JPH0673104A - β−サイクロデキストリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 澱粉以外の基質からβ−サイクロデキストリ
ンを効率よく製造する。 【構成】 グルコースの数が２〜１０であるマルトオリ
ゴ糖とサイクロデキストリングルカノトランスフェラー
ゼとを、β−サイクロデキストリン溶液に過剰量加えた
ときにβ−サイクロデキストリンの５０％以上を沈澱さ
せる有機溶媒を含む溶液中で共存させ、４０℃よりも低
い温度で反応を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、サイクロデキストリン
の製造法に関し、詳しくは、澱粉以外の原料から効率よ
くβ−サイクロデキストリンを製造する方法を提供する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】サイクロデキストリン（以下、「ＣＤ」
という。）は、６〜１２個のグルコースがグルコシド結
合で環状に結合した非還元性のマルトオリゴ糖である。
ＣＤとしては、グルコースが６個結合したα−ＣＤ、７
個結合したβ−ＣＤ、８個結合したγ−ＣＤが、単品あ
るいは混合物として工業的に生産されている。ＣＤは、
環の外周は親水性であり、空洞内は疎水性である両性物
質であって、その疎水性空洞に各種の分子等を安定に包
み込む包接機能を有している。

【０００３】このため、揮発性物質の不揮発化や、不快
臭のマスキング等が可能であり、医薬品、食料、化粧品
等に使用されるなど、幅広い分野で利用されている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＣＤは、従来、澱粉を
基質としたＣＤ生成酵素（サイクロデキストリングルカ
ノトランスフェラーゼ：以下、「ＣＧＴａｓｅ」とい
う。）による酵素反応により得られている。工業的には
基質濃度が高い方が望ましいが、反応液の粘度が高くな
り、攪拌操作が困難になり、反応率も低下する。そのた
め、予め澱粉をα−アミラーゼを用いた前処理により液
化して粘度を下げる方法もあるが、工程が煩雑となる。

【０００５】また、反応生成物は、α、β、γ型のＣＤ
の混合物として得られ、主として利用されているβ−Ｃ
Ｄを得ようとする場合には精製が必要となり、収率も低
下する。一方、澱粉以外の基質を用いたＣＧＴａｓｅに
よるＣＤの生産は報告されていない。

【０００６】本発明はかかる観点からなされたものであ
り、澱粉以外の基質からβ−ＣＤを効率よく製造する方
法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するために鋭意研究を行った結果、原料基質として
高濃度のマルトオリゴ糖を用い、ＣＧＴａｓｅを作用さ
せると、β−ＣＤのみが生成されることを見出し、本発
明に至った。

【０００８】すなわち本発明は、グルコースの数が２〜
１０であるマルトオリゴ糖とサイクロデキストリングル
カノトランスフェラーゼとを、β−サイクロデキストリ
ン溶液に過剰量加えたときにβ−サイクロデキストリン
の５０％以上を沈澱させる有機溶媒を含む溶液中で共存
させ、４０℃よりも低い温度で反応を行うことを特徴と
するβ−サイクロデキストリンの製造法である。

【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ＣＤの製造法は、有機溶媒存在下でマルトオリゴ糖にＣ
ＧＴａｓｅを作用させることを特徴とする。

【００１０】原料基質であるマルトオリゴ糖としては、
重合度２〜１０程度のものが好ましく、これらは単独で
も混合物でも使用できる。入手のしやすさ、製造コスト
等の点からマルトースが特に好ましい。

【００１１】ＣＧＴａｓｅとしては、通常のＣＤの工業
生産に使用されるBacillus macerans、Bacillus megate
rium、 Bacillus circulans等が産生する酵素が挙げら
れる。この酵素は、種々の反応を触媒するが、本発明に
おいては分子内転移反応（環化反応）、分子間転移反応
（不均化反応）によりβ−ＣＤが生成する。

【００１２】有機溶媒としては、β−ＣＤと比較的強く
包接体を形成するものがよく、シクロヘキサン、シクロ
オクタン、シクロドデカン等の環状炭化水素類、ベンゼ
ン、エチルベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ
−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼン、ナフタレン、アン
トラセン等の芳香族化合物類、テトラクロロエチレン、
クロロホルム等のハロゲン化合物類等の１種あるいは２
種以上の混合物が挙げられる。これらの中では、シクロ
ヘキサンが特に好ましい。

【００１３】上記有機溶媒の反応液中の濃度は、好まし
くは３０〜８０vol％、さらに好ましくは４０〜６０vol
％であり、水あるいは緩衝液と混合して攪拌しながら反
応を行う。

【００１４】マルトースを基質とした場合には、基質濃
度が４０（W/V）％を越えるとβ−ＣＤの生成量が頭打
ちになるので、これ以下の範囲で合成を行うことが収率
の点から好ましい。同様に、反応開始６０時間前後で生
成量は最大により、反応時間が６０時間を大きく越える
と生成量が減少するので、これ以下で行うことが望まし
い。また、反応液のｐＨは４．５〜８が好ましく、５〜
７がさらに好ましい。

【００１５】ＣＧＴａｓｅの至適温度は５０℃付近であ
るが、４０℃を越えた温度で反応を行うとＣＤは生成し
ないので、これよりも低い温度、好ましくは２５℃以
下、さらに好ましくは１０℃以下で反応を行う。

【００１６】生成したβ−ＣＤは、有機溶媒と包接体を
形成して沈澱するので、反応液や未反応基質と容易に分
離することができる。

【００１７】

【作用】マルトオリゴ糖にＣＧＴａｓｅを作用させる
と、分子間転移反応により、グルコースの単量体〜８量
体（マルトオクタオース）程度までのマルトオリゴ糖に
変化する。ここで、６量体以上のオリゴ糖は分子内転移
反応によりＣＤとなる可能性を有するが、系中に同時に
マルトオリゴ糖が存在するため、生成したＣＤは速やか
に開環転移反応により分解され、系中にはほとんど残ら
ない。

【００１８】この反応を、ＣＤと包接体を形成して反応
生成物を沈澱を生成させるような有機溶媒を加えた系で
行うと、環化反応により生成したＣＤは酵素の作用を受
けにくくなり、反応系中に蓄積する。

【００１９】さらに、本発明においては４０℃以下で反
応を行うことによりＣＤが生成されるが、これは、４０
℃以下にすることによりＣＤと有機溶媒との包接体がよ
り安定に存在するためであると考えられる。

【００２０】

【実施例】以下に、本発明の実施例を説明する。尚、以
下の実施例で使用したＣＧＴａｓｅは、天野製薬（株）
から市販されているBacillus macerans由来のもの（商
品名コンチザイム）を用い、基質１ｇに対して３００Ｕ
（Tilden-Hudson単位：J.Bacteriol. 43, 527 (1942)）
使用した。この酵素は、澱粉を基質とした場合には、主
としてα−ＣＤを生成する。

【００２１】反応生成物の分析に使用したグルコアミラ
ーゼは、生化学工業（株）から市販されているRizopus
niveus由来のものを使用した。

【００２２】

【実施例１】シクロヘキサン−水系でのマルトースを基
質としたＣＤの製造について説明する。

【００２３】５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）０．５
ｍｌに対し、シクロヘキサンの量を変えてＣＤの製造を
行った。反応は、基質濃度２０％、７．５℃で、攪拌し
ながら６６時間行った。

【００２４】反応生成物の分析は、カラムにASAHIPAK N
H2P-50（旭化成製）を用いたＨＰＬＣ（高速液体クロマ
トグラフィー）により行った。図１に、シクロヘキサン
無添加で反応させたもの（Ａ）と、シクロヘキサンを
０．４ｍｌ添加して反応を行ったもの（Ｂ）のクロマト
グラムを示した。Ｂの１７．８５７分の位置に、Ａには
みられないピークが認められ、このピークは、β−ＣＤ
の標準物質のピークと保持時間が一致した。

【００２５】また、これらの試料にグルコアミラーゼを
加え、直鎖のマルトオリゴ糖を分解したもののクロマト
グラフを図２に示した。尚、ＣＤはグルコアミラーゼで
は分解されない。β−ＣＤの標準物質と一致したピーク
はＤでは残存し、これらの結果からこのピークがβ−Ｃ
Ｄであることがわかった。

【００２６】上記ピーク面積を指標とし、各反応のβ−
ＣＤの生成率（％）を算出した結果を図３に示す。ま
た、シクロヘキサンの濃度（反応液の総容量に対するシ
クロヘキサンの容量％）に対し、β−ＣＤの最大生成率
を１．０としたときの相対生成量を、図４に示した。

【００２７】これらの結果から、基質にマルトースを用
い、シクロヘキサン−水系でＣＧＴａｓｅを作用させる
ことにより、β−ＣＤが生成することがわかる。また、
シクロヘキサンの濃度は３０〜８０％、特に４０〜６０
％が好ましいことがわかった。

【００２８】

【実施例２】次に、本発明に使用できる溶媒の検索を行
った。α−ＣＤ、β−ＣＤ、γ−ＣＤの各１％溶液に、
過剰量の有機溶媒を添加し、室温で数分攪拌した後、水
相の上清をＨＰＬＣで分析することにより沈澱量を測定
した。すべて沈澱したものを沈澱生成率１００とした。
尚、常温で固体のものは、ヘキサンに溶解させて用い
た。

【００２９】さらに、各溶媒４４．４％で実施例１と同
様に反応を行い、反応時の沈澱の有無及び沈澱物の分析
を行った。結果を表１に示す。

【００３０】

【表１】

【００３１】この結果から、β−ＣＤを約５０％以上沈
澱させる有機溶媒を用いて反応を行うと、β−ＣＤが生
成することがわかった。

【００３２】

【実施例３】基質濃度を変えて、β−ＣＤの合成を行っ
た。酵素量も基質重量に対して一定(300U/g)となるよう
にした。有機溶媒にはシクロヘキサン（４４．４％）を
用い、実施例１と同様の条件で４８時間反応を行った。
結果を図５に示す。

【００３３】この結果から、マルトース濃度が高くなる
にしたがって、β−ＣＤの生成量が増加することがわか
った。但し、３０％を越えると生成量は頭打ちになる。

【００３４】

【実施例４】マルトース（２０％）を基質としたβ−Ｃ
Ｄの合成におけるｐＨの影響を調べた。有機溶媒にはシ
クロヘキサン（４４．４％）を用い、緩衝液には、ｐＨ
４〜５では５０ｍＭ酢酸緩衝液を、ｐＨ６〜８では５０
ｍＭリン酸緩衝液を使用した。結果を図６に示す。

【００３５】この結果から、ｐＨ５〜８が好ましいこと
がわかった。

【００３６】

【実施例５】さらに、β−ＣＤの合成反応における反応
時間とβ−ＣＤの生成量との関係を調べた。基質にはマ
ルトース（２０％）を用い、シクロヘキサン３０ｍｌと
１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）２４ｍｌとの混合
系で、７．５℃で反応を行った。結果を図７に示す。

【００３７】この結果から、反応開始６０時間前後でＣ
Ｄ生成量は最大となり、その後、徐々に減少することが
わかった。

【００３８】

【実施例６】β−ＣＤの合成反応における温度の影響を
調べた。基質にはマルトース（２０％）、有機溶媒には
シクロヘキサン（４４．４％）を用い、50mMリン酸緩衝
液(pH6)との混合系で、温度を変えて４８時間反応を行
った。結果を図８に示す。

【００３９】この結果から、４０℃ではβ−ＣＤの合成
反応は起こらず、４０℃を越えない温度で反応が起こる
ことがわかった。

【００４０】

【発明の効果】本発明により、澱粉以外の原料からβ−
ＣＤを製造することが可能となった。本方法は、原料が
高濃度でも反応液の粘度が高くならないので、前処理を
必要としない。また、反応生成物がβ−ＣＤのみである
ので、精製操作が簡便である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 β−ＣＤ合成反応後のクロマトグラム。Ａは
シクロヘキサン無添加、Ｂは添加したものである。

【図２】 グルコアミラーゼ処理したβ−ＣＤ合成反応
物のクロマトグラム。Ｃはシクロヘキサン無添加、Ｄは
添加したものである。

【図３】 反応液に対するシクロヘキサンの量とβ−Ｃ
Ｄの生成率との関係を示す図。

【図４】 シクロヘキサン濃度とβ−ＣＤの相対生成量
との関係を示す図。

【図５】 基質濃度とβ−ＣＤの生成率との関係を示す
図。

【図６】 β−ＣＤ合成におけるｐＨの影響を示す図。

【図７】 β−ＣＤの生成量と反応時間との関係を示す
図。

【図８】 β−ＣＤの生成率と反応温度との関係を示す
図。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルコースの数が２〜１０であるマルト
   オリゴ糖とサイクロデキストリングルカノトランスフェ
   ラーゼとを、β−サイクロデキストリン溶液に過剰量加
   えたときにβ−サイクロデキストリンの５０％以上を沈
   澱させる有機溶媒を含む溶液中で共存させ、４０℃より
   も低い温度で反応を行うことを特徴とするβ−サイクロ
   デキストリンの製造法。
2. 【請求項２】 前記マルトオリゴ糖がマルトースである
   請求項１記載のβ−サイクロデキストリンの製造法。
3. 【請求項３】 前記有機溶媒が、シクロヘキサン、シク
   ロオクタン、ベンゼン、エチルベンゼン、ｏ−キシレ
   ン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、ｏ−ジクロロベンゼ
   ン、テトラクロロエチレン、クロロホルム、シクロドデ
   カン、ナフタレン、アントラセンから選ばれることを特
   徴とする請求項１又は２記載のβ−サイクロデキストリ
   ンの製造法。
4. 【請求項４】 前記有機溶媒の濃度が２０〜８０Vol％
   である請求項１〜３のいずれか一項に記載のβ−サイク
   ロデキストリンの製造法。