989）中
でクロ−ニングされたＨ．ハロビウムからのｂｏｐ−遺
伝子を有する０．９ｋｂの大きさのＳａｌＩフラグメン
トより成る。得られたプラスミドｐＭｃ５−８／ｂｏｐ
（図１）は、不活性アンピシリン−抵抗遺伝子（ｂｌａ
＊）並びに活性クロラムフェニコ−ルアセチルトランス
フェラ−ゼ−遺伝子（ｃａｔ）を有する。ｐＭｃ５−８
／ｂｏｐをスタンセン等の方法（Stanssens;Nucleic Ac
ids Research 17,4441-4454,1989）により突然変異させ
た。このために、ｐＭｃ５−８／ｂｏｐの一本鎖ＤＮＡ
を単離し、ｐＭａ５−８のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ−フラ
グメントとハイブリド結合させた。プラスミドｐＭａ５
−８は、不活性クロラムフェニコ−ルアセチルトランス
フェラ−ゼ−遺伝子（ｃａｔ＊）並びに活性アンピシリ
ン−抵抗遺伝子（ｂｌａ）を有する。ギャップ二本鎖Ｄ
ＮＡの製造のために、ｐＭａ５−８フラグメント（０．
１ｐモル）及び一本鎖ＤＮＡ（０．５ｐモル）よりなる
混合物を、３６μｌの量で、３７℃で５分間インキュベ
−トし、次いでハイブリド化緩衝液（１．５Ｍ ＫＣ
ｌ，１００ｍＭトリス／Ｃｌ ｐＨ７．５）４μｌの添
加の後に、７０℃に加熱し、室温まで冷却した。次い
で、このバッチ８μｌを突然変異性オリゴヌクレオチド
４〜１０ｐモル（２μｌ）と混合し、ハイブリド形成の
ために５分間６５℃に加熱し、室温まで冷却した。この
突然変異生成のために使用された７０マ−のオルゴヌク
レオチドは、ｂｏｐ−遺伝子中の８５及び９６位でのＡ
ｓｐの代わりにそれぞれＡｓｎに関してコ−ドした（配
列１）。ＤＮＡ−ポルメラ−ゼ／リパ−ゼ−反応のため
に、このバッチに１０倍緩衝液（ＫＣｌ ６２５ｍＭ、
トリス−ＨＣｌ ２７５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １５０ｍ
Ｍ、ＤＴＴ ２０ｍＭ、ＡＴＰ ０．５ｍＭ、４個のｄ
ＮＴＰ各々０．２５ｍＭ，ｐＨ７．５）４μｌを加え、
Ｈ2Ｏで４０μｌにし、ＤＮＡ−ポリメラ−ゼ（クレノ
フ−フラグメント）１単位及びＴ４−ＤＮＡ５単位の添
加の後、室温で４５分間インキュベ−トした。ＤＮＡ−
ポリメラ-ゼ/リガ-ゼ-バッチの形質変換の後に、双方の
連鎖の異なる抵抗マ-カ-を用いて、変異された連鎖(ア
ンピシリン-抵抗)を選択した。これによりプラスミドｐ
ＭａＤ８５１,９６Ｎ（図２、図３）が得られた。この
プラスミドは、８５及び９６位に、変異されたｂｏｐ−
遺伝子を含有する。
ｐ−遺伝子を有するベクタ−でのＨ．ハロビウムのｂｏ
ｐ陰性の菌株の形質変換及び変更されたバクテリオロド
プシンの表現の立証 １．突然変異生成 プラスミドｐＭｃ５−８／ｂｏｐ（図１）は、ＳａｌＩ
で切断された突然変異ベクタ−ｐＭｃ５−８（Stanssen
s等のNucleic Acids Research 17,4441-4454,1989）中
でクロ−ニングされたＨ．ハロビウムからのｂｏｐ−遺
伝子を有する０．９ｋｂの大きさのＳａｌＩフラグメン
トより成る。得られたプラスミドｐＭｃ５−８／ｂｏｐ
（図１）は、不活性アンピシリン−抵抗遺伝子（ｂｌａ
＊）並びに活性クロラムフェニコ−ルアセチルトランス
フェラ−ゼ−遺伝子（ｃａｔ）を有する。ｐＭｃ５−８
／ｂｏｐをスタンセン等の方法（Stanssens;Nucleic Ac
ids Research 17,4441-4454,1989）により突然変異させ
た。このために、ｐＭｃ５−８／ｂｏｐの一本鎖ＤＮＡ
を単離し、ｐＭａ５−８のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ−フラ
グメントとハイブリド結合させた。プラスミドｐＭａ５
−８は、不活性クロラムフェニコ−ルアセチルトランス
フェラ−ゼ−遺伝子（ｃａｔ＊）並びに活性アンピシリ
ン−抵抗遺伝子（ｂｌａ）を有する。ギャップ二本鎖Ｄ
ＮＡの製造のために、ｐＭａ５−８フラグメント（０．
１ｐモル）及び一本鎖ＤＮＡ（０．５ｐモル）よりなる
混合物を、３６μｌの量で、３７℃で５分間インキュベ
−トし、次いでハイブリド化緩衝液（１．５Ｍ ＫＣ
ｌ，１００ｍＭトリス／Ｃｌ ｐＨ７．５）４μｌの添
加の後に、７０℃に加熱し、室温まで冷却した。次い
で、このバッチ８μｌを突然変異性オリゴヌクレオチド
４〜１０ｐモル（２μｌ）と混合し、ハイブリド形成の
ために５分間６５℃に加熱し、室温まで冷却した。この
突然変異生成のために使用された７０マ−のオルゴヌク
レオチドは、ｂｏｐ−遺伝子中の８５及び９６位でのＡ
ｓｐの代わりにそれぞれＡｓｎに関してコ−ドした（配
列１）。ＤＮＡ−ポルメラ−ゼ／リパ−ゼ−反応のため
に、このバッチに１０倍緩衝液（ＫＣｌ ６２５ｍＭ、
トリス−ＨＣｌ ２７５ｍＭ、ＭｇＣｌ2 １５０ｍ
Ｍ、ＤＴＴ ２０ｍＭ、ＡＴＰ ０．５ｍＭ、４個のｄ
ＮＴＰ各々０．２５ｍＭ，ｐＨ７．５）４μｌを加え、
Ｈ2Ｏで４０μｌにし、ＤＮＡ−ポリメラ−ゼ（クレノ
フ−フラグメント）１単位及びＴ４−ＤＮＡ５単位の添
加の後、室温で４５分間インキュベ−トした。ＤＮＡ−
ポリメラ-ゼ/リガ-ゼ-バッチの形質変換の後に、双方の
連鎖の異なる抵抗マ-カ-を用いて、変異された連鎖(ア
ンピシリン-抵抗)を選択した。これによりプラスミドｐ
ＭａＤ８５１,９６Ｎ（図２、図３）が得られた。この
プラスミドは、８５及び９６位に、変異されたｂｏｐ−
遺伝子を含有する。
【００３９】２． ハロバクテリウム ハロビウム中で
の表現のための変異されたｂｏｐ−遺伝子の再クロ−ニ
ング（Umklonierung） ａ）Ｅ．コリ−ベクタ− 図３は、プラスミドｐＭａＤ８５，９６Ｎ及びｐＷＴ７
７からのｐＷｔ７８の構成を記載している。このプラス
ミドｐＷＴ７７は、市場で得られる、この中のＰｓｔＩ
−制限位置に、野生型ｂｏｐ−遺伝子及びｂｒｐ−遺伝
子を有するハロバクテリアＰｓｔＩ−フラグメントがク
ロ−ン導入されているＥ．コリ−プラスミドｐＧＥＭ４
である。ｐＷＴ７７をＨｉｎｄIIIと連結させ、Ａｓｐ
７１８で部分的に切断した。ベクタ−分（ｐＧＥＭ４）
及び野生型ｂｏｐ−遺伝子の5´-領域をを有する６．８
ｋｂ ＨｉｎｄIII／Ａｓｐ７１８フラグメントＷＴ７
７δＡＨを、ｂｏｐ−遺伝子の変異された3´−領域を
有するｐＭａＤ８５,９６ＮからのＨｉｎｄIII／Ａｓｐ
７１８−フラグメントと連結させた。この際、７．４ｋ
ｂの大きさのプラスミドｐＷＴ７８が生じた。
の表現のための変異されたｂｏｐ−遺伝子の再クロ−ニ
ング（Umklonierung） ａ）Ｅ．コリ−ベクタ− 図３は、プラスミドｐＭａＤ８５，９６Ｎ及びｐＷＴ７
７からのｐＷｔ７８の構成を記載している。このプラス
ミドｐＷＴ７７は、市場で得られる、この中のＰｓｔＩ
−制限位置に、野生型ｂｏｐ−遺伝子及びｂｒｐ−遺伝
子を有するハロバクテリアＰｓｔＩ−フラグメントがク
ロ−ン導入されているＥ．コリ−プラスミドｐＧＥＭ４
である。ｐＷＴ７７をＨｉｎｄIIIと連結させ、Ａｓｐ
７１８で部分的に切断した。ベクタ−分（ｐＧＥＭ４）
及び野生型ｂｏｐ−遺伝子の5´-領域をを有する６．８
ｋｂ ＨｉｎｄIII／Ａｓｐ７１８フラグメントＷＴ７
７δＡＨを、ｂｏｐ−遺伝子の変異された3´−領域を
有するｐＭａＤ８５,９６ＮからのＨｉｎｄIII／Ａｓｐ
７１８−フラグメントと連結させた。この際、７．４ｋ
ｂの大きさのプラスミドｐＷＴ７８が生じた。
【００４０】ｂ）Ｅ．コリ−ハロバクテリウム−ベクタ
− ハロバクテリウム ハロビウム中の変異されたｂｏｐ−
遺伝子の表現のために、プラスミドｐ３１９／Ｄ８５,
９６Ｎを使用した。その構成は、図４に示されており、
それは、ニイ（Ｎｉ）等により記載されたプラスミドｐ
３１９の構成（Ｎｉ等のＧｅｎｅ９０（１９９０）１６
７−１７２）と類似している。このプラスミドｐＨ４５
５は、ラム及びドウリットル（Lam,Doolittle,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA ８６，（１９８９）５４７８−５４８
２）により記載されている。このプラスミドは、Ｅ．コ
リ−分と並んで、メビノリン抵抗遺伝子ＩＳＨ５１−Ｄ
ＮＡ及び末端遺伝子ハロバクテリウム ボルカニイ プ
ラスミドｐＨＶ２を含有する。ｐＨ４５５をＨｉｎｄII
Iを用いて切断し、メビノリン−抵抗遺伝子及びｐＨＶ
２−分を含有する約１６ｋｂのフラグメントを、Ｈｉｎ
ｄIII−線状化されたプラスミドｐＷＴ７８と連結させ
た。得られたプラスミドｐ３１９／Ｄ８５,９６Ｎ（Ｄ
ＳＭ６２２５）を、ハロバクテリウムハロビウムＬ３３
の形質変換のために使用した。
− ハロバクテリウム ハロビウム中の変異されたｂｏｐ−
遺伝子の表現のために、プラスミドｐ３１９／Ｄ８５,
９６Ｎを使用した。その構成は、図４に示されており、
それは、ニイ（Ｎｉ）等により記載されたプラスミドｐ
３１９の構成（Ｎｉ等のＧｅｎｅ９０（１９９０）１６
７−１７２）と類似している。このプラスミドｐＨ４５
５は、ラム及びドウリットル（Lam,Doolittle,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA ８６，（１９８９）５４７８−５４８
２）により記載されている。このプラスミドは、Ｅ．コ
リ−分と並んで、メビノリン抵抗遺伝子ＩＳＨ５１−Ｄ
ＮＡ及び末端遺伝子ハロバクテリウム ボルカニイ プ
ラスミドｐＨＶ２を含有する。ｐＨ４５５をＨｉｎｄII
Iを用いて切断し、メビノリン−抵抗遺伝子及びｐＨＶ
２−分を含有する約１６ｋｂのフラグメントを、Ｈｉｎ
ｄIII−線状化されたプラスミドｐＷＴ７８と連結させ
た。得られたプラスミドｐ３１９／Ｄ８５,９６Ｎ（Ｄ
ＳＭ６２２５）を、ハロバクテリウムハロビウムＬ３３
の形質変換のために使用した。
【００４１】３．形質変換及び表現 形質変換のために、菌株ハロバクテリウム ハロビウム
Ｌ３３（ＤＳＭ５７３５）を用いた。この形質変換
は、ニイ等によるGene ９０（１９９０）１６９−１７
２に開示された方法により実施した。
Ｌ３３（ＤＳＭ５７３５）を用いた。この形質変換
は、ニイ等によるGene ９０（１９９０）１６９−１７
２に開示された方法により実施した。
【００４２】ａ）スフェロブラスト形成 成長培地（ＮａＣｌ ２５０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
２０ｇ、クエン酸三ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ３ｇ、ＫＣ
ｌ ２ｇ，ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、２モル／ｌ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ7.2，酵母エキス（Difco）３ｇ、
トリプシン（Difco） ３ｇ、トリプトン（Difco） ５
ｇ及びＨ2Ｏ １０００ｍｌまで）中のハロバクテリウム
ハロビウムＬ３３（ＤＳＭ５７３５）の細胞培養液
３５ｍｌ（約９０連鎖単位）の１ｍｌを、１．５ｍｌエ
ッペンドルフ−容器中で１５分間、室温で、３０００〜
４０００Ｕｐｍで遠心分離した。上澄を、パスツ−ル−
ピペットを用いて、できるだけ完全に取り出す。細胞
を、スフェロブラスト形成性溶液（ＳＰＨ：ＮａＣｌ
２モル／ｌ、ＫＣｌ ２５モル／ｌ、トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．７５） ５０ｍモル／ｌ、サッカロ−ス １
５％ 、滅菌濾過）１００μｌ中に入れる。引き続き、
ＳＰＨ中の０．５モル／ｌEDTA １０μｌを、容器の内
部上縁にピペット導入し、細胞懸濁液と迅速に混合する
（エッペンドルフ−容器の回転）ことにより一緒にす
る。
２０ｇ、クエン酸三ナトリウム・２Ｈ2Ｏ ３ｇ、ＫＣ
ｌ ２ｇ，ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２ｇ、２モル／ｌ
トリス−ＨＣｌ ｐＨ7.2，酵母エキス（Difco）３ｇ、
トリプシン（Difco） ３ｇ、トリプトン（Difco） ５
ｇ及びＨ2Ｏ １０００ｍｌまで）中のハロバクテリウム
ハロビウムＬ３３（ＤＳＭ５７３５）の細胞培養液
３５ｍｌ（約９０連鎖単位）の１ｍｌを、１．５ｍｌエ
ッペンドルフ−容器中で１５分間、室温で、３０００〜
４０００Ｕｐｍで遠心分離した。上澄を、パスツ−ル−
ピペットを用いて、できるだけ完全に取り出す。細胞
を、スフェロブラスト形成性溶液（ＳＰＨ：ＮａＣｌ
２モル／ｌ、ＫＣｌ ２５モル／ｌ、トリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．７５） ５０ｍモル／ｌ、サッカロ−ス １
５％ 、滅菌濾過）１００μｌ中に入れる。引き続き、
ＳＰＨ中の０．５モル／ｌEDTA １０μｌを、容器の内
部上縁にピペット導入し、細胞懸濁液と迅速に混合する
（エッペンドルフ−容器の回転）ことにより一緒にす
る。
【００４３】スフェロブラストの形成は、室温で、約３
０分間以内に行い、光顕微鏡の下で、スフェロブラスト
形成の完結を制御することができる。
０分間以内に行い、光顕微鏡の下で、スフェロブラスト
形成の完結を制御することができる。
【００４４】ｂ）スフェロブラストの形質変換 ＤＮＡを、２０μｌの量で（ＤＮＡ−溶液（５０ｍＭト
リス Ｃｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ １５μｌ
中の１０μｇ）１５μｌ及びＳＰＨ中の０．５モル／ｌ
のＥＤＴＡ ５μｌよりなる）、スフェロブラスト懸濁
液に加え、室温で５分間インキュベ−トする。形質変換
バッチ１個当たりプラスミド−ＤＮＡ３〜１０μｇを使
用した。ポリエチレングリコール−溶液（２４０μｌ）
を、エッペンドルフ容器の蓋部に入れ、ＳＰＨ−懸濁液
と迅速に混合することにより一緒にした。インキュベ−
シヨンは、室温で２０分である。
リス Ｃｌ，ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ １５μｌ
中の１０μｇ）１５μｌ及びＳＰＨ中の０．５モル／ｌ
のＥＤＴＡ ５μｌよりなる）、スフェロブラスト懸濁
液に加え、室温で５分間インキュベ−トする。形質変換
バッチ１個当たりプラスミド−ＤＮＡ３〜１０μｇを使
用した。ポリエチレングリコール−溶液（２４０μｌ）
を、エッペンドルフ容器の蓋部に入れ、ＳＰＨ−懸濁液
と迅速に混合することにより一緒にした。インキュベ−
シヨンは、室温で２０分である。
【００４５】ポリエチレングリコール溶液は、ＰＥＧ６
００（シグマ） ６０％（ｖ／ｖ）及びＳＰＨ ４０％
よりなる。使用ＰＥＧ６００は、場合により、次のよう
に精製する。
００（シグマ） ６０％（ｖ／ｖ）及びＳＰＨ ４０％
よりなる。使用ＰＥＧ６００は、場合により、次のよう
に精製する。
【００４６】ＰＥＧ６００の精製は、クレ−ベ（Ｋｌｅ
ｂｅ）等のＧｅｎｅ ２５（１９８３）３３３以後の記
載に依る．ＰＥＧ ６００ ３０ｇを、ベンゾール３０
ｍｌ中に溶かした。このＰＥＧ６００／ベンゾール−混
合物に、イソオクタン６０ｍｌを加え、氷上に３０分間
静置した。このＰＥＧ６００は固化し、従って上部有機
相はデカンテ−ション除去できた。このＰＥＧ６００
を、水浴中で室温まで加温した。更に、イソオクタン
６０ｍｌをこのＰＥＧ６００に加え、充分振動させ、こ
の混合物を一晩室温で、放置した。イソオクタン相を捨
て、ＰＥＧ６００を、分液ロート中でジエチルエーテル
１５０ｍｌで２回振出させた。次いでジエチルエーテル
を、回転蒸発器で除去した（約２時間）。
ｂｅ）等のＧｅｎｅ ２５（１９８３）３３３以後の記
載に依る．ＰＥＧ ６００ ３０ｇを、ベンゾール３０
ｍｌ中に溶かした。このＰＥＧ６００／ベンゾール−混
合物に、イソオクタン６０ｍｌを加え、氷上に３０分間
静置した。このＰＥＧ６００は固化し、従って上部有機
相はデカンテ−ション除去できた。このＰＥＧ６００
を、水浴中で室温まで加温した。更に、イソオクタン
６０ｍｌをこのＰＥＧ６００に加え、充分振動させ、こ
の混合物を一晩室温で、放置した。イソオクタン相を捨
て、ＰＥＧ６００を、分液ロート中でジエチルエーテル
１５０ｍｌで２回振出させた。次いでジエチルエーテル
を、回転蒸発器で除去した（約２時間）。
【００４７】ｃ）形質変換されたスフェロブラストの再
生 形質変換バッチを、再生溶液（ＲＥＧ：ＮａＣｌ ３．
５モル／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １５０ｍモル／ｌ、
ＫＣＬ ５０ｍモル／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ７ｍ
モル／ｌ、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２） ５０ｍモル
／ｌ、サッカロ−ス１５％、滅菌濾過）１ｍｌで希釈
し、混合し、かつ前記のように、遠心分離する。次い
で、上澄を吸引パスツ−ル−ピペットを用いて完全に取
り出し、バクテリアペレット（屡々見えない）を、完全
培地（ＮａＣｌ ２５０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
２０ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム・Ｈ2Ｏ ３ｇ／
ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２ｇを有するＨ2Ｏ ８０
ｍｌ及びサッカロ−ス １８ｇ、トリプトン ０．６
ｇ、酵母エキス０．４ｇを有するＨ2Ｏ ３０ｍｌより
なる混合物）１ｍｌ中に注意深く懸濁させ、３７℃で一
晩インキュベ−トした。
生 形質変換バッチを、再生溶液（ＲＥＧ：ＮａＣｌ ３．
５モル／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １５０ｍモル／ｌ、
ＫＣＬ ５０ｍモル／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ７ｍ
モル／ｌ、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２） ５０ｍモル
／ｌ、サッカロ−ス１５％、滅菌濾過）１ｍｌで希釈
し、混合し、かつ前記のように、遠心分離する。次い
で、上澄を吸引パスツ−ル−ピペットを用いて完全に取
り出し、バクテリアペレット（屡々見えない）を、完全
培地（ＮａＣｌ ２５０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
２０ｇ／ｌ、クエン酸三ナトリウム・Ｈ2Ｏ ３ｇ／
ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．２ｇを有するＨ2Ｏ ８０
ｍｌ及びサッカロ−ス １８ｇ、トリプトン ０．６
ｇ、酵母エキス０．４ｇを有するＨ2Ｏ ３０ｍｌより
なる混合物）１ｍｌ中に注意深く懸濁させ、３７℃で一
晩インキュベ−トした。
【００４８】ｄ）平板培養 細胞０．１〜０．２５ｍｌそれぞれを、新製オ−バ−レ
イ−培地（ＮａＣｌ２５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２
ｇ、クエン酸三ナトリウム・Ｈ2Ｏ ０．３ｇ、ＫＣｌ
０．２ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．００２ｇを Ｈ
２Ｏで８５ｍｌにし、ｐＨを７．２に調節し、酵母エキ
ス０．３ｇ、トリプトン０．５ｇ、寒天０．８ｇを１５
ｍｌまで充填し、双方の成分を、オ−トクレ−ブ処理
し、一緒にし、サッカロ−ス１５ｇ／溶液１００ｍｌ並
びにメビノリンを最終濃度２０μモル／ｌになるまで５
６℃で加える）３ｍｌ中に４４℃で入れる。この懸濁液
をただちにサポ−ト−プレ−ト（ＮａＣｌ ２５０ｇ，
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｇ，クエン酸三ナトリウム・
Ｈ2Ｏ ３ｇ，ＫＣｌ ２ｇを８５０ｍｌに充填し、双
方をオ−トクレ−ブ処理し、オ−トクレ−ブ処理後に一
緒にし、メビノリンを最終濃度２０μモルまで添加し
た）上に注ぐ。
イ−培地（ＮａＣｌ２５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２
ｇ、クエン酸三ナトリウム・Ｈ2Ｏ ０．３ｇ、ＫＣｌ
０．２ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．００２ｇを Ｈ
２Ｏで８５ｍｌにし、ｐＨを７．２に調節し、酵母エキ
ス０．３ｇ、トリプトン０．５ｇ、寒天０．８ｇを１５
ｍｌまで充填し、双方の成分を、オ−トクレ−ブ処理
し、一緒にし、サッカロ−ス１５ｇ／溶液１００ｍｌ並
びにメビノリンを最終濃度２０μモル／ｌになるまで５
６℃で加える）３ｍｌ中に４４℃で入れる。この懸濁液
をただちにサポ−ト−プレ−ト（ＮａＣｌ ２５０ｇ，
ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２０ｇ，クエン酸三ナトリウム・
Ｈ2Ｏ ３ｇ，ＫＣｌ ２ｇを８５０ｍｌに充填し、双
方をオ−トクレ−ブ処理し、オ−トクレ−ブ処理後に一
緒にし、メビノリンを最終濃度２０μモルまで添加し
た）上に注ぐ。
【００４９】このプレ−トを封印し、少なくとも４週
間、４０℃で 恒温保持器中で保持する。
間、４０℃で 恒温保持器中で保持する。
【００５０】４．形質変換体の培養及びこの変換された
バクテリオロドプシンの単離 数週後にはじめて現われる変換された細胞のコロニ−
は、自然のメビノリン抵抗細胞（黄色）とは対照的に、
灰色に着色されており、メビノリン２０μモル／ｌを含
有する完全培地３５ｍｌ中で増殖される。この細胞混合
物から、クロ−ニングにより培地へのメビノリンの添加
を不必要とする相同組換体を単離することができる。
バクテリオロドプシンの単離 数週後にはじめて現われる変換された細胞のコロニ−
は、自然のメビノリン抵抗細胞（黄色）とは対照的に、
灰色に着色されており、メビノリン２０μモル／ｌを含
有する完全培地３５ｍｌ中で増殖される。この細胞混合
物から、クロ−ニングにより培地へのメビノリンの添加
を不必要とする相同組換体を単離することができる。
【００５１】８５及び９６位でのＡｓｐからＡｓｎへの
アミノ酸交換を伴うＢＲムテインの単離は、エスタ−ヘ
ルト及びステッケニウスにより記載された方法（Oesate
rhelt, Stoeckenius,Methods Enzymol.31,Biomembrane
s,667-678，（１９７４））の様に、サッカロ−ス密度
勾配遠心により行う。このタンパク質は、浮動密度の青
色膜として野生型の紫膜と同様に得られる。
アミノ酸交換を伴うＢＲムテインの単離は、エスタ−ヘ
ルト及びステッケニウスにより記載された方法（Oesate
rhelt, Stoeckenius,Methods Enzymol.31,Biomembrane
s,667-678，（１９７４））の様に、サッカロ−ス密度
勾配遠心により行う。このタンパク質は、浮動密度の青
色膜として野生型の紫膜と同様に得られる。
【００５２】５． バクテリオロドプシン変異体の特性
化 固有の蛋白質としてＢＲムテインＤ８５，９６Ｎを含有
する膜フラクシヨンは、紫膜の浮動密度に相当する約
１．２ｇ／ｃｍ3の浮動密度を有する。蛋白質の吸収極
大は、６０８ｎｍ（１０ｍＭトリス−緩衝液、ｐＨ７．
０）においてである。このレチナ−ルのシッフの塩基の
ｐｋ値は、１Ｍ ＮａＣｌ以上の塩濃度で、１３の野生
型とは対照的に８．５まで低下し、光サイクルにおける
Ｍ−中間体の欠乏と同様にハロロドプシンの挙動に相当
する。脱蛋白されたシッフの塩基を有する中間体の代わ
りに最大青色移動中間体として、測光法により５３５ｎ
ｍで示差最大を有する菌種が現われる。出発状態は、５
ｍｓで再ポピュレ−シヨンされる。
化 固有の蛋白質としてＢＲムテインＤ８５，９６Ｎを含有
する膜フラクシヨンは、紫膜の浮動密度に相当する約
１．２ｇ／ｃｍ3の浮動密度を有する。蛋白質の吸収極
大は、６０８ｎｍ（１０ｍＭトリス−緩衝液、ｐＨ７．
０）においてである。このレチナ−ルのシッフの塩基の
ｐｋ値は、１Ｍ ＮａＣｌ以上の塩濃度で、１３の野生
型とは対照的に８．５まで低下し、光サイクルにおける
Ｍ−中間体の欠乏と同様にハロロドプシンの挙動に相当
する。脱蛋白されたシッフの塩基を有する中間体の代わ
りに最大青色移動中間体として、測光法により５３５ｎ
ｍで示差最大を有する菌種が現われる。出発状態は、５
ｍｓで再ポピュレ−シヨンされる。
【００５３】ＢＲムテインＤ８５,９６Ｎ含有膜を、黒
色フィルム膜に吸着させ、バンベルク等の方法（Bamber
g；Biochim.Biophys.Act７７３，５６−６０，１９８
４）により試験した。この際に測定されたクロリド依存
性で、光誘導性の定常電流は、このムテインがハロロド
プシンの光化学的特性のみならずそのイオン移動活性を
有することを証明している。
色フィルム膜に吸着させ、バンベルク等の方法（Bamber
g；Biochim.Biophys.Act７７３，５６−６０，１９８
４）により試験した。この際に測定されたクロリド依存
性で、光誘導性の定常電流は、このムテインがハロロド
プシンの光化学的特性のみならずそのイオン移動活性を
有することを証明している。
【図１】プラスミドＭｃ５−８ｂｏｐの制限地図を示す
図。
図。
【図２】天然ｂｏｐ遺伝子の突然変異生成を示す図。
【図３】ｐＷＴ７６の構成を示す図。
【図４】ｐ３１９／Ｄ８５,９６Ｎの構成を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/74 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 イェルク ティットル ドイツ連邦共和国 ミュンヘン 19 ルフ ィニシュトラーセ 16 (72)発明者 アンヤ マトゥツァク ドイツ連邦共和国 ジンゲン ブラウエン シュトラーセ１ (72)発明者 クラウス マイ ドイツ連邦共和国 ミュンヘン 80 ガル マイアーシュトラーセ 12
Claims (7)
- 【請求項１】 ハロバクテリア野生型菌株のオプシンの
８５および９６位が突然変異されていることを特徴とす
る、バクテリオロドプシンの二重突然変異体。 - 【請求項２】 その極大吸収が５７８ｎｍより大きく、
光サイクルにおける長生き中間体は、５００ｎｍより長
い波長で吸収極大を有することを特徴とする、バクテリ
オロドプシンの多重突然変異体。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のバクテリオロドプ
シンを生産する、ハロバクテリア菌株。 - 【請求項４】 請求項３記載のハロバクテリア菌株から
の突然変異体を含有する細胞膜フラグメント。 - 【請求項５】 請求項３記載のハロバクテリア菌株を製
造する方法において、 １）オプシン遺伝子を方向付け突然変異生成させ、 ２）工程１）で突然変異生成されたオプシン遺伝子に相
当するオプシン遺伝子が不活性であるか又はｂｏｐ遺伝
子および他のレチナ−ル蛋白質遺伝子を欠いているハロ
バクテリウム ハロビウムの菌株の細胞を、工程１）で
突然変異されたオプシン遺伝子のコピ−少なくとも１個
を有する組換えハロバクテリウムベクタ−を用いて形質
変換させ、かつ ３）この形質変換されたハロバクテリウム ハロビウム
細胞を再生させ、培養することを特徴とする、ハロバク
テリア菌株の製法。 - 【請求項６】 ベクタ−ｐ３１９／Ｄ８５,９６Ｎ（Ｄ
ＳＭ６２２５）。 - 【請求項７】 Ｈ．ハロビウム菌株ＨＮ５（ＤＳＭ６２
２９）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4037342.8 | 1990-11-23 | ||
| DE4037342A DE4037342A1 (de) | 1990-11-23 | 1990-11-23 | Bakteriorhodopsin-doppelmutanten |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH069697A true JPH069697A (ja) | 1994-01-18 |
| JPH0772196B2 JPH0772196B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=6418815
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3304973A Expired - Fee Related JPH0772196B2 (ja) | 1990-11-23 | 1991-11-20 | バクテリオロドプシン−二重突然変異体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5290699A (ja) |
| EP (1) | EP0487099B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0772196B2 (ja) |
| DE (2) | DE4037342A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002540988A (ja) * | 1999-03-31 | 2002-12-03 | ノーベルト・ハンプ | 物体のフォトクロミックラベリング及び／又は物体の真正の保護のための方法及び標本 |
| US7343145B2 (en) | 2004-02-04 | 2008-03-11 | Futaba Corporation | Radio control system for models |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4226868A1 (de) | 1992-08-13 | 1994-02-17 | Consortium Elektrochem Ind | Zubereitungen von Bakteriorhodopsin-Varianten mit erhöhter Speicherzeit und deren Verwendung |
| US5757525A (en) * | 1996-06-05 | 1998-05-26 | University Of Massachusetts | All-optical devices |
| US5854710A (en) * | 1996-09-09 | 1998-12-29 | University Of Massachusetts | Optical fourier processing |
| US5825725A (en) * | 1997-05-06 | 1998-10-20 | The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of The University Of Oregon | Method and apparatus for reversible optical data storage |
| US7253268B2 (en) | 2000-05-03 | 2007-08-07 | Monterey Bay Aquarium Research Institute | Light-driven energy generation using proteorhodopsin |
| CA2507165C (en) * | 2002-11-26 | 2014-10-14 | Genencor International, Inc. | Optical information carrier comprising immobilized proteorhodopsin |
| EA023130B1 (ru) | 2010-06-18 | 2016-04-29 | Ю-Ника Текнолоджи Аг | Способ нанесения композиций, содержащих бактериородопсин, на основу и продукты, полученные этим способом |
| US9207237B2 (en) | 2010-08-23 | 2015-12-08 | President And Fellows Of Harvard College | Systems, methods, and workflows for optogenetics analysis |
| US9057734B2 (en) | 2010-08-23 | 2015-06-16 | President And Fellows Of Harvard College | Optogenetic probes for measuring membrane potential |
| WO2015195769A2 (en) | 2014-06-18 | 2015-12-23 | President And Fellows Of Harvard College | Optogenetic probes for measuring membrane potential |
| EP3012784B1 (de) | 2014-10-24 | 2017-02-15 | Actilor Intellectual Asset AG | Selektiv optisch auslesbarer Datenträger |
| US10077463B2 (en) | 2015-01-15 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | Optical selection of cells |
-
1990
- 1990-11-23 DE DE4037342A patent/DE4037342A1/de not_active Withdrawn
-
1991
- 1991-11-14 US US07/791,858 patent/US5290699A/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-20 JP JP3304973A patent/JPH0772196B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-11-22 DE DE59107720T patent/DE59107720D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-11-22 EP EP91119946A patent/EP0487099B1/de not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES=1988US * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002540988A (ja) * | 1999-03-31 | 2002-12-03 | ノーベルト・ハンプ | 物体のフォトクロミックラベリング及び／又は物体の真正の保護のための方法及び標本 |
| US7343145B2 (en) | 2004-02-04 | 2008-03-11 | Futaba Corporation | Radio control system for models |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0772196B2 (ja) | 1995-08-02 |
| EP0487099A3 (en) | 1993-05-26 |
| EP0487099B1 (de) | 1996-04-24 |
| DE4037342A1 (de) | 1992-05-27 |
| DE59107720D1 (de) | 1996-05-30 |
| US5290699A (en) | 1994-03-01 |
| EP0487099A2 (de) | 1992-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Krebs et al. | Gene replacement in Halobacterium halobium and expression of bacteriorhodopsin mutants. | |
| Koomey et al. | Effects of recA mutations on pilus antigenic variation and phase transitions in Neisseria gonorrhoeae | |
| Khosla et al. | Heterologous expression of a bacterial haemoglobin improves the growth properties of recombinant Escherichia coli | |
| Golden et al. | [12] Genetic engineering of the cyanobacterial chromosome | |
| US5470719A (en) | Modified OmpA signal sequence for enhanced secretion of polypeptides | |
| JPH069697A (ja) | バクテリオロドプシン−二重突然変異体 | |
| JPH07503857A (ja) | アフィディダエ科の害虫を抑制するためのバシラス・チューリンゲンシス単離体の用途 | |
| CN107163113B (zh) | 水稻半卷叶控制基因srl9及其叶形改良的用途 | |
| Murayama et al. | vidence for Involvement ofEscherichia coliGenespmbA, csrAand a Previously Unrecognized GenetldD, in the Control of DNA Gyrase byletD (ccdB) of Sex Factor F | |
| KR20190005707A (ko) | 디옥시바이오라세인 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법 | |
| JPH04500754A (ja) | 異種遺伝子発現のための改良細菌株 | |
| KR100457879B1 (ko) | 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법 | |
| KR101215245B1 (ko) | 비-항생제 내성 선별 마커를 포함하는 선별 시스템 | |
| HUT51671A (en) | Process for producing new proteins | |
| Rozsa et al. | Interesting sequence differences between the pilin gene inversion regions of Moraxella lacunata ATCC 17956 and Moraxella bovis Epp63 | |
| JPH01503593A (ja) | 光誘導プロモーター | |
| JP2003289868A (ja) | 酢酸耐性遺伝子、該遺伝子を用いて育種された酢酸菌、及び該酢酸菌を用いた食酢の製造方法 | |
| US7790185B2 (en) | Method for the production of bacterial toxins | |
| CN114540399A (zh) | 一种制备l-缬氨酸的方法及其所用基因突变体和生物材料 | |
| JP3968618B2 (ja) | シゾサッカロミセス・ポンベで使用可能な誘導プロモータ、誘導発現ベクター、およびそれらの利用 | |
| JPH0272881A (ja) | クラミドモナス ラインハーティを形質転換する方法およびシステム | |
| CN119979489B (zh) | 一种BaP4H突变体及其应用 | |
| KR20040072545A (ko) | 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를함유하는 셔틀벡터 | |
| EP0750038B1 (en) | A mutant gene causing a defect in mitochondrial recombination and a method for its detection | |
| JP2005517406A5 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080802 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080802 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090802 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100802 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110802 Year of fee payment: 16 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |